Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Ảnh hưởng của hydroxymethylfurfural đến khả năng lên men ethanol của kluyveromyces marxianus cố định trong gel alginate

- - Xác định mức độ ảnh hưởng của HMF đến sự thay đổi thành phan acid béo trongmang tế bao chất của nâm men có định trong gel alginate và nâm men tự đo.- _ Xác định khả năng tái sử dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYEN HỎNG PHƯƠNG THẢO

ANH HUONG CUA HYDROXYMETHYLFURFURALDEN KHA NANG LEN MEN ETHANOL CUA

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GS.TS Lê Văn Việt Mẫn

PGS.TS Hoàng Kim Anh

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngànhsau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

CHỦ TỊCH HOI DONG TRƯỞNG KHOA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập- Tự do- Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VAN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Hồng Phương Thảo MSHV: 1570441

Ngày sinh: 01/01/1992 Nơi sinh: Sóc Trăng

Chuyên ngành: Công nghệ Thực Phẩm Mã số: 60540101I Tên đề tài

ANH HUONG CUA HYDROXYMETHYLFURFURAL DEN KHẢ NANG LÊNMEN ETHANOL CUA KLUYVEROMYCES MARXIANUS CÔ ĐỊNH TRONG GEL

ALGINATE.II Nhiệm vu và nội dung

- Xac định mức độ ảnh hưởng cua HMF đến sự sinh trưởng và khả năng lên menethanol của nấm men Kluyveromyces marxianus cô định trong gel alginate vànam men tự đo.

- - Xác định mức độ ảnh hưởng của HMF đến sự thay đổi thành phan acid béo trongmang tế bao chất của nâm men có định trong gel alginate và nâm men tự đo.- _ Xác định khả năng tái sử dụng của nắm men có định trong gel alginate trong môi

trường lên men có chat ức chê HMF

Ill Ngày giao nhiệm vụ01/12/2016

IV Ngày hoàn thành nhiệm vụ01/12/2017

V Cán bộ hướng dẫnGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

PGS.TS Hoàng Kim Anh

GS.TS Lê Văn Việt Mẫn GS.TS Lê Văn Việt Man

PGS.TS Hoàng Kim Anh

Trưởng khoa Kỹ Thuật Hóa Học

Đầu tiên, em kính gửi lời cảm on sâu sắc đến GS.TS Lê Van Việt Man va PGS.TSHoàng Kim Anh đã giúp đỡ, hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em cóthể hoàn thiện luận văn này.

Kế đến, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ Thực phẩmđã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức cần thiết và bố ích dé giúp em hoàn thiện

chuyên môn và bản thân hơn.

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã ủng hộ, động viên, giúp đỡ emcó đủ niềm tin để hoàn thành luận văn

Em cũng không quên gửi lời cảm ơn đến NCS Nguyễn Thanh Sang và bạn Lưu HồYến Ngọc đã đồng hành và hỗ trợ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng 01 năm 2018

Học viên thực hiện

Nguyễn Hồng Phương Thảo

Trong nghiên cứu này, quá trình lên men ethanol của nấm men K/yveromyœsmarxianus cô định trong gel alginate và nắm men tự do được khảo sát trong điều kiện môitrường lên men có nồng độ HMF thay đổi (1, 2, 3, 4 và 5g/L) Nam men cố định và nammen tự do được tái sử dụng ở nông độ HMF 2g/L Khi tăng nồng độ HMF từ 0 lên 5g/L,tốc độ sinh trưởng của nấm men cố định và nắm men tự do giam lần lượt là 1.54 lần và 1.59lần, mật độ tế bào cực đại của nắm men cố định và nắm men tự do giảm lần lượt là 2.68 lầnvà 4.29 lần; nằm men có định có thé lên men cạn kiệt đường trong khi đó nấm men tự dochỉ có thé sử dụng cạn đường khi HMF tăng từ 0 lên Ig/L Trong các nghiệm thức đượckhảo sát, ndm men cố định đều thể hiện kha năng sinh trưởng, sử dụng cơ chất và sinh tonghop ethanol cao hơn so voi nắm men tự do Qua trình cố định K/uyveromyces marxianustrong gel alginate làm giảm độ bất bão hòa chất béo của mang tế bào và thay đổi này có thégiúp tế bào nam men cố định đáp ứng tốt hơn với chất ức chế HMF so với nắm men tự do.Nắm men cố định tái sử dụng và duy trì hoạt tính lên men ồn định qua 30 chu kì lên men,nam men tự do không tái sử dụng do thời gian lên men dai.

il

In this study, the fermentation of immobilized K/uyveromyces marxianus in calciumalginate gel and free cell was investigated under different HMF concentration of 1, 2, 3, 4and 5g/L The immobilized and free cells were also used for repeated batch fermentation at2 g/L HMF When increasing the HMF concentration from 0 to 5 g/L, the growth rate ofthe immobilized cell and free cell decreased was 1.54 times and 1.59 times, the maximumcell density decreased was 2.68 and 4.29 times; the residual sugar level in the culture outletof immobilized cell was approximately 5 g/L, while the residual sugar level in the cultureoutlet of free cell only was approximately 5g/L from 0 to Ig/L HMF At all investigatedconditions, immobilized cell always demonstrated faster growth rate, glucose uptake rateand ethanol formation rate than free cell The immobilized process of Kluyveromycesmarxianus in calcium alginate gel decrease the unsaturation degree of fatty acids in cellularmembrane of Kluyveromyces marxianus cell and that improved adaption of the yeast toenvironmental stress than free cell In the repeated batch ethanol fermentation, theimmobilized cells was used and maintained stable fermentation activity over 30fermentation cycles.

lil

Tôi xin cảm đoan đây là nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu vàcác kết luận trong luận văn này là trung thực và không sao chép từ bất kỳ nguồn nao vàdưới bất cứ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫnvà phi nguồn tài liệu tham khảo theo đúng quy định.

Tác giả luận văn

Nguyễn Hồng Phương Thảo

iv

DANH MỤC HÌNH 55:2 2222 th HH HH ườn viii0:(090160089//002.//1000000nn8n8n88 jCHƯƠNG 2: TONG QUANievccsecsessessessessecsessesssssessecressessessssussussussussussssussussussursaessesressessveaeesees 32.1 Nắm men Klyveromyces MAPXICNUS eccecceccessessessessessessessecscsvssusssesusssesessstesteressessesseeseeaee 3

VN Nt ng: anhẶd 3

2.1.2 Kha năng chịu ức chế của nắm men Kluyveromyces HAF.XỈAWM3 4

2.1.3 Khả năng ung dụng cua Kluyveromyces marxianus trong lên men ethanol 6

2.2 ChGt tec ChE HMP ờỚÿỹÿỹÿỹNNếG a ố ố 8

2.2.1 Su hinh thatnh HMP Voice ccccccccccssccccceccessscccccessstseccesssstsccccesssstscecccestaceccessettasceeseees ổ2.2.2 Sự ức chế của HMF đối với tế DAO NGM MEN vevecccccscsccscscsvesescscssssesestsveressssevsresessens ổ2.2.3 Kha năng chuyên hóa HMF nắm men Kluyveromyces IHAFXỈAWM3 - 9

2.3 Kha năng lên men của nắm men cô định trong môi trường có các chất ức chế l ]2.4, Diém M65 CU AE ổn na 12

CHƯƠNG 3 NGUYEN LIEU VA PHƯƠNG PHAP NGHIÊN CỮỬU 13

B.D 217.154: 13An l5 na 13

2s 71 13

3.1.3 Chất mang Algindte ciccecccccccccccsccssceccessecsecsecsecsessessessessessessucsussessessussssussussuvsaeseseesen 13BDA, 0i , ae 133.2 Mục đích và nội dung HnghiÊH CUU ác 112312111111 198 118111 118 111 11x trệt 14SN 0Nnïnïớ"ớ"ớ"ớớAẽaẽud ăă.c 14

