Luận án đánh giá được tính đa dạng của vi sinh vật phân lập trong nhiên liệu Jet A1; xác định được những vi sinh vật chủ chốt gây hại đối với nhiên liệu máy bay; đánh giá được hiệu quả của chất diệt khuẩn đang được sử dụng ở Việt Nam và đưa ra khuyến cáo nhằm kiểm soát các vi sinh vật phá hỏng nhiên liệu, đảm bảo an toàn cho các chuyến bay.
bộ giáo dục v đo tạo viện khoa học v công nghệ việt nam Viện công nghệ sinh học Phạm Thị Hằng nghiên cứu thnh phần khu Hệ vi sinh vật nhằm hạn chế tác hại chúng nhiên liệu máy bay Jet A1 Chuyên ngành: Vi sinh vật häc M· sè: 62 42 40 01 Tãm t¾t LuËn án tiến sĩ sinh học Hà Nội - 2010 Công trình đợc hon thnh Viện Công nghệ sinh học ViƯn Khoa häc vμ C«ng nghƯ ViƯt Nam Ng−êi h−íng dẫn: PGS.TS Lại Thuý Hiền PGS.TS Trần Đình Mấn Phản biện 1: PGS.TS Phạm Văn Toản Bộ Nông nghiệp v Phát triển nông thôn Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy Viện Công nghệ Sinh học Phản biện 3: TS Dơng Văn Hợp Viện Vi sinh vật v Công nghệ sinh học Luận án đợc bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án tiến sỹ cấp Nh nớc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học vμ C«ng nghƯ ViƯt Nam - 18 Hoμng Qc ViƯt, Cầu Giấy, H Nội Vo hồi giờ, ngy tháng Có thể tìm thấy luận án tại: - Th viện Công nghệ sinh học - Th viện Quốc gia năm 2010 CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN Lai Thuy Hien, Pham Thi Hang, Vuong Thi Nga, Hoang Hai, Nobuyasu Ymaguchi, Katsuji Tani (2008), Microbial diversity in trace water of jet fuel in Vietnam, ASEAN Journal on Science and Technology for Development, tr 303-312 Pham Thi Hang, Lai Thuy Hien (2008), Identification of fungi isolated from JetA1 fuel systems by 26s rRNA sequencing, International 8th General Seminar of CUP on Environmental Science and Technology, Osaka, Japan 11/2008, tr 476-483 Pham Thi Hang, Lai Thuy Hien, Dang Phuong Nga, Daisuke Inoue, Kazunari Sei, Michihiko Ike (2007), Identification of some predominant bacteria isolated from JetA1 fuel in Vietnam by sequence analysis of 16S rRNA gene, International 7th General Seminar of CUP on Environmental Science and Technology, tr 301-308 Lại Thúy Hiền, Đỗ Thu Phương, Vũ Phương Anh, Đặng Phương Nga, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, Vương Thị Nga, Lê Gia Hy, Trần Đình Mấn (2005), Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật dầu mỏ, Hội nghị Khoa học kỉ niệm 30 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 57-66 Phạm Thị Hằng, Lại Thúy Hiền, Nguyễn Đình Quyến (2000), Đặc điểm phân loại khả phân hủy hidrocacbon số chủng vi khuẩn Gram âm phân lập từ nhiên liệu máy bay JetA1, Tạp chí Sinh học, 22(4), tr 31-37 Lại Thúy Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Đặng Phương Nga, Đỗ Thu Phương, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng (1999), Chọn chủng vi khuẩn phân hủy hydrocacbon mạch dài ứng dụng khai thác