Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu sản xuất PHB từ chủng vi khuẩn E.Coli tái tổ hợp

Escherichia coli DH5α mangoperon phbCAB có khả năng sinh tổng hợp PHB ở pH tối ưu 7,0; điều này có thể đượcứng dụng để sản xuất PHB trong công nghiệp vì vi khuẩn có thể sinh trưởng và ph

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Địa điểm và thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Sinh Học, Viện Bảo Tồn Nguồn Gen Đại Học Nguyễn Tất Thành Số 298 – 300A Nguyễn Tất Thành, P13, Q4, Tp Hồ Chí Minh

Thời gian thực hiện: từ tháng 10 năm 2015 đến tháng 06 năm 2016

Vật liệu E coli tái tổ hợp DH5α mang operon phbCAB 4985

E coli tái tổ hợp được cung cấp bởi Phòng Vi Sinh thuộc Viện Kĩ Thuật Công Nghệ Cao NTT – trường đại học Nguyễn Tất Thành [Tạo dòng phân tử operon phb CAB của vi khuẩn Alcaligenes eutrophus H16 vào vi khuẩn E coli DH5αđể sản xuất Poly 3-Hydroxybutyrate trêncơ chất mật rỉ]

Trần Hoàng Dũng 1 , Huỳnh Văn Hiếu 2 , Phạm Công Hoạt 3 và Chung Anh Dũng 4

1Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT-, trường ĐH Nguyễn Tất Thành;

2Khoa Khoa học Nông nghiệp – Công nghệ Sinh học, trường ĐH Nguyễn Tất Thành;

3Bộ Khoa học Công nghệ

4Phòng Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam;

Liên hệ tác giả: Trần Hoàng Dũng;tranhoangdung1975@yahoo.com,ĐT: 01222999537

Hóa chất và dụng cụ sử dụng

Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm gồm:

- Môi trường 707 giữ giống và nhân sinh khối: [7]

Thành phần Lượng thành phần

Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê ở bảng 2.2.

Bảng 2.1 Các hóa chất dung trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Code No Nước sản xuất

4 NaCl Bio Basic Inc 1107NBUC21E2B1 Mỹ

6 Phenol Scharlau FE04820250 Tây Ban Nha

10 Nước cất 2 lần khử ion Việt Nam

22 (NH 4 ) 2 SO 4 NP 215 Trung Quốc

41 Cao men HiMedia 0000200631 Ấn Độ

42 Sudan Black B Bio Basic Inc S0593 Mỹ

45 Methanol HiMedia AS059 Ấn Độ

Ngoài những dụng cụ thí nghiệm cơ bản (que cấy, đèn cồn, erlen,…), các thiết bị khác được lệt kê trong bảng 2.3.

Thiết bị lên men quy mô 150 ml được thiết kế tại phòng Vi sinh gồm bình erlen 250 mL, nút cao su có gắn ống dẫn khí và thoát khí, bộ thổi khí hồ cá và dây dẫn khí có nút điều chỉnh lượng khí lưu thông.

Hình 2 1: Mô hình lên men BioFlo 110

Hình 2 2: Mô hình lên men 150ml có sục khí

Hình 2 3: Hệthốngnhân giống cấp 2 cung cấp giống lên men

Hình 2 4: Hệthống lên men 1,5l có sục khí Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Hãng sản xuất Code No Nước sản xuất

1 Tủ đông ALASKA BD_2099 Mỹ

3 Lò vi sóng CANDY 3800017911474340 Trung Quốc

4 Bộ điện di CONSORT 102384EV 245 Bỉ

5 Bàn đọc gel CONSORT E2723 Bỉ

8 Máy ủ nhiệt khô HEATING BLOCK 0402160127B008 Hàn Quốc

9 Tủ cấy vô trùng HUY HOANG 475 Việt Nam

10 Tủ sấy LANGSHAN 0513-86511077 Trung Quốc

11 Cân kỹ thuật OHAUS B222969314 Mỹ

13 Nồi hấp vô trùng STURDY 120718010-006 Đài Loan

14 Tủ lạnh TATUNG TRA 0410A210142 Việt Nam

15 Máy ly tâm WISD 4039671240106 Hàn Quốc

16 Máy ly tâm EPPENDORF Đức

17 Máy khuấy từ gia nhiệt WISESTIR DH.WMH03023 Đức

Bảng 2.3 Danh mục hóa chất phân tích

Tên hóa chất Mã hàng hóa Hãng sản xuất

Phương pháp nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu điều kiện hoá lý thich hợp đểchủng E coli tái tổhợp tạo PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường quy mô 150ml và 1.5l.