3.2.2 Ouy trình có định nắm men trong gel AIZiNAtC eececcecsccsessessvsssesseeseeeeseeseeseeseen 14

3.2.4 Phương pháp PRGn tach cocccccccccccccccccccccccccsccssccsscessccsecesecsssessecescessecssesesecssseseseseenses 183.2.5, Công thc tinh OG ceccccccccccccccccccccsccsccscsesescesseeseeesecesecssesssessssessessecsssesseeseseseenses 19

3.2.5 Phương pháp xử li số li@teeceeccecccccsccsssessessessessessessecsessesssscsssessussussussussussuseeeeseeseee 20CHUONG 4 KET QUA VÀ BAN LUAN icsccccsssessesssessessssssessessessssssssscssesseceusescsussussresseceveeeen 224.1 Ảnh hưởng của nông độ HME lên sự sinh trưởng va kha năng lên men của nammen Klyveromyces marxianus cô định trong gel qÌgifdf€ -cccccctcctteEerterkrrrees 22

4.1.1 Anh hưởng của nông độ HMF đến quá trình sinh trưởng của nam men cô

7;/0005/000n0Ẽ0178e8 32

Mới

Bảng 2 1: Một số yếu tố ức chế sự sinh trưởng và sinh tổng hop ethanol của nắm men

KI] UyVerOMYyCeS MALXIANUS 00005757 5

Bang 2 2: Một số nghiên cứu về sử dung nắm men Kluyveromyces marxianus tao ethanoltừ phụ phẩm ngành công nghiỆp - EE£E*E*+E*+E+ESEEEEEEEEEEEEEEEvEkerkerkerkerkee 7Bang 3 1: Thành phan của các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứu 14Bảng 4 1: Ảnh hưởng của HMF đến quá trình sinh trưởng của nắm men cố định trong gelalginate và nắm men tỰ dO - - S®SE£Ek* +99 E1 E111 1111111111 1111111 24Bảng 4.2: Ảnh hưởng của HMF đến lượng đường sót và độ lên men của nắm men cố địnhtrong gel alginate và nâm men tự do ở thời điểm 96 giờ - 2-2 se eerereeei 28Bảng 4.3: Ảnh hưởng của HMF đến thời gian kết thúc lên men và tốc độ sử dụng đườngcủa nắm men cố định trong gel alginate và nắm men tự đo - 5 s2 s sex 29Bảng 4 4: Ảnh hưởng của HME đến nồng độ ethanol cuối và tốc độ sinh tổng hợp ethanolcủa nắm men cố định trong gel alginate và nắm men tự đo s- 5 s2 s se 32Bảng 4 5 : Ảnh hưởng của HMF đến hiệu suất sinh tổng hop ethanol của nấm men có địnhtrong gel alginate và nâm men tự dO 2 + EEEEEEEEEE£EEEEEEEEEEkEEeEereereerkrrs 33Bảng 4 6: Thời gian lên men trong quá trình tái sử dụng nắm men cố định 38Bảng 4 7: Hàm lượng ethanol cuối trong canh trường với nam men cố định và nấm men tự

do trong quá trình tái SỬ Ụng - <5 553112118931 193 39331811111 181 1111811811811 g1 kg 39

Bảng 4 8: Hiệu suất sinh tổng hop ethanol của nắm men cô định và nắm men tự do 40

Vil

Hình 2 1: Mối quan hệ của Kluyveromyces marxianus với mốt số loại nắm men khác

men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanol 5+5 «++<s++s++s+zesss 23

Hình 4 2: Ảnh hưởng của HMF đến quá trình sử dụng cơ chất của nắm men cố định ( À - ) và nắm men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanol -s- «+: 27Hình 4 3: Ảnh hưởng của HMF đến quá trình sinh tổng hop ethanol của nắm men cố định(- - A- - ) và nắm men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanol 31Hình 4 4: Sự thay đổi tỉ lệ hàm lượng của acid palmitic (C16:0) trong màng tế bao chat của

-nam men cố định (- - Á - - ) và nắm men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanolHình 4 5: Sự thay đổi tỉ lệ hàm lượng của acid stearic (C18:0) trong màng tế bào chất củanam men cố định (- - Á - - ) và nắm men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanolHình 4 6: Sự thay đổi tỉ lệ hàm lượng của acid palmitoleic (C16:1) trong màng tế bào chatcủa nam men cố định (- -À- - ) và nấm men tự do (—m—) trong quá trình lên men

S001 35

Hình 4 7: Sự thay đổi tỉ lệ hàm lượng của acid oleic (C18:1) trong màng tế bao chất củanắm men cố định (- - Á - - ) và nấm men tự do (—m—) trong quá trình lên men ethanol

Vill

nắm men cô định (- - Á - - ) va nắm men tự do (—=—) trong quá trình lên men ethanolHình 4 9: Sự thay đổi độ bất bão hòa của acid béo trong màng tế bao chất của nắm men cốđịnh (- - À - - ) và nắm men tự do (——m—) trong quá trình lên men ethanol 36

Ix

ADH Alcohol dehydrogenaseALDH Aldehyde dehydrogenaseATP Adenosin triphosphate

CD Có định

DNS 3,5- dinitrosalicylic acidEDTA Ethylenediamine tetraacetic acid disodiumFDM Furan-2,5- dimethanol

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide dang khửNADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate dạng khử

PDH Pyruvate dehydrogenase

TD Tu do

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANH

CHUONG 1: GIỚI THIEU

Lên men ethanol là quá trình nắm men chuyển hóa các loại đường đơn giản (phô biếnnhất là đường glucose) thành ethanol và carbon dioxide Bản chất của quá trình lên men làsinh tổng hop năng lượng cho tế bào nấm men trong điều kiện không có oxy Ngày nay,ethanol được sản xuất chủ yếu là băng phương pháp lên men và ethanol được ứng dụngrộng rãi trong cuộc sống

Trước day, người ta chỉ tiến hành lên men ethanol với nắm men tự do vì quy trình vậnhành đơn giản Nhược điểm của phương pháp nay là giống nắm men chi sử dụng được chomột mẻ lên men, quá trình ly tâm tách nắm men ra khỏi dịch lên men tốn nhiều năng lượngnên chi phí cao (Vasconcelos và cộng sự, 2004) Dé khắc phục những nhược điểm đó, cácnhà khoa học đã tìm ra giải pháp có định nấm men lên chất mang Tế bào cố định có hoạttính 6n định khi lên men trong môi trường không thuận lợi như pH thấp, nhiệt độ cao, áplực thâm thấu cao hoặc môi trường có chất ức chế Ngoài ra, tế bào cố định có thé tái sửdụng cho nhiều mẻ lên men (Banat và cộng sự, 1998; Kocher và cộng sự, 2006) và quatrình tách tế bào ra khỏi dịch lên men rất đơn giản (Behera và cộng sự, 2010; Razmovskivà Vušurovié, 2011) Có bốn nhóm phương pháp cố định tế bào bao gồm hấp phụ, tạo liênkết cộng hóa tri, tạo liên kết ngang và đóng gói (Kourkoutas và cộng sự, 2004) Mỗi nhómphương pháp đều có những lợi thế và nhược điểm riêng Phô biến nhất hiện nay là phươngpháp đóng gói tế bào trong gel vì quy trình cố định đơn giản, chi phí thấp, hiệu suất cô địnhcao và hoạt tính của tế bào ổn định (Behera và cộng sự, 2010) Có nhiều loại chất mang đãđược dùng để có định nắm men, trong đó alginate canxi là chất mang đã được thương maihóa và sử dụng nhiều nhất trong công nghiệp lên men (Zhou và cộng sự, 2010; Bangrak và

cộng sự, 2011).

Trên thé giới, đến nay nắm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như là giốngvi sinh vật chủ lực trong quá trình lên men Gan đây, nắm men K/uyveromyces marxianusđược nhiều nhà khoa học và nhà sản xuất chú ý vì có khả năng lên men ethanol ở nhiệt độcao 35-52°C nên hạn chế được sự phát triển của các vi sinh vật nhiễm trong quá trình lên

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 1

men, đồng thời giảm chi phi năng lượng làm mát cho các thiết bị lên men (Limtong và cộng

sự, 2007; Abdel-Banat và cộng sự, 2010).

Nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất ethanol hiện nay là sinh khối do sản lượnglớn và giá thành rẻ Quy trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu lignocellulose gồm cóbốn giai đoạn chính: tiền xử lý sinh khối, thủy phân các polysaccharides thành các đườnglên men, lên men đường thành ethanol và chưng cất để thu ethanol Tiền xử lí là một giaiđoạn quan trọng dé phá vỡ cau trúc nguyên liệu đặc biệt là phá vỡ cấu trúc tinh thé cellulosegiải phóng ra các sợi polysaccharide ở dạng don, tăng khả năng tiếp cận của enzyme với cơchất dé thủy phan polysaccharide thành các đường lên men (Alvira và cộng sự, 2010) Quátrình tiền xử lý nguyên liệu giàu cellulose sinh ra nhiều hợp chất ức chế giống nắm mennhư là các dẫn xuất của furan, các acid hữu cơ và các hợp chat phenolic (Chandel và cộngsự, 2010), trong đó hydroxymethylfurfurol (HMF) là một trong những chất ức chế làm giảmmạnh khả năng lên men ethanol của nắm men (Liu và cộng sự, 2008)

Nghiên cứu này đánh giá sự sinh trưởng và hoạt tính lên men của nấm menKluyveromyces marxianus cô định trong gel alginate trong môi trường có chất ức chế HMF,từ đó so sánh với khả năng lên men của nắm men tự do Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đềcho những nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo để có thé tiến tới sử dụng nấm menKluyveromyces marxianus cỗ định trong quy trình lên men sản xuất ethanol công nghiệp

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 2

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANH

CHUONG 2: TONG QUAN

2.1 Nam men Alyveromyces marxianus2.1.1 Giới thiệu

Hiện nay trong công nghiệp lên men ethanol, nắm men Saccharomyces cerevisiae làloài vi sinh vật được sử dụng phô biến nhất Lên men ethanol là một quá trình tỏa nhiệt nênnhiệt độ của canh trường có thé tăng đến 45-50°C va gây ức chế giống nắm men (Liang vacộng sự, 2008) Các nhà sản xuất phải sử dụng tác nhân lạnh để làm mát canh trường do

Saccharomyces cerevisiae chỉ lên men hiệu qua trong khoảng nhiệt độ 30-35°C (Eladpum

và cộng sự, 2012) K/uyveromyces marxianus lanam men chịu nhiệt và trở thành đối tượngtiềm năng để nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn sản xuất

Kluyveromyces marxianus có quan hệ gần với S cerevisiae và họ hàng với

Kluyveromyces lactis (Liorente và cộng sự, 2000) Khi xem xét sự sinh trưởng,

Kluyveromyces marxianus có tôc độ tăng trưởng nhanh nhất so với các vi sinh vật nhânchuẩn khác Vi dụ như tốc độ tăng trưởng của Kluyveromyces marxianus CBS 6566 là0.6/h (Groeneveld va cộng sự, 2009), trong khi đó tốc độ tăng trưởng của S cerevisiae K1

chỉ là 0.49/h (Helle và cộng su, 2003) Thời gian phân bào của Kluyveromyces marxianus

rất ngăn và chỉ xấp xi 70 phút (Lane va cộng sự, 2010) Kluyveromyces marxianus có khảnăng sinh trưởng và lên men ethanol ồn định trong khoảng nhiệt độ 35-40°C, đặc biệt nammen này van sinh trưởng được ở nhiệt độ lên đến 52°C Kluyveromyces marxianus có khảnăng lên men nhiều nguồn carbohydrate khác nhau như các loại đường pentose và hexose,đặc điểm này không có ở S cerevisiae (Lane và cộng sự, 2010) Các đường có thé đượcKluyveromyces marxianus lên men bao gồm glucose, fructose, galactose, xylose,

saccharose, maltose va lactose (Fonseca và cộng sự, 2008).

HVTH: NGUYEN HONG PHUONG THAO 3

Lactose Glucose Maximum

assimilation Inulinase Max fermentation temperature

Saccharomyces cerevisiae = = 0.37 + 35°CKluyveromyces aestaurii h - nla + 35°CKluyveromyces nonfermentans - - nla - 42°CKluyveromyces wikerhamii - - 0.43 + 37°CKluyveromyces lactis + 0.50 + 37°CKluyveromyces marxianus + + 0.60 + 52°CKluyveromyces dobzhanskii —- - nla + 35°C

Hình 2 1: Mỗi quan hệ của Kluyveromyces marxianus với mốt số loại nấm men khác

(Lane, 2010).

2.1.2 Khả năng chịu ức chế của nam men Kluyveromyces marxianusTrong quá trình lên men ethanol, có nhiều yếu tố ngoại cảnh và những biến đổi diễnra bên trong canh trường tác động đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp ethanol của nammen; các yếu tố này có thé tác động thuận lợi hoặc bất lợi cho sự sống của nắm men Nhữngyếu tố gay ra các tác động bất lợi đe dọa sự tồn tại của tế bào, hoặc ít nhất là làm giảm khảnăng hoạt động của tế bào, được gọi là yếu tố ức chế đối với tế bào (Hohmamn, 2003) Dướitác động của các yếu tố ức chế, dé có thé tiếp tục tồn tai, nam men cần có những biến đổinội bào để bảo vệ tế bào khỏi tác động của yếu tố ức chế, sửa chữa và phục hồi một sốthành phan của tế bào bị tốn thương và thích nghi dân, điều đó được gọi là khả năng đápứng của tế bào, hay khả năng chịu ức chế của nắm men

Dé có thé khai thác tối đa tiềm năng của nắm men K marxianus, các nhà khoa học đãtiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố ức chế đến quá trình sinh trưởng và khảnăng lên men ethanol của nấm men, xác định được khả năng chịu ức chế của K marxianus,từ đó thiết lập các thông số tối ưu cho quá trình lên ethanol từ các nguồn cơ chất khác nhau.Có 3 nhóm yếu tố gây ức chế tế bào nắm men là yếu tố vật lí, yếu tố hóa học và yếu tố sinhhọc Những yếu tố thường gặp như là sự thay đổi về nhiệt độ, pH, áp suất thâm thấu, sự cómặt của một số chất hóa hoc, tia bức xạ (Bang 2.1) Trong quá trình lên men ethanol, nam

men có thê chịu tác động của một hoặc nhiêu yêu tô ức chê cùng lic Kêt qua từ nhiêu

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 4

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANHnghiên cứu cho thay nấm men Kluyveromyces marxianus là nấm men chịu nhiệt hoạt tínhôn định trong khoảng nhiệt độ 30-40°C (Du Le và cộng sự, 2013), pH nấm men hoạt độngồn định là 5.0 (Limtong và cộng sự, 2007) Đối với lactose, khi tăng nồng độ từ 1-280g/Lthì lượng ethanol được sinh ra nhiều hơn, tuy nhiên lượng sinh khối tạo thành bị giảm đi(Silveira và cộng sự,2005) Đối với glucose khi nông độ cao hơn 200g/L thì tốc độ sinhtrưởng và sinh tổng hợp ethanol của nắm men bị giảm (Du Le và cộng sự, 2015).

Kluyveromyces marxianus có khả năng kháng HMEF (Oliva và cộng sự, 2003); tuy nhiên

khi nồng độ HMF tăng đến 2g/L thì tế bao bắt đầu bị ức chế (Sanchez và cộng su, 1988).Nhiều hop chất hóa khác cũng có thé ức chế Kluyveromyces marxianus Ví dụ nhưoctanoic nồng độ 16mg/L và decanoic nồng độ 8 mg/L, làm giảm tốc độ tăng trưởng củanấm men (Viegas và cộng su,1989), Catechol nông độ 0.95/L và 4-hydroxybenzaldehy de1,02 g/L làm giảm 50% lượng sinh khối khi so sánh với môi trường có chất ức chế (Oliva

và cộng sự, 2003).

