Bài báo này giới thiệu một số kết quả về tuyển chọn chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol cao được phân lập từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng lên men ethanol từ dịch thủy phân bèo Nhật Bản bằng acid loãng nhằm giải quyết một lượng lớn sinh khối bèo Nhật Bản đang phát triển quá mức và tận dụng loại nguyên liệu này như một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình sản xuất ethanol sinh học.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN CÓ HOẠT LỰC CAOVÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU SUẤT LÊN MEN ETHANOL DỊCH THỦY PHÂN BÈO NHẬT BẢN BẰNG ACID LỖNG Nguyễn Minh Trí, Hồ Phan Ngọc Thúy Trường Đại học Khoa học Huế Ethanol loại nhiên liệu sinh học, sản xuất chủ yếu phương pháp lên men đường, tinh bột hay cellulose từ loạicây nơng nghiệp ngơ,lúa mì,lúa mạch, mía chuyển hóa thành đường đơn sản xuất etanol từ cỏ có chứa hợp chất cellulose Chính vậy, người ta nghiên cứu theo hướng sản xuất ethanol từ nguồn phế liệu nông nghiệp [3] Bèo Nhật Bản (Eichhornia crassipes) hay gọi bèo Tây, Lục Bình… có nguồn gốc từ Nam Mỹ di nhập vào Việt Nam từ năm 1902 với mục đích làm cảnh Hiện đối tượng phân bố rộng khắp thủy vực Việt Nam nói chung địa bàn tỉnh Thừa Thiên -Huế nói riêng Vì vậy, việc xử lý sinh khối bèo Nhật Bản vấn đề cần quan tâm [10] Bài báo giới thiệu số kết tuyển chọn chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol cao phân lập từ nguồn khác xác định khả lên men ethanol từ dịch thủy phân bèo Nhật Bản acid loãng nhằm giải lượng lớn sinh khối bèo Nhật Bản phát triển mức tận dụng loại nguyên liệu nguồn nguyên liệu tiềm trình sản xuất ethanol sinh học I PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu: - Bèo Nhật Bản - Chủng nấm men phân lập từ nguồn khác Phƣơng pháp nghiên cứu Phân lập chủng nấm men từ: 13 loại bánh men rượu, loại bã rượu, loại trái chín [1] Sơ tuyển hoạt lực lên men chủng nấm men phân lập cách xác định chiều cao cột khí CO2 sinh ống Durham thời điểm nuôi cấy [7] Xác định hàm lượng cellulose bèo Nhật Bản phương pháp thủy phân [2] Xác định hàm lượng đường khử phương pháp so màu với acid picrid [2] Xác định nồng độethanol trình lên menbằng phương pháp so màu [8] Các thí nghiệm thực ba lần lặp lại, kết giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Tất số liệu xử lý chương trình Microsoft Excell 2010 II KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập chủng nấm men Qua trình phân lập từ nguồn khác nhau, thu nhận 17 chủng nấm men Sau quan sát khuẩn lạc diện môi trường dinh dưỡng dựa vào đặc điểm khác màu sắc, hình dạng, kích thước tế bào nấm men để phân loại sơ chủng nấm men (Bảng 1) (Kurtzman and Fell, 1998) 1985 TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG Bảng Đặc điểm hình thái 17chủng nấm men đƣợc phân lập Mẫu Bánh men Quảng Ngãi Bánh men Sài Gịn Men bánh mì Chủng Mơ tả khuẩn lạc QN1 QN2 Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng nhạt, trơn Khuẩn lạc trắng đục, khô Khuẩn lạc to, màu trắng sữa, đậm nhạt dần Khuẩn lạc lớn, màu trắng đục, bề mặt khô, Khuẩn lạc trung bình, màu trắng sữa, bề mặt khơ Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt trơn láng Khuẩn lạc trắng trung bình sữa nhạt, trơn Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, khô Khuẩn lạc trắng sữa trơn to Khuẩn lạc to, bề mặt trơn, bóng có màu trắng sữa Khuẩn lạc vừa, nhạt đậm dần từ vào Khuẩn lạc nhỏ, nhân trắng sữa Khuẩn lạc nhỏ, trắng đục, khơ Khuẩn lạc trung bình, trơn láng Khuẩn lạc vừa, khơ Khuẩn lạc trung bình, màu trắng nhạt, trơn Khuẩn lạc trắng sữa to, khô QN3 QN4 QN5 QN6 SG1 SG2 SG3 BM1 BM2 Bã rượu Sake Trái BM3 BM4 BR1 BR2 TC1 TC2 Hình dạng tế bào hình oval lớn hình cầu hình oval lớn hình oval lớn hình oval nhỏ hình oval lớn Hình oval nhỏ Hình elip Hình oval nhỏ Hình oval lớn Hình elip Hình oval nhỏ Hình oval