dầu khí, Hội nghị Cơng nghệ sinh học toàn quốc, tr 36-42 Lại Thúy Hiền, Đỗ Thu Phương, Vũ Phương Anh, Đặng Phương Nga, Phạm Thu Thuỷ, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng (1998), Vi sinh vật nhiên liệu Jet A1 giải pháp loại trừ chất diệt khuẩn, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học, tr 286-301 -1- MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nhiên liệu máy bay loại sản phẩm chuyên dụng dành riêng cho động máy bay nên địi hỏi phải có độ tinh cao Đối với nhiên liệu, việc kiểm soát chất lượng bao gồm đặc điểm vật lý, hóa học vi sinh vật quan trọng Vì dù tiêu không bảo đảm gây hậu vơ nghiêm trọng, ảnh hưởng đến an toàn chuyến bay Trong nhiên liệu máy bay bị nhiễm hàng trăm loại vi sinh vật khác nhau, nhiều loài số có khả sử dụng tốt hydrocarbon nhiên liệu Chúng vừa sinh trưởng tốt nhiên liệu vừa vi sinh vật tiên phong công vào nhiên liệu, kéo theo phát triển nhiều loại vi sinh vật khác Vi sinh vật nhiễm nhiên liệu máy bay gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng nhiên liệu như: thay đổi thành phần hóa học, tính chất lý hóa nhiên liệu; gây ăn mòn bể chứa đường ống dẫn; gây tắc lọc hệ thống dẫn Do đó, việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật đồng thời phát lồi có khả sử dụng nhiên liệu máy bay cần thiết, vừa có ý nghĩa khoa học vừa mang tính thực tiễn cao Để giải vấn đề tồn nêu trên, luận án: “Nghiên cứu thành phần khu hệ vi sinh vật nhằm hạn chế tác hại chúng nhiên liệu máy bay Jet A1” thực với mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu đề tài - Đánh giá tính đa dạng vi sinh vật phân lập nhiên liệu Jet A1 Việt Nam - Xác định vi sinh vật chủ chốt gây hại nhiên liệu máy bay Việt Nam -2- - Đánh giá hiệu chất diệt khuẩn sử dụng Việt Nam đưa khuyến cáo nhằm kiểm soát vi sinh vật phá hỏng nhiên liệu, đảm bảo an toàn cho chuyến bay Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu nhiên liệu, vết nước nhiên liệu lấy từ máy bay kho bể chứa nhiên liệu Việt Nam - Phân lập vi sinh vật ưu (vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men) - Phân loại số chủng vi sinh vật chiếm ưu khu hệ phương pháp hình thái, sinh lý, sinh hố phân tích trình tự 16S, 26S rDNA - Xác định thành phần chủng loại đánh giá đa dạng vi sinh vật nhiên liệu Jet A1 kỹ thuật DGGE, so sánh với phương pháp truyền thống - Phát vi sinh vật có khả sử dụng hydrocarbon nhiên liệu, gây ảnh hưởng đến an tồn bay Những đóng góp luận án (1) Đã phát thêm số loài vi khuẩn nấm mốc thường gặp nhiên liệu máy bay Jet A1 Việt Nam (2) Lần Việt Nam phân lập Dietzia sp từ nhiên liệu Jet A1 Vi khuẩn có khả sử dụng mạch carbon từ C8 − C25 sinh tổng hợp CHHBMSH gồm vòng benzene, hai nhóm COO− hai mạch carbon C12 CHHBMSH vi khuẩn Dietzia sp sinh giúp nhiều loại vi khuẩn khác sinh trưởng phá hỏng nhiên liệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu đề tài Các mẫu