Ảnh hưởng của sự kết hợp đồng thời của nhiều chất ức chế như acid acetic, furfural

va catechol lên Kluyveromyces marxianus cũng đã được nghiên cứu Sự tăng trưởng và sinh

ethanol của nắm men K/uyveromyces marxianus CECT 10875 bi ảnh hưởng đáng kế bởi sựtương tác của ba hợp chất trên, trong đó furfural làm giảm mạnh tốc độ tăng trưởng củanam men (Oliva và cộng sự, 2006) Các acid yếu như acid acetic và acid formic làm giảmmạnh lượng sinh khối của tế bào (Oliva và cộng sự, 2003, 2006)

Bang 2 1: Một số yếu tổ ức chế sự sinh trưởng và sinh tong hop ethanol của nam men

Kluyveromyces marxianusYêu tô ức chê Tác giảNhiệt độ cao Rodrussamee va cộng sự (2011), Du Le và cộng sự (2013), Nathalia

và cộng sự (2015), Nachaiwieng va cộng sự (2015)

Áp suất thâm thấu | Margaritis và Bajpai (1983), Silveira và cộng sự (2005), Du Le và

cộng sự (2015)

pH thấp Bajpai và cộng sự (1987), Limtong và cộng sự (2007)Nông độ Ethanol Bajpai và Margaritis (1982), Rosa và cộng sự (1992)

HME, Furfural Sanchez và cộng sự (1988), Oliva và cộng sự (2003.2006)

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 5

Hydrogen peroxide | Pinheiro và cộng sự (2002), Dellomonaco va cộng sự (2007)Acid béo Viegas và cộng sự (1989)

2.1.3 Kha năng ứng dung của Kluyveromyces marxianus trong lên men ethanol

Trong quá trình lên men ethanol, nam men K/uyveromyces marxianus có những đặcđiểm nỗi bật hơn so với những vi sinh vật khác, khả năng chịu nhiệt cao, khả năng sử dụngnhiều loại đường lên men nên nắm men K/wyyeromyces marxianus ngày càng được nhiềunhà khoa học và nhà sản xuất quan tâm, đặc biệt là khi sử dụng sinh khối từ các phụ phẩmcông nông nghiệp để sản xuất ethanol

Trước đây phan dich whey được xem là chất thải trong ngành sản xuất phô mai và cầnphải được xử lí Hiện nay dịch whey được sử dụng làm cơ chất cho sự phát triển củaKluyveromyces marxianus dé sản xuất ra sinh khôi hoặc sản xuất ethanol (B.Das và cộngsự, 2016) Sinh khối nam men Kluyveromyces marxianus có thé được sử dụng làm thức ăncho động vật hoặc làm sản phẩm chiết xuất sử dụng trong chế biến thực phẩm công nghiệp.Khi sản xuất ethanol từ whey, lượng ethanol tối đa có thé thu được sẽ là 80g/L khi nồng độlactose ban dau là 170g/L (Silveira, 2005) Đến nay có nhiều công bố khoa học thử nghiệmsử dung Kluyveromyces marxianus dé sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose Trong

nghiên cứu của Nachaiweng và cộng sự (2015), Kluyveromyces marxianus được sử dụng

lên men ethanol từ nguyên liệu vỏ trâu Với nhiệt độ lên men là 43°C, lượng ethanol thuđược là 15.63 g/L Tương tự, nim men Kluyveromyces marxianus cũng được thử nghiệmđể sản xuất ethanol từ vỏ cam (Wilkins và cộng sư, 2007), vỏ khoai môn (Wei và cộng su,2016),rơm lúa mì (Moreno và cộng sự, 2013), bã hạt điều (de Barros và cộng sự,2017)

Các phương pháp lên men ethanol khác nhau cũng đã được khảo sát Bảng 2.2 giới thiệu

mốt số kết quả nghiên cứu sử dụng K/uyveromyces marxianus dé lên men ethanol từ phụphẩm của ngành công nghiệp

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 6

LUẬN VĂN TÓT NGHIỆP PGS.TS HOÀNG KIM ANH

Bang 2 2: Một sô nghiên cứu vê sử dụng nâm men Kluyveromyces marxianus tạo ethanol

từ phụ phẩm ngành công nghiệp

Hàm NhiệtNguyên , , lượng | do lên

liệu Gidng nam men | Phương pháp ethanol men Tác giả

(g/L) (oC)

Vỏ cam Kluyveromyces Lén men truc 15 37 Wilkins va cộng

marxianus tiép sự,(2007)Bã giây Kluyveromyces Lén men SSF 40 38 Madrid và cộng

marxianus ATCC [ và SHF su, (2011)36907

Rơm lúa | Kluyveromyces Lén men SSF 16.7 42 Moreno va cộngmi marxianus CECT | và PSSF sự,(2013)

Whey Kluyveromyces Lén men truc| 43.71 35 Das va cộng su,

marxianus NCIM | tiép (2016)

3217Ba hạt | Kluyveromyces Thuy phan va 58 40 de Barros và

diéu marxianus lén men déng cộng su,(2017)

ATCC36907 thoi (SSF)

HVTH: NGUYEN HONG PHUONG THAO 7

2.2 Chat ức chế HMF

2.2.1 Sự hình thành HMF

Hợp chất 5-hydroxymethylfurfural (HMF) là một sản phẩm phụ trong quá trình tiềnxử lí nguyên liệu lignocellulose Hợp chất này được hình thành bởi sự mat nước của hexosevà pentose (Ulbricht và cộng sự, 1984) Hình 2.2 giới thiệu khái quát về các hợp chất ứcchế giống nắm men được hình thành trong quá trình tiền xử lý lignocellulose Tùy theo loạinguyên liệu và điều kiện tiền xử lý mà các dẫn xuất furan khác nhau sẽ được tạo ra vớinhững nồng độ khác nhau (Almeida, 2007) Ví du, nồng độ HMF trong dịch thủy phân từvân sam có thé thay đổi từ 2,0 g/L -5,9 g/L tùy thuộc vào chế độ tiền xử lý với acid loãngmột lần (Larsson và cộng sự, 1999) hoặc hai lần (Nilvebrant và cộng sự, 2003)

Cellulose aN Lignin Wood extractives

l„—zz I

Gluc ose M: al Galacios iy yr Ari tbinc SC,

i)

OH |

a N ` A ( “SN

H Son H.CLevulinic acid 0 Formic acid Acetic acid

aldehyde dehydrogenase (ALDH) (Modig và cộng sự, 2002) Các enzyme này tham gia vào

quá trình giải độc rượu cho tế bào Khi có mặt của HMF, những enzyme trên bị ức chế nênethanol tích lũy trong tế bào ngày càng nhiều, từ đó tế bao bị ngộ độc và dần dan chết đi.HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 8

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANHCùng voi HME kết quả cho thấy fufural có khả năng ức chế enzyme ADH va PDH Tuynhiên, khả năng ức chế enzyme ADH của furfural mạnh hơn so với HME Ví dụ với nồngđộ 10mM HMF làm giảm 50% hoạt tinh xúc tác của ADH, nhưng nồng độ furfural tương

tự lại làm giảm hơn 90% hoạt tính của enzyme này (Modig va cộng sự, 2002).

Trong quá trình lên men ethanol, sản phẩm trung gian acetaldehyde cần NADH đểchuyên hóa thành ethanol Khi có mặt của HMF, NADH uu tiên khử HMF thành HDM, dođó NADH bị giảm dân từ đó gây tích tụ acetaldehyde bên trong tế bào chất Đây là lý dolàm cho pha tăng trưởng logarite của tế bào nấm bị trễ đi (Jones, 1989) Nắm men hấp thuHMF còn làm giảm nồng độ NAD(P)H (Palmqvist và cộng su, 1999) NADHP là coenzymecan thiết cho sự tổng hợp các acid amin va nucleotide, từ đó làm cho quá trình tổng hợpsinh khối và tăng trưởng tế bào bị trì hoãn (Taherzadeh và cộng su,2000, Liu và cộngsự,2004) Do ca NADH và NADHP đều tham gia vào chu trình đường phân và TCA, do đóHME còn tác động đến quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bao (Horvath và cộng sự,

2003).

