Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng trong sản xuất whisky từ malt đại mạch và ngô tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN V N QUY N NGHI N C U TUYỂN CHỌN CH NG N M M N ĐỂ NG NG TRONG S N XU T WHIS Y T M T ĐẠI MẠCH VÀ NG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9.42.01.07 TÓM TẮT UẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2020 Cơng trình hoàn thành tại: TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Ngu ễn Qu ng Th o GS TS Ngu ễn Th nh Đ t Ph n biện : GS TS Ho ng Đình Hò Ph n biện : PGS TS Đinh Thị im Nhung Ph n biện 3: PGS TS Vƣơng Trọng H o Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội vào hồi … … ngày … tháng… năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Quốc Gia, Hà Nội Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ Đ U Lí chọn đề tài Whisky thuộc loại rượu mạnh (độ rượu từ 40 – 50% Vol) sản xuất cách chưng cất dịch lên men số loại ngũ cốc (đại mạch, lúa mì, ngơ, lúa gạo, ), rượu sau chưng cất tàng trữ với gỗ sồi thời gian dài để hoàn thiện hương, vị, mầu sắc đặc trưng sản ph m Mỗi loại whisky có hương vị đặc trưng riêng khác v : chất lượng nguyên liệu sản xuất, chủng nấm men, u kiện kh hậu, quy trình sản xuất, thời gian u kiện tàng trữ,… Theo MarketLine: Giá trị thị trường rượu mạnh vượt mức 306 tỷ USD vào năm 2015, tốc độ tăng trưởng năm năm gần đạt 17%, sản lượng tiêu thụ tăng từ 19 tỷ lít (2010) lên 22 tỷ lít (2015), tăng 10% dẫn đầu thị trường whisky (chiếm 27% thị phần) Châu Âu, Ấn Độ, Mỹ thị trường tiêu thụ số mặt hàng này, chiếm 48% thị trường giới Quy mơ thị trường rượu mạnh tồn cầu định giá 336 tỷ USD vào năm 2016 dự kiến chứng kiến mức tăng trưởng hàng năm (CAGR) 33,4% từ năm 2017 đến năm 2025 thị trường Mỹ Nhu cầu sử dụng rượu cao độ nói chung whisky nói riêng Việt Nam khoảng từ 500 520 triệu lít/năm Rượu cao độ (chủ yếu loại rượu Whisky, Cognac Vodka,…) hàng năm nhập kh u tiêu thụ Việt Nam chiếm khoảng 20% tổng sản lượng rượu thị trường (trong dòng rượu whisky chiếm thị phần lớn 30%) Việt Nam lại chưa sản xuất loại rượu nên phải nhập kh u với số lượng lớn ngoại tệ, ảnh hưởng không nhỏ đến phát triển b n vững v kinh tế Việt Nam Việt Nam có ti m v nguyên liệu (vi sinh vật, ngũ cốc,…) để sản xuất rượu whisky, để chủ động sản xuất rượu whisky Việt Nam, chọn đ tài: “N u tuyển chọn chủng nấm me để ng dụ tr s xuất w s y t m t đ m v ” với mong muốn đóng góp phần v kiến thức khoa học, cơng nghệ, bước hồn thiện nâng cao quy mô sản xuất rượu whisky Việt Nam, tạo sản ph m có chất lượng tốt, an tồn, có giá trị kinh tế cao, bước hạn chế nhập kh u, góp phân ổn định kinh tế quốc gia Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn – chủng nấm men có chất lượng tốt, đáp ứng yêu cầu công nghệ chất lượng sản ph m ác định số đặc điểm hình thái, sinh l , sinh hóa, di truy n định tên khoa học chủng nấm men đ tuyển chọn Ứng dụng chủng nấm men đ tuyển chọn để nghiên cứu sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch ngơ Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch sản ph m đạt tiêu chu n chất lượng an toàn thực ph m theo quy định Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ sản xuất chất lượng sản ph m rượu whisky; 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học (đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh trưởng, phát triển) định danh tên khoa học chủng nấm men đ tuyển chọn 3.3 Nghiên cứu động học qúa trình lên men rượu 3.4 Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch 3.5 Ứng dụng quy trình cơng nghệ sản xuất thử nghiệm sản ph m sở sản xuất rượu Kết qu đ đ t đƣợc 4.1 Tuyển chọn 01 chủng nấm men đáp ứng yêu cầu công nghệ chất lượng sản ph m rượu whisky 4.2 ác định đặc điểm sinh học, di truy n định tên khoa học đến loài cho chủng nấm men đ tuyển chọn Saccharomyces cerevisiae MS42 4.3 Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch 4.4 Sản xuất 10.000 l t rượu whisky từ ngô malt đại mạch Công ty cổ phần TNHH MTV Bia- Rượu Eresson Việt Nam Công ty cổ phần TNHH MTV Bia- Rượu Eresson Việt Nam (gồm sản ph m: Whisky 100% malt; Whisky 100% ngô; Whisky 20% matl 80% ngô), sản ph m đ u đạt quy chu n kỹ thuật quốc gia An toàn thực ph m sản ph m đồ uống có cồn theo quy định Ý nghĩ kho học thực tiễn - Về mặt khoa học Đ tài đ tuyển chọn chủng nấm men Việt Nam gỗ sồi S8 phù hợp để sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch Chủng nấm men có khả sinh trưởng phát triển mạnh môi trường malt, ngô, hiệu suất lên men đạt từ 89,51 – 91,40%, 25oC, pH 5,0 – 5,5, có khả lên men rượu đạt 12,3 oVol, sản ph m có hương, vị đặc trưng rượu whisky Cung cấp sở khoa học v quy trình cơng nghệ sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch (đặc biệt trình hình thành biến đổi số chất tạo hương đặc trưng rượu whisky qúa trình tàng trữ) phù hợp với u kiện thực tiễn Việt Nam - Về mặt thực tiễn Đ tài ứng dụng vào thực tiễn sản xuất doanh nghiêp đ tạo sản ph m có chất lượng tốt, đạt Tiêu chu n chất lượng an toàn thực ph m theo quy định, khách hàng Trung Quốc Singapore đánh giá cao Việc sản xuất whisky Việt Nam góp phần khai thác có hiệu nguồn ngun liệu (ngơ, chủng nấm men,…) có Việt Nam để chủ động sản xuất loại sản ph m cao cấp Việt Nam bước hạn chế nhập kh u ngoại tệ tiến tới xuất kh u sản ph m đặc trưng Việt Nam Những đóng góp luận án 6.1 Tuyển chọn định danh khoa học 01 chủng nấm men phân lập từ nguồn bánh men rượu truy n thống x Mẫu Sơn, huyện Bình Lộc, tỉnh Lạng Sơn (Saccharomyces cerevisiae MS42) đạt tiêu ch để sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch như: Có khả lên men dịch đường hóa từ malt đại mạch ngơ tạo độ rượu đạt 12,3%Vol 25oC, tạo hương, vị tốt, đặc trưng cho sản ph m Chủng M42 có khả sinh trưởng tốt môi trường malt (M), ngô (N) sau 36 – 48 nuôi cấy đạt số lượng tế bào tối đa từ 213 x 106 – 215 x 106 tế bào/ml Lên men rượu tối ưu từ dịch lên men có hàm lượng đường:160 – 180g/l; pHopt: 5,0 – 5,5; Topt = 20 – 30oC đạt độ cồn: 9,00 – 9,91%Vol Hiệu suất lên men từ 89,52 – 91,13%, tạo t độc tố methanol, acetaldehyde, fufurol 6.2 ác định loại nguyên liệu phù hợp để sản xuất rượu whisky gồm: Malt, ngơ có Việt Nam gỗ sồi (k hiệu S8) nhập kh u từ Mỹ Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch phù hợp với u kiện thực tiễn Việt Nam 6.3 Bước đầu nghiên cứu hình thành biến đổi số chất tạo hương rượu whisky trình tàng trữ rượu với gỗ sồi 6.4 Cung cấp sở khoa học v chủng nấm men quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch, ngô áp dụng sản xuất quy mô thực nghiệm Việt Nam đ tạo loại sản ph m whisky: 100% malt; 100% ngô 20% malt + 80% ngô Sản ph m đạt tiêu chu n chất lượng an toàn thực ph m theo quy định Cấu trúc luận án Luận án cấu trúc làm phần: mở đầu, nội dung, kết luận, danh mục cơng trình khoa học đ cơng bố, tài liệu tham khảo phụ lục Phần nội dung luận án triển khai thành ba chương sau: Chương 1: Tổng quan vấn đ nghiên cứu (38 trang) Chương 2: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (20 trang) Chương 3: Kết thảo luận (80 trang) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm men 1.1.1 Đ ươ nấm men Nấm men nhóm nấm đơn bào tập hợp đơn bào, có k ch thước, đường kính tế bào từ – 10 μm Tuỳ lồi nấm men tế bào có hình cầu, hình trứng, hình ovan, hình chanh, hình el p, hình mũ phớt, hình thổ, hình li m, hình thoi, hình cung nhọn, hình tam giác, hình chai, hình thấu kính, hình lê, hình bán cầu có rìa hẹp,… Thành tế bào nấm men Saccharomyces có cấu tạo chủ yếu từ mannam glucan, số chi có thêm kitin Màng tế bào chất gồm lớp phân tử phospholipid với mối liên kết este đặc trưng cho màng vi sinh vật nhân thực Trong tế bào chất có bào quan như: nhân, ti thể, riboxơm, khơng bào, thể Golgi,… Nhân tế bào Saccharomyces cerevisiae có 16 nhiễm sắc thể (đơn bội – 1n) 16 cặp nhiễm sắc thể (lưỡng bội – 2n) Ngoài nhân có nhi u