2.4.1 Kiểm tra một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn.

Kiểm tra đại thể: quan sát hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa.

Kiểm tra vi thể: quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi quang học.

Kiểm tra hoạt tính PHB: xác định khả năng tạo PHB của chủng vi khuẩn bằng thuốc nhuộm Sundan Black B

18 Máy quang phổ LABOMEC, INC Mỹ

20 Bộ sục khí HEIBAO Trung Quốc

23 Bình chiết Soxhlet 24 Giấy lọc Fisherband FISHER

2.4.1.1 Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn.

- Kiểm tra đại thể chủngE colitái tổ hợp thông qua quan sát hình dạng khuẩn lạc.

- Kiểm tra hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi bằng phương pháp nhuộm Gram.

2.4.1.2 Kiểm tra hoạt tính tạo PHB của E coli tái tổ hợp bằng phương pháp nhuộm SBB.

Nguyên tắc: PHB bắt màu xanh đen với thuốc nhuộm SBB [30].

Vi khuẩn được cấy sáu điểm trên đĩa petri đựng môi trường 707 Sau 48 giờ, kiểm tra hoạt tính tạo PHB của vi khuẩn bằng cách nhuộm với SBB (0,02%).

Thuốc nhuộm SBB 0,02% được đổ ngập mặt thạch Sau 30 phút, rửa bằng cồn 96% để loại bỏ thuốc nhuộm thừa Các khuẩn lạc bắt màu xanh đen với SBB biểu thị sự hiện diện của PHB trong tế bào [30].

2.4.1.3Xác định khối lượng khô tếbào. Ống eppendorf 1.5 mL được sử dụng để xác định trọng lượng khô tế bào Các ống eppendorf này được sấy khô ở 90C trong 24 giờ, để nguội, cân khối lượng ống (g).

Thu 1 mL mẫu và đem đi ly tâm (6000 rpm, 15 phút), thu nhận pha rắn.

Rửa pha rắn với nước cất và tiếp tục ly tâm để thu hồi lại pha rắn Làm khô sinh khối thu được đến khi khối lượng không đổi (90C, 24 giờ) Khối lượng sinh khối khô là hiệu số giữa khối lượng ống eppendorf mang mẫu với khối lượng eppendorf ban đầu [9].

2.4.1.4Xác định PHB trong tếbào bằng phương pháp nhuộm huỳng quang.

Nguyên tắc: khi nhuộm Nile Blue A, các hạt PHB trong tế bào bắt màu cam sáng dưới ánh sáng huỳnh quang ở bước sóng 460 nm [30].

Phương pháp nhuộm: Lam kính chứa vết tế bào vi khuẩn được nhuộm với Nile blue A 1% ở 55C trong 10 phút Tiếp theo, rửa lam với nước cất rồi rửa vết bằng acid acetic 8% trong 1 phút Rửa lại bằng nước cất và dùng giấy thấm thấm khô Để quan sát,làm ẩm vết nhuộm, dùng lamen đậy lên vết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng 460 nm [8].

2.4.2 Xử lý mật rỉ đường

Hòa tan rỉ đường với nước theo tỉ lệ 1:1 rồi chuẩn độ pH dung dịch đến 1,5 bằng H 2 SO 4 98% Đun sôi dung dịch trong 30 phút để thủy phân bã hữu cơ Để nguội rồi dùng Ca(OH) 2 để chuẩn độ pH dung dịch đến 7-7,5 Để yên dung dịch trong 12 giờ để lắng tủa Lọc bỏ tủa và đưa đi hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút Phân tích thành phần rỉ đường tại trung tâm đo lường chất lượng 3 (Quatest 3).[14]

Mật rỉ đường + Nước (TL1:3)

Chuẩn pH dung dịch đến 1,5 bằng H 2 SO 4 98%

Hấp khửtrùng Để nguôi đến 60 0 C (121 0 C, 1atm)

Chuẩn pH dung dịch Đểlắng tủa trong 12h Ly tâm loại tủa đến 7.5 bằng Ca(OH) 2 (6000rpm,10 phút)

Hình 2.5 Sơ đồ phương pháp xử lí mật rỉ đường[14]

2.4.3 Tối ưu hóa các thông số dinh dưỡng cho sản xuất PHB bởi cho E coli DH5α mang operon phbCAB. Để tối ưu hóa môi trường lên men tạo PHB, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của 8 yếu tố là nguồn Carbon, nồng độ Carbon, Nguồn nitrogen, nồng độ nitrogen, nồng độ phosphorus, Khoáng vi lượng, tỉ lệ giống, thời gian lên men và pH môi trường đối với sinh trưởng và sinh tổng hợp PHB ởE ColiDH5α mang operon phbCAB 4985.