nhiên liệu máy bay lấy từ kho bể, xe téc thùng chứa nhiên liệu hai cánh máy bay Nội Bài (Hà Nội), Cát Bi (Hải Phòng), Đà Nẵng Tân Sơn Nhất (Tp Hồ Chí Minh) Phạm vi nghiên cứu vi sinh vật chiếm ưu nhiên liệu ảnh hưởng chúng đến nhiên liệu -3- Bố cục luận án Luận án gồm 122 trang, phần mở đầu trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết thảo luận 53 trang, kết luận trang, danh mục cơng trình cơng bố trang, tài liệu tham khảo 13 trang phụ lục 10 trang Chương Tổng quan tài liệu 1.1 Một số đặc điểm, tính chất nhiên liệu máy bay 1.1.1 Thành phần hóa học nhiên liệu máy bay 1.1.2 Các tính chất nhiên liệu máy bay 1.1.3 Phân loại nhiên liệu máy bay 1.1.4 Một số chất phụ gia bổ sung nhiên liệu 1.2 Vi sinh vật nhiên liệu máy bay 1.2.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nhiên liệu máy bay giới 1.2.2 Nấm mốc Cladosporium resinae nhiên liệu máy bay 1.2.3 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật nhiên liệu máy bay Việt Nam 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tồn vi sinh vật nhiên liệu máy bay 1.3 Ảnh hưởng vi sinh vật đến nhiên liệu máy bay 1.3.1 Vi sinh vật làm thay đổi thành phần, tính chất nhiên liệu dẫn đến làm hỏng nhiên liệu 1.3.2 Vi sinh vật gây ăn mòn thiết bị tiếp xúc 1.3.3 Các ảnh hưởng khác 1.4 Ngăn ngừa xử lý thành phần nhiễm bẩn nhiên liệu 1.4.1 Xả nước thường xuyên 1.4.2 Sử dụng màng bảo vệ bể chứa 1.4.3 Lọc 1.4.4 Kết tủa 1.4.5 Loại trừ thành phần dinh dưỡng vi sinh vật 1.4.6 Sử dụng chất diệt khuẩn, chất ức chế vi sinh vật phụ gia -4- Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Tổng số 50 mẫu nhiên liệu máy bay lấy từ kho bể, xe téc thùng chứa nhiên liệu hai cánh máy bay sân bay Nội Bài (Hà Nội), Cát Bi (Hải Phòng), Đà Nẵng Tân Sơn Nhất (Tp Hồ Chí Minh) 2.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng cung cấp hãng có uy tín giới: Sigma, Takara, Invitrogen, Merck… 2.3 Phương pháp 2.3.1 Các phương pháp thu mẫu: lấy mẫu nhiên liệu cần lấy mẫu chuyên dụng; Lọc mẫu nhiên liệu màng lọc chịu dầu bơm hút chân không 2.3.2 Các phương pháp phân lập vi sinh vật: Phân lập xác định số lượng vi sinh vật nhiên liệu theo phương pháp Koch; Đếm số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha lỗng tới hạn 2.3.3 Các phương pháp phân tích mẫu: Xác định Gram; Quan sát nấm mốc kỹ thuật tiêu phòng ẩm; Quan sát vi khuẩn kính hiển vi điện tử quét; Xác định đặc điểm sinh hóa vi khuẩn kit chuẩn API 50 CHB, API 20 NE; Đánh giá khả sử dụng nhiên liệu nuôi lắc môi trường 5% Jet A1 làm nguồn carbon; Đánh giá CHHBMSH phương pháp E24, Drop collapse Oil spreading; Tách chiết thô tinh CHHBMSH sắc ký mỏng; Xác định thành phần dầu CHHBMSH sắc ký khí; Phân tích cấu trúc CHHBMSH sắc ký khối phổ; Tách chiết DNA tổng số, PCR, điện di DNA - DGGE, đọc trình tự gen 16S 26S rDNA 2.3.4.Các phương pháp đánh giá kết quả: Sử dụng giao diện tìm kiếm BLAST NCBI; Xây dựng