Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI HOÀNG THỊ LỆ THƯƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY TỪ QUẢ DỨA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quang Hào TS Trần Thị Thuý Hà Nội - 2020 Luận án hoàn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quang Hào TS Trần Thị Thúy Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ hội đồng chấm luận án tiến sĩ Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2020 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Trung tâm thông tin thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Hoàng Thị Lệ Thương, Nguyễn Quang Hào (2014), Động thái lên men vang dứa để sản xuất rượu Brandy chủng Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học, Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, 30(6S), tr 587-591 Hồng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2016), Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường dinh dưỡng đến trình lên men vang để sản xuất Brandy từ dứa Queen chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8, Tạp chí Khoa học cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 12 (73), tr 23-28 Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2017), Taxonomic characterization and identification of Saccharomyces cerevisiae D8 for brandy production from pineapple, Tạp chí sinh học, số 39 (4), tr 474-482 Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Cải biến chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae D8 kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên nhằm nâng cao hoạt lực lên men ethanol, Tạp chí công nghệ sinh học, số 16 (2): tr 337 – 344 Hoàng Thị Lệ Thương, Trần Thị Thúy, Nguyễn Quang Hào (2018), Vai trò gỗ sồi cất giữ brandy dứa Việt Nam, Tạp chí sinh học số 40 (2): tr 130 - 139 MỞ ĐẦU Brandy loại rượu cao độ chưng cất từ vang chất lượng cao, ưa chuộng Brandy có tác dụng kích thích thần kinh, tim mạch, tiêu hóa nên sử dụng lượng nhỏ ngày tốt cho sức khỏe Rượu brandy phù hợp với nhu cầu giới trẻ nói riêng người dân nói chung nên sử dụng ngày nhiều Tuy nhiên, rượu brandy mà sử dụng chủ yếu nhập ngoại, khối lượng nhập đứng thứ số loại rượu mạnh nhập vào Việt Nam Mức tăng trưởng thị trường brandy bình quân năm 18,8% nên rượu có giá thành cao, chưa sử dụng rộng rãi Chính vậy, việc tìm nguồn ngun liệu nước cơng nghệ phù hợp để chủ động sản xuất brandy đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng có ý nghĩa quan trọng Dứa ăn phổ biến nước ta, phân bố từ Bắc đến Nam Năm 2007 tổng sản lượng dứa nước đạt 529.100 tấn, năm 2011 đạt 532.700 tấn, năm 2016 đạt 579.982,3 tấn, năm 2018 đạt 674 nghìn ln đứng đầu loại ăn Quả dứa có thành phần dinh dưỡng phong phú Hàm lượng nước, đường, protein, vitamin, khoáng chất độ acid dịch cao, phù hợp cho sản xuất rượu vang chất lượng để chưng cất thành brandy có hương vị đặc trưng Cho đến nay, theo tài liệu mà tham khảo được, nghiên cứu dứa Việt Nam dừng lại quy trình bảo quản tươi, sấy khô, làm siro, đồ uống lên men vang Nhiều công ty, doanh nghiệp quan nghiên cứu thực phẩm nước tiến hành quy trình sản xuất rượu brandy từ vải thiều, táo, mận, điều…Riêng với rượu brandy từ dứa, có dự án “Hồn thiện cơng nghệ sản xuất brandy trái (vải, dứa) quy mô công nghiệp” Công ty TNHH MTV Bia rượu Eresson chủ trì Theo hướng này, nấm men thu thập từ nhiều nguồn ngồi nước, quy trình cơng nghệ chưng cất tháp cao Sản phẩm brandy dứa dừng lại mức thăm dò thị trường, số lượng ít, giá thành cao, chưa phổ biến Do đó, việc nghiên cứu chế biến dứa thành rượu brandy theo hướng truyền thống thành công sở khoa học để tổ chức sản xuất rượu brandy từ dứa Việt Nam, tạo thêm hướng tiêu thụ cho dứa, giải công ăn việc làm cho nông dân lao động, góp phần phát triển kinh tế cho nhiều địa phương trồng dứa Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn sản xuất, nhằm giúp nông dân giải khâu tiêu thụ dứa phương pháp chế biến, tiến hành đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ dứa” Mục tiêu đề tài Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ dứa đạt chất lượng tốt Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu etanol phân lập từ dịch ép dứa Queen trồng Nông trường Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình Phạm vi nghiên cứu: - Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu phân lập từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên - Nguyên vật liệu: Giống dứa Queen trồng Nông trường dứa Đồng Giao - Tam Điệp Ninh Bình Nội dung nghiên cứu (1) Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao cho hương thơm đặc trưng trình lên men dịch dứa Queen (2) Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm men tuyển chọn: Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả lên men loại đường, khả đồng hóa muối nitrat, định tên khoa học, ảnh hưởng yếu tố môi trường (hàm lượng đường, ảnh hưởng pH môi trường, ảnh hưởng nguồn nitơ) đến sinh trưởng