yếu tố di truy n khác plasmid, yếu tố di truyền vận động (Transposon) Nấm men trì nòi giống hai hình thức sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính Tuy nhiên, có ln phiên sinh sản vơ tính hữu tính với giai đoạn đơn bội, lưỡng bội khác vòng đời nấm men t y theo môi trường Hiện nay, nấm men đ xác định được: 1110 loài/ 58 chi/ 17 họ / Bộ Saccharomycetales/ Lớp Saccharomycetes/ Ngành Ascomycota 1.1.2 Nhu cầu d dưỡ b n nấm men Nấm men có khả sinh trưởng phát triển u kiện hiếu khí kị khí Các q trình trao đổi chất khác nhau, nhu cầu dinh dưỡng khác Trong môi trường nuôi cấy cung cấp đầy đủ nhân tố cần thiết để tế bào nấm men sinh trưởng phát triển Tỉ lệ nguyên tố sinh khối tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae C: 1,72; O: 0,44; N: 0,15 1.1.3 Nấm men công nghệ s n xuất rượu 1.1.3.1 Tiêu chuẩn chủng nấm men sản xuất rượu - Sinh trưởng mạnh dịch đường lên men, sử dụng nhi u loại đường (glucose, maltose, maltotriose, ) - Có khả tiết hệ enzyme để lên men hiệu - Có khả lên men tạo độ cồn cao trình lên men (12 – 15%Vol) - Chịu chất kháng khu n (SO2) biến động u kiện lên men (pH: 4,5 – 6,5; Nhiệt độ: 16 – 35oC) - Tạo hương giá trị cảm quan tốt, đặc trưng cho sản ph m, sinh độc tố, không tạo vị lạ không mong muốn - Ổn định lâu dài sản xuất - Ngoài tuỳ theo công nghệ yêu cầu v chất lượng sản ph m mà chủng nấm men sử dụng cần phải có thêm yêu cầu cụ thể khác như: khả tạo hương u kiện khác nhau, sử dụng loại đường,… 1.1.3.2 Các chủng nấm men sử dụng sản xuất rượu Trong sản xuất rượu thường sử dụng 15 chi điển hình tham gia lên men rượu Trong sản xuất rượu, loài sử dụng rộng rãi là: Saccharomyces cerevisiae Rƣợu whisk 1.2.1 P â rượu w s y Rượu whisky thuộc loại rượu mạnh sản xuất cách chưng cất dịch lên men rượu từ số loại ngũ cốc (malt đại mạch, lúa mì, ngô, lúa gạo, ), sau chưng cất, rượu tàng trữ với gỗ sồi thời gian định Whisky phân loại nhi u cách khác nhau: * Phân loại theo nguyên liệu sử dụng để sản xuất: - Malt whisky (Single Malt Whisky): loại whisky làm từ 100% malt đại mạch - Grain whisky: loại whisky sản xuất từ malt đại mạch có bổ sung thay tỷ lệ hạt ngũ cốc đinh thường ngô - Rye: loại whisky chủ yếu sản xuất từ 51% lúa mạch đen - Bourbon: loại whisky chủ yếu sản xuất từ 51% ngơ, chưng cất tối đa 81%Vol cồn tàng trữ tối đa 61%Vol cồn * Phân loại theo nguyên liệu kỹ thuật sản xuất: - Single: loại whisky sản xuất từ loại nguyên liệu chuyên biệt tạo sản ph m riêng khiết, không phối trộn (thường dùng cho whisky Scotland: (Single-Malt-Whisky) - Straight: loại whisky sản xuất từ loại nguyên liệu chuyên biệt (thường dùng cho whisky Mỹ) - Blend: loại whisky đ pha trộn Trong trình sản xuất nhi u loại whisky khác từ nhi u lò nấu rượu khác pha đấu vào với Trong số sản ph m có đến 70 loại whisky khác - Pot Still: loại whisky sản xuất dùng loại bình nấu cổ điển (thường dùng cho số loại whisky Ireland) - Pure Pot Still: loại whisky sản xuất dùng mạch nha bình nấu rượu cổ điển (thường dùng cho số loại whisky riêng lẻ Ireland) 1.2.2.Công nghệ s n xuất rượu whisky 1.2.2.1 Nguyên liệu sản xuất Nguyên liệu ch nh để sản xuất whisky đại mạch nảy mầm số trường hợp có sử dụng tỷ lệ định loại ngũ cốc nảy mầm khác như: ngô, lúa mì đen, đại mạch, rượu sản xuất từ malt đại mạch đánh giá có chất lượng, cảm quan hiệu kinh tế cao Tại Mỹ Canada, ngơ ngun liệu cho sản xuất whisky có hàm lượng tinh bột cao (khoảng 67 - 69%) Gỗ sồi có thành ph n chủ yếu gồm: cellulose (38-52%), hemicellulose (25-30%), lignin (22-25%) tannin (5-10%) Thành tế bào gồm có phân tử cellulose, hemicellulose lignin, khu vực gian bào bao gồm chủ yếu lignin Hợp chất polyphenolic gỗ sồi có chức quan trọng tuổi rượu Polyphenol sồi có vai trò quan trọng trưởng thành rượu, ngồi có ảnh hưởng kết hợp với hiệu ứng chống oxy hóa mạnh để tạo góp phần tạo hương, vị rượu ngâm sồi Các hợp chất thường phân loại thành ba chính: nhóm phenol dễ bay hơi; axit phenolic ellagitannins 1.2.2.2 Công nghệ sản xuất rượu whisky Nguyên liệu (Matl/ đại mạch/ngô) nghi n nhỏ đường hóa (trường hợp sử dụng ngơ đại mạch có bổ sung enzyme amylase) để thu dịch đường (khoảng 8-120 Bx), dịch đường sau u chỉnh pH, nhiệt độ, sử dụng trực tiếp để lên men tạo rượu Qúa trình lên men thực thùng gỗ sồi Tank inox (tùy theo yêu cầu công nghệ, quy mô sản xuất) Nấm men Sacharomyces cerevisiae bổ sung vào dịch lên men để tiến hành qúa trình lên men tạo rượu, thời gian lên men thường từ 5-8 ngày (tùy theo chất lượng dịch u kiện lên men) Kết thúc trình lên men, dịch dấm chưng cất lần để độ rượu đạt 63-68%Vol Rượu 63-68%Vol ngâm thùng gỗ sồi (theo công nghệ truy n thống) ngâm với gỗ sồi (dạng thanh) Tank inox (khi sản xuất quy mơ lớn) để rượu trích ly chất thơm có gỗ sồi qúa trình tàng trữ tạo hương, vị đặc trưng rượu whisky Thời gian ủ gỗ sồi không t năm thường kéo dài hàng chục ch hàng trăm năm t y theo yêu cầu chất lượng loại rượu whisky độ rượu giảm dần theo thời gian ủ tàng trữ Kết thúc trình ủ hương, chuyên gia định phương án phối chế loại rượu (hoặc phối chế rượu cao độ với nước m m) để tạo loại rượu thương ph m có chất lượng cảm quan độ rượu theo yêu cầu hãng 1.2.3 Tình hình nghiên c u s n xuất rượu whisky t i Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất rượu whisky Việt Nam hạn chế Năm 2006, Đặng Tất Thành đ thực đ tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để sản xuất rượu cao độ từ malt đại mạch" quy mô thực nghiệm Năm 2008, Nguyễn Đức Quang (Viện nghiên cứu Bia Rượu Nước giải khát) đ thực đ tài “Nghiên cứu sản xuất rượu có độ cồn cao từ nguồn Đại mạch Việt Nam” đ xây dựng qui trình cơng nghệ sản xuất thử với qui mơ 40 lít/mẻ 150 lít/mẻ, hiệu suất thu hồi 88%, rượu có độ cồn 30%Vol, chất lượng sản ph m tốt Các đ tài tập trung tuyển chọn nấm men lên men tạo rượu để thu hồi rượu cao độ từ matl đại mạch, sản ph m chưa phải rượu whisky chưa có nghiên cứu qúa trình l o hóa rượu cúng sử dụng gỗ sồi để tạo hương, vị rượu whisky Năm 2016, Nguyễn Minh Thu (Viện Công nghiệp thực ph m) thực đ tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu Whisky từ malt đại mạch nguyên liệu thay Việt Nam” thuộc “Đ án ứng dụng phát triển công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020”, bước đầu đ đưa quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky có sử dụng ngơ gạo làm ngun liệu thay Trong cơng nghệ có sử dụng gỗ sồi (dạng phôi bào bột), nhiên chưa có nghiên cứu sâu v qúa trình tạo hương, vị đặc trưng rượu whisky kiến thức khoa học v công nghệ chất lượng cảm quan sản ph m trình tàng trữ nên sản ph m chưa thương mại hóa Cơng ty TNHH Một thành viên ERESSON đ đầu tư hệ thống thiết bị sản xuất thử nghiệm rượu whisky từ malt đại mạch tạo rượu có chất lượng tốt, nhiên Cơng ty chưa có nghiên cứu sâu khoa học v sử dụng gỗ sồi trình ủ để tạo hương, vị đặc trưng cho sản ph m whisky nên sản ph m chưa đủ u kiện để thương mại hóa sản xuất quy mơ lớn Do vậy, việc nghiên cứu để hồn thiện cơng nghệ sản xuất rượu whisky Việt Nam đảm bảo tính khoa học từ khâu tuyển chọn nấm men phù hợp, xác định nguyên liệu, gỗ sồi, công nghệ sản xuất, tàng trữ,… đến sản ph m đủ u kiện thương mại cần thiết cấp bách để đáp ứng nhu cầu thị trường CHƢƠNG NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U 2.1 Nguyên liệu - Nguồn nấm men để phân lập tuyển chọn: 107 dòng nấm men phân lập tuyển chọn từ nguồn bánh men rượu truy n thống: Men Hồng Mi Bản Phố, Bắc Hà, Lào Cai; Men Mẫu Sơn xã Mẫu Sơn, Lộc Bình, Lạng Sơn; Men làng Vân làng Vân Xá, xã Vân Hà,Việt Yên, Bắc Giang; Chủng Saccharomyces cerevisiae TCCY thuộc ngân hàng giống ĐHQG Hà Nội; 04 chủng Saccharomyces cerevisiae Viện Công nghiệp thực ph m bao gồm: TN2, EC1118, BDX, R2226 - Malt: Malt đại mạch nghiên cứu sử dụng gồm: 02 loại malt premium, xuất xứ Barly - Sebastian (Pháp) Buloke (Úc) Sản ph m công ty Đường Malt (Bắc Ninh) nhập