phát sinh chủng loại phần mềm CLUSTALX 1.83; Đánh giá độ đa dạng quần thể số Shannon, Simpson, Margalef Menhinick -5- Chương Kết thảo luận 3.1 Số lượng thành phần vi sinh vật nhiên liệu máy bay 3.1.1 Phân tích số lượng vi sinh vật nhiên liệu máy bay Tất 50 mẫu nhiên liệu máy bay xuất vi sinh vật với số lượng khác Vi khuẩn hiếu khí từ 0,2 x 101 CFU/ml đến 106 CFU/ml Các mẫu có số lượng vi sinh vật cao đột biến mẫu lấy từ máy bay thường mẫu lẫn nước Nấm mốc có mặt 27/27 mẫu nhiên liệu lấy từ máy bay, 9/12 mẫu bể chứa 7/11 mẫu xe téc với số lượng cao mẫu A345, lên tới 6,3 x 102 CFU/ml Số lượng vi sinh vật nhiên liệu tăng dần theo thời gian trình bảo quản, sử dụng, tương tự nghiên cứu Lại Thúy Hiền đtg [68], [94] 3.1.2 Thành phần vi sinh vật nhiên liệu máy bay Trong số vi sinh vật phân lập được, chủng vi khuẩn nấm mốc chiếm ưu với tỷ lệ gần (46,19 % 43,33 %), chọn làm đối tượng cho nghiên cứu Xạ khuẩn có 14 chủng, chiếm 6,67 % Nấm men có chủng chiếm tỷ lệ 3,81 % Cả hai nhóm giảm số lượng đa dạng lồi (Hình 3.1) Sử dụng cơng thức tốn học để so sánh số độ đa dạng (Shannon), độ đồng (Simpson) đa dạng quần thể (Menhinick, Margalef) Kết cho thấy, vi khuẩn nấm mốc hai nhóm chiếm ưu nhất, bỏ xa nhóm cịn lại nấm men xạ khuẩn (Hình 3.2) 7% 4% 43% 17.954 16.831 6.693 6.279 2.431 0.966 0.878 46% N Êm m èc X ¹ khuÈn V i khuÈn N Êm m en Hình 3.1 Tỷ lệ nhóm vi sinh vật có mặt nhiên liệu Jet A1 0.871 0.997 1.039 0.552 0.999 0.610 0.481 0.410 0.377 Vi khuẩn Nấm mốc Nấm men Xạ khuẩn Margalef Menhinick Simpson Shannon Hình 3.2 Đánh giá mức độ đa dạng đồng nhóm vi sinh vật nhiên liệu máy bay dựa vào số toán học -6- 3.2 Phân loại đánh giá đa dạng chủng nấm mốc nhiên liệu 3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc Các chủng nấm mốc mơ tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc khuẩn ty Chúng xếp thành nhóm gồm Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Curvularia số chủng chưa định tên Penicillium sp A307.5 Aspergillus sp A345.6 Cladosporium sp A302.1 Curvularia sp A348.6 Hình 3.3 Hình thái quan sinh bào tử số chủng nấm mốc phân lập nhiên liệu Jet A1 Kết phân lập phân loại 91 chủng nấm mốc nhiên liệu máy bay Việt Nam cho thấy, Penicillium gồm 28 chủng có mặt 55 % số mẫu có mốc, Aspergillus gồm 25 chủng có mặt 52,5 % số mẫu có mốc Cladosporium phân lập 11 chủng, có mặt mẫu, chiếm tỷ lệ 22,5 % Curvularia có mặt mẫu, chiếm tỷ lệ 10,0 % Các loại mốc cịn lại khơng thuộc chi nêu chiếm tỷ lệ 50 % (Hình 3.4) Mặt khác, nhóm nấm mốc nhiên liệu đánh giá độ đa dạng, độ đồng Kết cho thấy Penicillium Aspergillus chiếm ưu (Hình 3.5) -7- 60 5.985 5.320 2.217 Penicillium 10 P e n i c i l l i u Aspergillus m A s p e g i l l u s Cladosporium C l a d o s p o ri u m C u l cCurvularia u v a ri a K h ¸Khác c Penicillium Hình 3.4 Tỷ lệ chi nấm mốc có mặt nhiên liệu Jet A1 0.593 Margalef 0.524 0.986 0.997 2.306 Menhinick 