nhỏ Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu Khảo sát hoạt lực lên men ethanol chủng nấm men Để xác định hoạt lực lên men chủng nấm men dựa vào khả sinh khí CO2 trình lên men Tuy nhiên thời gian lên men ống Durham ngắn, trình lên men rượu có thời gian dài ngày Vì phương pháp xác định chiều cao cột khí CO2 ống Durham sở ban đầu để tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực cao Trên sở đó, chúng tơi tiến hành ni cấy chủng nấm men môi trường dinh dưỡng điều kiện nhiệt độ 30ºC xác định chiều cao cột khí CO2 sau đợt theo dõi Kết khảo sát qua lần lặp lại cho thấy: thời điểm khác nhau, chiều cao cột khí CO2 ống Durham khác nhau, cho thấy cường độ lên men chủng nấm men khác (Bảng 2) Bảng Chiều cao cột khí CO2 sinh ống Durham chủng nấm men STT Chủng nấm men 1986 qua lần lặp lại Chiều cao cột khí CO2 (cm) 12 18 24 30 36 QN1 4,2 7,5 9,0 11,0 11,0 11,0 QN2 - - - - - - HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 7 QN3 QN4 QN5 QN6 SG1 SG2 SG3 0,3 2,1 0,2 1,1 1,4 3,8 1,9 2,5 2,2 5,1 3,4 5,3 7,8 8,3 5,6 7,9 8,6 9,0 7,8 8,0 10,8 10,6 8,9 8,2 10 BR1 3,6 4,5 6,6 7,5 8,9 10,4 11 BR2 1,3 2,5 5,8 6,0 6,9 7,5 12 BM1 2,0 3.4 5,6 6,1 7,5 8,0 13 BM2 - - 1,0 2,4 4,7 6,2 14 BM3 1,2 2,0 3,8 5,3 7,9 9,0 15 BM4 - - - - - - 16 TC1 - 1,1 2,0 4,4 5,9 7,0 TC2 0,9 2,6 3,7 5,0 6,5 7,4 17 Ghi chú: (-) chưa tạo CO2 ống Durham Ở thời điểm đầu trình lên men, đa số chủng nấm men có khả lên men tạo khí CO2 Chủng QN1 có chiều cao cột khí cao so với chủng lại, cho thấy chủng có khả lên men nhanh Sau 36 lên men, chiều cao cột khí ống Durham thay đổi q trình lên men kết thúc Trong số 17 chủng nấm men khảo sát chủng QN1 có thời gian lên men ngắn (24 giờ) chiều cao cột khí sinh ống Durham đạt tối đa (11,00 cm) Một số chủng nấm men khơng thấy xuất bọt khí CO2 ống Durham chứng tỏ chủng nấm men khơng lên men mơi trường dinh dưỡng Từ kết khảo sát khả lên men thông qua chiều cao cột khí CO2 chúng tơi lựa chọn chủng QN1 để định danh tên khoa học thực nghiên cứu Phân loại Chủng nấm men QN1 phân loại phương pháp giải trình tự gen 18S rRNA tra cứu Gen Bank để định danh lồi Kết giải trình tự gen chủng nấm men QN1 sau: Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct Query Sbjct 1021 61 961 121 901 181 841 241 781 301 721 361 661 CTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAG CTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCCTGTTCCAAGGAACATAGACAAG GAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTC GAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATTTC AAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTT AAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGTTGGTTTCTTTT CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACT CCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCCTACCTGATTTGAGGTCAAACT TTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGT TTAAGAACATTGTTCGCCTAGACGCTCTCTTCTTATCGATAACGTTCCAATACGCTCAGT ATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCA ATAAAAAAGATTAGCCGCAGTTGGTAAAACCTAAAACGACCGTACTTGCATTATACCTCA AGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGaaaaaaaaa AGCACGCAGAGAAACCTCTCTTTGGAAAAAAAAA 60 962 120 902 180 842 240 782 300 722 360 662 394 628 Hình 1: Trình tự nucleotide đoạn gen 18S rARN chủng QN1 1987 TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG Hình 2: Chủng QN1 môi trƣờng thạch đĩa ảnh tiêu nhuộn Gram (×40) Bảng Đánh giá mức độ tƣơng đồng trình tự đoạn gen 18S rRNA chủng QN1 Tên loài Saccharomyces cerevisiae Tên chủng YZ Mã số truy cập KT459474.1 Độ tương đồng (%) 100 Qua kết giải mã trình tự gen, chúng tơi nhận thấy trình tự đoạn gen 18S rRNA chủng nấm men BĐ1 tương đồng 100% với trình tự đoạn gen 18S rRNA chủng Saccharomyces cerevisiae YZ, KT459474.1 Chủng QN1 xếp vào chi Saccharomyces, lồi Saccharomyces cerevisiae Chúng tơi đặt tên loài Saccharomyces cerevisiae