kh u - Ngô DK9955: giống ngô lai hạt vàng Đơn vị cung cấp: cửa hàng tư nhân Nguyễn Thị Vân Anh, địa chỉ: thị trấn Quang Minh, huyện Mê Linh, Hà Nội - Gỗ sồi: sử dụng để nghiên cứu 24 loại sồi thương ph m d ng để ngâm rượu Mỹ, Pháp Australia, cụ thể: Sồi Australia bao gồm loại: Arobois HM, Arobois Aroneo, INTENSE, BALANCED, SAVORY; Sồi Mỹ bao gồm loại, kí hiệu: BLA42, CSA12, CSA32, CSA02, CXA02, CXA32, CXA12, MSA42, TXA 82HV; Sồi Pháp bao gồm 10 loại, kí hiệu: CXF00F, CXF02, SLF12, CSF30, CSF02F, CXF32, CXF12, BLF42, MSF42, TXF 82HV Các mẫu gỗ sồi sử dụng nghiên cứu chúng tơi mã hóa từ: S1 – S24 Môi trƣờng 2.2.1 M trường giữ giống 2.2.1.1 Môi trường Hansen (ký hiệu là: M1) 2.2.1.2 Môi trường dịch chiết malt - aga (ký hiệu là: M2) 2.2.2 M trường nhân sinh khối nấm men YPD 2.2.3 M trường nhân giố ơb n 2.2.4 M trườ xá định kh ă s trưởng lên men nấm men Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 P ươ p áp v s vật sinh học phân tử 2.3.1.1 Phân lập nấm men 2.3.1.2 Xác định số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu 2.3.1.3 Xác định đặc điểm quần thể tế bào nấm men 2.3.1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử định tên khoa học nấm men 2.3.2 P ươ p áp - lý 2.3.2.1 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp DNS 2.3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số (Phenol – axit sunfuric) 2.3.2.3 Xác định hàm lượng axit tổng số theo phương pháp trực tiếp 2.3.2.4 Xác định hàm lượng este theo phương pháp định phân TCVN 378-86 2.3.2.5 Xác định hàm lượng aldehyde theo sắc ký khí 2.3.2.6 Xác định protein hòa tan (phương pháp Lowry) 2.3.2.7 Xác định hàm lượng axit amin tự (FAN) theo [TCVN 8764:2012] 2.3.2.8 Xác định hàm lượng acetaldehyde (Phương pháp sắc ký khí) 2.3.2.9 Xác định hàm lượng metanol(Phương pháp sắc ký khí) 2.3.2.10 Xác định số chất thơm rượu (Phương pháp sắc ký khí) 2.3.3 P ươ p áp m quan Phương pháp cảm quan cho điểm: Theo TCVN 3217 – 79 2.3.4 P ươ p áp t ọc - Tính trung bình tổng thể - Độ lệch tiêu chu n tổng thể - Hệ số biến thiên trung bình tổng thể: - Xử lý số liệu thống kê: phần m m Excel CHƢƠNG NỘI DUNG VÀ KẾT QU NGHIÊN C U 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm men phù hợp 3.1.1 Tiêu chuẩn tuyển chọn nấm men - Sinh trưởng mạnh dịch đường lên men, sử dụng nhi u loại đường (glucose, maltose, maltotriose, ) - Có khả tiết hệ enzyme để lên men hiệu - Có khả lên men dịch malt, ngơ tạo độ cồn cao (12 – 15%Vol) - Chịu chất kháng khu n (SO2) biến động rộng số u kiện lên men (pH: 4,5 – 6,5; Nhiệt độ: 16 – 35oC) - Tạo hương, vị, đặc trưng cho sản ph m, sinh độc tố, không tạo vị lạ không mong muốn - Ổn định chất lượng sản xuất, đáp ứng yêu cầu sản xuất quy mô lớn 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men 3.1.2.1 Nguồn nấm men Từ nguồn bánh men rượu truy n thống: Men Hồng Mi Bản Phố, Bắc Hà, Lào Cai; Men Mẫu Sơn xã Mẫu Sơn, Lộc Bình, Lạng Sơn; Men làng Vân làng Vân Xá, xã Vân Hà, Việt Yên, Bắc Giang Kết thu 107 dòng nấm men, đó: Nguồn bánh men Bắc Hà (BH) phân lập 42 dòng: BH1 – BH42; Nguồn bánh men Mẫu Sơn (MS) phân lập 43 dòng: MS1 – MS43; Nguồn bánh men Làng Vân (LV) phân lập 22 dòng: LV1 – LV22 3.1.2.2 Đánh giá khả lên men tạo hương vị đặc trưng Từ dòng nấm men đ phân lập, tiến hành lên men lần 1, loại môi trường 100% malt 100% ngô Sau thời gian lên men 10 ngày, t = 25oC, chiết dịch lên men chưng cất tiến hành đánh giá cảm quan lần nồng độ rượu 40%Vol theo phương pháp cho điểm TCVN 321579 Kết đ thu 15 dòng có khả lên men tốt, tạo sản ph m cảm quan đặc trưng, có khả tạo hương vị tốt, điểm cảm quan loại 15,2 điểm, cụ thể: - Men lá, từ men Mẫu Sơn – Lạng Sơn (03 dòng): MS18, MS40, MS42; - Men Hồng Mi, Bắc Hà - Lào Cai (10 dòng): BH1, BH2, BH19, BH20, BH24, BH30, BH33, BH34, BH41, BH42; - Men làng Vân, Việt Yên - Bắc Giang (02 dòng): LV4, LV22 Kết qủa chi tiết khả lên men 15 dòng môi trường malt (M) môi trường ngô (N) thu (Bảng 3.1; Bảng 3.2): Bảng 3.1: Kết phân t ch đánh giá cảm quan 15 dòng nấm men (trên mơi trường malt - M) Đánh giá cảm quan (TCVN 3215-79) Phần Hiệu Đường Đường sót trăm suất Độ Dòng khử (quy v cồn lên Hệ Hệ Hệ TT nấm (quy v Tổng maltose) thực men số Mùi số Vị số men maltose) điểm g/l tế (% rượu màu (0,8) (1,2) (2,0) g/l Vol) (%) sắc LV4 170,6 2,08 ± 0,1 8,5 78,40 3,6 0,8 3,9 1,2 3,7 2,0 15,0 LV22 170,6 3,26 ± 0,2 9,2 85,45 4,6 0,8 4,2 1,2 3,8 2,0 16,3 MS18 170,6 3,24 ± 0,2 9,2 86,44 4,5 0,8 4,3 1,2 3,7 2,0 16,3 MS40 170,6 3,01 ± 0,2 9,5 88,11 4,5 0,8 4,1 1,2 3,8 2,0 16,1 MS42 170,6 2,05 ± 0,2 9,7 89,45 4,5 0,8 4,3 1,2 3,9 2,0 16,6 BH1 170,6 3,24 ± 0,2 9,0 83,58 4,3 0,8 3,1 1,2 3,9 2,0 15,0 BH2 170,6 2,95 ± 0,1 9,0 83,44 4,6 0,8 3,9 1,2 3,7 2,0 15,8 BH19 170,6 3,25 ± 0,2 9,5 88,23 4,5 0,8 3,9 1,2 3,9 2,0 16,1 BH20 170,6 2,16 ± 0,1 8,8 81,20 4,1 0,8 3,1 1,2 4,2 2,0 15,4 10 BH24 170,6 5,23 ± 0,2 9,2 86,47 3,5 0,8 4,1 1,2 3,9 2,0 15,5 11 BH30 170,6 5,62 ± 0,2 9,0 84,79 4,6 0,8 4,1 1,2 3,8 2,0 16,2 12 BH33 170,6 3,01 ± 0,2 9,5 88,11 4,2 0,8 3,4 1,2 4,2 2,0 15,8 13 BH34 170,6 5,28 ± 0,2 9,0 84,62 4,1 0,8 3,2 1,2 4,1 2,0 15,3 14 BH41 170,6 5,28 ± 0,3 8,5 79,91 3,9 0,8 3,1 1,2 4,3 2,0 15,4 15 BH42 170,6 2,95 ± 0,2 9,2 85,29 4,2 0,8 3,8 1,2 3,6 2,0 15,2 Kết cho thấy: Trên môi trường dịch 100% malt, chủng MS42 đạt điểm cao 16,6 điểm, tiếp đến chủng LV22 đạt 16,3 điểm chủng BH30 đạt 16,2 điểm Hiệu suất lên men cao nhất: MS42 đạt 89,45%; BH19 đạt 88,23%; MS40 đạt 88,11% Bảng 3.2: Kết phân t ch đánh giá cảm quan 15 dòng nấm men (trên mơi trường ngơ - N) TT Dòng nấm men Đường khử (quy v maltose) g/l 10 11 12 13 14 15 LV4 LV22 MS18 MS40 MS42 BH1 BH2 BH19 BH20 BH24 BH30 BH33 BH34 BH41 BH42 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 169,3 Đường sót (quy v maltose) g/l 2,58± 0,2 3,26± 0,2 3,28± 0,2 3,05± 0,2 2,16± 0,1 3,64± 0,2 2,15± 0,1 3,65± 0,2 2,56± 0,2 5,63± 0,3 4,02± 0,2 3,41± 0,2 3,28± 0,2 5,68± 0,3 3,05± 0,2 Phần trăm cồn thực tế (% Vol) 8,50 9,00 9,20 9,40 9,50 8,70 9,00 9,00 8,50 8,50 9,00 9,30 9,00 8,50 9,00 Hiệu suất lên men rượu (%) 79,22 84,22 86,10 87,85 88,32 81,60 83,66 84,42 79,21 80,70 84,61 87,11 84,23 80,72 84,12 Đánh giá cảm quan (TCVN 3215-79) Độ màu sắc 4,5 4,5 4,5 4,5 4,8 4,2 4,2 4,1 3,6 3,2 4,5 3,9 4,2 3,9 4,3 Hệ số (0,8) Mùi Hệ số (1,2) Vị Hệ số (2,0) Tổng điểm 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 4,1 3,9 4,1 4,1 4,2 4,2 4,1 4,0 4,3 4,1 4,1 4,2 4,1 4,1 3,8 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 3,2 3,5 3,2 3,2 3,5 3,2 3,1 3,5 3,1 3,6 3,5 3,2 3,2 3,5 3,2 2 2 2 2 2 2 2 14,9 15,3 14,9 14,9 15,9 14,8 14,5 15,1 14,2 14,7 15,5 14,6 14,7 15,0 14,4 Trên môi trường dịch 100% ngô, chủng MS42 đạt điểm cao 15,9 điểm, tiếp đến chủng BH30 (đạt 15,5 điểm) chủng LV22 (đạt 15,3 điểm) Trong 15 chủng 03 chủng MS42, BH30 LV22 đ u đạt tiêu đạt điểm cao môi trường M N, chủng MS42 đạt điểm cao môi trường M N Do vậy, dòng LV22, MS42, BH30 tiếp tục sử dụng nghiên cứu tiêu chí 3.1.2.3 Đánh giá khả sinh độc tố tạp chất Để xác định khả lên men sinh độc tố tạp chất: metanol, acetandehyde, Furfurol, rượu bậc cao (propanol, iso/n-butanol, iso/n-pentanol) Các mẫu rượu dòng nấm men: MS42, BH30 LV22 phân tích sắc ký kh để xác định thành phần hàm lượng độc tố tạp chất Kết thu (Bảng 3.3; Bảng 3.4): Bảng 3.3: Kết phân tích sắc ký kh rượu từ dịch malt sau chưng cất STT Dòng nấm men Metanol (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) LV22 MS42 BH30 KPH (˂0,5) PH (˂0,5) KPH (˂0,5) Acetandehyde (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) 35 ± 39 ± 91 ± Rượu bậc cao (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) 218 ± 183 ± 252 ± Furfurol (mg/l) H.HD.QT.022 KPH (˂0,21) PH (˂0, ) KPH (˂0,21) Bảng 3.4: Kết phân tích sắc ký kh rượu từ dịch ngơ sau chưng cất STT Dòng nấm men LV22 MS42 BH30 Metanol (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) KPH (˂0,5) PH (˂0,5) KPH (˂0,5) Acetandehyde (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) 131 ± 125 ± 127 ± Rượu bậc cao (mg/l) H.HD.QT.196 (GC-FID) 229 ± 216 ± 232 ± Furfurol (mg/l) H.HD.QT.022 0,26 ± 0,01 PH (˂0, ) KPH (˂0,21) 11 Hình 3.3: Khu n lạc chủng MS42 Hình 3.4: Hình dạng tế bào mơi trường Hansen chủng MS42 kính hiển vi điện tử 3.2.2 Kh ă me đường chủng nấm men MS42 Tiến hành thí nghiệm khả lên men loại đường chủng MS42 cách: Sử dụng kit thử API 20C aux ID32C Kết cho thấy, chủng nấm men MS42 có khả sử dụng nhi u loại đường khác nhau, cụ thể: Bảng 3.7: Khả sử dụng số loại đường chủng MS42 Loại đường D-Glucose Maltose Rafinose Maltotriose Mannose Trehalose D-mannitol Khả lên men Loại đường Saccharose D-Galactose Fructose Deoxyribose Melibiose Melezitose Khả lên men ++ ++ ++ + + + Ghi chú: Có lên men không mạnh: +, Lên men mạnh: ++ 3.2.3 Gi i trình tự gen chủng MS42 Vùng ITS1, ITS2 5,8S D1,D2 28S: Kết phân tích cho thấy: Chủng MS42 thuộc chi nấm men Saccharomyces lồi Saccharomyces cerevisiae Chúng tơi đặt tên Saccharomyces cerevisiae MS42 Vị trí phân loại Saccharomyces cerevisiae MS42: Lãnh giới (Domain): Nhân thực (Eukayota)/ Giới (Kingdom): Nấm (Fungi)/ Ngành: Nấm túi (Ascomycota)/ Ngành phụ: (Ascomycotina)/ Lớp: Nấm túi (Ascomycetes)/ Bộ: Endomycetales/ Họ: Saccharomycetaceae/ Giống (chi): Saccharomyces/ Loài: Saccharomyces cerevisiae 3.3 Anh hƣởng tới sinh trƣởng phát triển chủng Saccharomyces cerevisiae MS42 trình nh n giống Từ kết nghiên cứu đ lựa chọn môi trường u kiện nhân giống phù hợp với chủng S cerevisiae MS42 môi trường (G2) với độ đường 100 (g/l), pH = 4,5 Thời gian nhân giống 24 giờ, nhiệt độ từ 25 – 30oC với nồng độ ơxi hồ tan từ 6,5 – 7,5 (mg/l) Việc bổ sung giá đỗ nhân giống nấm men ứng dụng sản xuất sử dụng giá đỗ (100g/l), xay nhỏ, bổ sung vào dịch malt sau tr ng tạo dịch nhân giống 3.4 Nghiên cứu nh hƣởng số yếu tố đến trình lên men rƣợu - Hàm lượng đường: Lượng đường từ 140 – 160 g/l để lên men sản xuất rượu whisky có thời gian lên men ngắn, hiệu suất lên men cao, dịch sau lên men đạt độ cồn đạt 7,88 – 9,00%Vol Tuy nhiên, để đảm bảo hiệu suất lên men cao, dịch lên men có độ cồn cao, hạn chế tạp nhiễm trình lên men, hiệu thu hồi rượu sau chưng cất, chọn hàm lượng đường dịch lên men mức 160 g/l (t nh theo maltose) 12 - pH: môi trường dịch malt 100%, pH = 4,5 – 5,5 có hàm lượng cồn, hiệu suất lên men điểm cảm quan đ u đạt mức cao Trong đó, hàm lượng metanol thấp so với mơi trường có pH=4,0 Kết tốt dịch lên men có pH = 5,0 Khi pH tăng đến 6,0 lượng acetaldehyde, rượu cao phân tử tăng mạnh hiệu suất lên men giảm Theo số tác giả dịch lên men có pH = 5,0 không ph hợp với sinh trưởng nấm men mà ph hợp với hoạt động nhi u loại enzyme thực q trình chuyển hóa đường thành rượu - Nhiệt độ: Nhiệt độ dịch lên men từ 16oC - 20oC cho kết tốt v nồng độ cồn, hàm lượng acetandehyde, methanol thấp Tuy nhiên, việc lên men 16oC - 20oC tang chi ph sản xuất, việc sử dụng kỹ thuật thiết bị cất ph hợp hạn chế nhi u loại độc tố, tạp chất Theo chúng tôi, nhiệt độ lên men 25-30oC ph hợp với u kiện sản xuất, nhiệt độ đảm bảo hiệu suất lên men cao, tạo độc tố, tạp chất phù hợp với u kiện thực tiễn Việt Nam - Chất khử trùng (SO2): Việc sử dụng hàm lượng K2S2O5 mức 2,0-3,0 g/l ph hợp với khả lên men chủng MS42, đồng thời hạn chế nhiễm khu n trình lên men Kết ph hợp với công bố nhi u tác giả nghiên cứu sử dụng SO2 (nồng độ tối đa SO2 không nên vượt 490 ppm) Ở ngưỡng bổ sung K2S2O5 0,3 g/l trình lên men thu lượng cồn cao, hàm lượng acetaldehyd methanol có cao mức 0,2 g/l lại trì khả chống nhiễm tốt Do vậy, chọn K2S2O5 mức 0,3 g/l - Số lượng tế bào tiếp giống đến trình lên men rượu: Để đảm bảo an tồn qúa trình lên men, rút ngắn thời gian lên men, hạn chế nhiễm khu n đảm bảo chất lượng sản ph m, hiệu suất lên men rượu, theo nên chọn bổ sung giống ban đầu tỷ lệ 7-10%V (tương đương 12 – 18x 106tế bào/ml) ph hợp để tạo áp đảo nấm men giúp hỗ trợ chống nhiễm tốt, hiệu suất lên men cao 3.5 Nghiên cứu động học trình lên men rƣợu Saccharomyces cerevisiae MS42 3.5.1 Nghiên c u động họ trì me rượu t m t đ i m ch Để xác định động thái trình lên men, đ sử dụng dịch lên men dịch malt đại mạch (100%), u chỉnh u kiện lên men ph hợp theo kết th nghiệm đ nghiên cứu: Hàm lượng đường tổng số 160 (g/l), pH: 5,5; K2S2O5: 0,3 (g/l); tỷ lệ tiếp giống 7%V; nhiệt độ lên men 25-28oC Thực lên men quy mô dung t ch 10 lit/mẻ Tiến hành phân tích mẫu lên men 12 giờ/lần Sự biến đổi nấm men, đường cồn trình lên men thể qua đồ thị (Hình 3.5): Hình 3.5 Đồ thị động thái lên men rượu dịch malt * Kết luận: Đi u kiện lên men ph hợp chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MS42 để sản xuất rượu cao độ từ dịch lên men 100% malt đại mạch gồm: dịch malt có hàm lượng đường 160 - 170 g/l; pH = 4,5 – 5,0; ToC: 25 - 30oC; K2S2O5: 0,2 - 0,3 (g/l); tỷ lệ tiếp giống ban đầu: - 10%; thời gian lên men: 132 - 144 13 3.5.2 Nguyên c u động họ trì me rượu t ngơ ác định động thái q trình lên men, sử dụng dịch lên men ngô (100%), u chỉnh u kiện lên men ph hợp theo kết th nghiệm đ nghiên cứu: Hàm lượng đường tổng số 160 (g/l), pH = 5,5; tỷ lệ tiếp giống 7%; nhiệt độ lên men 25-28oC; quy mô lên men dung t ch 10 lit/mẻ Tiến hành thu phân t ch mẫu sau 12 giờ/lần Sự biến đổi số lượng nấm men, đường cồn q trình lên men dịch ngơ thể qua đồ thị (Hình 3.6): Hình 3.6: Đồ thị động thái lên men rượu từ dịch ngô * Kết luận: Đi u kiện lên men ph hợp chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MS42 để sản xuất rượu cao độ từ dịch lên men 100% ngô gồm: Dịch ngơ có hàm lượng đường 140-160 g/l; pH = 5,0 – 5,5; ToC = 25-30oC; Hàm lượng bổ sung chất chống nhiễm khu n K2S2O5: 0,2 – 0,3 (g/l); tỷ lệ tiếp giống ban đầu: – 10%V; Thời gian lên men: 156 - 168 3.6 Nghiên cứu công nghệ s n xuất rƣợu whisky từ ngô v m lt đ i m ch (quy mơ phòng thí nghiệm) 3.6.1 Nghiên c u công nghệ s n xuất rượu whisky t m t đ i m ch 3.6.1.1 Chế biến dịch lên men từ malt đại mạch Để ổn định nâng cao chất lượng dịch đường hóa từ Malt, chúng tơi đ bổ sung Termamyl® SC (0,08%) Dextrozyme® GA (0,3%) Kết thu dịch malt có thành phần sau: oBx: 18,0; Đường khử: 160,5 g/l; Protein: 19,21 g/l; FAN: 264,5 mg/l; pH: 5,4 3.6.1.2 Lên men sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch Tiến hành lên men dịch malt với quy mô 100 lit/mẻ với u kiện lên men đ xác định nghiên cứu: Nhiệt độ lên men: T = 25oC; hàm lượng đường 160,55 g/l; pH = 5,4; hàm lượng bổ sung K2S2O5 0,3 g/l; lượng tiếp giống 7%V (tương đương 12 đến 15 x 106 tế bào/ml dịch lên men) Quá trình lên men rượu kết thúc sau 144 kể từ tiếp giống, thu kết (Bảng 3.8): Bảng 3.8: Sự biến đổi trình lên men rượu từ dịch malt (M) Thành phần Thời gian 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h Hàm lượng đường (quy theo đường maltose) g/l 160,5 ±0,5 150,2 ±0,5 130,1 ±0,5 106,1 ±0,5 78,4 ±0,3 50,8 ±0,3 31,2 ±0,3 Hàm lượng cồn (%Vol) Số lượng tb (x106 tb/ml) Axit tổng số (qui v axit acetic) mg/l 0,2±0,05 1,2±0,05 2,1±0,05 3,3±0,1 5,0±0,1 6,6±0,1 7,8±0,1 17 ± 1,0 100 ± 2,0 198 ± 3,0 213 ± 3,0 215 ± 3,0 206 ± 3,0 183 ± 3,0 423,2 ± 2,0 428,5 ± 2,0 432,9 ± 2,0 456,8 ± 2,0 463,8 ± 2,0 465,8 ± 3,0 484,3 ± 3,0 14 84 h 96 h 108 h 120 h 132 h 144 h 16,6 ±0,2 14,8 ±0,2 11,3 ±0,2 7,2 ±0,2 5,0 ±0,2 4,6 ±0,2 8,3±0,1 8,6±0,1 8,7±0,1 8,8±0,1 9,2±0,1 9,1±0,1 159 ± 3,0 120 ± 2,0 80 ± 2,0 62 ± 1,0 48 ± 1,0 42 ± 1,0 486,2 ± 3,0 509,8 ± 3,0 510,5 ± 3,0 512,8 ± 3,0 518,5 ± 3,0 519,8 ± 3,0 Kết cho thấy: Tại thời điểm sau 96 lên men, hàm lượng đường có giảm chậm lại khơng đổi sau 144 Lượng đường sót lại 5,1 g/l Hàm lượng cồn đạt cực đại giai đoạn 96 – 144 giờ, sau có tăng nhẹ ổn định giai đoạn cuối qúa trình lên men, đạt 9,1 ± 0,1 (%Vol) Axit tổng số dịch lên men tăng dần nên độ pH có giảm dần thay đổi khơng q lớn Kết thúc lên men lượng axit có dịch lên men