Nói chung, HMF ức chế nắm men thông qua nhiều cơ chế khác nhau như làm giảmkhả năng tông hop năng lượng trong tế bào, làm giảm nồng độ ATP trong nội bao, ức chếmột số enzyme nội bào hoặc làm giảm nông độ một số cofactor (Almeida và cộng sự, 2007).2.2.3 Khả năng chuyển hóa HMF nắm men Kluyveromyces marxianus

Trong môi trường lên men có bố sung HMF, để có thể tồn tại và phát triển các tế bàonam men can biến đổi để thích nghi; quá trình biến đổi và thích nghi gồm có 2 cấp độ, đólà cấp độ tế bào và cấp độ phân tử

Ở cấp độ tế bào, nắm men chuyên hóa HMF thành các loại rượu ít độc hơn băng cáchsử dụng oxidoreductase và NAD(P)H hoặc NADH như là một yếu tố kết hợp, một quá trìnhtrao đôi chất xảy ra với tỷ lệ cao (Ask và cộng sự, 2013) Sự tái sinh của các cofactor thúcday quá trình sinh năng lượng bên trong tế bao va làm giảm nông độ các chất ức chế

(Taherzadeh va cộng sự, 1999; Ask và cộng sự, 2013).

Không giống như furfural có rất ít tài liệu về chuyển hóa HME ở nắm men Sản phẩmcuối cùng của quá trình chuyển hóa HMF ở nắm men Saccharomyces cerevisiae là 2,5-bis-hydroxymethylfuran, còn được gọi là furan-2,5-dimethanol (FDM) Hợp chất này khôngHVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 9

gây độc cho tế bao (Liu va cộng sự, 2004) Công thức hóa hoc FDM_ là CoHsOs, trọng

lượng phân tử là 128 (Z Lewis Liu, 2006).

Trong môi trường lên men có mặt HMF, tế bao nắm men có kha năng khử nhóm chứcaldehyde của HMF và HMF được chuyển hóa thành FDM, quá trình này cần sự tham gia

của NADH ( Liu và cộng sự, 2008) Còn theo nhận định của Wahlbom va cộng sự (2002)

thì quá trình khử HMF cân có cofactor là NADHP Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác lạicho răng cả hai cofactor NADH và NADHP đều có thé tham gia khử nhóm aldehyde củaHMF (Ask và cộng sự, 2013) Khả năng chuyển hóa furfural và HMF có liên quan đến chutrình đường phân và lên men ethanol (Hình 2.4) Khi đó, con đường chuyển hóa sẽ cạnhtranh các cofactor NADH va NADPH với các con đường chuyên hóa khác HMF cạnh tranhNADH trong quá trình làm giảm acetaldehyde tạo ethanol, kết quả là quá trình khử

acetaldehyde thành ethanol bị gián đoạn Tương tự, HMF cạnh tranh NADHP trong quá

trình tổng hop các acid amin va nucleotide, kết quả là làm chậm quá trình tổng hop sinhkhối của tế bào (Taherzadeh và cộng sự, 2000; Liu và cộng sự, 2004) Với sự hiện diện củaHMF trong môi trường lên men, glucose không được nắm men chuyển hóa cho đến khi tếbào chuyển hóa và làm giảm nồng độ HMF đến một giá trị xác định, điều này là nguyên

nhân gây kéo dài thích nghi trogn quá trình lên men (Liu và cộng sự,2004).

Glucose

ADP

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANHO cap độ phân tử, việc giải độc HMF tại chỗ có liên quan đến gen Liu và cộng su(2011) giới thiệu các enzyme tham gia vào phan ứng oxy hóa, tạo động lực cho các chuyểnhóa sinh học làm giảm tác động của các chất ức chế Có khoảng 365 gen được xác định cóliên quan đến khả năng thích nghi của nấm men với HMF (Ma va Liu 2010) Một kết quảnghiên cứu khác của Ask và cộng sự (2013) cho răng có khoảng 886 gen thay đổi về biểuhiện khi các phản ứng chuyển hóa HMF diễn ra, trong đó các gen TF, MSN2 /MSN4, YAP,GRE và HSFI tham gia vào các phản ứng làm giảm ức chế, đặc biệt là nhóm genYAP liênquan đến khả năng khử HMF của nấm men (Lin va cộng sự, 2009, Sasano và cộng sự,2012) Nhiều gen mã hóa chức năng như ARII, ADH6, ADH7, va OYE3 tham gia vào quatrình chuyển hoá sinh học làm giảm tác động của HMF trong tế bào (Rodrigues-Pousada

và cộng sự 2010).

2.3 Khả năng lên men của nam men cố định trong môi trường có các chất ức chếNắm men có định có nhiều ưu điểm trong lên men ethanol như là có thể lên men đượcở pH thấp, nhiệt độ cao, áp suất thâm thấu cao và nồng độ ethanol cao trong môi trường(Liang Y va cộng su, 2008) Loài nam men cố định được nghiênc cứu nhiều nhất làSaccharomyces cereviae Các nghiên cứu trước đây cho thấy khi sử dụng các môi trườngvà điều kiện lên men khác nhau thì tế bào Saccharomyces cereviae có định luôn sinh ralượng ethanol nhiều hơn và lên men cạn kiệt đường hon so với tế bào tự do (Nigam và cộng

sự, 2000).

Đối với nam men K/uyveromyces marxianus, đến nay có rất ít công bố khoa học vềquá trình cố định tế bào và ứng dụng của chúng để lên men ethanol Du Le va cộng sự(2015) đã thử nghiệm cố định Kluyveromyces marxianus trên be thân chuối rồi sử dụngnấm men cố định để lên men ethanol trên môi trường có nông độ đường khác nhau Khităng nồng độ glucose ban dau từ 200 đến 280g/L thì sự sinh trưởng và sinh tổng hợp ethanolđều bị giảm đi Nắm men cố định luôn sử dụng đường với tốc độ nhanh hơn và sinh raethanol nhiều hơn nắm men tự do Lượng ethanol do nấm men có định sinh ra cao hon 1.12-167 lần so với nấm men tự do Gan đây, Quyên và cộng sự (2017) đã sử dụngKluyveromyces marxianus cô định trên be đừa nước để lên men ethanol trong môi trườngcó chất ức chế là acid acetic Khi tăng nồng độ acid acetic từ 0 đến 8¢/L thì tốc độ sinhHVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 11

trưởng của nấm men cố định va tự do giảm đi lần lượt là 8.3 và 10.3 lần Tương tự, tốc độsinh ethanol của tế bào nắm men cố định và tự do cũng giảm di lần lượt là 4.1 và 6.8 lần.Điều nay cho thấy acid acetic ức chế mạnh nắm men K/wyveromyces marxianus;tuy nhiêntế bào có định luôn sinh trưởng tốt hơn va sinh ethanol nhanh hon han so với tế bào tự do.2.4 Điểm mới của đề tài

Như vậy, có rất ít công bố khoa học về nam men K/uyveromyces marxianus cỗ địnhcũng như ứng dụng của loài ndém men cố định nay trong quá trình lên men ethanol khi cómặt của các chat ức chế Bên cạnh đó, gel alginate là chất mang phô biến nhất trong ngành

cônh nghiệp lên men.

Trong nghiên cứu này, nắm men Kluyveromyces marxianus sẽ được cô định trong gelalginate canxi để lên men ethanol trong môi trường có chứa HME với những nồng độ khácnhau Kết quả nghiên cứu sẽ làm sáng tỏ khả năng lên men của tế bào có định trong môi

trường có chât ức chê so với nâm men tự do.