QN1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid thời gian đến trình thủy phân bèo Nhật Bản Phản ứng thủy phân tiến hành nồng độ acid H 2SO4 loãng từ 0,5 - 2% 1000C thời điểm khác qua lặp lại lần kết thể hình 1,5 Hàm lượng đường khử(g/l) 0,5 H2SO4(%) 2.5 2 1.5 1,5 1 0.5 0,5 30 60 90 120 150 180 Thời gian (phút) Hình 3: Ảnh hƣởng nồng độ acid thời gian đến phản ứng thủy phân 1988 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Kết hình cho thấy, khoảng thời gian từ 30 – 120 phút hàm lượng đường khử tạo thành dịch thủy phânbèo Nhật Bản nồng độ acid H2SO4tăng tỷ lệ thuận với thời gian phản ứng Tại thời điểm 120 phút hàm lượng đường khử có giá trị cao (2,208 g/l) ứng với nồng độ acid H2SO4 1%, tiếp đến (2,198 g/l) nồng độ H2SO4 1,5% thấp (2,193 g/l) nồng độ H 2SO4 0,5%… Với kết khảo sát này, theo việc sử dụng nồng độ acid H 2SO4 1% để thực phản ứng thủy phân bèo Nhật Bản thời gian 120 phút thích hợp cho việc thu nhận dung dịch đường khử Theo nghiên cứu Das Arpan bèo Nhật Bản xử lý với tỷ lệ rắn lỏng 1:10 (w/v) acid sulfuric 2% nhiệt độ áp suất cao, lượng đường khử thu tối đa 425,6 mg/g [4] Theo kết nghiên cứu Nguyễn Xuân Cự (2010),thì trình thủy phân thân ngô H2SO42% 120oC 60 phút với tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch H 2SO42% 1/10 (w/v) có hàm lượng đường khử tạo thành cao (4,2 g/l) dung dịch [3] Kết lên men ethanol dịch thủy phân b o Nhật Bản Từ kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ acid thời gian đến trình thủy phân bèo Nhật Bản, chọn nồng độ H 2SO4 1% thời gian cho phản ứng thủy phân 120 phút Tiến hành thủy phân bèo Nhật Bản H 2SO4 1% thời gian 120 phút, sau lọc lấy dịch trung hòa NaOH 1M Hàm lượng ethanol (%) Thực trình lên men: phân phối dịch thủy phân bèo Nhật Bản trung hịa vào bình lên men, bình 100 ml khử trùng 1at 60 phút Sau dùng pipet vơ trùng lấy 1ml dịch từ bình nuôi cấy chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae QN1 cho vào bình lên men Ni nhiệt độ phịng từ 25-29oC Sau 24 giờ, tiến hành lấy – ml để xác định nồng độ ethanol tạo thành phương pháp trắc quang máy Cobas C311 Analyzer hãng Hitachi (hình 4) 20 18 16 14 12 10 18.969 16.533 14.871 11.067 9.618 24 48 72 96 120 144 Thời gian (giờ) Hình 4: Hàm lƣợng ethanol tạo thành theo thời gian lên men qua lần lặp lại Kết khảo sát qua lần lặp lại thể hình cho thấy:hàm lượng ethanol tạo thành cao ngày thứ sau lên men đạt 18,696%, ngày sau hàm lượng ethanol có xu hướng giảm dần Theo chúng tôi, thời gian ngày khoảng thời gian nấm men thích nghi với mơi trường chất phản ứng lên men tạo ethanol tăng mạnh Trong điều kiện lên men kỵ khí, ngồi ethanol tạo thành cịn có nhiều sản phẩm phụ khác acid lactic, 1989 TIỂU BAN SINH THÁI HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG phenol, furfural… làm hạn chế khả lên men vi sinh vật nên Mặt khác, nồng độ ethanol đạt cao hoạt động chủng nấm men bị kìm hãm chủng khơng lên men để chuyển hóa đường thành ethanol, nồng độ ethanol từ ngày thứ trở giảm dần Kết Kumar sau lên men dịch thủy phân bèo Nhật Bản với H2SO4 2% chủng nấm men Pichia stipitis NCIM-3497 thu ethanol với hàm lượng 0,425 g/g [6] Theo nghiên cứu Isarankura-Na-Ayudhya, ban đầu thủy phân bèo Nhật Bản với acid sulfuric 10% sau lên men dịch thủy phân chủng nấm Candida shehatae Kết thu hệ số sản xuất ethanol tối đa 0,19 g/g suất 0,008 g/l/h [5] Cũng so với kết Satyanagalakshmi nghiên cứu sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu bèo Nhật Bản xử lý với H2SO4 4% Trong điều kiện tối ưu, thu bioethanol với hiệu suất thực tế 59,3% [9] III KẾT LUẬN Đã phân lập 17 chủng nấm men từ nguồn khác nhau, có 12 chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol Kết khảo sát hoạt tính lên men ethanol phương pháp Durham chủng QN1 11 cm cao so với chủng nấm men cịn lại Bằng phương pháp giải trình tự gen 18S rRNA tra cứu Gen Bank, kết định danh chủng QN1 