là: 519,8 mg/l Kết phân tích tiêu: Hàm lượng đường; hàm lượng cồn; số lượng tế bào, độ pH quy mô lên men 100 lít/mẻ mặc d có số sai khác nhỏ so với quy mơ thí nghiệm (10 lít/mẻ) khơng có ý nghĩa thống kê, lượng cồn tạo 9,1 ± 0,1(%Vol) tương đương với quy mơ thí nghiệm 9,1 ± 0,1 (%Vol) Kết cho thấy: Chủng MS42 có tính ổn định cao, sử dụng để sản xuất quy mô lớn 3.6.1.3 Chưng cất rượu malt a) Chưng cất lần Dịch sau lên men có độ cồn: 9,0%Vol chưng cất lần áp suất chân không 404,6mmHg, nhiệt độ sôi rượu áp suất 63,04oC Nhiệt độ chưng cất thực từ 63 – 75oC Đối với thiết bị 100 lit/mẻ thực giai đoạn chưng cất dịch malt giai đoạn đầu: 63 – 65oC, giai đoạn chưng cất giữa: 68 – 70oC, giai đoạn chưng cất cuối: 73 – 75oC Chưng cất thu hồi tồn rượu có nồng độ 20%Vol (hệ số bay rượu 3,31) Thành phần số độc tố tạp chất rượu malt chưng cất lần 1: Acetaldehyde: 56,23± 0,1 mg/l; Metanol: 8,32 ± 0,05 mg/l; Rượu bậc cao: 238,26± 1,0 mg/l; Fucfurol: 2,28±0,1 mg/l b) Chưng cất lần Chưng cất lần áp suất chân không 404,6mmHg, nhiệt độ chưng cất thực từ 51 – 65oC Thực giai đoạn chưng cất lần dịch malt giai đoạn đầu: 51 – 54oC, giai đoạn chưng cất 55 – 58oC, giai đoạn chưng cất cuối: 59 – 65oC Rượu chưng cất lần tách theo giai đoạn để phân t ch nhằm mục tiêu xác định việc tách lượng rượu đầu, rượu cuối thu sản ph m tối ưu Phân tích thành phần, hạm lượng độc tố tạp chất giai đoạn khác (đầu – – cuối) để xác định quy trình cất thu hồi sản ph m phù hợp Kết phân t ch thu (Bảng 3.9): Bảng 3.9: Kết phân tích mẫu rượu malt chưng cất lần STT Mẫu M1 (1%) M2 (3%) M3(5%) M4 (7%) M5 (giữa) M6(20%) M7 (15%) M8 (10%) M9 (5%) Acetaldehyde(mg/l) 54,53± 0,10 47,22± 0,10 33,35± 0,10 20,58± 0,10 18,53± 0,10 - Metanol (mg/l) 11,52 ± 0,12 9,17 ± 0,10 5,43 ± 0,10 4,21 ± 0,10 3,29 ± 0,08 - Rƣợu bậc cao (mg/l) 2,55 ± 0,05 5,58 ± 0,05 21,63 ± 0,05 50,92 ± 0,08 67,51 ± 1,00 117,63 ± 1,00 329,27 ± 1,00 416,21 ± 1,00 442,29 ± 1,00 Fucfurol (mg/l) 1,36 ± 0,05 2,11 ± 0,05 15 Đối với chưng cất rượu malt giai đoạn đầu từ – 3% hàm lượng acetaldehyde, metanol cao, rượu bậc cao xuất với hàm lượng thấp, riêng fucfurol chưa có Tiếp tục q trình cất acetaldehyde, metanol có xu hướng giảm dần giảm mạnh cất đạt 5% rượu đầu Rượu bậc cao có tăng dần q trình cất, cất đến giai đoạn 20% rượu cuối hàm lượng rượu bậc cao tăng rõ rệt (117,63 mg/l) tiếp tục tăng nhanh 15% rượu cuối (329,27 mg/l) Giai đoạn rượu cuối 10% - 5% hàm lượng rượu bậc cao đạt từ 436, 29 – 442,29 mg/l bắt đầu xuất fucfurol Như vậy, để thu hồi sản ph m loại bỏ nhi u độc tố tạp chất rượu malt việc tách rượu đầu, cuối cần thiết ượng rượu tách ph hợp theo chúng tôi, cần tách lượng rượu đầu: – 5%; lượng rượu cuối tách từ 10% - 15% Các sản ph m rượu đầu, rượu cuối tách riêng để chưng cất lại c ng mẻ sau, chưng cất thành mẻ riêng Kết phân t ch thành phần độc tố tạp chất rượu sản ph m sau chưng cất lần có hàm lượng thấp, đó: Acetaldehyde: 18,53 mg/l; Metanol: 3,29 mg/l, Rượu bậc cao: 67,51 mg/l, Fucfurol: không phát Rượu malt sản ph m sau chưng cất lần (M5) có độ cồn 65 – 68%Vol tàng trữ tạo hương với gỗ sồi để tạo whisky thương ph m 3.6.2 Nghiên c u công nghệ s n xuất rượu whisky t ngô 3.6.2.1 Chế biến dịch lên men từ ngô Trong sản xuất thí nghiệm q trình đường hóa dịch ngơ tiến hành qua hai giai đoạn: Hồ hóa nấu chín dịch (đun sơi/45 phút); Dịch hóa: hạ nhiệt v 65oC bổ sung enzyme Termamyl® SC 0,35%, Dextrozyme® GA 1,5% giữ 65oC/60 phút, để đảm bảo q trình đường hóa hiệu Tiếp tục hạ nhiệt độ v 52oC, bổ sung enzyme Neutrase 0,03% giữ nhiệt độ 52oC/30 phút để phân giải protein thành axit amin tự (FAN) giúp cho sinh trưởng, phát triển nấm men Thành phần dịch ngơ lên men rượu sản xuất whisky: oBx: 18,0; Đường khử: 160,50 g/l; Protein: 14,23 g/l; FAN 168,5 mg/l; pH: 5,4 3.6.2.2 Lên men sản xuất rượu whisky từ ngô Lên men dịch ngô với quy mô 100 lit/mẻ với u kiện lên men đ xác định nghiên cứu (tại Mục 3.4.2): Nhiệt độ lên men: 25oC; hàm lượng đường 169,3 g/l; pH = 5,6; lượng tiếp giống 7%Vol (đạt 12 x 106 - 15 x 106 tế bào/ml dịch lên men) Quá trình lên men rượu kết thúc sau 168 kể từ tiếp giống, thu kết (Bảng 3.10): Bảng 3.10: Sự biến đổi trình lên men rượu từ dịch ngơ (N) Thành phần Thời gian 0h 12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 84 h 96 h 108 h 120 h 132 h 144 h 156 h 168 h Hàm lượng đường (quy theo đường maltose) g/l 160,3±0,5 142,1±0,5 121,5±0,5 110,2±0,5 78,4±0,3 62,8±0,3 40,2±0,3 30,1±0,3 21,8±0,3 14,2±0,3 11,6±0,2 8,2±0,2 6,1±0,2 4,2±0,1 4,1±0,1 Hàm lượng cồn (%Vol) Số lượng tế bào (x106 tb/ml) Axit tổng số (qui v axít acetic) mg/l 0,2 ± 0,05 1,3 ± 0,05 2,8 ± 0,05 4,6 ± 0,05 6,1 ± 0,1 6,9 ± 0,1 7,2 ± 0,1 7,6 ± 0,1 7,8 ± 0,1 8,0 ± 0,1 8,3 ± 0,1 8,6 ± 0,1 9,1 ± 0,1 9,1 ± 0,1 9,0 ± 0,1 17±1,0 130±3,0 205±3,0 212±3,0 213±3,0 198±3,0 162±2,0 116±2,0 108±2,0 85±2,0 71±2,0 60±2,0 46±2,0 45±1,0 43±1,0 418,5± 1,0 429,1± 1,0 431,5± 2,0 456,9± 2,0 462,8± 2,0 469,8± 2,0 481,3± 2,0 483,3± 2,0 491,9± 2,0 495,5± 3,0 510,8± 3,0 516,8± 3,0 519,7± 3,0 521,6± 3,0 522,3± 3,0 16 Kết cho thấy: Các tiêu v hàm lượng đường, hàm lượng cồn, axit tổng số, số lượng tế bào có biến đổi tương đồng th nghiệm lên men dịch ngô, nhiên lượng axit tổng số tăng so với quy mơ thí nghiệm (2 lit/mẻ), u giải thích phần vi khu n tham gia lên men Các kết nghiên cứu cho thấy phù hợp với nghiên cứu nhi u tác giả trước Q trình lên men dịch ngơ sản xuất với u kiện trên, thời gian thực lên men tối ưu từ – ngày 3.6.2.3 Chưng cất rượu ngô a Chưng cất lần Dịch sau lên men có nồng độ cồn (9,0%Vol) chưng cất lần áp suất chân không 404,6mmHg, nhiệt độ sôi rượu áp suất 63,04oC Quy trình chưng cất lần rượu ngô thực tương tự chưng cất rượu từ malt đại mạch: Giai đoạn đầu: 63 – 65oC, giai đoạn chưng cất 68 – 70oC, giai đoạn chưng cất cuối: 73 – 75oC Chưng cất lần 1, thu hồi toàn rượu có nồng độ 20%Vol Thành phần số độc tố tạp chất rượu ngô chưng cất lần 1: Acetaldehyde: 83,62± 0,1(mg/l); Metanol: 10,92 ± 0,05 (mg/l); Rượu bậc cao: 295,18± 1,0 (mg/l); Fucfurol: 3,42±0,1 (mg/l) b Chưng cất lần Chưng cất lần áp suất chân không 404,6mmHg, nhiệt độ chưng cất thực từ 51 – o 65 C Thực giai đoạn chưng cất lần dịch ngô giai đoạn đầu: 51 – 54oC, giai đoạn chưng cất 55 – 58oC, giai đoạn chưng cất cuối: 59 – 65oC Rượu chưng cất lần tách theo giai đoạn để phân t ch nhằm mục tiêu xác định việc tách lượng rượu đầu, rượu cuối thu sản ph m tối ưu Phân tích thành phần, hàm lượng độc tố tạp chất giai đoạn khác (đầu – – cuối) để xác định quy trình cất thu hồi sản ph m phù hợp Kết phân t ch thu (Bảng 3.11): Bảng 3.11: Kết phân tích mẫu rượu ngơ chưng cất lần STT Mẫu M1 (1%) M2 (3%) M3(5%) M4 (7%) M5 (giữa) M6(20%) M7 (15%) M8 (10%) M9 (5%) Rƣợu bậc cao Acetaldehyde(mg/l) Metanol (mg/l (mg/l) 69,16± 0,10 13,23 ± 0,12 5,02 ± 0,05 55,18± 0,10 10,26 ± 0,10 9,15 ± 0,05 34,23± 0,10 6,89 ± 0,10 13,28 ± 0,05 24,62± 0,10 5,35 ± 0,10 24,95 ± 0,08 22,06± 0,10 5,02 ± 0,05 29,83 ± 1,00 129,17 ± 1,00 335,59 ± 1,00 436,92 ± 1,00 465,18 ± 1,00 Fucfurol (mg/l) 1,32 ± 0,05 4,68 ± 0,05 5,23 ± 0,05 Đối với chưng cất chân không rượu ngô giai đoạn đầu từ – 5% hàm lượng Acetaldehyd, metanol có hàm lượng cao, rượu bậc cao bắt đầu xuất với hàm lượng thấp, fucfurol chưa thấy xuất Tiếp tục trình cất acetaldehyde, metanol có xu hướng giảm dần giảm mạnh cất đạt 7% rượu đầu Rượu bậc cao có xu hướng tăng dần trình cất, cất đến giai đoạn 20% rượu cuối hàm lượng rượu bậc cao tăng rõ rệt (129,17 mg/l) tiếp tục tăng nhanh 15% rượu cuối (335,59 mg/l) Giai đoạn rượu cuối 10% - 5% hàm lượng rượu bậc cao đạt từ 456, 92 – 465,18 mg/l Ở giai đoạn 15% - 10% rượu cuối bắt đầu xuất fucfurol Như vậy, rượu ngô việc tách rượu đầu, cuối để thu hồi sản ph m đạt chất lượng cao loại bỏ nhi u độc tố tạp chất, theo cần tách – 7% lượng rượu đầu lượng rượu cuối tách từ 15 – 10% Kết phân t ch thành phần độc tố tạp chất