phát triển chủng nấm men tuyển chọn (3) Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men vang dứa chủng nấm men tuyển chọn: pH, nhiệt độ, acid hữu cơ, hàm lượng đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống; nghiên cứu trình lên men vang từ dịch dứa Queen (4) Cải biến chủng nấm men D8 kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên (5) Nghiên cứu quy trình chưng cất, làm sạch, tạo màu hương vị cho brandy Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án - Ý nghĩa khoa học: Luận án cung cấp dẫn liệu khoa học việc sử dụng dứa để lên men vang sản xuất brandy chất lượng cao Kết nghiên cứu phân tích thành phần dịch ép dứa Queen (nguyên liệu dùng để lên men vang sản xuất brandy); tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men cao, hương thơm đặc trưng; cải biến chủng nấm men theo phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên tạo dịng nấm men có khả chịu độ rượu, chịu đường có hoạt lực lên men cao 22% so với chủng gốc Luận án đề xuất phương pháp loại bỏ tạp chất không mong muốn rượu brandy thô, tác dụng gỗ sồi việc tàng trữ tạo màu sắc hương vị cho brandy dứa; xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất brandy từ dứa - Ý nghĩa thực tiễn Các kết nghiên cứu luận án ứng dụng để sản xuất brandy dứa, làm đa dạng hóa sản phẩm chất lượng cao từ dứa, mở thêm hướng giải đầu cho dứa Bên cạnh đó, luận án dùng tài liệu tham khảo phục vụ học tập, nghiên cứu, giảng dạy lên men vang ứng dụng sản xuất rượu brandy từ dứa Những điểm luận án - Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu có hệ thống sản xuất brandy dứa từ phân lập, tuyển chọn, định tên khoa học chủng nấm men tuyển chọn, điều kiện nhân giống, lên men, chưng cất, loại bỏ tạp chất, tàng trữ tạo hương vị màu sắc đặc trưng cho brandy - Tạo đươc biến chủng có hoạt lực lên men rượu cao đạt hàm lượng ethanol 15,1 % V/V từ chủng S cerevisiae đột biến ngẫu nhiên - Đề xuất việc sử dụng nước chiết giá đỗ thay cho pepton nhân giống nấm men để lên men vang, sản xuất brandy - Đề xuất quy trình lên men vang để sản xuất brandy dứa sử dụng chủng nấm men S cerevisiae D8 nguồn nguyên liệu dứa Queen - Đề xuất phương pháp loại bỏ tạp chất rượu brandy môi trường acid cách kết hợp phương pháp hóa học vật lý Cấu trúc luận án Luận án gồm 136 trang, bao gồm phần sau: Mở đầu: trang Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 44 trang Chương Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu: 23 trang Chương Kết Thảo luận: 63 trang Kết luận Kiến nghị: trang Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo 45 tài liệu tiếng Việt, 131 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web Phụ lục: Luận án có phụ lục kết phân tích CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trong chương này, ba vấn đề liên quan đến nghiên cứu luận án tổng quan Đó là: (1.1) NẤM MEN; (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT BRANDY (1.3) CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY Trong phần (1.1) NẤM MEN, Lịch sử nghiên cứu sử dụng nấm men sản xuất rượu (mục 1.1.1.) giới Việt Nam trình bày cụ thể Các tiêu chí Phân loại, tuyển chọn chủng nấm men (mục 1.1.3.) tổng quan Các loài nấm men dùng sản xuất vang thuộc giống Saccharomyces (gồm 286 loài nằm 17 chi Đặc điểm sinh học nấm men (Đặc điểm hình thái, cấu tạo tế bào đặc điểm sinh lý – mục 1.1.2) Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển lên men nấm men (nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hóa tan, hàm lượng đường, hàm lượng rượu, chất khử trùng,…mục 1.1.4) trình bày cụ thể từ trang 15 đến trang 20 Trong phần (1.2) DỨA – NGUYÊN LIỆU ĐỂ SẢN XUẤT BRANDY, tổng quan (1.2.1) Nguồn gốc dứa; (1.2.2) Sơ lược tình hình trồng chế biến dứa ở Việt Nam; (1.2.3) Đặc điểm sinh học thành phần dinh dưỡng dứa trình bày từ trang 21 đến trang 26 Phần (1.3) CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT BRANDY mơ tả (1.3.1) Lịch sử nghiên cứu sản xuất rượu brandy giới Việt Nam, từ trang 27 đến trang 33; (1.3.2) Sản xuất vang để chưng cất thu brandy từ trang 34 đến trang 38; (1.3.3) Chưng cất rượu vang để thu brandy (1.3.4.) Tàng trữ tạo hương cho brandy trang 38 đến 44 (1.3.5) Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam từ trang 45 đến 48 Trong mục 1.3.1 (Tình hình nghiên cứu sản xuất rượu brandy), số sản phẩm brandy nước (Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Đức, Mỹ châu Mỹ latin…) số quy trình công nghệ sản xuất brandy giới (VD: Quy trình sản xuất rượu Cognac) tổng quan Tình hình sản xuất vang brandy Việt Nam đề cập cụ thể Trong mục 1.3.2 (Sản xuất vang để chưng cất thu brandy) tổng quan về: (1) Cơ chế lên men rượu; (2) Các giai đoạn lên men vang từ khâu chuẩn bị nguyên liệu, dịch lên men đến nhân giống nấm men giai đoạn lên men mô tả kỹ lưỡng Trong mục 1.3.3 (Chưng cất rượu vang để thu brandy) mục 1.3.4 (Tàng trữ tạo hương cho brandy) mô tả thiết bị chưng cất rượu (từ chưng cất gián đoạn, cải tiến đến chưng cất liên tục) kỹ thuật làm rượu, tạo màu tạo hương cho brandy thành phẩm Trong mục 1.3.5 (Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam) tiêu chuẩn nguyên liệu, cảm quan, thành phần hóa học, giới hạn thành phần kim loại nặng, phụ gia thực phẩm quy cách việc bao gói, ghi nhãn, bảo quản vận chuyển brandy trình bày cụ thể CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trong chương này, Ngun liệu, hóa chất thiết bị trình bày mục (2.1) bao gồm: (2.1.1) Nguyên liêu dứa; (2.1.2) Các hố chất mơi trường; (2.2.3) Chủng giống vi sinh vật (2.1.4) Thiết bị nghiên cứu Các Phương pháp nghiên cứu (mục 2.2) chia thành 04 nhóm sau: 2.2.1 Phương pháp vi sinh gồm phương pháp: Pha loãng mẫu để phân lập nấm men, Phân lập nấm men môi trường Hansen đặc, Làm tiêu sống tiêu cố định nhuộm đơn, Bảo quản chủng giống nấm men, Hoạt hoá tế bào nấm men, Đếm số lượng tế bào nấm men, Nghiên cứu hình thái, kích thước khuẩn lạc tế bào nấm men, Xác định hoạt lực lên men, Sàng lọc tuyển chọn dịng đột biến có hoạt lực lên men cao, Định loại nấm men 2.2.2 Phương pháp hóa lý-hố sinh gồm phương pháp: Xác định trị số pH, Xác định hàm lượng oxy hòa tan, Xác định hàm lượng đường tổng, Xác định hàm lượng Vitamin C, Xác định acid tổng số, Xác định hàm lượng rượu etanol, Thu hồi làm rượu, Xác định hàm lượng furfurol Xác định hiệu suất lên men 2.2.3 Phương pháp phân tích cảm quan rượu 2.2.4 Phương pháp phân tích xử lý số liệu CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm men từ dịch ép dứa Queen 3.1.1 Phân lập nấm men môi trường dịch ép dứa Queen Từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên, phân lập chủng nấm men, kí hiệu D1, D2, D3, D4, D5, D6, D7 D8 có khả sinh trưởng lên men etanol mơi trường có hàm lượng đường acid tổng số cao Định hướng phân lập tạo điều kiện thuận lợi cho việc tuyển chọn chủng nấm men có khả sinh trưởng mạnh, lên men etanol tốt điều kiện lên men tự nhiên dịch ép dứa Queen, hạn chế tạp nhiễm từ vi sinh vật khác tự nhiên 3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men a) Đánh giá sinh trưởng chủng nấm men phân lập môi trường Hansen với lượng bổ sung giống ban đầu (13,4 × 106 tế bào/ml) cho thấy: Chủng nấm men D1, D4 D5 có khả sinh trưởng môi trường Hansen tốt cả, mật độ tế bào bình nhân giống đạt 130 × 106 tế bào/ml Các chủng D2, D3 D8 sinh trưởng hơn, đạt 121 – 128 × 106 tế bào/ml dịch môi trường nhân giống Khả sinh trưởng chủng D6 D7 môi trường nhân giống (đạt 120 × 106 tế bào/ml) b) Khảo sát hoạt lực lên men chủng nấm men phân lập Các tiêu chí sử dụng để tuyển chọn chủng nấm men là: khả lên men mạnh, chịu độ đường cao, pH thấp tạo hương thơm đặc trưng Hoạt lực lên men chủng nấm men D1 - D8 đánh giá thông qua lượng CO2 thoát sau 120 lên men 28°C (Bảng 3.1) Ngồi ra, chúng tơi so sánh khả tạo hương chủng để lựa chọn 04 chủng vừa có hoạt lực lên men etanol cao, vừa có hương thơm đặc trưng dứa dịch lên men; chủng: D3, D4, D5 D8 Bảng 3.1 Hoạt lực lên men etanol khả tạo hương chủng nấm men phân lập Hoạt lực lên men tính lượng CO2 sinh (g/100ml) Thời gian lên men (h) 24 72 96 120 Hương thơm D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 4,44 ± 5,06 ± 4,88 ± 5,38 ± 5,79 ± 5,02 ± 4,63 ± 5,10 ± 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,02 0,02 0,02 5,08 ± 6,25 ± 6,02 ± 7,0 ± 8,70 ± 6,84 ± 5,55 ± 6,48 ± 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,02 0,01 0,01 7,32 ± 7,63 ± 8,13 ± 8,29 ± 9,67 ± 7,96 ± 7,82 ± 9,85 ± 0,02 0,03 0,01 0,02 0,03 0,02 0,01 0,01 7,35 ± 7,70 ± 8,24 ± 8,32 ± 9,73 ± 7,85 ± 7,98 ± 9,89 ± 0,02 0,01 0,03 0,02 0,02 0,03 0,02 0,03 ++ ++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ Chú thích: Khả tạo hương thơm: +++: Thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ;+: Thơm Đánh giá khả lên men chủng nấm men tuyển chọn mơi trường có pH thấp (Bảng 3.2) chúng tơi nhận thấy: chủng D8 có khả lên men mạnh nhất, tạo từ 9,65 đến 9,88 g CO /100 ml dịch lên men mơi trường có pH từ 3,5 đến 4,5 Bảng 3.2 Khả lên men chủng nấm men D3, D4, D5, D8 mơi trường có pH thấp Hoạt lực lên men tính lượng CO2 (g/100ml) pH môi trường D3 D4 D5 D8 2,5 2,79 ±0,03 3,32 ± 0,02 3,07 ± 0,01 2,49 ± 0,2 3,0 8,88 ± 0,02 8,79 ± 0,03 6,92 ± 0,02 9,10 ± 0,02 3,5 9,41 ± 0,01 9,44 ± 0,02 8,01 ± 0,02 9,65 ± 0,02 4,0 9,52 ± 0,01 9,62 ± 0,02 8,93 ± 0,02 9,88 ± 0,02 4,5 9,53 ±0,02 9,63 ±0,01 8,96 ±0,03 9,97 ±0,03 Ở mơi trường có pH = 3, chủng D3, D4 D5 lên men yếu chủng D8 lên men mạnh, tạo 9,10 g CO /100 ml Sự khác biệt khả lên men etanol chủng nấm men tuyển chọn mơi trường có pH 4,0 4,5 khơng nhiều, có ý nghĩa thống kê (p Trình tự D1/D2 chủng nấm men D8 ACGTCGCAGTCCTCAGTCCCAGCTGGCAGTATTCCCACAGGCTATAATACTTACCGAGGCAAGCTACATTCCTATGGATT TATCCTGCCACCAAAACTGATGCTGGCCCAGTGAAATGCGAGATTCCCCTACCCACAAGGAGCAGAGGGCACAAAACACC ATGTCTGATCAAATGCCCTTCCCTTTCAACAATTTCACGTACTTTTTCACTCTCTTTTCAAAGTTCTTTTCATCTTTCCA