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 12

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANH

CHUONG 3 NGUYEN LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU

3.1 Nguyên liệu

3.1.1 Nim menNam men sử dung trong nghiên cứu nay là Kjyveromyces marxianus, do phòng thinghiệm Công nghệ thực phẩm- Bộ môn Công nghệ Thực phẩm- Khoa Kỹ Thuật Hóa Hoc-Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM cung cấp

Nam men được bảo quản trên môi trường thạch nghiêng có bố sung glycerol 20% ở 18°C Trước khi sử dụng, nắm men được nhân giống trên môi trường lỏng với 3 cấp nhângiống dé có đủ lượng sinh khối cần thiết Khi kết thúc quá trình nhân giống, huyền phù nắmmen được đem ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 phút.Sinh khối nấm men thu được sau quá trình ly tâm sẽ được sử dụng để cố định trong gel

-alginate

3.1.2 Chất ức chếChất ức chế HMF (5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde) được mua từ công ty Sigma-Aldrich ( Hoa Ky), độ tinh khiết là 99%

3.1.3 Chất mang alginateChat mang sử dung là natri alginate (CøHoNaO?), sản phẩm của công ty Kimica- Nhat

Ban Độ nhớt cua dung dịch natri alginate 1% ở 20°C dao động trong khoảng 300 ~400mPa.s.

Hóa chất CaCla được dùng dé tạo gel alginate canxi, CaClo là sản phẩm của công tyhóa chất Xilong, độ tinh khiết là 99%,

3.1.4 Môi trường

Trong quá trình thí nghiệm, có 4 loại môi trường được sử dụng gồm môi trường giữgiống, môi trường nhân giống, môi trường thích nghi và môi trường lên men Thanh phanmôi trường bao gồm đường glucose, cao nấm men, MgSO.7HaO, KHzPOx, (NH3)2SOs

Glucose được mua từ công ty hóa chất Xilong, độ tinh khiết là 99%,Hóa chất MgSOs.7H2O, KH2POa, (NHa)2SO¿ là sản phẩm của công ty hóa chất Xilong,độ tinh khiết của các hóa chất xấp xi 99%,

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 13

Cao nắm men là sản phẩm của công ty HIMEDIA, hàm lượng protein tổng trong caonam men dao động trong khoảng 50-75%.

Bảng 3 1: Thành phần của các môi trường sử dụng trong quá trình nghiên cứuThành phần Môi trường Môi trường Mỗi trường Môi trường

giữ giống nhân giống lỏng thích nghi lên men

Glucose (g) 40 40 80 150

Cao nam men (g) 5 5 5 5

KH2POs (g) 2 2 2 2(NH3)2SO4 (g) 2 2 2 2MgSOx.7HaO (g) | | | |Agar (g) 40 0 0 0Nước (mL) 1000 1000 1000 10003.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

3.2.1 Mục dichSo sánh kha nang lên men cua nam men cô định va tự do trong môi trường có HMFđông thời xác định khả năng tái sử dung của nâm men cô định.

3.2.2 Quy trình cô định nắm men trong gel alginate

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANH

<> C cach > Pha huyền phù Hòa tan

Nước vô trùng Rửa hạt

Hat gel alginate chứanam men

Hình 3 1 : Quy trình cô định nam men trong gel alginateNatri alginate được hòa tan trong nước cất dé tạo ra dung dịch có nông độ 1.5%, tươngtự dung dịch CaCl› được pha với nồng độ 0.05M (5.72g/L) Cả 2 dung dịch được tiệt trùngở nhiệt độ 121°C trong 15 phút, rồi làm nguội về nhiệt độ phòng Môi trường thích nghỉđược tiệt trùng trong điều kiện tương tự

Sinh khối nấm nen được cho vào nước cất dé tạo ra huyền phù có mật độ tế bào là6.107 tb/mL, huyén phu nấm men được trộn với dung dich alginate đã qua tiệt trùng và mậtđộ tế bào trong hỗn hop đạt 3.107tb/mL

Hỗn hợp nắm men va alginate được máy bơm nhu động nhỏ giọt vào dung dịch CaCl0.05M, ống dẫn hỗn hợp có đường kính trong xấp xi 2mm Dung dịch CaCla được khay đảoliên tục trên máy khuấy từ Khi hỗn hop alginate và nắm men rơi vào dung dịch CaCh, quátrình tao hạt gel diễn ra rất nhanh do các ion Ca? từ bên ngoài khuếch tán vào bên trong

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 15

hạt dé thé chỗ cho ion Na Sau 30 phút ngâm, các hạt gel được hình thành có đường kính

khoảng 3-4mm.

Sau quá trình có định nắm men, một số hạt gel sẽ được đem hòa tan trong dung dịchEthylenediamine tetraacetic acid disodium (EDTA) 5% dé xác định mật độ tế bào nắm mencó định có trong ImL hạt Các hat gel còn lại sẽ được hoạt hóa băng các ngâm trong môitrường thích nghỉ có b6 sung muối CaCl, nồng độ muối CaCh trong môi trường thích nghỉlà 0.05M, thời gian hoạt hóa là 30 phút Sau quá trình hoạt hóa, mật độ tế bào trong hạt geldao động trong khoảng 6.107-7.107 tb/mL hat gel Các hạt gel chứa nam men được rửa sạchvới nước vô trùng rồi sử dụng cho quá trình lên men ethanol

3.2.3 Nội dung thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của HMF lên sự sinh trưởng và khả năng lên men của nắmmen Klyveromyces marxianus cô định trong gel alginate

Mục dich của thí nghiệm này là xác định quy luật ảnh hưởng của nông độ HME đếnsự sinh trưởng và khả năng lên men của nắm men Kjyyeromyces marxianus cỗ định tronggel alginate Cac mẫu đối chứng cũng được thực hiện trong cùng một điều kiện khảo sátnhưng sử dụng tế bào K/yveromyces marxianus tự do

Các yếu tố có định:- Thé tích môi trường lên men: 10 mL đối với thí nghiệm xác định sự sinh trưởng

và 100mL đối với thí nghiệm xác định khả năng lên men

- - Nhiệt độ lên men: 35°C.

- Mat độ giống cấy ban dau: 107tb/mL

- Thoi gian khảo sát quá trình lên men: 96 giờ.

Các yếu tổ thay đổi:- Nông độ HMF trong môi trường ban đầu được thay đổi lần lượt là Ig/L, 2 g/L,

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANH- Béncanh đó, mẫu sinh khối ném men có định va nắm men tự do cũng được lấy tai

thời điểm 0 giờ, thời điểm mật độ tế bào cực đại và thời điểm kết thúc khảo sát lúc96 giờ để xác định độ bất bão hòa của màng tế bảo

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng tái sử dụng nấm men Klyveromyces marxianus cỗ

định trong môi trường lên men có HMF.

Mục dich của thí nghiệm này là xác định số lần tái sử dụng nắm men K/yveromycesmarxianus cô định trong gel alginate khi lên men trong môi trường có HME Các mẫu đốichứng cũng được thực hiên trong cùng một điều kiện khảo sát nhưng sử dụng tế bảo

Klyveromyces marxianus tự do.

Các yếu tổ cỗ định:- _ Thể tích môi trường lên men: 100 mL

- - Nhiệt độ lên men: 35°C.

- Mat độ giống cấy ban dau: 107tb/mL.- Nồng độ HMF trong môi trường lên men: 2g/L

Khi quá trình lên men một chu kì kết thúc, tiễn hành xác định:

- Ham lượng đường khử và hàm lượng ethanol sinh ra.

- _ Thời gian kết thúc lên men.- - Đối với tế bào cố định, quá trình lên men được cho là kết thúc khi trong 12 giờ liên

tục nồng độ đường glucose trong môi trường lên men không thay đổi Các hat gelalginate chứa nắm men được tách ra khỏi dịch lên men băng cách lọc qua rây Sau đócác hạt gel alginate được ngâm trong dung dịch CaCl› vô trùng nông độ 0.05M trong

thời gian 30 phút Sau khi ngâm, các hạt gel nguyên được phân riêng và xác định lại

số lượng Các hạt gel nguyên được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần trước khi sửdụng cho chu kì lên men kế tiếp Quá trình tái sử dụng nắm men cố định được xem làkết thúc khi thời gian của mẻ lên men kéo dài hơn 96 giờ hoặc khi có hơn 50% số hạt

gel bi phá vỡ.