rượu sản ph m sau chưng cất lần rượu ngô cao rượu malt đ u hàm lượng thấp, đó: Acetaldehyde(22,06 mg/l); Metanol (5,02 mg/l), Rượu bậc cao (29,83/l), Fucfurol: không phát Rượu ngô 17 sản ph m sau chưng cất lần (N5) có độ cồn 65 – 68%Vol tàng trữ tạo hương với gỗ sồi để tạo whisky thương ph m 3.6.3 Nghiên c u tỷ lệ phối trộ rượu m t v để t o lo rượu Blend Trong sản xuất sản ph m rượu 100% malt; 100% ngô, để đánh giá rượu phối trộn malt ngô, thực phối trộn rượu malt:ngô theo tỉ lệ khác Đánh giá cảm quan sản ph m phối trộn 40oVol Kết thu (Bảng 3.12): Bảng 3.12 Đánh giá cảm quan tỉ lệ rượu phối trộn malt ngô Loại rượu/(M:N) Tỉ lệ rượu malt: ngô (M:N) Chỉ số 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 1:9 2:8 Điểm cảm quan 16,6 16,6 16,3 16,3 16,1 16,1 15,9 15,9 15,2 Như để tạo sản ph m phối trộn sử dụng rượu từ malt ngô theo tỷ lệ malt: ngô 2:8 3:8 phù hợp mà đảm bảo tốt chất lượng hương, vị đặc trưng sản ph m Kết ph hợp với khuyến cáo chuyên gia sản xuất whisky Mỹ, loại whisky pha chế từ rượu malt ngô theo tỷ lệ rượu ngô không 20% người tiêu d ng đánh giá tốt Căn kết phân tích khuyến cáo chuyên gia, chọn tỷ lệ rượu pha chế theo tỷ lệ malt: ngô 2:8 để nghiên cứu sản xuất sản ph m whisky pha chế Phương án phối trộn nguyên liệu malt: ngô sở sản xuất theo công nghệ truy n thống quy mô nhỏ áp dụng chủ động chất lượng nguyên liệu ổn định, kỹ thuật lên men nên sản ph m Tuy nhiên, kỹ thuật phối trộn nguyên liệu không đạt hiệu kinh tế muốn tạo nhi u loại sản ph m thuộc dòng phối chế Vì vậy, cơng nghệ sản xuất rượu whisky quy mô lớn, thường sản xuất độc lập nguồn nguyên liệu, chuyên gia thường sử dụng nhi u loại rượu khác v nguyên liệu hương, vị để phối trộn nhằm tạo sản ph m đạt chất lượng theo yêu cầu hãng sản xuất 3.6.4 Nghiên c u qúa trình ủ chín t ươ rượu whisky 3.6.4.1 Nghiên cứu chọn loại gỗ sồi phù hợp Gỗ sồi sử dụng để nghiên cứu 24 loại sồi thương ph m d ng để ngâm rượu có nguốn gốc xuất xứ từ Mỹ, Pháp Australia Gỗ sồi thương ph m sau cân để xác định trọng lượng rửa nhi u lần nước m m ngâm mẫu rượu 65%Vol để xác định loại gỗ sồi; trọng lượng gỗ cần sử dụng/l t rượu, thông qua cảm quan màu sắc, vị phân tích hương đặc trưng để chọn loại gỗ sồi phù hợp sản xuất whisky Trong 24 mẫu gỗ sồi đ sử dụng để nghiên cứu, sau 90 ngày ủ cho thấy: 04 mẫu có hương, vị phù hợp với hương, vị đặc trưng rượu whisky (hương malt, tannin gỗ sồi rõ, kết hợp Vanillin, mẫu gỗ sồi có ký hiệu: S3, S5, S6, S8, điểm cảm quan cao (kể hương, vị mầu sắc) mẫu S8 đạt 16,4 điểm Tiến hành tiếp tục ủ theo dõi mẫu gỗ sồi tạo hương, vị đặc trưng whisky đ chọn sau lần thêm 90 ngày (tổng thời gian ủ 180 ngày), tiếp tục cảm quan lần mẫu, thu kết sau (Bảng 3.13): TT Bảng 3.13: Kết cảm quan lần 04 mẫu gỗ sồi sau 180 ngày ủ với rượu Đánh giá c m quan (TCVN 3215-79) Ký Độ Ghi hiệu (loại hương rượu trong, Hệ số Hệ số Hệ số Tổng lo i gỗ Mùi Vị tương đồng) màu (0,8) (1,2) (2,0) điểm sồi sắc S3 4.5 0.8 4.3 1.2 3.7 2.0 16.2 whisky loại chivas S5 4.3 0.8 4.0 1.2 3.9 2.0 16.0 whisky loại single malt S6 4.3 0.8 4.0 1.2 3.9 2.0 16.0 whisky loại chivas 4.5 0.8 4.3 1.2 3.9 2.0 S8 16.6 whisky loại single malt 18 Kết cho thấy: Trong mẫu gỗ sồi đ chọn có 02 mẫu sồi: S5, S8 có hương, vị đặc trưng cho dòng rượu whisky cao cấp, mẫu S8 có giá trị cảm quan (hương, vị mầu sắc, độ trong) phù hợp để sản xuất whisky loại 100% từ malt 100% từ ngô ph hợp với loại rượu pha chế ngô malt nên chọn gỗ sồi ký hiệu S8 đẻ tiến hành nghiên cứu 3.6.4.2 Xác định lượng gỗ sồi ngâm độ rượu ngâm phù hợp - ác định lượng gỗ sồi ngâm phù hợp: Thực ngâm gố sồi S8 với rượu 65oVol So sánh với rượu thương ph m (Singleton (Scotchland) 100% malt; Jack Danies (Mỹ) 100% ngô KNOB CREEK (Mỹ) 80% ngô = 20% malt) Kết cho thấy: Sau 90 đến 120 ngày ngâm gỗ sồi S8 (trọng lượng 3,0 g l t rượu 65% Vol) cho kết cảm quan (mầu sắc, hương, vị) tốt - ác định độ rượu ngâm phù hợp (%Vol): Khi ngâm gỗ sồi S8 (dạng thanh) với trọng lượng 3,0 g gỗ / l t rượu 65% khả chiết màu tốt mẫu rượu có nồng độ 65 – 70 (%Vol), thời gian chiết màu đạt tương đương mẫu đối chứng từ 90 – 120 ngày Kết ph hợp với kết số tác giả khác - Nhận xét: Từ kết thí nghiệm thu thấy để sản xuất rượu whisky từ ngô malt đại mạch Việt Nam loại gỗ sồi phù hợp để sử dụng S8 với tỷ lệ 3,0 g/l t rượu 65 – 70 (%Vol), thời gian chiết màu đặc trưng đạt từ 90 – 120 ngày sau thời gian 120 ngày tàng trữ, biến đổi v màu rượu không đáng kể, nhiên thời gian chưa đủ để rượu “ch n” trình biến đổi hương, vị đặc trưng cần tiếp tục tàng trữ thêm thời gian (thường không t năm) để rượu có hương, vị tốt 3.6.4.3 Bước đầu nghiên cứu biến đổi số chất thơm trình tàng trữ rươu whisky Trong phạm vi nghiên cứu luận án, bước đầu nghiên cứu qúa trình tạo hương thơm số chất tạo hương đặc trưng rượu whisky phương pháp sắc ký GC-MS để xác định thành phần, hàm lượng nhóm chất ellagitannins thủy phân từ tannin, điển hình loại polyphenol hình thành chủ yếu từ liên kết oxy hóa nhóm alloyl glucose β-1,2,3,4,6-pentagalloyl Các mẫu phân tích gồm: 03 mẫu rượu sử dụng để đối chứng gồm: (Singleton (Scotchland)100% malt; Jack Danies (Mỹ) 100% ngô KNOB CREEK (Mỹ) 80% ngô = 20% malt) mẫu rượu whisky nghiên cứu sản xuất từ kết nghiên cứu luận án a)Sự biến đổi số chất tạo hương rượu sau tháng ủ gỗ sồi Sau 06 tháng tàng trữ, thành phần hương tạp chất theo hương có thay đổi lớn Các mẫu rượu có ngâm sồi biến đổi thành phần, hàm lượng chất tạo hương rõ rệt Điển o- ylene, n-Propyl acetate, Octanoic acid, ethyl ester,… Đặc biệt Vanillin (Aldehyd phenolic) đ xuất mẫu ngâm sồi Allene; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester; cis-Thujan-3-one 2,4-dinitrophenylhydrazone thấy mẫu rượu 100% malt Benzoic acid trimethylsilyl ester; iso-Amyl acetate ester thấy mẫu rượu ngô ngâm sồi b) Sự biến đổi số chất tạo hương rượu sau 12 tháng ủ gỗ sồi Sau 12 tháng tàng trữ thành phần tạp chất (1,3-Benzodioxole-5-propanol, 4,7dimethoxy-.alpha.-methyl-; 3-Butyn-1-ol; Ethanone, 1-(8-pyridinyl)-, oxime;…) hương đ giảm rõ, nhi u thành phần tạp không phát Sự giảm thành phần, hàm lượng hương tạp nguyên nhân quan trọng giúp cho giá trị cảm quan hương rượu sản ph m tăng lên trình tàng trữ Thành phần n-Propyl acetate; Decanoic acid, ethyl ester; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester thấy xuất mẫu rượu matl Oxalic acid, cyclohexylmethyl tridecyl ester; Furo 2,3-d pyrimidine, 4,6-dimethyl-2methylsulfanyl-; iso-Amyl acetate thấy xuất mẫu rượu ngô Hàm lượng Vanillin có rượu malt lớn rượu ngô 19 c) Sự biến đổi số chất tạo hương rượu sau 18 tháng ủ gỗ sồi Sau 18 tháng tàng trữ cho thấy: n-Propyl acetate; Octanoic acid, ethyl ester; mẫu rượu malt có với hàm lượng lớn so với rượu ngô o-Xylene; 2-(4-tert-Butylphenoxymethyl)-4-hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester có hàm lượng lớn rượu malt không thấy xuất rượu ngô Ngược lại Oxalic acid, cyclohexylmethyl tridecyl ester; iso-Amyl acetate; 4-methyl-2-pentanone thấy xuất rượu ngơ Hàm lượng Vanillin có mẫu rượu ngâm sồi cao h n so với mẫu không ngâm sồi Thành phần nhi u loại tạp chất theo hương so với trước tàng trữ đ giảm mạnh không phát Các sản ph m ngâm sồi đ tạo nhi u tinh chất tạo hương đặc trưng whisky kết tương tác rượu với chất có gỗ sồi, rượu sản ph m có thành phần điển hình như: Vanillin; n-Propyl acetate; 2-(4-tert-Butylphenoxymethyl)-4-hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester; iso-Amyl acetate;… Sự phối trộn giữ rượu malt rượu ngô tàng trữ làm tăng số thành phần hương rượu sản ph m so với rượu ngơ (100%), rõ rệt thành phần hàm lượng chất như: n-Propyl acetate; Octanoic acid, ethyl ester; Decanoic acid, ethyl ester; Vanillin d) Sự biến đổi số chất tạo hương rượu sau 24 tháng ủ gỗ sồi Sau 24 tháng tàng trữ cho thấy: rượu 100% malt phát 09 loại hợp chất tạo hương, chất n-Propyl acetate; o-Xylene; Decanoic