TCACTGTACTTGTTCGCTATCGGTCTCTCGCCAATATTTAGCTTTAGATGGAATTTACCACCCACTTAGAGCTGCATTCC CAAACAACTCGACTCTTCGAAGGCACTTTACAAAGAACCGCACTCCTCGCCACACGGGATTCTCACCCTCTATGACGTCC TGTTCCAAGGAACATAGACAAGGAACGGCCCCAAAGTTGCCCTCTCCAAATTACAACTCGGGCACCGAAGGTACCAGATT TCAAATTTGAGCTTTTGCCGCTTCACTCGCCGTTACTAAGGCAATCCCGGT Saccharomyces cerevisiae Sequence ID: gb|KF646229.1| Identities 531/531(100%) Kết đọc trình tự đoạn D1/ D2 chủng nấm men D8 kết so sánh với trình tự tương tự ngân hàng gen NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) cho thấy mức độ tương đồng trình tự 99 đến 100% so với trình tự đoạn D1/D2 chủng nấm men S cerevisiae ATCC 18824 KC881066.1, S cerevisiae SR127 CP011558.1, S cerevisiae NCIM3186 CP011821.1 S bayanus CHFY0321EU719073 Kết định tên khoa học hình thái tế bào khuẩn lạc, phương pháp hóa sinh phương pháp sinh học phân tử khẳng định chủng D8 thuộc loài S cerevisiae họ Saccharomycetaceae, Saccharomycetales Chủng đặt tên S cerevisiae D8 để tiếp tục tiến hành nghiên cứu lên men rượu sản xuất rượu brandy từ dứa Queen Các kết trình bày báo số 3.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm men S cerevisiae D8 Chúng tiến hành nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển nấm men S cerevisiae D8 nhằm xác định mơi trường nhân giống thích hợp Các yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến trình nhân giống nấm men S cerevisiae D8 bao gồm: pH môi trường, nhiệt độ, hàm lượng đường, nguồn nitơ, trình bày cụ thể 12 từ trang 79 đến 90 toàn văn luận án tiến sỹ Đặc biệt, nước chiết giá đỗ khơng thay pepton nhân giống S cerevisiae D8 mà đem lại hiệu nhân giống cao so với dùng pepton Nước chiết giá đỗ cung cấp nitơ đặc biệt vitamin khống (hai nhóm chất mà pepton bị thiếu hụt) cho sinh trưởng nấm men Thêm vào đó, nước chiết giá đỗ lại rẻ tiền, dễ làm, dễ kiếm so với pepton ảnh hưởng đến hương thơm màu sắc tự nhiên sản phẩm lên men cuối Các nghiên cứu giúp xác định môi trường nhân giống tốt nấm men S cerevisiae D8 là: Mơi trường Hansen có hàm lượng đường 70g/l, pH 4,0 nước chiết 100 g giá đỗ /l, nhiệt độ nuôi 28oC Trong môi trường này, mật độ tế bào nấm men cực đại đạt 342,8 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt 88% 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men vang dứa 3.3.1 Thành phần hóa học dịch dứa ép Kết phân tích cho thấy dịch ép dứa Queen có hàm lượng đường tổng đạt trung bình 126 g/l, hàm lượng vitamin C đạt 41 mg/l, acid tổng số 3,6 g/l, giá trị pH đạt 3,4 Kết cao công bố sở liệu dinh dưỡng USDA Theo công bố sở liệu này, hàm lượng đường dịch dứa 9,26 g/l, vitamin C 36,2 mg/l Điều giải thích thành phần hóa học dứa phụ thuộc vào giống dứa, đất trồng, chế độ chăm sóc, mùa vụ thời điểm thu hoạch… So sánh với tiêu chí nguyên liệu sản xuất rượu brandy, thành phần hóa học dịch ép dứa vừa phân tích hồn tồn phù hợp để lên men chưng cất rượu brandy 3.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men vang dứa Kết nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống, đến khả lên men rượu chủng S cerevisiae D8 dẫn từ bảng 3.7 đến 3.11 toàn văn luận án từ trang 92 - 98 báo số 13 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men dịch dứa Chỉ tiêu Nhiệt độ lên men (ᴼC) 28 20 24 Hàm lượng rượu (%V/V) 10,82±0,4 10,91±0,2 Đường tiêu hao (g/l) 194,18±0,03 Acid tổng số (g/l) Hiệu suất lên men (%) 32 36 11,04±0,1 11,02±0,2 10,82±0,3 194,31±0,05 194,72±0,02 195,03±0,03 195,37±0,07 5,71 ±0,02 5,93 ±0,05 6,09±0,02 6,14±0,02 6,22±0,03 83,35±0,31 84,13±0,15 85,11±0,08 85,01±0,15 83,25±0,23 +++ +++ +++ ++ ++ Hương thơm dịch lên men Ghi chú: Khả tạo hương thơm: +++: thơm nhiều; ++: Thơm trung bình ; +: Ít thơm Bảng 3.8 Ảnh hưởng pH ban đầu đến trình lên men vang dứa Chỉ tiêu pH ban đầu môi trường lên men 3,5 4,5 Hàm lượng rượu (% V/V) Đường tiêu hao (g/l) 11,03±0,01 11,08±0,03 11,16±0,06 11,01±0,02 10,84±0,2 194,43±0,07 194,97±0,09 195,52±0,03 195,36±0,05 195,20±0,04 Acid (g/l) 5,44 ±0,03 5,62±0,03 5,68±0,01 5,89±0,04 6,04±0,05 Hiêu suất lên men (%) 85,1±0,08 85,84±0,23 86,28±0,46 85,01±0,15 83,64±0,15 ++ +++ +++ +++ ++ Hương thơm dịch lên men Bảng 3.9 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến trình lên men Chỉ tiêu Hàm lượng đường môi trường lên men (g/l) 126 150 170 200 220 250 Hàm lượng rượu (% V/V) 6,92±0,03 8,58±0,02 9,54±0,02 11,22±0,02 11,24±0,02 11,21±0,03 Đường tiêu hao (g/l) 115,88 ±0,01 144,99 ±0,02 164,92 ±0,02 194,46 211,22 ±0,02 240,14 ±0,02 Acid (g/l) 6,64±0,02 6,22±0,02 5,83±0,01 5,56±0,02 5,28±0,01 5,21±0,02 89,02±0,21 88,43±0,17 86,78±0,18 86,67±0,15 78,88±0,14 69,58±0,18 ++ +++ +++ Hiêu suất lên men (%) Hương thơm dịch lên men ++ ++ ++ ±0,03 14 Bảng 3.10 Ảnh hưởng hàm lượng oxy hòa tan ban đầu dịch lên men đến trình lên men vang dứa Hàm lượng oxy hòa tan dịch lên men (mg/l) Chỉ tiêu 11,29±0,02 11,81±0,02 12,37±0,02 11,88±0,02 11,36±0,02 Đường tiêu hao (g/l) 197,5±0,02 197,6±0,02 198,8±0,02 197,4±0,02 197,3±0,02 Acid (g/l) 5,1±0,02 