0.953 Simpson 0 0.305 Shannon Khác 0.598 20 0.957 4.655 0.887 1.153 Cladosporium 0.947 30 2.621 Curvularia 2.935 40 Aspergillus T û lƯ (% ) 50 Hình 3.5 Đánh giá mức độ đa dạng đồng chi nấm mốc nhiên liệu máy bay dựa vào số toán học Như vậy, thành phần loại mốc có thay đổi so với nghiên cứu Lại Thúy Hiền đtg trước [8], [12] Các nghiên cứu khác giới đánh giá Cladosporium Aspergillus mốc chiếm ưu nhiên liệu [46], [58], [112] Nhưng mẫu lấy Việt Nam, Cladosporium xuất với tỷ lệ hẳn Đây câu hỏi cịn bỏ ngỏ, cần phải có thêm nghiên cứu sâu để tìm câu trả lời 3.2.2 Phân loại nấm mốc so sánh trình tự gen 26S rDNA Một số chủng nấm mốc phân loại phương pháp so sánh trình tự gen 26S rDNA đoạn D1/D2 (Hình 3.6) Dựa vào kết độ tương đồng so với GenBank đặc điểm hình thái học [55] xếp chủng nấm mốc nghiên cứu vào loài sau: - Chủng A345.1M giống 98,1 % với Aspergillus sp - Chủng A345.2M giống 97,0 % với Aspergillus sydowii - Chủng A302.1M giống 100 % với Cladosporium breviramosum - Chủng A302.3M giống 99,8 % với Fusarium solani - Chủng A348.1M giống 99,5 % với Arthrobotrys foliicola - 10 - Bảng 3.1 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Gram âm thường gặp nhiên liệu Jet A1 Đặc điểm F502.4 A309.1 A343.7 F502.1 A343.2 Khử nitrate + + + + (NO2) − Chuyển hóa indole − − + − − Axit hóa glucose + − + + +w Arginine dihydrolase + + + − − Urease + + + − +w Esculin + − + + − Gelatine + − + + + β-galactosidase − − + + − Glucose + − + + + Arabinose + − − + − Mannose + − + + − Manitol + − + + − N-acetyl-glucosamine + − + + − Maltose − − + + + Gluconate + − + + + Caprate + − + − − Adipate + + − − + Malate + +w + − + Citrate + +w + − + +w − + − + Cytochrome oxidase + − − − − Catalase + + + + + Thủy phân Đồng hóa Phenyl acetate Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (+w) phản ứng dương tính yếu (−) phản ứng âm tính; - 11 - Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Gram dương thường gặp nhiên liệu Jet A1 Đặc điểm Catalase Axit hóa glucose A345t.2 + + A345.1 + + A343.4 + + A306.1 +w + A343.1 + + Glycerol Erythritol D-arabinose L-arabinose D-ribose D-xylose L-xylose D-Adonitol Methyl-β D-Xylopyranoside D-galactose D-glucose D-fructose D-manose L-sorbose L-rhamnose Dulcitol Inositol D-mannitol D-sorbitol Methyl-β D-manopyranoside Methyl-β D-glucopyranoside N-acetyl-glucosamine Amygdalin Arbutin Esculin Salicin D-cellobiose D-maltose D-lactose D-melibiose D-saccharose D-trehalose Inulin D-melezitose D-raffinose Amidon Glycogen Xylitol Gentiobiose D-turanose D-lyxose D-tagatose D-fucose L-fucose D-arabitol L-arabitol Kali gluconate Kali 2-etogluconate Kali 5-etogluconate + − − + + + − − − + + + + − − − − + + − + − + + + + + + − − + + + − + + + − + − − − − − − + − − − − − − + − + − − − + + + − − − − + − − − − − + +w − − − + − − − + − − + − − − − − − − − − + − − − + + − − − − − − + +w − + + − − − − +w − − − − − + +w − − − + +w − − + + − − − − − − − − +w − − − − − − + +w − − + − + − + − + + + + +w − − +w + + − + + − − +w − − + − − + +w − + − − +w − − + − − − + + − − − + − − − − − − − − − − + − − − − − − − − − − − − − − − − + − − − − − − − − − − − + − − − − − − − − + Ghi chú: (+) phản ứng dương tính; (−) phản ứng âm tính; (+w) phản ứng dương tính yếu - 12 - Dựa vào đặc điểm sinh hóa Bảng 3.1, 3.2, tra phần mềm APILAB Plus đối chiếu với hệ thống phân loại vi sinh vật Bergey’s Manuel [49], số chủng phân loại đến loài sau: - Chủng F502.4 giống 99 % với Pseudomonas cepacia - Chủng F502.1 giống 98 % với Aeromonas sp - Chủng A345t.2 giống 99 % với Bacillus subtilis 3.3.3 Phân loại vi khuẩn so sánh trình tự gen 16S rDNA 3.3.3.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn nhiên liệu máy bay Tổng số 14 chủng vi khuẩn thường gặp, đại diện cho nhóm vi khuẩn Gram âm nhóm vi khuẩn Gram dương chọn để tách chiết DNA tổng số, sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng PCR 3.3.3.2 Nhân đoạn gen 16S rDNA kỹ thuật PCR Có 13/14 chủng xuất sản phẩm băng nhất, có kích thước khoảng 1356 bp Sản phẩm PCR sau kiểm tra tinh kít làm nguyên liệu cho việc đọc trình tự gen 16S rDNA 3.3.3.3 Đọc trình tự đoạn gen 16S rDNA Trình tự đoạn gen xác định theo phương pháp Sanger cải tiến [106], liệu xử lý chương trình PC/GENE Sử dụng giao diện tìm kiếm BLAST để so sánh trình tự nucleotide nhận với trình tự có sẵn GenBank Dựa vào kết độ tương đồng so với GenBank, phát sinh chủng loại, kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh hóa đối chiếu với hệ thống phân loại vi sinh vật Bergey’s Manuel, xếp chủng vi khuẩn nghiên cứu vào loài sau: - Chủng A345.4 giống 98,3 % với Bacillus flexus - Chủng A345t.2 giống 98,5 % với Bacillus subtilis - Chủng A345.1 giống 99,2 % với Brevibacillus borstelensis - Chủng A343.7 giống 98,8 % với Sphingomonas paucimobilis - Chủng A343.4 giống 99,1 % với Dietzia sp - Chủng A343.3 giống 97,8 % với Brachybacterium sp - Chủng A343.2 giống 98,1 % với Sphingomonas pseudosanguinis - Chủng A343.1 giống 98,8 % với Brevibacterium casei - 13 - - Chủng A309.1 giống 99,5 % với Acinetobacter johnsonii - Chủng A306.1 giống 99,7 % với Brachybacterium paraconglomeratum - Chủng A302.4 giống 99,6 % với Staphylococcus epidermidis - Chủng A307.2 giống 97,8 % với Serinicoccus - Chủng A502.1 chưa phân loại Kết phân loại cho thấy, khu hệ vi sinh vật nhiên liệu đa dạng có thay đổi mạnh mẽ so với nghiên cứu công bố trước Bacillus chiếm ưu nhiều nghiên cứu công bố [14], [34], [41], [49], [62] Pseudomonas đại diện quan trọng nhiên liệu có khả sử dụng hydrocarbon nhiên liệu tốt lại giảm hẳn số lượng thành phần loài Ngoài ra, Staphylococcus, Sphingomonas, Acinetobacter Brevibacterium đại diện phổ biến nhiên liệu máy bay [58], [99], [111] Nhiều lồi trước xuất chưa cơng bố thấy có mặt nhiên liệu (Brevibacillus, Branchybacterium, Dietzia