- _ Đối với tế bào tự do quá trình lên men được cho là kết thúc khi trong 12 giờ liên tụcnông độ đường glucose trong môi trường lên men không thay đổi Sau một chu kì lên

men, nâm men được tách khỏi canh trường băng cách cho vào ông ly tâm vô trùng,

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 17

mẫu canh trường được ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng trong thờigian 5 phút Nắm men tiếp tục được rửa sạch băng nước cất vô trùng 3 lần với chế độly tâm như trên trước khi sử dụng cho chu kì lên men kế tiếp Quá trình tái sử dụngnắm men được xem là kết thúc khi thời gian của mẻ lên men kéo dài hơn 96 giờ.

3.2.4 Phương pháp phân tích

Xác định tế bào nam menDé xác định số lượng tế bào nắm men cố định và tự do, xác định tỉ lệ tế bào nắm menchết, phương pháp nhuộm xanh methylene và quan sát dưới kính hiển vi quang học (Liang

và cộng sự, 2008) được sử dụng.

Đối với nam men tự do: lắc đều môi trường lên men, tiễn hành lẫy mẫu và pha loãngvới nước vô trùng đến độ pha loãng đã chọn sao cho khi trộn dịch pha loãng và dịchmethylene 0.01% theo tỉ lệ 1:1, thì số tế bào đếm được trong mỗi kính trường năm trongkhoảng 50-200 tế bào Sau đó tiễn hành đếm trực tiếp tế bào nắm men bằng buồng đếmNeubauer dưới kính hiển vi quang học rồi tính toán suy ra mật độ tb/mL dịch lên men

Đối với tế bào nắm men cố định: hạt gel alginate được vớt ra khỏi môi trường lênmen, toàn bộ hạt được cho vào ống đong 10mL và định mức đến vạch 10mL băng dungdich muối Ethylenediamine tetraacetic acid disodium (EDTA) 5% Hỗn hợp được lắc bangmáy Vortex cho đến khi tạo thành huyền phù vi sinh vật Xác định số tế bào trong dịchhuyền phù tương tự như đối với mẫu lên men sử dụng tế bào, từ đó tính toán suy ra mật độtế bào/mL hạt gel và mật độ tế bào/mL dịch lên men

Xác định hàm lượng dường khử

Hàm lượng đường khử của mẫu được xác định băng phương pháp quang phổ so màuvới thuốc thử 3,5- dinitrosalicylic acid (DNS) ( Miller và cộng sự, 1959) Phương pháp nàydựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Trong dung dịch kiềm,DNS sẽ bị khử thành acid 3- amino-5- nitrosalicylic chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.Cường độ màu sau phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong mẫu Dựa theo phươngtrình đường chuẩn của glucose chuẩn với thuốc thử, ta xác định được hàm lượng đường

khử trong mẫu Bước sóng được sử dụng trong phương pháp này là 540nm

Xác định hàm lượng ethanol

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 18

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANHHam lượng ethanol được xác định băng phương pháp enzyme sử dung ethanol assay

kit (Mhanna, 2011) Phương pháp này dựa trên sự xúc tác của 2 enzyme: alcohol

dehydrogenase (AHD) và aldehyde dehydrogenase (AI-DH) Đầu tiên ethanol trong mẫu

phân tích sẽ phản ứng với NAD* nhờ xúc tác của enzyme ADH, ethanol bi oxi hóa tạo

acetaldehyde va NADH, xác định độ hấp thu lần 1 của NADH ở bước sóng 340nm Bướckế tiếp, b6 sung enzyme AI-DH vào hỗn hợp trên, acetaldehyte phản ứng với NAD* nhờxúc tác của enzyme AI-DH tạo ra acid acetic và NADH, đo độ hấp thu lần 2 của NADH.Từ độ chênh lệch của 2 lần đo độ hấp thu NADH ta sẽ suy ra được hàm lượng ethanol trong

mẫu

ADH(1) Ethanol + NAD* —— Acctaldehyde + NADH + H*

AI-DH(2) Acetaldehyde + NAD* + H2O ———> Acetic acid + NADH + H*

Dich lên men được pha loãng đến néng độ sao cho ham lượng ethanol dự đoán trong

mẫu dao động trong khoảng 0.0025-0.12g/L Mẫu được xác định theo hướng dẫn của bộ

kit và đo quang ở bước sóng 340nm.

Xác định độ bất bão hòa của chất béo màng té bào chấtThành phan acid béo trong màng tế bao chất của nắm men được xác định theo phươngpháp được dé xuất bởi Beltran và cộng sự (2008) Cân 10g sinh khối ướt và phối trộn với

50mL hỗn hợp methanol và chloroform (2:1 v/v) Hỗn hợp này được xử lý bởi sóng siêu

âm với cường độ 300W, trong thời gian 30 phút Quá trình trích ly chất béo từ màng tế baođược thực hiện trong điều kiện lắc đảo với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 2 giờ Hỗnhợp sau khi lắc đảo được chiết băng dung dịch KCl 0.8% cho đến khi cả 2 pha trong suối.Phân dung môi hòa tan chất béo được thu hồi, thành phần acid béo màng tế bào chất củanam men được xác định bằng phương pháp sac ký khí

3.2.5 Công thức tính toanXác định tốc độ sinh trưởng trung bình của ndm men

In X.—lmXo

Tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men : X = ;X: tốc độ sinh trưởng trung bình của nắm men (tb/mL.h).HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 19

X:: mật độ tế bào nắm men trong dịch lên men tại thời điểm t (tb/mL).Xo: mật độ tế bao nắm men trong môi trường bắt đầu lên men (107 tb/mL).

t: thời gian lên men (h).Độ lên men

Dung đồ thị biểu diễn sự thay đổi của hàm lượng đường theo thời gian lên men : S = S(t)

Tat cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại để lấy giá trị trung bình, kết quađược biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình + độ lệch chuẩn Phân tích và xử lí các kết quảthí nghiệm bang phưng pháp phân tích phương sai Analysis of Variance (ANOVA) trênHVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 20

LUAN VAN TOT NGHIEP PGS.TS HOANG KIM ANHphan mềm Statgraphics XV.I để xác định sự khác biệt giữa các số liệu là có ý nghĩa hay

không.

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 21

CHUONG 4 KET QUA VA BAN LUAN

4.1 Anh hưởng của nồng độ HMF lên sự sinh trưởng và kha năng lên men của nammen Klyveromyces marxianus cô định trong gel alginate

Mục dich trong thi nghiệm này là nhăm xác định mức độ ảnh hưởng của HMF đến sựsinh trưởng va khả năng lên men của nắm men K/uyveromyces marxianus cỗ định trong gelalginate Nam men cé định và nắm men tự do được lên men trong môi trường có HME thayđổi nòng độ từ 0 đến 5g/L Các thông số được bố trí theo thí nghiệm 1 của mục 3.2.3 Hammục tiêu bao gồm mật độ tế bào cực đại, tốc độ sinh trưởng của nấm men, tốc độ sử dụngđường, tốc độ sinh tổng hợp ethanol và hiệu suất sinh ethanol Đồng thời thành phần acidbéo của màng tế bào cũng được xác định nhăm đánh giá mức độ ảnh hưởng của HMF đếntế bào nắm men cố định và tự do

4.1.1 Ảnh hưởng của nông độ HMF đến quá trình sinh trưởng của nằm men cỗ định

và tu’ do

Đường cong sinh trưởng của nấm men cố định va tự do trong môi trường có HMFthay đổi nồng độ từ 0 đến 5g/L được biểu diễn trong hình 4.1 Từ đường cong sinh trưởng,chúng ta có thể xác định được mật độ tế bào cực đại, thời gian lên men dé mật độ tế bàocực đại và tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men ở từng nồng độ HME đã khảo sát,các số liệu được trình bày trong bảng 4.1