5,2±0,02 5,3±0,02 5,3±0,02 5,4±0,02 91,17±0,02 95,18±0,02 91,66±0,02 86,58±0,02 ++ +++ +++ +++ Hàm lượng rượu (% V/V) Hiệu suất lên men (%) 87,07±0,02 Hương thơm dịch lên men ++ Bảng 3.11 Ảnh hưởng lượng men giống đến trình lên men vang dứa Chỉ tiêu Thể tích men giống (% V/V) 10 Hàm lượng rượu (% V/V) 12,35±0,01 12,37±0,02 12,37 ±0,02 12,34±0,01 Đường tiêu haog/l) 198,16±0,02 198,75±0,03 198,48±0,01 198,31 ±0,03 Acid (g/l) 4,52±0,02 4,67±0,01 4,81±0,01 4,83±0,02 Hiệu suất lên men (%) 95,09±0,08 95,28±0,15 95,28±0,15 94,99±0,08 Thời gian kết thúc lên men (ngày) 3 Hương thơm dịch lên men + +++ ++ ++ Từ kết nêu trên, lựa chọn mơi trường thích hợp cho lên men vang dứa Queen để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa có pH=4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan mg/l, hàm lượng men giống bổ sung 17,1×106 tế bào/ml dịch lên men (5% thể tích V/V bình lên men) Lên men 28o C 14 ngày thu loại vang dứa đạt tiêu chuẩn để chưng cất brandy dứa 3.3.3 Quá trình lên men vang dứa (quy mơ 20 100 lít/mẻ) chủng S cerevisiae D8 Giống nấm men S cerevisiae D8 nhân giống cấp 1, mô tả cụ thể phần phương pháp trang 53 luận án Giống nấm men cần kiểm tra nhanh giai đoạn việc quan sát hình thái xác định mật độ tế bào nấm men sống, đảm bảo mật độ tế bào sống giai đoạn nhân 15 giống cấp phải đạt tối thiểu 340 × 106 tế bào sống/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt xấp xỉ 88% Lên men vang dứa để sản xuất brandy từ dịch dứa Queen Biến động số lượng tế bào nấm men, đường tiêu hao, lượng rượu, hàm lượng acid dịch lên men theo dõi 24 h đầu Kết sau h lấy mẫu thể bảng 3.12 Trong ngày đầu lên men lượng tế bào tăng nhanh, lượng đường tiêu hao chậm, tiêu hao hết 38,5 g/l Theo lý thyết tạo 5,9 g/100ml rượu tương đương 7,47% V/V thực tế lượng rượu sinh đạt 2,24% V/V, thấp nhiều so với lượng rượu tạo thành theo lý thuyết Điều lý giải lượng đường tiêu hao ngày đầu lên men chủ yếu cho tế bào nấm men sinh trưởng phát triển Chỉ sau 24 h, số lượng tế bào dịch lên men đạt cực đại 342,8 ×106 tế bào/ ml, lượng đường tiêu hao chủ yếu dùng để tạo etanol Bảng 3.12 Động thái trình lên men dịch dứa 24 đầu quy mô 20 lit/mẻ Chỉ tiêu Thời gian Đường tiêu hao Số lượng tế bào nấm men (×106 Lượng rượu tạo thành Acid tổng số (g/l) tế bào/ml) (% V/V) (g/l) 0 17,3 ± 0,2 3,6 ± 0,01 2,8 ± 0,1 24,5 ± 0,3 0,16 ± 0,02 3,6 ± 0,01 5,9 ± 0,3 41,2 ± 0,5 0,34 ± 0,03 3,6 ± 0,01 12 12,6 ± 0,3 88,4 ± 0.6 0,72 ± 0,1 3,7 ± 0,02 16 18,7 ± 0,5 216,7 ± 0,8 1,09 ± 0,1 3,8 ± 0,02 20 26,1± 0.5 296,5 ± 1,63 ± 0,2 3,8 ± 0,02 24 38,5± 0,4 342,8 ± 2,24 ± 0,3 3,9 ± 0,02 (h) Động thái lên men dịch dứa ngày đánh giá qua tiêu theo ngày Kết biểu thị hình 3.9 16 Hình 3.9 Động thái trình lên men vang dứa quy mô 20 lit/mẻ Thành phần dịch lên men thay đổi rõ ràng 10 ngày đầu lên men Số lượng tế bào, hàm lượng đường hàm lượng rượu có liên quan chặt chẽ với Sau ngày đầu số lượng tế bào sống đạt mức cực đại 342,8 × 106 tế bào/ml, đường chất dinh dưỡng có mơi trường tiêu hao chủ yếu cho nấm men sinh trưởng phát triển, tạo sinh khối lớn lượng rượu tạo khơng tương ứng với lượng đường tiêu hao Ngày thứ hai, lượng tế bào sống không tăng, giữ pha cân động, số tế bào sinh tương đương với số tế bào chết Lượng rượu tăng nhanh tương ứng với đường tiêu hao cho trình lên men tạo rượu etanol Từ ngày thứ trở đi, số lượng tế bào sống giảm nhanh dần, giải thích tốc độ giảm nhanh lượng oxy bình lên men giảm nấm men dùng trình sinh trưởng hiếu khí, đồng thời lượng rượu tạo thành tăng gây ức chế sinh trưởng nấm men, lượng CO2 q trình hơ hấp lên men tế bào nấm men tạo môi trường kị khí bình lên men Lúc nấm men chuyển từ giai đoạn sinh trưởng hiếu khí sang giai đoạn lên men, chuyển đường thành rượu chủ yếu Đặc biệt hàm lượng rượu tăng nhanh vào ngày thứ 3, thứ Từ ngày thứ trở đi, trình lên men diễn chậm chạp, thông số thay đổi không đáng kể, lượng đường, chất q trình lên men rượu, 50 g/l 17 Đến ngày lên men thứ 10, lượng rượu tạo 11,3 % V/V không tăng Ngày thứ 25, kết thúc trình lên men lượng rượu đạt 11,6 % V/V Các kết trình bày báo số 3.3.4 Sản xuất brandy dứa ở quy mô thực nghiệm (100 lít/mẻ) chủng S cerevisiae D8 Ở quy mơ 100 lít, sau 10 ngày, q trình lên men vang dứa kết thúc, vang non có độ rượu 12,4 % V/V Kết cao số công bố Nadya Hajar, et al (2012) đạt 8,6% V/V) tiệm cận kết lên men Ibegbulem cộng (2014) đạt 12,7% V/V) Hàm lượng đường sót 1,25 g/l, acid 5,67 g/l hiệu suất lên men đạt 95,3%, đạt tiêu chuẩn rượu vang để chưng cất brandy Sau 25 ngày, trình lên men hoàn toàn kết thúc, lượng rượu tạo đạt 12,4% V/V, hàm lượng đường sót cịn 0,93 g/l, acid tổng số 5,78 g/l không khác biệt nhiều với thành phần dịch lên men sau 10 ngày Hơn nữa, kết cảm quan cho thấy: chưng cất sau 10 ngày lên men, rượu brandy có hương vị tốt giai đoạn lên men phụ kéo dài đến 25 ngày, brandy thơm Đây khác biệt sản xuất Brandy từ dứa so với từ nho Khi kéo dài lên men phụ dịch nho lên