Chuẩn bị mẫu tiếp giống, E coli được cấy vào erlen 250 mL chứa 100 mL môi trường 707 Erlen được đặt trên máy lắc (tốc độ 150 rpm, 30C) trong 24 giờ theo AzharA.El-Sayed và cs (2009).

Cấy dịch môi trường vào trong các erlen chứa 150 ml môi trường lên men, đậy kín miệng erlen bằng nút cao su có gắn ống dẫn khí và thoát khí Môi trường lên men sử dụng nguồn carbon là mật rỉ đường mía sẽ được thay đổi các thông số về dinh dưỡng và điều kiện môi trường để tối ưu hóa quá trình sản xuất PHB.

2.4.3.1 Khảo sát nguồn carbon thích hợp.

Thay thế nguồn carbon trong môi trường MSM sửa đổi bằng các cơ chất khác nhau, đó là glucose (1%), fructose (1%), lactose 1g/L (1%), sucrose1g/L (1%), maltose 1g/L (1%), xylose 1g/L (1%), glycerol 1g/L (1%), mật rỉ đường 120gram/lit (12 %) và acid oleic 1g/L (1%) Sau khi tuyển lựa nguồn tối ưu, E coli tái tổ hợp được tăng sinh trên môi trường MSM có sửa đổi với những nồng độ khác nhau của nguồn carbon được lựa chọn (1,0; 1,5; 2; 2,5 ,12 %).

2.4.3.2 Khảo sát nguồn nitrogen thích hợp.

Thay thế NH 4 Cl 0,05% bằng các nguồn đạm vô cơ khác với nồng độ tương đương, đó là (NH 4 NO 4 ), (NH 4 ) 2 HPO 4 , (NH 4 ) 2 SO 4 Sau đó, E coli tái tổ hợp được tăng sinh trên môi trường MSM có sửa đổi với những nồng độ khác nhau của nguồn nitro được lựa chọn 0,005; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 4 g/L (0,005; 0,1; 0,5; 1; 1,5; 2; 4 %).

2.4.3.3 Khảo sát nguồn phosphate thích hợp.

Nguồn phosphate được nghiên cứu là cặp chất KH 2 PO 4 – K 2 HPO 4 dùng phối hợp, với các nồng độ (tính theo g/l) là: 1 – 1; 2 – 2; 4 – 4; 1 – 2; 1 – 4; 1 – 8; 2 – 1; 2 – 4; 2 – 8; 4 – 1; 4 – 2; 4 – 8.

2.4.4 Tối ưu hóa môi trường PHB theo ma trận Plackett – Burman và phương pháp RSM–CCD

Lên men thử nghiệm mô hình tối ưu được thực hiện với quy mô 150ml nuôi cấy sục khí và 1,5 l trên bình lên men Bioflo 110 Bioreactor (New Brunswick Scientific, USA) Nồi lên men được điều khiển tự động ở pH 7.0, nhiệt độ 30 o C, nồng độ Oxygen hòa tan (DO) 25%, tốc độ cánh khuấy tự động.

Ma trận Plackett-Burman dùng trong thực nghiệm tối ưu hóa có 12 thí nghiệm và8 yếu tố: mật rỉ đường, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , pH, tỉ lệ tiếp giống, thời gian lên men, nồng độ khoáng vi lượng Sau khi sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng chính đến sản lượng sinh khối và PHB, kế hoạch hóa thực nghiệm được thực hiện theo RSM- CCD.

Dùng phần mềm Design Expert 7.0.0 (Plackett Burman), excel, phân tích ANOVA để xử lý số liệu [32].

2.4.4.1Phương pháp xác định điều kiện hóa lý thích hợp để chủng E coli tái tổ hợp lên tạo PHB tối ưu từ cơ chất mật rỉ đường quy mô 150 ml bằng phương pháp ma trận thực nghiệm.