Serinicoccus) Một điều dễ nhận thấy chiếm ưu lồi thuộc nhóm Actinobacteridae (Serinicoccus, Brevibacterium, Brachybacterium Dietzia) Bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA, nhiều loại vi khuẩn phát nhiên liệu máy bay Việt Nam Sự thay đổi biến đổi khu hệ vi sinh vật nhiên liệu, tác động chất phụ gia, chất diệt khuẩn, hay đơn giản phát triển kỹ thuật phân tích vi sinh vật thay đổi hệ thống phân loại học định tên loài 3.3.4 Đánh giá đa dạng vi khuẩn nhiên liệu máy bay phương pháp DGGE 3.3.4.1 Tách chiết DNA tổng số khu hệ vi khuẩn nhiên liệu máy bay Các mẫu nhiên liệu lọc để tách chiết DNA tổng số gồm 23 mẫu, có 17 mẫu lấy từ máy bay, mẫu lấy từ bể chứa mẫu lấy từ xe téc - 14 - 3.3.4.2 Nhân đoạn gen 16S rDNA kỹ thuật PCR Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy, tất mẫu xuất băng vị trí khoảng 454 bp sử dụng làm nguyên liệu cho bước điện di biến tính theo gradient nồng độ 3.3.4.3 Điện di biến tính theo gradient nồng độ Tất mẫu DGGE có phân tách thành nhiều băng với số lượng, kích thước khác tập trung chủ yếu vùng biến tính khoảng 55 − 60 % B5N1 B6N1 B6N2 T4K3 301 345 1803 1804 ASA 307 348 302 343 309 502 504 ASB ASC ASD ASE ASI ASJ ASH Hình 3.8 Kết DGGE đoạn gen 16S rDNA vi khuẩn mẫu nhiên liệu Trong vùng biến tính từ 55 − 60 % xác định tổng số 19 đường băng khác nhau, so với phương pháp phân lập thạch phần trước (Mục 3.2.3) có đa dạng 35,7 % (19 đường băng so với 14 nhóm chủng vi khuẩn) Kết đọc trình tự đoạn 16S rDNA so sánh với GenBank sau: - Mẫu số có trình tự đoạn 16S rDNA giống 98 % với chi Dietzia - Mẫu số có trình tự đoạn 16S rDNA giống 100 % với lồi Brevibacterium casei - Mẫu số có trình tự đoạn 16S rDNA giống 98 % với chi Acinetobacter - Mẫu số có trình tự đoạn 16S rDNA giống 100 % với loài Bacillus subtilis - Mẫu số có trình tự đoạn 16S rDNA giống 99 % với chi Brevibacillus - Mẫu số 15 có trình tự đoạn 16S rDNA giống 100 % với chi Pseudomonas - Mẫu số 16 có trình tự đoạn 16S rDNA giống 100 % với chi Sphingomonas - 15 - Bằng phân tích DGGE xác định vi khuẩn thường gặp trong nhiên liệu Bacillus (87 %), Brevibacterium (83 %), Dietzia (78 %) Acinetobacter (65 %) 3.4 Khả sử dụng hydrocarbon chủng vi sinh vật thường gặp nhiên liệu 3.4.1 Khả sử dụng hydrocarbon nhiên liệu số nấm mốc Kết đánh giá sinh trưởng khuẩn ty nấm mốc thời gian 30 ngày mơi trường Gost trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Khả sinh trưởng nhiên liệu số chủng nấm mốc thường gặp STT Tên chủng Khả sinh trưởng nhiên liệu ASG.2M − Cladosporium sp A301.3M + Penicillium sp A301.4M + Penicillium sp A302.1M + Cladosporium breviranmosum A302.3M − Fusarium solani A306.1M − Curvularia sp A307.2M − Penicillium sp A307.4M − Chưa xác định A343.1M + Aspergillus sydowii 10 A345.2M ++ Aspergillus versicolor 11 A345.3M + Cladosporium sp 12 A345.4M − Chưa xác định 13 A345t.1M +++ Aspergillus