2.9.1 Khái niệm
SSR hay còn gọi là microsatellite ngày nay đã trở thành thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR hay VNTR. Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus là 20 – 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome.
Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những alen đồng trội (bao gồm 2 loại: alen đồng hợp và alen dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker.
Tần số đột biến từ 5.10-6 - 10-4, nó tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng (Lagercrantz, 1993).
2.9.2 Các loại microsatellite
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) chúng ta có:
Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4
ACTCACTCACTCACTC
Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa.
Những đoạn lặp lại của poly A/poly T là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau. Tuy nhiên, nó không phù hợp để sử dụng trong lập bản đồ, phân tích quần thể vì nó không ổn định và bền vững trong quá trình phân tích bằng PCR. Trong quá trình này, dưới tác động của enzyme Taq polymerase nó có thể làm cho kích thước alen bị thay đổi bằng cách
thêm một nucleotide A vào cuối đoạn hoặc chèn vào vùng lặp lại của alen.
Những phân tích gần đây trong số liệu của những đoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT là loại thường gặp hơn cả ở động vật có vú, gấp đôi so với AT và gấp 3 so với AG/TC. Loại dinucleotide thường gặp ở thực vật là AA/TT và AT/TA. Chúng có thể phân ra ba loại sau:
- Hoàn hảo: không có sự ngắt quãng CACACACACACA
- Phối hợp: kết hợp nhiều loại lặp lại CACACACAGAGAGA
- Ngắt quãng: bị chèn bởi một hoặc nhiều bởi một hoặc nhiều base CACATTCACACATTCATT
Loại có tính đa hình cao nhất là loại không bị ngắt quãng, nhưng trong thực tế các microsatellite thường bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các trình tự lặp lại.
Trong số 3 nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất hiện các kiểu này tùy thuộc vào chủng loại genome (Ma và ctv, 1996).
2.9.3 Vai trò của microsatellite
Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng cụ thể của những vùng như vậy vẫn còn
chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền.
Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên, có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã
của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen (Beckmann và Weber, 1992).
Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promoter. Vị trí của microsatellite gần hay xa promoter cũng làm hoạt động của promoter thay đổi.
Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen (Morgante và Olivieri, 1993).
Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng
thì gen được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hướng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về
chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể.
Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của
microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi. Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều
chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa. Do vậy, microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa (Rossetto, 2001).
2.9.4 Ưu khuyết điểm của phương pháp SSR
Phương pháp microsatellite hiệu quả hơn phương pháp RFLP ở chỗ đòi hỏi lượng DNA phân tích ít hơn, mức độ đa hình cao hơn và thêm vào đó là khả năng phân tích tự động bằng máy giải trình tự.
Primer microsatellite có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nhà nghiên cứu vì mỗi locus có mang trình tự microsatellite đều được phát hiện bởi những cặp primer thích hợp. Primer microsatellite cũng dễ áp dụng từ loài này sang loài khác hơn phương pháp AFLP.
Phương pháp microsatellite cho kết quả phân tích tính đa hình chính xác hơn, với mức độ đa hình cao gấp 7 lần so với phương pháp RAPD.
Hiện nay, microsatellite là công cụ chủ yếu và đang thay thế phương pháp RFLP trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền ở thực vật. Ngoài ra, sự kết hợp giữa phương pháp microsatellite và phương pháp AFLP sẽ giúp cho việc xây dựng bản đồ di truyền một cách chi tiết.
Đặc tính đồng trội (co – dominant), đồng phân ly của microsatellite là một ưu điểm trong nghiên cứu lập bản đồ di truyền, trong khi RAPD và AFLP không có đặc tính này.
Hạn chế của phương pháp microsatellite là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellite có tỉ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại. Thứ nhất, trình tự vùng
flanking ở 2 bên vùng microsatellite thường khác nhau giữa các loài do đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellite của loài này cho loài khác. Thứ hai, do tỉ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellite, ví dụ như AC19, chúng ta cũng không thể kết luận rằng 2 loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC18 rồi đột biến thành AC19, còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC20 rồi đột biến thành AC19 (Powell và ctv, 1996).
2.9.5 Ứng dụng của microsatellite
Việc ứng dụng microsatellite trong nghiên cứu di truyền ở cây trồng mới được thực hiện trong khoảng thời gian gần đây nhưng kết quả ứng dụng rất thành công do mức độ đa hình phát hiện bởi microsatellite cao hơn bất kỳ marker phân tử nào khác. Do đó, microsatellite là một công cụ rất đắc lực trong nghiên cứu đa dạng di truyền của cây trồng (Powell và ctv, 1996).
Nhờ những tính chất của một marker, microsatellite được áp dụng trong nhiều lĩnh vực như: Lập bản đồ gen, nghiên cứu những gen liên quan đến bệnh di truyền, giám định pháp y, phân tích để tìm ra bố mẹ, xác định phả hệ, xác định cấu trúc quần thể, đặc biệt là áp dụng trong việc xác định cấu trúc và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể, xác định các vị trí liên quan đến tính trạng số lượng (QTL). Các thông tin về microsatellite đa alen của một locus cũng như trên nhiều locus có thể được phân tích bằng các phương pháp thống kê để đưa ra nhiều thông tin bổ ích về cấu trúc quần thể, phả hệ, các gen liên quan đến năng suất và chất lượng sản phẩm, gen chống bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).