men sau chưng cất cho brandy thơm hơn; nhiên việc kéo dài thời gian lên men phụ vang dứa lại thu brandy dứa hương nhiều Vì vậy, chúng tơi chọn ngày thứ 10 thời điểm kết thúc lên men để chưng cất rượu brandy dứa Những kết cho phép khẳng định mơi trường thích hợp cho lên men vang dứa để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa điều chỉnh để có pH = 4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan 7mg/l, hàm lượng men giống bổ sung 17,3 × 106 tế bào/ml dịch lên men, lên men 28o C, thời gian dừng lên men vang dứa để chưng cất ngày thứ 10 sau lên men 3.4 Cải biến chủng nấm men S cerevisiae D8 kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên 3.4.1 Tác dụng gây chết hóa chất NTG, tia cực tím UV kết hợp NTG với UV đến tế bào nấm men S cerevisiae D8 Chủng nấm men S cerevisiae D8 gây đột biến phương pháp: Sử dụng hóa chất NTG (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine), tia cực tím UV (50W, 260nm) kết hợp NTG với UV khoảng thời gian từ 20 – 140 phút Tác dụng gây chết tác nhân đột biến đến tế bào nấm men S cerevisiae D8 trình bày hình 3.10 18 Tỷ lê tế bào chết (%) 96,55 ±3,29 100 99,04 ± 3,57 99,24 ± 3,65 99,89 ± 3,98 99,99 ± 4,18 99,56 ±4,09 99,89 ± 4,13 97,65 ± 3,54 89,04 ± 2,52 90 97,58 ± 3,93 98,72 ± 4,04 93,35 ± 3,35 89,43 ± 3,28 85,76 ± 3,02 80 78,28 ± 2,13 67,53 ± 1,95 70 70,63 ±1,88 60 Tỷ lệ tế bào chết xử lý NTG 57,13 ± 1,14 54,11 ± 1,09 50 Tỷ lệ tế bào chết xử lí UV 40 30 Tỷ lệ tế bào chết xử lí NTG + UV 32,42 ± 0,25 28,24 ± 0,22 20 10 Thời gian (phút) 00 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Hình 3.10 Tác dụng gây chết hóa chất NTG, tia cực tím UV kết hợp NTG với UV đến tế bào nấm men S cerevisiae D8 Thời gian làm chết 99% tế bào nấm men S cerevisiae D8 (có × 106 tế bào sống/ml) xử lý với UV, NTG, UV kết hợp NTG 120 phút, 100 phút 80 phút Tỉ lệ tế bào chết cao đồng thời rút ngắn thời gian gây chết xử lý đột biến kết hợp NTG UV so với gây đột biến riêng lẻ NTG UV đươc Liu đồng tác giả (2011), Sridhar đồng tác giả (2002) công bố Hiệu gây chết kết hợp NTG với UV cao kết hợp sử dụng lực điện trường với NTG công bố Kim Lee (1998) 3.7.2 Hoạt lực lên men etanol biến chủng Việc gây đột biến ngẫu nhiên phương pháp kết hợp sử dụng NTG UV làm tăng tỉ lệ chết nấm men so với xử lý riêng rẽ với NTG UV Từ khuẩn lạc sống sót thí nghiệm có tỷ lệ sống sót 10,57%, biến chủng sinh etanol cao, chịu hàm lượng đường rượu cao sàng lọc tuyển chọn Hoạt lực lên men biến chủng bới NTG UV thể bảng 3.13 19 3.14 trang 105 đến 106 luận án báo số Bảng 3.14 Hoạt lực lên men ethanol biến chủng thu từ xử lý đột biến tích lũy (kết hợp NTG UV) STT 10 11 12 13 14 15 Chủng nấm men/ biến chủng S.c erevisiae D8 N140.6 NU120.4 NU140.12 NU80.17 NU100.8 NU60.11 NU120.9 NU140.4 NU100.16 NU80.24 NU60.18 NU120.6 NU60.5 NU80.8 Nồng độ rượu ethanol thu (%V/V) 12,4 ± 0,2 14,0 ± 0,2 15,1 ± 0,2 14,8 ± 0,1 14,8 ± 0,1 14,6 ± 0,2 14,5 ± 0,1 14,4 ± 0,3 14,3 ± 0,2 14,3 ± 0,2 14,3 ± 0,1 13,8 ± 0,2 13,8 ± 0,1 13,6 ± 0,2 13,3± 0,1 Khả sinh ethanol chủng/biến chủng so với chủng S cerevisiae D8 biến chủng N140.6 (%) (%) 100 88 113 122 119 119 118 117 116 115 115 115 111 111 110 107 100 108 106 106 105 104 103 102 102 102 99 99 97 95 Các biến chủng S cerevisiae D8 sống sót sau xử lý với NTG sàng lọc môi trường lên men có hàm lượng đường tổng 220 g/l thu biến chủng có hoạt lực lên men rượu cao chủng S cerevisiae D8 Đăc biệt biến chủng 140.6 có hoat lực lên men đạt 14,02 % V/V, cao 13% so với chủng gốc S cerevisiae D8 Biến chủng N140.6 lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu Hoạt lực lên men etanol biến chủng phân thành nhóm khác biệt có ý nghĩa (các biến chủng nhóm có hoạt lực lên men khác khơng có ý nghĩa) Nhóm gồm biến chủng tích lũy NU140.12, NU80.17, NU100.8 có hoạt lực lên men etanol cao 20% so với chủng S cerevisiae D8 Nhóm gồm biến chủng tích lũy NU60.11, NU120.9, NU140.4, NU100.16, NU80.24 có hoạt lực lên men etanol cao 16 - 20% so với chủng S cerevisiae D8 Nhóm gồm biến chủng NU60.18, NU120.6, NU60.5, NU80.8 có hoạt lực lên men cao 10% so với chủng S cerevisiae D8 Đặc biệt biến chủng tích lũy NU120.4 có hoạt lực lên men etanol cao (đạt hàm lượng rượu etanol 15,1% V/V sau 10 ngày lên men), tăng 22% so với chủng S cerevisiae D8 tăng 8% so với biến chủng gốc N140.6 Khả lên men sinh etanol biến chủng tích lũy NU 120.4 cao khác biệt so với 12 biến chủng lại với mức ý nghĩa p = 0,05 Kết cao so với công bố trước Kim Lee (1998) gây đột biến S cerevisiae phương pháp khác (đạt hàm lượng rượu etanol 13,3%) Biến chủng NU 120.4 có hoạt lực lên men etanol cao ổn định (đạt hàm lượng rượu 20 15,1% V/V tăng 22% so với chủng nấm men S cerevisiae D8) mơi trường lên men có 250 g/l đường phát triển tốt mơi trường có từ đến 10% rượu etanol, có hoạt lực lên men etanol cao Do vậy, biến chủng tiềm lưu giữ để tiếp tục nghiên cứu sâu trước ứng dụng sản xuất rượu cao độ từ dịch dứa Queen 3.5 