acid, ethyl ester; Octanoic acid, ethyl ester; Vanillin mẫu rượu malt có hàm lượng lớn rượu ngơ Octanoic acid, ethyl ester; Decanoic acid, ethyl ester; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4-hydroxy-pyrimidine-5carboxylic acid ethyl ester có hàm lượng lớn rượu matl khơng thấy xuất rượu ngô Ngược lại Oxalic acid, cyclohexylmethyl tridecyl ester; Cyclohexanone; 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene;iso-Amyl acetate; 4-methyl-2-pentanone thấy xuất rượu ngô Sau 24 tháng tàng trữ, sản ph m ngâm sồi đ tạo nhi u tinh chất tạo hương đặc trưng whisky kết tương tác rượu với chất có gỗ sồi, rượu sản ph m có thành phần điển hình như: n-Propyl acetate; Vanillin; Octanoic acid, ethyl ester; Decanoic acid, ethyl ester; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4-hydroxypyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester; iso-Amyl acetate,… Thành phần hàm lượng chất tạo hương rượu malt rượu ngơ có khác biệt rõ Nhi u hợp chất thấy rượu malt như: o-Xylene; Octanoic acid, ethyl ester; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4-hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester Ngược lại, nhi u hợp chất thấy rượu ngô như: Ethanol, 2-(vinyloxy)-; 3-Nonen-1-ol, (Z)-; Oxalic acid, cyclohexylmethyl tridecyl ester; iso-Amyl acetate; 4-methyl-2-pentanone Cả loại sản ph m đ u có màu sắc tương tự dòng rượu ngoại nhập kh u, có vị đặc trưng whisky (hậu vị nhẹ, êm dịu) Phân tích GC-MS v hương cho thấy: Hương có nhi u thành phần tương đồng điển hình nhóm: n-Propyl acetate; Vanillin; Octanoic acid, ethyl ester; Decanoic acid, ethyl ester; 2-(4-tert-Butyl-phenoxymethyl)-4hydroxy-pyrimidine-5-carboxylic acid ethyl ester; iso-Amyl acetate e) Đánh giá cảm quan rượu whisky sau 24 tháng tàng trữ Thực đánh giá cảm quan theo thang điểm 20, Tiêu chu n Việt Nam TCVN 3217 – 79, trình tàng trữ Kết thu (Bảng 3.14): TT Bảng 3.14: Kết cảm quan sau 24 tháng tàng trữ Đánh giá c m quan (TCVN 3215-79) Ký hiệu mẫu Lo i nguyên liệu Độ trong, Hệ số Hệ số Hệ số Mùi Vị rƣợu màu sắc (0,8) (1,2) (2,0) S8.M 100% malt 4,5 0,8 4,3 1,2 4,1 2,0 S8.N 100% ngô 4,4 0,8 4,0 1,2 3,8 2,0 20% malt, 80% S8.N8:M2 4,4 0,8 4,1 1,2 4,0 2,0 ngô Tổng điểm 17,0 15,9 16,4 20 Sau 24 tháng tàng trữ với gỗ sồi S8, sản ph m dòng whisky đ u đạt điểm cảm quan mức khá, đó: whisky từ malt đạt (17,0 điểm); whisky từ ngô (15,9 điểm); whisky từ ngô: malt đạt (16,4 điểm) Kết đánh giá cảm quan chuyên gia cho thấy: Điểm cảm quan trung bình có trọng lượng v m i vị sản ph m sau 24 tháng đ u cao 3,8 điểm Đi u cho thấy: Ngoài sản ph m whisky từ 100% malt 100% ngô, việc tạo dòng sản ph m whisky từ ngơ kết hợp với malt đại mạch mang giá trị cao, đặc trưng, ph hợp với thị trường đồng thời hạ giá thành sản ph m so với whisky từ 100% malt 3.6.5 Quy trình cơng nghệ s n xuất rượu whisky t m t đ i m ch 3.6.5.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch Malt đại mạch Nghi n nguyên liệu (d ≤ 0,3mm); Phối trộn malt:nước = 1:4 Termamyl 0,08%; Dextrozyme 0,3 % Đường hóa (45oC/25' - 52oC/40' - 64oC/60' - 75oC/15') Dịch đường hóa malt (Hạ nhiệt v u kiện lên men) K2S2O5 0,3 g/l Dịch lên men (Hàm lượng đường:160 - 165g/l, t = 25 - 28oC pH: 5,2 – 5,6) Nấm men MS42 (7%V) đạt 15 x 106tb/ml Lên men Thời gian: 5–6 ngày; t = 25–28oC; Nồng độ cồn: 9,0–9,1%Vol Chưng cất lần 1: P=404,6mmHg, t = 63–75oC Rượu lần 1: 18 – 20%Vol Chưng cất lần 2: P=404,6mmHg, t=51 – 65oC, Vđ=5%; Vc=10% Rượu lần 2: 65 – 68%Vol Thời gian ≥ 24 tháng t = 20 – 30oC Gỗ sồi ngâm (S8): 3g/l Whisky 100% malt (60 – 63%Vol) Thời gian ≥ năm t = 20 – 30oC + H2O Whisky 100% malt (40 – 42%Vol) Whisky 100% malt (50 – 53%Vol) + H2O Hình 3.7 Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ malt đại mạch 21 3.6.5.2 Thuyết minh quy trình cơng nghệ a) Nghiền nấu ngun liệu Malt (Sebastian – Pháp): nghi n với k ch thước (d < 0,3mm), tỉ lệ trộn malt: nước theo tỉ lệ 1:4 1:4,2 ph hợp với lên men sản xuất để đảm bảo hàm lượng đường dịch lên men đạt 160 – 170 g/l - Quy trình đường hóa dịch malt: Malt sau nghi n nhỏ phối trộn với nước m m (lọc RO2) bổ sung Termamyl® SC (0,08%), Dextrozyme® GA (0,3%) nâng nhiệt lên 45oC/25 phút, nhằm đạt hệ số trương nở tối đa đồng thời hoạt hóa hệ enzyme có malt Tiếp tục nâng lên đến 52oC/ 40 phút, u kiện cho enzyme proteaza hoạt động tối ưu, chuyển hoá protein thành axit amin Nhiệt độ tiếp tục nâng đến 64oC/ 60 phút Ở mức nhiệt độ này, enzyme amylase hoạt động tối ưu, phân cắt phân tử tinh bột thành đường đơn giản, dextrin, có phân tử lượng thấp dễ hoà tan nước Cuối dịch đường hoá nâng lên 75oC 15 phút, u kiện enzyme amylase giữ hoạt tính, chuyển hóa triệt để tinh bột thành đường Kết thúc q trình đường hóa, dịch hạ nhiệt v 25oC bơm v tank lên men, bổ sung K2S2O5 (0,3g/l) Thực tiếp men giống để đảm bảo trình lên men thực sau tạo lượng dịch lên men b) Lên men rượu Chủng S cerevisiae MS42 hoạt hoá tiến hành nhân giống môi trường nhân giống G1, G2 Thời gian cấp nhân giống 24 Nhiệt độ lên men 25 – 28oC Lượng tiếp giống 7%Vol (đạt 15 x 106 tế bào/ml dịch lên men) Thời gian lên men dịch malt từ – ngày c) Chưng cất thu rượu cao độ Quy trình chưng cất thực chưng cất lần thiết bị chưng cất chân không, chưng cất lần có tách rượu đầu rượu cuối để giảm độc tố tạp chất không mong muốn có rượu Chưng cất lần 1: áp suất chân không 404,6 mmHg, nhiệt độ từ 63 – 75oC Giai đoạn đầu: 63 – 65oC, giai đoạn chưng cất 68 – 70oC, giai đoạn chưng cất cuối: 73 – 75oC Thu hồi tồn rượu có nồng độ 20%Vol Chưng cất lần 2: áp suất chân không 404,6 mmHg, nhiệt độ từ 51 – 65oC Nhiệt độ giai đoạn đầu: 51 – 54oC, giai đoạn chưng cất 55 – 58oC, giai đoạn chưng cất cuối: 59 – 65oC Tách sản ph m rượu đầu cuối, cụ thể: Rượu malt: Vđầu = – 5%; Vcuối = 15 – 10%; d) Tàng trữ, tạo hương hoàn thiện sản phẩm Rượu sau chưng cất lần đạt độ cồn từ 65 – 68oVol tàng trữ với gỗ sồi (S8) hàm lượng 3,0g/l Thiết bị tàng trữ: tank inox 50 l t, u kiện tự nhiên, nhiệt độ: 20 – 30oC Thời gian tàng trữ tối thiểu năm Kết thúc trình tàng trữ thực phối trộn, tạo màu bổ sung caramen đường, tạo hương, lọc rượu hoàn thiện sản ph m 3.6.6 Quy trình cơng nghệ s n xuất rượu whisky t ngơ 3.6.6.1 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô 22 Ngô hạt Nghi n nguyên liệu (d ≤ 0,5 mm); Phối trộn ngơ:nước = 1:4 Đường hóa (45oC/20' – đun sơi/40' - 65oC/60' - 52oC/30') Termamyl® SC (0,3%); Dextrozyme® GA (1,5%); Neutrase (0,03%) Dịch đường hóa ngơ (Hạ nhiệt v u kiện lên men) Dịch lên men (Hàm lượng đường:160 - 165g/l, t = 25 - 28oC pH: 5,4 – 5,8) Nấm men MS42 (7%V) đạt 15 x 106tb/ml Lên men Thời gian: 7–8 ngày; t = 25–28oC; Nồng độ cồn: 9,0–9,1%Vol Chưng cất lần 1: P=404,6mmHg, t = 63–75oC Rượu lần 1: 18 – 20%Vol Chưng cất lần 2: P=404,6mmHg, t=51 – 65oC, Vđ=5%; Vc=12% Rượu lần 2: 65 – 68%Vol Thời gian ≥ 24 tháng t = 20 – 30oC Gỗ sồi ngâm (S8): 3g/l Whisky 100% ngô (60 – 63%Vol) Thời gian ≥ năm t = 20 – 30oC + H2O Whisky 100% ngô (40 – 42%Vol) Whisky 100% ngơ (50 – 53%Vol) + H2O Hình 3.8 Sơ đồ sản xuất rượu whisky từ ngô 3.6.6.2 huyết minh quy trình cơng nghệ sản xuất rượu whisky từ ngô a) Nghiền nấu nguyên liệu Ngô (giống DK9955): nghi n với k ch thước (d < 0,5mm), tỉ lệ trộn ngô: nước theo tỉ lệ 1:4,0 hàm lượng đường dịch lên men đạt 165 – 170 g/l - Quy trình đường hóa dịch ngơ: Ngơ sau nghi n nhỏ phối trộn với nước (lọc RO2) bổ sung nâng nhiệt lên o 45 C/20 phút, nhằm đạt hệ số trương nở tối đa đồng thời hoạt hóa enzyme có ngơ Nấu chín dịch ngơ để thực hồ hóa cách đun sơi/ 45 phút, giai đoạn hồ hóa tồn lượng tinh bột lại nhiệt, đồng thời tr ng dịch lên men Kết thúc giai đoạn hồ hóa, hạ nhiệt độ v 65oC, bổ sung Termamyl SC (0,3%), Dextrozyme® GA (1,5%) giữ 23 thời gian 65oC/60 phút, giai đoạn đường hóa dịch lên men Tiếp tục hạ nhiệt độ v 52oC, bổ sung Neutrase 0,03% giữ nhiệt độ 52oC/30 phút b) Lên men rượu: Chủng S cerevisiae MS42 hoạt hoá tiến hành nhân giống môi trường nhân giống G1, G2 Thời gian cấp nhân giống 24 Nhiệt độ lên men 25 – 28oC Lượng tiếp giống 7%Vol (đạt 15 x 106 tế bào/ml dịch lên men) Thời gian lên men dịch ngô từ – ngày c) Chưng cất thu rượu cao độ Quy trình chưng cất thực chưng cất lần thiết bị chưng cất chân không, chưng cất lần có tách rượu đầu rượu cuối để giảm độc tố tạp chất khơng mong muốn có rượu Chưng cất lần 1: áp suất chân không 404,6 mmHg, nhiệt độ từ 63 – 75oC Giai đoạn đầu: 63 – 65oC, giai đoạn chưng cất 68 – 70oC, giai đoạn chưng cất cuối: 73 – 75oC Thu hồi toàn rượu có nồng độ 20%Vol Chưng cất lần 2: áp suất chân không 404,6 mmHg, nhiệt độ từ 51 – 65oC Nhiệt độ giai đoạn đầu: 51 – 54oC, giai đoạn chưng cất 55 – 58oC, giai đoạn chưng cất cuối: 59 – 65oC Tách sản ph m rượu đầu cuối, cụ thể: Rượu ngô: Vđ = – 7%; Vc = 15 – 10%; Sau chưng cất lần 2, rượu sản ph m đạt 65 – 68%Vol d) Tàng trữ, tạo hương hoàn thiện sản phẩm Rượu sau chưng cất lần đạt độ cồn từ 65 – 68oVol tàng trữ với gỗ sồi (S8) hàm lượng 3,0g/l Thiết bị tàng trữ: tank inox 50 l t, u kiện tự nhiên, nhiệt độ: 20 – 30oC Thời gian tàng trữ tối thiểu năm Kết thúc trình tàng trữ thực phối trộn, tạo màu bổ sung caramel đường, tạo hương, lọc rượu hoàn thiện sản ph m 3.7 Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thử nghiệm sản phẩm Công ty Eresson 3.7.1 Chế biến dịch lên men Chế biến dịch malt; Chế biến dịch ngô (Thực theo quy trình phòng thí nghiệm) 3.7.2 L me rượu 3.7.2.1 Nhân giống nấm men Chủng S cerevisiae MS42 hoạt hoá tiến hành nhân giống nhi u cấp môi trường G1, G2; cấp nhân giống có mức tăng v thể tích gấp khoảng 10 lần, thời gian cấp nhân giống 24 3.7.2.2 Dịch lên men lên men rượu Dịch lên men chế biến theo quy trình cơng nghệ thơng số kỹ thuật đ xác định quy mơ phòng thí nghiệm Dịch lên men (dịch malt; dịch ngơ) có thành phần gồm: đường tổng số 160 - 165(g/l), pH = 5,0 – 5,6, xử lí chống nhiễm bổ sung K2S2O5 0,3 (g/l) dịch malt, nhiệt độ 25oC tank inox dung tích 8.000 lít có hệ thống u khiển nhiệt độ tự động sau kết thúc q trình lên men, chúng tơi tiến hành chưng cất để thu hồi rượu 3.7.3 C ất Tiến hành chưng cất thực nghiệm dịch lên men môi trường M N thiết bị chưng cất chân không inox sản xuất thực nghiệm dung tích 4.000 lit Quy trình chưng cất thực chưng cất lần (theo quy trình kỹ thuật đ thiết lập quy mơ phòng thí nghiệm) thiết bị chưng cất chân không, giai đoạn cất rượu lần có tiến hành tách rượu đầu rượu cuối để giảm hàm lượng độc tố tạp chất Kết sản xuất: Đ sản xuất 10.000 lit (rượu malt: 6.000 lit, rượu ngô 4.000 lit) Rượu sau chưng cất đ đạt tiêu chu n v số v an toàn thực ph m theo quy định (tại Thông tư số 45/2010/TT-BYT ngày 22 tháng 12 năm 2010 Bộ trưởng Bộ Y tế v quy chu n kỹ thuật quốc gia sản ph m đồ uống có cồn); Tiêu chu n quốc gia TCVN 7043:2013 v rượu trắng 24 3.7.4 Tàng trữ, t ươ v t ện s n phẩm Rượu sau chưng cất lần đạt độ cồn từ 65 – 68oVol tàng trữ gỗ sồi (S8) hàm lượng 3,0g/l tank inox có dung tích từ 3.000 đến 5.000 lít u kiện xưởng sản xuất, nhiệt độ trung bình: 25 – 30oC Thời gian tàng trữ đ thực năm (t nh đến tháng 6/ năm 2019) tiếp tục tàng trữ 3.7.5 Đá ất ượng s n phẩm Kết phân tích chất lượng sản ph m tiêu An toàn thực ph m (do Viện Kiểm nghiệm ATTP quốc gia phân tích) cho thấy: sản ph m đ u đạt yêu cầu theo quy định Điểm cảm quan sản ph m đạt mức; Khá Sản ph m Công ty TNHH MTV Eresson khách hàng Trung Quốc đánh giá cao, phù hợp yêu cầu đủ u kiện thương mại sau hoàn thiện thủ tục pháp lý thương mại theo quy định KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A KẾT LUẬN Luận án “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng sản xuất whisky từ malt đại mạch ngô” đ giải vấn đ sau: Từ nguồn bánh men truy n thống thu thập Bắc Hà (Lào Cai), Mẫu Sơn (Lạng Sơn), làng Vân (Bắc Giang) đ phân lập tuyển chọn 01 chủng nấm men (ký hiệu MS42) Đ nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa trình tự nucleotid ADN, v ng ITS1, ITS2 5,8S D1, D2 28S xác định chủng MS42 thuộc loài Saccharomyces cerevisiae đặt tên chủng Saccharomyces cerevisiae MS42 Chủng MS42 có đặc điểm sinh học sau: Có khả lên men dịch đường hóa từ malt đại mạch ngô tạo độ rượu đạt 12,3%Vol 25oC, tạo hương, vị tốt, đặc trưng cho sản ph m Chủng M42 có khả sinh trưởng tốt mơi trường malt (M), ngô (N) sau 36 – 48 nuôi cấy đạt số lượng tế bào tối đa từ 213 x 106 – 215 x 106 tế bào/ml Lên men rượu tối ưu từ dịch lên men có hàm lượng đường:160 – 180g/l; pHopt: 5,0 – 5,5; Topt = 20 – 30oC đạt độ cồn: 9,00 – 9,91%Vol Hiệu suất lên men từ 89,52 – 91,13%, tạo t độc tố methanol, acetaldehyde, fufurol Đ chọn sử dụng loại gỗ sồi dạng Mỹ (kí hiệu: S8) phù hợp, tạo hương, vị mầu sắc đặc trưng dòng rượu whisky Bước đầu nghiên cứu q trình tạo hương whisky trình tàng trữ với gỗ sồi Kết phân t ch sắc ký (GC-MS) mẫu rượu malt (100%), ngô (100%) rượu phối trộn malt: ngô = 2: sau 24 tháng tàng trữ với gỗ sồi S8 cho thấy: Thành phần hàm lượng hợp chất tạo hương đặc trưng (n-Propyl acetate; o-Xylene; Octanoic acid, ethyl ester; Decanoic acid, ethyl ester; Vanillin) đ tăng lên rõ rệt ngược lại tạp chất đ giảm mạnh nhi u chất (Ethanone, 1-(8-pyridinyl)-, oxime; 1Butanol, 3-methyl-; Sulphuric acid dibutyl ester,…) không phát sản ph m Đ tài luận án đ xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất loại rượu whisky (100% ngô; 100%malt đại mạch 80% ngô 20% malt) đ áp dụng vào thực tế Công ty TNHH MTV Bia-Rượu Eresson sản xuất 10.000 lít sản ph m đạt tiêu chu n chất lượng an toàn thực ph m theo quy định, khách hàng Công ty đánh giá cao v chất lượng sản ph m giá trị thực tiễn./ B KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu sâu v trình hình thành hương, vị sản ph m whisky qúa trình tàng trữ (ít sau năm) để bổ sung giá trị khoa học cho lĩnh vực nghiên cứu - Nghiên cứu đa dạng nguồn nguyên liệu kỹ thuật sản xuất rượu phù hợp u kiện thực tiễn Việt Nam, tạo số dòng sản ph m có chất lượng cao, có hương, vị đặc trưng, có gía trị kinh tế cao gắn với n n văn hóa Việt Nam 25 DANH M C CÁC C NG TR NH HO HỌC Đ C NG Nguyễn Văn Quyên, Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thành Đạt (2016), “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men ph hợp ứng dụng sản xuất rượu dòng whisky từ ngơ malt đại mạch”, ạp ch khoa học Đại học Sư phạm Hà Nội, Tập 61, Số 4, tr.122 – 129 Nguyễn Văn Quyên, Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thảo Anh, Nguyễn Thành Đạt (2016), “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến sinh trưởng chủng nấm men Saccharomces cerevisiae MS42” ạp ch Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Tập 14, Số 3, tr 523 – 532 Nguyễn Văn Quyên, Nguyễn Quang Thảo, Nguyễn Thảo Anh, Nguyễn Thành Đạt (2018), “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình lên men rượu chủng Saccharomyces cerevisiae MS42 từ malt đại mạch”, ạp ch Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, Tập 16, Số 3, tr 525 – 532 Nguyen Quang Thao, Nguyen Van Quyen, Nguyen Thao Anh and Nguyen Thanh Dat (2016), “Effects of fermentation conditions on ethanol production from conrn by Saccharomyces cerevisiae MS42”, Journal of science of HNUE, Vol 61, No 9, pp 169 – 176 ... đáp ứng u cầu cơng nghệ chất lượng sản ph m ác định số đặc điểm hình thái, sinh l , sinh hóa, di truy n định tên khoa học chủng nấm men đ tuyển chọn Ứng dụng chủng nấm men đ tuyển chọn để nghiên. .. Đ tài đ tuyển chọn chủng nấm men Việt Nam gỗ sồi S8 phù hợp để sản xuất whisky từ ngô malt đại mạch Chủng nấm men có khả sinh trưởng phát triển mạnh môi trường malt, ngô, hiệu suất lên men đạt... DUNG VÀ KẾT QU NGHIÊN C U 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm men phù hợp 3.1.1 Tiêu chuẩn tuyển chọn nấm men - Sinh trưởng mạnh dịch đường lên men, sử dụng nhi u loại đường (glucose, maltose, maltotriose,