Việc sử dụng nấm men chịu nhiệt trong sản xuất ethanol là một hướng đi có tiềm năng lớn với các nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới như Việt Nam. Trong nghiên cứu này, 23 dòng nấm men được thử khả năng lên men ethanol từ dịch ép mía ở 37 °C và 40 °C. Tối ưu hóa điều kiện lên men được thực hiện với mật số giống chủng (105 , 106 và 107 tế bào/mL), hàm lượng đường ban đầu (150, 200 và 250 g/L) và thời gian lên men (5, 6 và 7 ngày).
ISSN: 1859-2171 e-ISSN: 2615-9562 TNU Journal of Science and Technology 202(09): 185 - 192 LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH ÉP MÍA SỬ DỤNG NẤM MEN CHỊU NHIỆT Huỳnh Xuân Phong*, Hà Phú Quý, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Ngô Thị Phương Dung Viện Nghiên cứu phát triển Cơng nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ TĨM TẮT Việc sử dụng nấm men chịu nhiệt sản xuất ethanol hướng có tiềm lớn với nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới Việt Nam Trong nghiên cứu này, 23 dòng nấm men thử khả lên men ethanol từ dịch ép mía 37 °C 40 °C Tối ưu hóa điều kiện lên men thực với mật số giống chủng (105, 106 107 tế bào/mL), hàm lượng đường ban đầu (150, 200 250 g/L) thời gian lên men (5, ngày) Kết thử nghiệm lên men 37 °C tuyển chọn 10 chủng nấm men với hàm lượng ethanol sinh khoảng 10,03-10,57% (v/v), chủng Y8 có hiệu suất lên men cao nhất, đạt 92,62% Kết thử nghiệm lên men 40 °C với chủng Y8 cho thấy hàm lượng ethanol sinh hiệu suất lên men cao 5,74% (v/v) 71,47% Kết định danh xác định chủng Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35 Y42 Saccharomyces cerevisiae, chủng Y39 Candida tropicalis, chủng YVN7 C glabrata chủng YVN12 Torulaspora globosa Trong đó, chủng S cerevisiae Y8 thích hợp để sản xuất ethanol với điều kiện lên men từ dịch ép mía 37 °C, nồng độ giống 10 tế bào/mL, hàm lượng đường ban đầu 248,2 g/L thời gian lên men ngày, hàm lượng ethanol đạt 10,58% (v/v) Từ khóa: Lên men ethanol, nấm men chịu nhiệt, dịch ép mía, Saccharomyces cerevisiae, tối ưu hóa Ngày nhận bài: 27/6/2019; Ngày hoàn thiện: 21/7/2019; Ngày đăng: 27/7/2019 ETHANOL PRODUCTION FROM SUGAR-CANE JUICE BY USING THERMOTOLERANT YEASTS Huynh Xuan Phong*, Ha Phu Quy, Nguyen Ngoc Thanh, Bui Hoang Dang Long, Ngo Thi Phuong Dung Biotechnology Research and Development Institute, Can Tho University ABSTRACT Using thermotolerant yeasts for ethanol fermentation is a potential orientation in tropical countries as Vietnam In this study, 23 yeast strains were tested for ethanol fermentation ability at 37 °C and 40 °C in sugarcane juice The fermentation conditions were set up in a factorial design (three factors) at three levels: yeast inoculum (105, 106 and 107 cells/mL), initial sugar concentration (150, 200 and 250 g/L) and fermentation time (5, and days) The results showed that 10 yeast isolates were able to produce ethanol with high concentrations (10.03-10.57% v/v) at 37 °C Of which, strain Y8 got the highest efficiency (92.62%) At 40 °C, strain Y8 got the highest produced ethanol concentration and efficiency, 5.74% (v/v) and 71.47%, respectively Yeast strains were identified as follows: strains (Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y42) as Saccharomyces cerevisiae, Y39 as Candida