loài Saccharomyces cerevisiae, xếp vào chi Saccharomyces Các thông số tối ưu cho trình thủy phân bèo Nhật Bản dung dịch acid H2SO4 loãng: thời gian thủy phân 120 phút với acid H2SO4 1% nhiệt độ 1000C Sau trình lên men dịch thủy phân bèo Nhật Bản Saccharomyces cerevisiae QN1, hàm lượng ethanol đạt giá trị cao 18,969 g/l thời điểm 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lý Nguyễn Bình, Trần Văn Khánh, Hà Phƣơng Thảo, Nguyễn Văn Thành,2015 ―Phân lập tuyển chọn nấm men có hoạt lực cao từ men rượu‖ Tạp ch Khoa học Trường Đai học Cần Thơ, tr 18–28 Phạm Thị Trân Châu, 2007.Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo dục Nguyễn Xuân Cự, 2010.―Nghiên cứu khả thủy phân axít lỗng bước đầu đánh giá hiệu sản xuất etanol sinh học từ thân ngơ‖, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tụ nhiên Công nghệ (26), tr 211 – 216 Das Arpan, et al, 2016 "Production of bioethanol as useful biofuel through the bioconversion of water hyacinth (Eichhornia crassipes)." Biotech 6.1: – Isarankura-Na-Ayudhya, C., Kongpanpee, T., Prabkate, P., Prachayasittikul, V., & Tantimongcolwat, T.,2007 Appropriate technology for the bioconversion of water hyacinth (Eichhornia crassipes) to liquid ethanol Kumar, Ashish, L K Singh, Sanjoy Ghosh., 2009 "Bioconversion of lignocellulosic fraction of water-hyacinth (Eichhornia crassipes) hemicellulose acid hydrolysate to ethanol by Pichia stipitis." Bioresource Technology 100.13: 3293-3297 Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003.Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập - Thí nghiệm vi sinh vật học, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 1990 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ Lê Thanh Mai,2009.Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, NXB giáo dục, Hà Nội Satyanagalakshmi, K., Sindhu, R., Binod, P., Janu, K U., Sukumaran, R K., & Pandey, A, 2011 Bioethanol production from acid pretreated water hyacinth by separate hydrolysis and fermentation 10 Nguyễn Minh Trí, Ngơ Nguyễn Quỳnh Chi, 2016 Xử lý bèo Nhật Bản chế phẩm sinh học Vixura tạo nguồn phân hữu sinh học, Tạp chí KH&CN, trường ĐHKH Huế Tập: 4, Số: 1, tr: 115-120 SELECTION OF HIGH PERFORMANCE YEAST STRAIN AND INITIAL EVALUATION OFETHANOL FERMENTATION EFFICIENCY WITH DILUTE ACID DILUTED Nguyen Minh Tri, Ho Phan Ngoc Thuy SUMMARY The study was carried out with the aim of selecting domesticated yeast strains to increase the performance of ethanol fermentation The study was conducted based on the yeast strains isolated from traditional yeast cake: Ba Don, Saigon, Hue, yeast breads, distillers Sake and ripe fruits In total, we had 17 yeast strains Of which, the QN1 yeast strains has high ethanol fermentation activity and good heat resistance compare with the other strains By sequencing the 18S rRNA gene and looking up Gen Bank, the results of identifying candidate BĐ1 are classified as Candida species, Candida tropicalis The optimal parameters for hydrolysis of Eichhornia crassipes is at concentration of dilute acid: The hydrolysis time is 120 minutes with 1% H2SO4 at 100oC After fermenting the Eichhornia crassipes with Saccharomyces cerevisiae QN1, ethanol reached the highest value of 18,969 g / l at 48 hours 1991 ... sát hoạt lực lên men ethanol chủng nấm men Để xác định hoạt lực lên men chủng nấm men dựa vào khả sinh khí CO2 q trình lên men Tuy nhiên thời gian lên men ống Durham ngắn, trình lên men rượu có. .. điểm đầu trình lên men, đa số chủng nấm men có khả lên men tạo khí CO2 Chủng QN1 có chiều cao cột khí cao so với chủng lại, cho thấy chủng có khả lên men nhanh Sau 36 lên men, chiều cao cột khí... thu bioethanol với hiệu suất thực tế 59,3% [9] III KẾT LUẬN Đã phân lập 17 chủng nấm men từ nguồn khác nhau, có 12 chủng nấm men có hoạt tính lên men ethanol Kết khảo sát hoạt tính lên men ethanol