2.4.4.1.1 Chọn lọc yếu tố môi trường đểtối ưu hóa lên men E coli tái tổhợp tạo PHB

Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng Tuy nhiên, việc tiến hành thí nghiệm theo phương pháp truyền thống để tìm ra sự ảnh hưởng của các yếu tố cần rất nhiều thời gian Thiết kế sàng lọc yếu tố thí nghiệm bằng phương pháp Plackett–Burman giúp tìm ra yếu tố thí nghiệm ảnh hưởng nhất đến chỉ tiêu theo dõi, qua đó loại bỏ bởi các yếu tố thí nghiệm và giảm đáng kể thời gian thí nghiệm Vì vậy, đối với quy mô bài nghiên cứu, các yếu tố thí nghiệm được chọn sẽ được xử lý bằng phần mềm Design–Expert 7.0.0, theo thiết kế ma trận Plackett – Burman nhằm tìm ra 3 yếu tố ảnh hưởng nhất đến sinh khối và hàm lượng PHB của vi khuẩn này.[35]

Qua các tài liệu thu thập của các nghiên cứu (bảng PL1) chúng tôi nhận thấy các yếu tố: Glucose, (NH4) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , K 2 HPO 4 , pH, tỷ lệ giống, thời gian nuôi, khoáng vi lượng là những thành phần ảnh hưởng rất lớn đến quá trình nuôi cấy, thu nhận số lượng tế bào và lượng PHB của vi khuẩn Tuy nhiên để tận dụng nguồn phụ phẩm từ ngành sản xuất đường hiện nay là nguồn mật rỉ đường, sau khi phân tích thành phần của mật rỉ đường chúng tôi nhận thấy rằng hàm lượng đường glucose trong mật rỉ tương đối cao (18,5%) và một số khoáng chất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn.

Xử lý và phân tích số liệu

Phân tích thống kê bằng chương trình Design–Expert, Anova, Excel Các chỉ số đưa ra trong quá trình phân tích: tỷ lệ phần trăm, giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, p.

Cấy chuyền giữ giống trong ống nghiệm (có bổ sung Ampicillin), cấy trên đĩa thạch để quan sát khuẩn lạc (có bổ sung Ampicillin), nhuộm Sundan Black B quan sát dưới kính hiển vi để xác định PHB trong tế bào.

Giống vi khuẩn E.coliDH5α mang operon phbCAB

Cấy giống từ môi trường tăng sinh sang bình lên men

Cấy tăng sinh trong môi trường 707 có bổ sung glucose

Sau khi cấy truyền giữ giống, tiếp tục cấy tăng sinh trên môi trường 707 (có bổ sung Ampicillin) lỏng, lắc ở 160rpm trong 24h, để tế bào đạt mật độ 10 6

Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lập lại ở quy mô lên men 150ml, với các thông số: pH, nguồn carbon, nguồn ni tơ, tỉ lệ giống, thời gian lên men, nồng độ khoáng vi lượng, nguồn muối phosphate…

Môi trường lên men có bổ sung mật rỉ đường đã xử lý bằng H 2 SO 4 , với các nồng độ khác nhau (sử dụng ma trận Plackett Burman để thiết kế các thí nghiệm xác định các yếu tố môi trường lên men: pH, nồng độ rỉ đường, nguồn ni tơ thích hợp, nồng độ ni tơ thích hợp, nồng độ K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , tỉ lệ giống, thời gian lên men, nồng độ khoáng vi lượng.

Xác định được các thông số tối ưu của môi trường lên men Áp dụng các thông số tối ưu của môi trường lên men ở quy mô 150ml lên hệ thống bioreactor 1,5l, sục khí O 2 với Oxy hòa tan được duy trì ở 10% độ bão hòa không khí trong quá trình lên men, nhiệt độ phòng 35 0 C, thởi gian lên men 48h, tỉ lệ giống 5%

Thử nghiệm lên men trên bioreactor

Khảo sát phương pháp tách chiết và tinh sạch PHB, định tính PHB…

Khảo sát các phương pháp tách chiết thu hồi PHB từ sinh khối tế bào

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Kết quả khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống vi khuẩn

Trên môi trường thạch đĩa, khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng nhạt, trơn bóng, kích thước 2-5 mm sau 48 giờ nuôi cấy Khi nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 60X, vi khuẩn dạng hình que bắt màu hồng của thuốc nhuộm fuchsin.