tropicalis, YVN7 as C glabrata, and YVN12 as Torulaspora globosa The optimized conditions for ethanol production from sugarcane juice at 37 °C by using S cerevisiae Y8 were determined: inoculum level of 107 cells/mL, initial sugar concentration of 248.2 g/L, and days of fermentation, the ethanol concentration was obtained at 10.58% (v/v) Keywords: Ethanol fermentation, thermotolerant yeast, sugarcane juice, S cerevisiae, optimization Received: 27/6/2019; Revised: 21/7/2019; Published: 27/7/2019 * Corresponding author Email: hxphong@ctu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 185 Huỳnh Xuân Phong Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Giới thiệu Ethanol khơng sử dụng chủ yếu cho sản xuất hay sử dụng y tế, mà cho sản xuất chất màu sơn ngành cơng nghiệp hóa chất khác Trong kỷ 19, ngành thương mại trở thành ngành công nghiệp với sản lượng lớn, lợi ích kinh tế cải tiến trình chưng cất Ngày nay, ethanol hóa chất cơng nghiệp quan trọng có tiềm nguồn nhiên liệu sinh học để thay cho nguyên liệu hóa thạch [1, 2] Hầu phát triển số nước phát triển sử dụng ethanol sinh học để thay phần cho xăng Lý tình trạng suy giảm dự trữ dầu, chi phí cho ngun liệu hóa thạch tăng cao vấn đề môi trường [3] Sản xuất ethanol thường lên men nấm men từ nguồn nguyên liệu nông nghiệp Khả chịu đựng nấm men điều kiện nhiệt độ độ ethanol cao trình lên men trở thành đặc điểm ngày quan trọng thu hút nhiều nhà nghiên cứu với nhiều lợi ích khai thác thông qua việc sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt để sản xuất ethanol [4-6] Chi phí làm mát q trình sản xuất ethanol tốn kém, cách sử dụng nấm men chịu nhiệt, chi phí cho q trình làm mát giảm xuống [5, 7] Bên cạnh đó, trình biến đổi khí hậu, nóng lên tồn cầu thúc đẩy việc tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả chịu nhiệt để ứng phó với thay đổi [6, 8] Nhiệt độ thích hợp cho trình lên men ethanol sử dụng nấm men khoảng 25-30 oC [4, 5] Tuy nhiên, với xu hướng gia tăng nhiệt độ toàn cầu nhiệt độ Việt Nam vào mùa hè thường gia tăng đến khoảng 35-37 oC, chí 40 oC Do đó, việc tuyển chọn ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt giúp trì ổn định trình lên men khoảng thời gian nhiệt độ gia tăng, đặc biệt vào mùa hè, mà không cần tốn nhiều chi phí để làm mát Ethanol có nguồn gốc đường thường sản xuất từ mía, củ cải đường, lúa miến ngọt,… Theo Goldemberg [9], mía nguyên liệu sử dụng nhiều sản xuất ethanol chủ yếu Brazil Ở số nước có ngành cơng nghiệp mía 186 202(09): 185 - 192 đường Brazil, Ấn Độ Thái Lan, sản lượng mía thơ đạt 77 tấn/ha sản lượng mía thành phẩm (đã loại bỏ lá) đạt 58 tấn/ha Cũng quốc gia này, hecta mía đượng sản xuất 4.000 lít ethanol năm [10] Tại Việt Nam, diện tích mía nước 298.200 với suất mía bình quân đạt 63,9 tấn/ha Phần lớn nguồn nguyên liệu mía nước ta sử dụng để sản xuất đường, nhu cầu tiêu thụ lớn năm gần nguồn mía cho sản xuất đường có dấu hiệu bão hịa, giá mía nước tụt giảm khiến cho hàng ngàn mía ứ đọng năm Do đó, tận dụng nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất ethanol sinh học tạo lợi lớn việc sản xuất nguyên liệu thay Mục tiêu nghiên cứu nhằm tuyển chọn chủng nấm men chịu nhiệt triển vọng có khả ứng dụng lên men sản xuất ethanol từ dịch ép mía nhiệt độ cao Vật liệu