Chưng cất, làm sạch, tàng trữ tạo hương cho brandy dứa từ chủng S cerevisiae D8 3.5.1 Chưng cất làm rượu Hoạt động nấm men trình lên men rượu thường kèm nhiều sản phẩm phụ không mong muốn như: acid, metanol, aldehit, furfurol (Mục Thành phần tạp chất có brandy dứa thơ trình bày trang 111 luận án) Do vậy, việc nghiên cứu để tìm phương pháp phù hợp để loại bỏ tạp chất rượu cách hiệu cần thiết Nghiên cứu sử dụng ba phương pháp làm rượu khác nhau: chưng cất phân đoạn (từ trang 112 đến 114 luận án), phương pháp hóa học (từ trang 114 đến 119 luận án) phương pháp kết hợp hóa học chưng cất phân đoạn (từ trang 119 đến 121 luận án) nghiên cứu nhằm tìm kiếm phương pháp phù hợp để loai bỏ tạp chất brandy dứa sản xuất từ chủng S cereveisiae D8 Phương pháp làm kết hợp cho rượu brandy có hàm lượng tạp chất giảm mạnh: lượng aldehit giảm 94,5% 12 mg/l; rượu bậc cao giảm 45,9% 332,0 mg/l; ester giảm 54,2% 125,0 mg/l; metanol giảm 44,6% 36 mg/l; acid giảm 62,7% 0,2 g/l; furfurol không phát hiện; điểm cảm quan đạt 16/20 Rượu Brandy dứa làm phương pháp kết hợp đạt tiêu chuẩn rượu Việt Nam QCVN6-3: 2010/BYT Phương pháp làm kết hợp phương pháp tối ưu so với phương pháp chưng cất phân đoạn phương pháp hóa học thực riêng rẽ Brandy dứa thô làm phương pháp loại bỏ phần lớn tạp chất, rượu sạch, không bị hương thơm, chất lượng rượu đạt tiêu chuẩn rượu Việt Nam 21 Đơn vi mg/l; g/l; điểm 700.0 614.0 ± 0.4 600.0 Brandy dứa thô 500.0 400.0 332.0 ± 273.0 ± 0.2 300.0 Brandy làm phương pháp tổng hợp 220.0 ± 0.3 200.0 125.0 ± 65.0 ± 0.2 36.0 ± 0.2 100.0 12.0 ± 0.3 0.9 ± 0.05 0.0 16 ± 0.04 0.6 ± 0.05 0.2 ± 0.03 12 ± 0.04 0.0 Hàm lượng Hàm lượng Hàm lượng andehit (mg/l) rượu bậc cao este (mg/l) (mg/l) Hàm lượng methanol (mg/l) Hàm lượng Hàm lượng Cảm quan Chỉ fucfurol ( axit (theo axit (điểm) tiêu mg/l) axetic) (g/l)) Hình 3.15 Thành phần tạp chất có brandy dứa làm phương pháp kết hợp 3.5.2 Tàng trữ tạo hương đặc trưng cho brandy dứa từ chủng S cerevisiae D8 Tàng trữ tạo hương đặc trưng cho brandy dứa gỗ sồi Đánh giá cảm quan rượu brandy dứa sau ngâm với bột/thanh gỗ sồi xử lí ở mức độ khác Thanh gỗ sồi bột gỗ sồi thương mại nhập từ Pháp sử dụng để nghiên cứu vai trò gỗ sồi sản xuất brandy dứa Việt Nam Sử dụng bột gỗ sồi thương mại trình tàng trữ brandy dứa cần khối lượng (4 g/l) so với dùng gỗ sồi dạng (10 g/l) đạt màu sắc, hương vị điểm cảm quan cao xử lí với gỗ sồi (Kết ghi lại Bảng 3.20 từ trang 123 đến 124 luận án báo số 5) Bảng 3.21 Một số thành phần hương brandy dứa trắng sau 24 tháng tàng trữ khơng có gỗ sồi Thời gian lưu (phút) 23,63 Hàm lượng (%) Công thức phân tử Metyl caprate 4,22 C11H22O2 Mùi vị trái lên men 24,76 Geranic acid 3,91 C10H16O2 Hương gỗ, vị béo ngậy ngào 25,78 Copaene 1,82 C15H24 Hương gỗ, vị mật ong, cay nhẹ 25,96 Ethyl decanoate 1,53 C12H24O2 Sáp, trái cây, táo 28,99 Muurolene 0,94 C15H24 Hương thảo dược 29,70 Muurolene 2,80 C15H24 Hương thảo mộc Thứ tự Tên hợp chất Đặc điểm chung hương vị 22 Sáp, kem, béo với xà phòng, sắc 30,02 Methyl laurate 0,84 C13H26O2 30,38 Cadinene 0,56 C15H24 Hương thảo dược 30,45 Calamene 2,10 C15H22 Hương hoa, vị cay yếu 10 31,10 Calacorene 0,34 C10H16 Thơm nhựa thông 11 33,61 Cubenol 3,76 C15H26O Hương thảo dược, vị trà xanh, cay 12 34,01 4,12 C15H26O Hương vị mật ong, thảo dược 13 34,10 2,19 C15H26O Hương hoa oải hương 14 34,38 Cadinol 0,98 15 34,97 Cadalene 1,02 C15H18 16 42,65 Ethyl Palmitate 3,71 C18 H36O2 Total 34,88 Muurolol ( =T- Muurolol) Cadinol ( =Tau -Muurolol) thái dừa Hương trái cây, kem lên men, vani, sắc thái balsamic ) 22 Bảng 3.22 Thành phần hương brandy dứa tàng trữ 24 tháng Thời gian lưu (phút) 5,54 với bột gỗ sồi thương mại (4g/l) Pinene Hàm lượng (%) 0,17 Công thức phân tử C10H16 5,91 Camphene 0,13 C10H16 6,22 Benzadehyde 0,42 C7H6O 8,52 Salicyaldehyde 0,12 C7H6O2 12.30 Benzenpropanal 0,70 C9H12O 12,43 Borneol (=EndoBorneol) 0,17 C10H18O 14,19 Cinnamaldehyde 0,97 16,15 74,22 20,12 Cinnamaldehyde Cinamaldehyde dimethyl acetal 18,97 C9H8O C9H8O C11H14O2 10 21,25 Coumarin 1,54 C9H6O2 11 21,33 Cinanamic acid 0,19 C11H12O2 12 21,47 Cinamyl acetate 1,23 13 23,38 0,12 14 24,08 Bisabolene(b-) Methoxycinnamaldehy de Total C11H12O2 C15H24 0,36 C10H10O2 Thứ tự Tên hợp chất Đặc điểm chung hương vị Hương gỗ thông xanh Hương gỗ, thơm mát, bạc hà, giống lim xanh, vỏ chanh, cam quýt Hương trái cây: Ngọt, dầu mỡ, hạnh nhân, anh đào, gỗ Hương hạnh nhân đắng Hương gỗ bồ đề, nhựa dương sỉ, vỏ số khác ổi, dâu tây, có rượu rum, vang, có số nấm mạch nha Mùi long não Mùi quế Hương quế Mùi cay quế tươi Hương thơm ngào Mùi trái thơm hương quế với chút hổ phách Hương hoa quế mật ong Mùi trái cây, hương thơm cam quýt nhựa thơm opoponax cay Thơm dâu tây, anh đào 99,31 Gỗ sồi có vai trị quan trọng việc tàng trữ, tạo hương, vị màu sắc đặc trưng cho brandy dứa Thành phần hàm lượng chất thơm brandy tàng trữ với gỗ sồi hồn tồn khác biệt với brandy dứa trắng từ dẫn đến màu sắc, hương