Hình 3.1 Khuẩn lạcE.Coli tái tổhợp (A) và hình dạng tế bào E.Coli tái tổhợp (B)

Chúng tôi tiến hành nhuộm Sudan Black B để kiểm tra nhanh khả năng tạo PHB của vi khuẩn.Khuẩn lạc E Coli tái tổ hợp bắt màu xanh đen (Hình 3.2) cho thấy có sự hiện diện của các hạt PHB trong tế bào, chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nên PHB.

Hình 3.2 Kết quả nhuộm Sudan Black B

A Trước khi nhuộm B Sau khi nhuộm

Kết quả xây dựng đường chuẩn PHB

Để định lượng PHB trong sinh khối vi khuẩn, chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn tương quan tuyến tính giữa hàm lượng PHB chuẩn theo giá trị mật độ quang OD 235 Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Tương quan giữa hàm lượng PHB chuẩn và giá trị OD 235

Hàm lượng PHB (àg/mL) OD 235

Biểu đồ 3.1: Đường chuẩn hàm lượng PHB

Kết quả phân tích cho thấy đường chuẩn là đường tuyến tính theo phương trình hồi qui y = 0.1391x - 0.0178, với r 2 = 0,9515, trong đó, y là giá trị OD 235 , x là hàm lượng PHB (àg/mL).

Khi xây dựng phương trình hồi quy, r 2 là hệ số được dùng để đánh giá mức độ chính xác của mô hình hồi quy so với các giá trị thí nghiệm.Giá trị r 2 thường nằm trong khoảng 0F– số liệu có ý nghĩa về mặt thống kê trình bày bảng 3.8) với mức ý nghĩa α= 0,1 để thực hiện thí nghiệm RSM – CCD.

Kết quả tinh sạch và xác định tính chất hóa, lý của polymer sinh học PHB

3.4.1 Tinh sạch bằng NaClO và chloroform

Sau khi xử lý NaClO và chloroform chúng tôi được kết quả như bảng 3.10.

Bảng 3.9: Độtinh sạch PHB được xửlý bằng sodium hypochlorite và chloroform

Hàm lượng PHB trong sinh khối (g/l) 0,181 0,172 0,156

Khối lượng sinh khối khô (g/l) 2,58g/l

Mẫu PHB được thu hồi sau khi chiết đạt 26,29% sau khi tinh sạch thu được bột PHB có độ tinh sạch khoảng 20,93% Phổ hồng ngoại của hai mẫu cho thấy giữa mẫu tinh khiết và không tinh khiết không có sự khác biệt ở đỉnh carbonyl đặc trưng của PHB tại 1726cm -1 (hình 3.5, 3.6) Nucleic acid và amino acid thơm hấp thụ ở khoảng 275nm được nhận diện là các tạp chất đi theo.

3.4.2 Nghiên cứu tính chất hóa lý của PHB thu được

3.4.2.1 Kết quả xác định khối lượng phân tử PHB thu được

Khối lượng phân tử của của các polymer là một trong những chỉ số đầu tiên được xác định để đánh giá chất lượng sản phẩm thu hồi PHB thu được từ vi khuẩn E coli trong nghiên cứu này được xác định Mw có so sánh với chất chuẩn PHB Kết quả hình 3.5 và 3.6 cho thấy đỉnh hấp thu của 2 mẫu gần tương đồng nhau và nằm ở sai số cho phép Không xuất hiện các đỉnh hấp thu mới trong phổ hồng ngoại của PHB thu từ E. coli Mẫu PHB chuẩn của Sigma và PHB thu được từE coli tái tổ hợp điều nằm ở dạng bột, do đó ta có thể kết luận khối lượng phân tử của hai mẫu tương tự nhau.

Hình 3.5: Phổhồng ngoại của PHB chuẩn Sigma

Hình 3.6: Phổhồng ngoại của PHB thu được từE coli tái tổhợp

3.4.2.2 Các tính chất hóa lý khác

Ngoài việc xác định khối lượng phân tử như là chỉ số quan trọng đầu tiên, PHB thu được từ vi khuẩn E coli tái tổ hợp cũng được đánh giá một số chỉ tiêu hóa lý khác xem bảng 3.11 Bên cạnh đó, chúng tôi còn thực hiện khảo sát các chỉ tiêu về hàm lượng kim loại nặng trong PHB.

Bảng 3.10: Hàm lương kim loại năng ởPHB tách chiết từE coli.

Hàm lượng kim loại nặng

Mức giới hạn cho phép theo QCVN 8-