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 22

Bảng 4 1: Ảnh hướng của HMF đến quá trình sinh trưởng của nam men cô định trong

gel alginate và nam men tự do

Thời gian lên

Nà Mật độ tế bào cực đại men tương ứng Tốc độ sinh trưởng

(g/) Nam men Nam men , Nam men Nam men

„ men cô | men tự

cô định tự do cô định tự do

định do

0 153.22°45.66 | 105.21°%®+16.26 24 24 0.40+0.01 | 0.35°%+0.05| 197.58°+7.76 | 100.56°%+6.36 24 24 0.40+0.02 | 0.34°¢0.032 110.5°+12.73 49 ,53'+9.19 24 48 0.38°+0.01 | 0.26°+0.023 84.5549.19 | 34.252420.15 24 48 0.36%*+0.01 | 0.25+0.00

tương tự đã được ghi nhận trong nghiên cứu của Talebnia và cộng sự (2006); các tác giả

nhận thấy mật độ tế bào cực đại của nắm men Saccharomyces cereviciae có định luôn caohơn nắm men tự do khi lên men trong môi trường có các chất ức chế từ quá trình tiền xử línguyên liệu lignocellulose Trong môi trường không có chất ức chế HME, mật độ cực đạicủa nắm men cố định cao hơn nấm men tự do 1.46 lần, thời gian đạt cực đại của cả hai loạinam men đều là 24 giờ Như vậy, nấm men Kluyveromyces marxianus cô định đã sinhtrưởng tốt hơn nắm men tự do ngay cả khi môi trường không có chất ức chế Khi tăng nồngđộ HMF từ 0 lên 1g/L, mật độ cực dai của nấm men cố định tăng 1.29 lần, trong khi đónấm men tự do có mật độ cực đại không đôi: thời gian lên men dé mật độ tế bào đạt cực đạiđối với nấm men có định va tự do vẫn là 24 giờ Khi tăng nồng độ HMF từ 1 lên 2g/L, mậtđộ tế bào cực đại của nấm men có định và tự do đều bị giảm đi lần lượt là 1.78 lần và 2.03HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 24

LUẬN VĂN TOT NGHIỆP PGS.TS HOÀNG KIM ANHlan; thời gian lên men dé mật độ tế bào là không thay đổi đôi với nam men cô định nhưngkéo dài thêm 24 giờ đối với nắm men tự do Như vậy, sự gia tăng nồng độ HMF từ 1 lên2ø/L đã ức chế sự sinh trưởng của nam men tự do nhiều hơn so với nắm men có định Trongmột nghiên cứu của Sanchez và cộng sự (1988), các tác giả đã lên men ethanol với nammen Saccharomyces cerevisiae tự do trong môi trường có chứa HME và đã nhận thấy rangnắm men bat dau bị ức chế khi nỗng độ HMF 2g/L Nhiều nghiên cứu trước đây cũng chứngminh răng tế bào ndm men cố định được bảo vệ tốt hơn so với ndm men tự do trong môitrường lên men có chat ức chế (Talebnia và cộng sự, 2006) Khi tiếp tục tăng nồng độ HMFtừ 2 lên 4g/L, thì mat độ tế bào cực đại của nấm men cố định tiếp tục 110.5 giảm còn 64.50(105 cfu/mL) Nếu nồng độ HMF tăng từ 4-5g/L thì mật độ tế bào cực đại không thay đổi.Đối với nắm men tự do khi tăng nồng độ HMF từ 2 đến 5/L thì mật độ tế bào cực đại khôngđổi Khi nồng đọ HMF trong môi trường càng cao thì thời gian lên men dé mật độ tế bàođạt cực đại của nắm men có định và tự do càng cách biệt nhau Cụ thé là với nông độ HMF2-3g/L, khoảng chênh lệch là 24 giờ; còn với nồng độ HMF 4-5g/L, khoảng chênh lệch là36 giờ Như vậy, nấm men tự do cần thời gian dài hơn dé mật độ tế bào trong dịch lên menđạt cực đại so với nắm men cố định Taherzadeh và cộng sự (2000) đã khảo sát sự ảnhhưởng của HMF trong khoảng nông độ 1-4g/L đến khả năng sinh trưởng của ném men tựdo Saccharomyces cerevisiae va đã kết luận rang khi tăng nồng độ HMF, mật độ tế bao cựcđại bị giảm, pha thích nghi của nấm men sẽ bị kéo dài.

Bang 4.1 còn cho thay su thay đôi tốc độ sinh trưởng của nấm men cô định và tự dolên men trong môi trường có HMF Nhìn chung, tốc độ sinh trưởng của nấm men cố địnhluôn cao hơn nấm men tự do ở tất cả các nông độ HME đã được khảo sát Khi nồng độHMF từ 0 lên 1¢/L thì tốc độ sinh trưởng của nắm men cố định và tự do không thay đối.Như vậy, nồng độ HMF thấp (không quá hơn 1g/L) sẽ không ảnh hưởng đến tốc độ sinhtrưởng của nắm men cố định và tự do Tuy nhiên, khi tăng HMF nông độ từ 1 lên 2g/L, tốcđộ sinh trưởng của nam men cô định là không đổi nhưng tốc độ sinh trường của nấm mentự do giảm 1.3 lần Nhìn chung, khi nồng độ HMF tăng cao thì tốc độ sinh trưởng của cả

nâm men cô định và nam men tự do đêu giảm.

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 2ã

Các nghiên cứu trước đây đã cho rang HMF đã kéo dài thời gian pha thích nghi valàm giảm sự sinh trưởng của các tế bào nấm men tự do (Jayakody và cộng sự, 2013; Liu vàcộng sự, 2004) Nguyên nhân cho là do HMF ức chế trực tiếp tới enzyme ADH nên quátrình chuyên hóa acetaldehyde thành ethanol bị ức chế: sự tích tụ acetaldehyde nội bào làlý do làm giảm sự sinh trưởng (Jones, 1989) Để chuyển hóa HMF thành HDM giải độccho nắm men, tế bào cần có sự tham gia của NADH và NADHP do đó dẫn đến do đó dẫnđến sự thiếu hụt NADH và NADHP trong tế bào, lam mất cân băng oxy hóa khử và làmgián đoạn các quá trình trao đôi chất của tế bào (Liu, 2011), ảnh hưởng đến chu trình đườngphân và chu trình TCA, làm thay đối năng lượng của quá trình chuyển hóa (Horvath vacộng su, 2003) HMF còn xâm nhập vào lớp màng kép của màng tế bào làm mất tính toànvẹn của màng, dẫn đến sự phá vỡ màng và làm giảm tốc độ tái tạo tế bào (Zaldivar và cộngsự, 1999) Các biến đổi trên làm giam sự sinh trưởng cua nấm men.

Từ số liệu trên có thé khang định rang, nim men Kluyveromyces marxianus cô địnhtrong gel alginate canxi có khả năng sinh trưởng tốt hơn nắm men tự do trong môi trườngcó HME với nồng độ từ 1-5g/L Cả nắm men cố định và tự do đều bắt đầu ức chế khi tăngnồng độ HMF trong môi trường lên men từ 1 lên 2g/L

4.1.2 Anh hưởng của nông độ HMF đến quá trình sử dụng cơ chất của nim men cỗ

định trong gel alginate và tự do

Hình 4.2 biéu diễn lượng đường sót trong quá trình lên men ethanol của nấm men cốđịnh và tự do trong môi trường có nồng độ HMF thay đổi từ 0-5g/L Từ hình 4.2, chúng tacó thể xác định được lượng đường sót khi kết thúc lên men, độ lên men, thời gian kết thúclên men và tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định và tự do Các giá trị này được trìnhbày trong bảng 4.2 và bảng 4.3 Quá trình lên men ethanol được xem là kết thúc khi lượng

đường không quá 5g/L.

Bảng 4.2 trình bày lượng đường sót và độ lên men của nấm men cố định và nắm mentự do ở thời điểm kết thúc thời gian khảo sát (96 giò)

Bang 4.3 trình bày thời gian kết thúc lên men và tốc độ sử dụng đường của nâm mencó định và tự do

HVTH: NGUYÊN HỎNG PHƯƠNG THẢO 26