phương pháp 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất Dịch ép nước mía mua chợ P Trà An, Q Bình Thủy, TP Cần Thơ Hai mươi ba chủng nấm men phân lập sơ tuyển dựa vào đặc tính chịu nhiệt lên men ethanol lưu trữ phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, trường Đại học Cần Thơ [11] chủng Kluyveromyces marxianus DMKU 3-1042 [4] Hóa chất sử dụng yeast extract, malt extract, peptone, D-glucose, agar từ HiMedia Laboratories (Ấn Độ); ethanol NaOH (Merck, Đức) Môi trường YPD bao gồm yeast extract 0,5%; peptone 0,5%; D-glucose 2,0%; môi trường YPD agar (môi trường YPD bổ sung 1,5 g/L agar) [4] 2.2 Thử nghiệm khả lên men nấm men 37 ºC từ dịch ép mía Thử nghiệm thực với mục đích đánh giá khả lên men chủng nấm men chịu nhiệt nhằm lựa chọn chủng nấm men có khả lên men tốt 37 oC Nấm men lấy khoảng nửa vòng kim cấy từ mẫu trữ chủng vào bình tam giác 250 mL có chứa 100 mL môi trường tăng sinh YPD khử trùng 121 °C 15 phút Ủ lắc 150 vòng/phút nhiệt độ phòng (28-30 o C) 24 (mật số đạt 108 tế bào/mL) Dịch ép mía trùng NaHSO3 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn Huỳnh Xn Phong Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN (140 mg/L giờ) Điều chỉnh dịch ép mía 200 g/L pH 5,5 Một mL (mật số 108 tế bào/mL) chủng nấm men chủng K marxianus dịch tăng sinh vào bình tam giác 250 mL có chứa 99 mL dịch ép nước mía, đậy water-lock ủ 37 oC ngày Các tiêu pH, hàm lượng đường hàm lượng ethanol phân tích sau kết thúc trình lên men 2.3 Thử nghiệm khả lên men nấm men 40 ºC từ dịch ép mía Các chủng nấm men tuyển chọn từ thử nghiệm lên men 37 °C tiếp tục đánh giá khả lên men 40 °C với mục tiêu tuyển chọn chủng nấm men trì khả lên men tốt Môi trường chuẩn bị, bước thực tiêu theo dõi tương tự thử nghiệm 37 °C với lần lặp lại 2.4 Định danh chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn Các chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn tăng sinh 10 mL môi trường YPD 37 °C 24 Nấm men trích DNA để khuếch đại trình tự vùng D1/D2 26S rDNA với cặp mồi NL-1 (5’GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) NL-4 (5’-GGTCCGTG TTTCAAGACGG-3’) phản ứng PCR [12] Sản phẩm PCR giải trình tự sử dụng hệ thống giải trình tự ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, California, USA) Trường Đại học Yamaguchi (Nhật Bản) Dựa trình tự 26S rDNA để phân tích so sánh với trình tự chủng nấm men ngân hàng liệu NCBI Xây dựng phả hệ dựa trình tự đoạn gene 26S rDNA theo phương pháp neigbor-joining chương trình MEGA với số bootstrap 1.000 lần lặp lại [13] 2.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men ethanol nấm men chịu nhiệt Chủng nấm men có khả lên men mạnh từ thí nghiệm tuyển chọn sử dụng thử nghiệm Nuôi nấm men môi trường tăng sinh YDP, ly tâm dịch tăng sinh, mật số nấm men sau chủng vào bình tam giác 107, 106 105 tế bào/mL) Thí nghiệm thực với 100 mL dịch ép mía lên men 37 oC với nhân tố: nồng độ giống (105, 106 107 http://jst.tnu.edu.vn; Email: jst@tnu.edu.vn 202(09): 185 - 192 tb/mL), hàm lượng đường (150, 200 250 g/Lvà thời gian lên men (5, ngày) 2.6 Phân tích xử lý kết Giá trị pH xác định pH kế (Sartorius, PB-20, Đức), Brix xác định khúc xạ kế (Hand Refractometer, FG103/113, Euromex-Hà Lan), hàm lượng đường xác định phương pháp DNS [14] hàm lượng ethanol xác định phương pháp chưng cất [15] Hiệu suất lên men tính dựa tỷ lệ hàm lượng ethanol thực tế thu so với ethanol lý thuyết tính theo lượng đường tiêu thụ [4] Kết xử lý vẽ biểu đồ phần mềm Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, USA) Số liệu xử lý thống kê chương trình Statgraphics Centurion XV ver 15.1.02 (Statpoint Technologies, Inc., USA) Kết thảo luận 3.1 Khả lên men 37 °C nấm men từ dịch ép mía Kết sau lên men cho thấy giảm thấp pH mức 3,11-3,73 so với pH ban đầu 5,5 (Bảng 1) Nguyên nhân khiến độ pH giảm hình thành sản phẩm phụ trình lên men CO2 acid hữu Hàm lượng ethanol đạt sau ngày lên men khoảng 2,2010,57% (v/v) hiệu suất lên men đạt 59,6192,62% Hàm lượng đường tiêu thụ khoảng 55,72-192,45 g Tuy nhiên, phần lớn chủng nấm men tuyển chọn cho thấy tương thích cao với mơi trường dịch ép mía với 10 chủng Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y39, Y42, YVN7 YVN12 cho độ cồn 10% (v/v), khoảng 10,03-10,57 g/L với hiệu suất lên men đạt 83,06 - 92,62% Trong đó, chủng Y8, Y31 YVN12 có lượng ethanol cao 10,37, 10,57 10,36% (v/v), với hiệu suất 92,62, 85,53 83,06% Dựa theo kết thống kê độ rượu hiệu suất lên men chọn 10 chủng nấm men Y8, Y31, Y32, Y33, Y34, Y35, Y39, Y42, YVN7 YVN12 cho khả lên men ethanol tốt từ 10,03-10,57% (v/v) để thử nghiệm lên men dịch nước ép mía 40 oC 3.2 Khả lên men 40 oC nấm men từ dịch ép mía Mười chủng nấm men có khả lên men sinh ethanol cao 37 oC (Y8, Y31, Y32, Y33, 187 Huỳnh Xn Phong Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CƠNG NGHỆ ĐHTN Y34, Y35, Y39, Y42, YVN7 YVN12) tuyển chọn sử dụng cho lên men ethanol từ dịch ép mía 40 oC Kết sau ngày lên men thể Bảng Kết cho thấy tất 10 chủng nấm men tuyển chọn có khả sinh ethanol 40 oC từ dịch ép mía Hàm lượng ethanol đạt 202(09): 185 - 192 khoảng 2,21-5,74% (v/v) với hiệu suất lên men đạt 54,18-71,47 tương ứng với lượng đường tiêu thụ khoảng 56,41-123,78 g Trong đó, chủng Y8 có nồng độ ethanol cao đạt 5,74% (v/v) có hiệu suất lên men cao nhất, đạt 71,47%, khác biệt có ý nghĩa so với chủng lại Bảng Kết lên men nấm men từ dịch ép mía 37 oC STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Chủng Y8 Y29 Y31 Y32 Y33 Y34 Y35 Y37 Y38 Y39 Y42 Y47 Y53 Y54 Y80 Y81 Y88 Y104 YVN3 YVN7 YVN8 YVN12 YVN30 K mar CV% pH sau lên men 3,42c 3,39c 3,66ab 3,65ab 3,67ab 3,65ab 3,71ab 3,16def 3,11f 3,68ab 3,73a 3,14f 3,14f 3,26d 3,15ef 3,19def 3,25de 3,15ef 3,66ab 3,66ab 3,25d 3,67ab 3,61b 3,19def 7,12 Đường sử dụng (g/L) 172,69e 96,35gh 190,55ab 186,23abc 179,59cde 178,73cde 180,80bcde 66,77j 82,55i 177,95cde 183,65abcd 73,84ij 66,18j 122,83f 98,59gh 103,34g 92,64h 55,72k 175,71de 187,70abc 97,73gh 192,45a 179,25cde 81,34i 17,27 Ethanol (% v/v) 10,37a 4,77ef 10,57a 10,29ab 10,12ab 10,29ab 10,10ab 2,28hi 3,60gh 10,22ab 10,03ab 2,85hi 2,77hi 6,32c 5,01de 5,42de 4,93e 2,20i 9,47b 10,34ab 5,84cd 10,36a 9,81ab 3,98fg 14,19 Hiệu suất lên men (%) 92,62a 76,49fg 85,53abcde 85,24abcde 86,96abcd 88,81abc 86,17abcde 65,11i 67,33hi 88,72abc 84,25bcdef 59,61i 61,85i 79,41defg 78,247efg 80,86cdefg 81,34cdefg 60,80i 83,18cdefg 84,94abcde 92,55ab 83,06cdefg 84,35abcdef 75,39gh 13,26 Giá trị trung bình lần lặp lại, cột chữ số mũ giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 5% (P