CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.3 Đánh giá kiểu gen quần thể thí nghiệm
DNA tổng số của bố mẹ và các dòng lai được ly trích theo phương pháp CTAB (cetyltrimethyllammonium bromide) của Murray và Thomson (1980), quy trình ly trích có cải tiến một số thành phần hóa chất nhằm phù hợp với điều kiện hiện có tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam. Quy trình ly trích gồm các bước sau:
Bước 1: Nghiền 0,5 g lá trong Nitơ lỏng, sau đó chuyển vào tuýp 1,5 ml.
Bước 2: Thêm 500 l dung dịch CTAB, lắc cho đến khi hỗn hợp đồng nhất.
Bước 3: Ủ mẫu ở 55oC trong 15 phút.
Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
Bước 5: Chuyển dịch nổi sang tuýp mới. Thờm 250 àl hỗn hợp chloroform:
isoamyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1), lắc mạnh trong 1 phút, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Bước 6: Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 1 phút ở 4oC, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sang tuýp mới.
Bước 7: Lặp lại bước 5 và 6.
Bước 8: Cho vào 500 l isopropanol, đảo nhẹ tuýp, ủ mẫu ở -20oC trong 1 giờ.
Bước 9: Thu tủa bằng cách ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
Bước 10: Đổ bỏ dịch nổi, rửa tủa với 500 l ethanol 70%, sau đó ly tâm
12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 4oC.
Bước 11: Tiếp tục đổ bỏ dịch nổi, rửa tủa với 500 l ethanol 70%, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 4oC.
Bước 12: Phơi khô tủa ở 50oC trong khoảng 15 phút.
Bước 13: Hòa tan mẫu trong 50 l dung dịch TE 1X và trữ mẫu ở - 20oC.
Sau đó, tiến hành định tính và định lượng DNA bằng phương pháp điện di và phương pháp đo OD.
Định tính DNA bằng phương pháp điện di
DNA sau khi ly trích sẽ được định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%. Vì DNA mang điện tích âm (do tính chất của nhóm phosphate), dưới tác dụng của điện trường DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ sát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn, lực cản càng mạnh nên di chuyển càng chậm. DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại được các đoạn DNA trên gel agarose.
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân tách tùy theo trọng lượng phân tử. Chúng có thể được quan sát bằng mắt thường nhờ kỹ thuật nhuộm màu với ethidium bromide và chụp gel bằng tia UV.
Cách tiến hành
- Pha gel agarose với nồng độ 1%: Cân 1 g agarose cho vào 125 ml dung dịch TAE 0,5 X. Đun sôi bằng lò Viba ở công suất 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn thể tích còn lại 100ml. Để nguội đến khoảng 60oC.
- Đổ gel, chờ agarose đông.
- Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 l loading dye và 4 l DNA mẫu.
- Chạy điện di ở điều kiện 90 V, 250 mA, thời gian 1 giờ 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 10mg/ml trong 30 phút, sau đó đưa vào máy Geldoc đọc kết quả. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
Định lượng DNA bằng phương pháp đo OD
Các mẫu DNA ly trích sau khi đã định tính bằng phương pháp điện di, sẽ được kiểm tra độ tinh sạch và định lượng hàm lượng DNA bằng cách đo mật độ quang OD, với bước sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng của một chất ở một bước sóng xác định, Nucleic acid hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm do sự có mặt của base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm) và 280 nm (OD280nm) của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong mẫu. Hàm lượng DNA được tính theo công thức:
Hàm lượng DNA (ng/àl) = [(62,9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100 DNA được xem là sạch khi tỉ số OD260nm/OD280nm nằm trong khoảng 1,8 đến 2,2.
- Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 l dung dịch DNA hòa tan với 1,8 ml TE 1X.
Cho vào Cuvette. Tiến hành đo OD.
- Mỏy định lượng DNA cho ra kết quả nồng độ DNA (ng/àl) và giỏ trị OD 260/280.
3.3.3.2 Tuyển chọn chỉ thị phân tử cho phản ứng PCR để xác định con lai chứa gen của quần thể lai tạo
Các chỉ thị phân tử SSR được tuyển chọn dựa vào cơ sở dữ liệu của cây lúa được công bố trên trang web http://www.gramene.org, các chỉ thị phân tử SSR được tìm kiếm theo tên, vị trí trên NST, quần thể lập bản đồ dựa theo công trình nghiên cứu được công bố của McCouch và ctv (2002).
Dựa vào những kết quả nghiên cứu trước đây như nghiên cứu của Zhang và ctv (2009) ở giai đoạn trổ bông của lúa, nghiên cứu của Zhu và ctv (2005) ở giai đoạn vào chắc lựa chọn ra các chỉ thị phân tử SSR để kiểm tra đa hình giữa các cá thểvề kiểu hình chịu nhiệt độ cao.
3.3.3.3 Phản ứng PCR với các chỉ thị phân tử SSR
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR system-9700 (PE Biosystem), với tổng thể tớch là 25 àl, với cỏc chỉ thị SSR tuyển chọn được, chương trỡnh nhiệt và các thành phần hóa chất trong hình 3.4 và bảng 3.3.
Sản phẩm PCR được kiểm tra kích thước bằng điện di trên gel agarose 3%, trong dung dịch đệm TAE 0,5X, dưới hiệu điện thế 200V trong 90 phút. Sau đó, gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide 10 mg/ml trong 30 phút và chụp dưới đèn UV.
Hình 3.4. Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR.
Bảng 3.2: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR
Thành phần Thể tích sử dụng PCR standard master mix 12,5 àl
Mồi xuụi (10àM) 0,5 àl Mồi ngược (10 àM) 0,5 àl
Nước biopure 10,5 àl
DNA mẫu 1 àl
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với các SSR primer, kết quả được so sánh với kết quả đánh giá kiểu hình nhằm xác định chính xác các locus cho đa hình giữa giống chống, chịu và giống nhạy nhiệt, từ đó dự đoán marker liên kết với các gen kháng mục tiêu.