vị cảm quan khác biệt Ban đầu, brandy dứa không màu, suốt; brandy tàng trữ với bột gỗ sồi có màu hổ phách đặc trưng Thành phần hợp chất thơm, dễ bay (16 chất phân tích được) brandy dứa không tàng trữ với gỗ sồi chủ yếu thu sau 20 phút sắc ký GC-MS, chiếm 34,88% thành phần chất thơm có rượu brandy trắng Thành phần, hợp chất thơm, dễ bay brandy dứa tàng trữ với bột gỗ sồi chủ yếu thu khoảng 15- 20 phút sắc ký GC-MS, gồm có 14 chất mới, có loại terpene, dẫn xuất terpene, hợp chất thơm; loại aldehyde, acide, ester Tóm lại, gỗ sồi có vai trò quan trọng việc tàng trữ, tạo hương, vị màu sắc đặc trưng cho brandy dứa Sử dụng gỗ sồi thương mại (4g/l thời gian 24 tháng, lâu tốt), thể tích khơng khí bên bình tàng trữ 6%, nhiệt độ trung bình 25 °C, độ ẩm tương đối khơng khí 80%) để thu brandy dứa có màu sắc, hương vi tốt nhất, điểm cảm quan cao 18,5/20 điểm 23 3.5.3 Quy trình cơng nghệ sản xuất brandy từ dứa chủng S cerevisiae D8 Từ nghiên cứu thử nghiệm (20 - 100 lít), chúng tơi đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất rượu brandy từ dứa Queen Quả dứa Chủng S cerevisiae D8 - Gọt vỏ,loại mắt, rửa sạch, để nước - Xay, ép nước máy Nhân giống cấp Nhân giống cấp Sơ chế nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa - Điều chỉnh tiêu hoá lý -Sunfit hoá - 10 h Chuẩn bị dịch lên men Nhân giống cấp 5% thể tích dịch lên men t = 28oC, ngày Lên men ngày Lên men phụ để thu vang non Chưng cất thu rượu brandy thơ Oxy hóa tạp chất KMnO4 khử acid NaOH Chưng cất phân đoạn Làm bandy dứa Tàng trữ tạo hương cho brandy dứa Gạn cặn, pha lỗng, điều chỉnh tiêu Đóng chai, dán nhãn, bao bì Brandy thành phẩm Hình 3.18 Sơ đồ quy trình sản xuất brandy dứa Thuyết minh quy trình cơng nghệ sản xuất brandy từ dứa trình bày trang 132 133 luận án Quy trình gồm cơng đoạn chính: (1) Nhân giống nấm men, (2) Sơ chế nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa, (3) Chuẩn bị dịch lên men, (4) Lên men chính, (5) Lên men phụ để thu vang non, (6) Chưng cất làm brandy dứa, (7) Tàng trữ tạo hương cho brandy dứa (8) Đóng chai, dán nhãn, bao bì 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ dịch dứa lên men tự nhiên phân lập chủng nấm men, tuyển chọn 01 chủng nấm men D8 có khả lên men ethanol cao, tạo ethanol đạt 12,4% v/v mơi trường lên men có hàm lượng đường 220 g/l, hiệu suất lên men đạt 95,3%, có khả sinh trưởng tốt trình lên men Đã xác định tên khoa học chủng D8 S cerevisiae D8 dựa đặc điểm hình thái, hóa sinh sinh học phân tử; xác định mơi trường nhân giống thích hợp S cerevisiae D8 là: hàm lượng đường 70g/l, (NH4)2SO4 g/l nước chiết 100 g giá đỗ /l, pH 4,0, nhiệt độ 28ºC Ở điều kiện vậy, số lượng tế bào nấm men sống cực đại đạt 342 × 106 tế bào/ml, tỉ lệ tế bào nảy chồi đạt 88% Đã nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình lên men vang dứa xác định mơi trường thích hợp cho lên men vang dứa Queen để sản xuất brandy là: Dịch ép dứa có pH= 4, hàm lượng đường 220 g/l, lượng oxy hòa tan 7mg/l, hàm lượng men giống bổ sung 17,1 × 106 tế bào/ml dịch lên men nhiệt độ 28oC Đã cải biến chủng S cerevisiae D8 kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên thu dịng đột biến tích lũy NU 120.4 có khả lên men ethanol cao đạt hàm lượng ethanol 15,1% V/V, tăng 22% so với chủng gốc S cerevisiae D8 Đã làm brandy dứa thô phương pháp kết hợp hóa học vật lý thu đươc brandy trắng có thành phần hương phong phú, xác định 16 chất, chiếm 34,88% tổng lượng chất bay có brandy dứa trắng, bao gồm có loại rượu, loại acid; loại ester loại poly saccharides (terpene); đạt điểm cảm quan 16,0/20 điểm Đã xác định hàm lượng bột gỗ sồi thích hợp để tàng trữ tạo hương cho brandy dứa g/l Rượu brandy dứa tàng trữ 24 tháng có điểm cảm quan tốt 18,5/20 Qua xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất brandy dứa gồm bước chính, (1) Nhân giống nấm men, (2) Sơ chế nguyên liệu chuẩn bị dịch ép dứa, (3) Chuẩn bị dịch lên men, (4) Lên men chính, (5) Lên men phụ để thu vang non, (6) Chưng cất làm brandy dứa, (7) Tàng trữ tạo hương cho brandy dứa, (8) Đóng chai, dán nhãn, bao bì KIẾN NGHỊ Cần phối hợp với đơn vị sản xuất, quan chức để sản xuất thức đưa sản phẩm brandy dứa thăm dò thị trường Tiếp tục nghiên cứu xác định gen đột biến vị trí đột biến dòng đột biến tiềm NU 120.4, nghiên cứu tính an tồn thực phẩm trước ứng dụng chủng cải biến vào sản xuất ... phát từ yêu cầu thực tiễn sản xuất, nhằm giúp nông dân giải khâu tiêu thụ dứa phương pháp chế biến, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ dứa? ??... brandy dứa; xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất brandy từ dứa 3 - Ý nghĩa thực tiễn Các kết nghiên cứu luận án ứng dụng để sản xuất brandy dứa, làm đa dạng hóa sản phẩm chất lượng cao từ dứa, ... nhân giống nấm men để lên men vang, sản xuất brandy - Đề xuất quy trình lên men vang để sản xuất brandy dứa sử dụng chủng nấm men S cerevisiae D8 nguồn nguyên liệu dứa Queen - Đề xuất phương