sp 14 A348.5M − Chưa xác định 15 A504.1M +++ Penicillium sp Ghi chú: Tên loài (−) không sinh trưởng; (+) sinh trưởng yếu; (++) sinh trưởng tốt; (+++) sinh trưởng tốt - 16 - Kết cho thấy, có 8/15 chủng có khả sinh trưởng nhiên liệu, có chủng sinh trưởng tốt Tất chủng Aspergillus (3/3 chủng) có khả sử dụng nhiên liệu làm nguồn carbon nhất, 3/4 chủng Penicillium có khả sử dụng nhiên liệu 2/3 chủng Cladosporium sinh trưởng yếu nhiên liệu Ngồi ra, chủng khác khơng có khả sinh trưởng độc lập nhiên liệu 3.4.2 Khả sử dụng hydrocarbon nhiên liệu số vi khuẩn Các chủng vi khuẩn khảo sát khả sinh trưởng nhiên liệu nuôi cấy lắc mơi trường khống tối thiểu bổ sung % nhiên liệu Jet A1 làm nguồn carbon (Bảng 3.4) Bảng 3.4 Khả sinh trưởng nhiên liệu số chủng vi khuẩn thường gặp STT Tên chủng Khả sinh trưởng Tên loài nhiên liệu A345.4 − Bacillus flexus A345t.2 − Bacillus subtilis A345.1 − Brevibacillus borstelensis A343.7 + Sphingomonas paucimobilis A343.4 +++ A343.3 − Branchybacterium sp A343.2 − Sphingomonas pseudosanguinis A343.1 − Brevibacterium casei A309.1 + Acinetobacter johnsonii 10 A307.2 − Serinococcus sp 11 F502.1 − Chưa xác định 12 A306.1 − Branchybacterium conglomeratum 13 A302.4 − Staphylococcus epidermidis 14 F502.4 ++ Pseudomonas sp Ghi chú: Dietzia sp (−) không sinh trưởng; (+) sinh trưởng yếu; (++) sinh trưởng tốt; (+++) sinh trưởng tốt - 17 - Kết khảo sát cho thấy, chủng có khả sinh trưởng độc lập nhiên liệu, hai chủng sinh trưởng tốt A343.4 F502.4 Nhiều nghiên cứu nước công bố khả sử dụng hydrocarbon nhiên liệu loài Pseudomonas đưa khuyến cáo ảnh hưởng chúng nhiên liệu mức cao [6], [13], [45], [63], [121], [129] Các nghiên cứu loài thuộc chi Dietzia chưa nhiều công bố vài năm gần [43], [81], [91], [130] Dịch nuôi cấy chủng Dietzia sp A343.4 sau ngày xác định thành phần dầu tổng số lại sắc ký khí (Hình 3.9) C16 C18 C14 C20 C22 C12 C24 C10 C8 a C8 C10 C12 C14 C16 C18 C20 C22 C24 b Hình 3.9 Phổ sắc ký nhiên liệu Jet A1 trước sau nuôi lắc với chủng Dietzia sp A343.4 a Trước nuôi cấy với vi khuẩn b Sau nuôi cấy với vi khuẩn Sau 14 ngày ni cấy mơi trường có % Jet A1, chủng nghiên cứu sử dụng mạnh carbon mạch ngắn từ C7 đến C9 (85 đến 97 %) chuỗi carbon mạch dài 3.4.3 Vai trò chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 sinh trưởng vi khuẩn khác nhiên liệu - 18 - Chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 ni lắc mơi trường khống Gost bổ sung % Jet A1 Sau ngày, dịch nuôi cấy khử trùng để diệt Dietzia sp A343.4 Tiếp tục đưa chủng không sử dụng trực tiếp nhiên liệu cấy vào bình tiệt trùng theo dõi sinh trưởng chúng sau ngày liên tục, kết trình bảy Bảng 3.4 Hình 3.10 Bảng 3.4 Khả sinh trưởng số chủng vi khuẩn dịch nuôi cấy Dietzia sp A343.4 khử trùng STT Tên chủng Số lượng vi khuẩn (CFU/ml) Khả Trước thí nghiệm Sau thí nghiệm sinh trưởng A345t.2 2,34 x 103 3,64 x 107 Tốt A345.1 1,42 x 103 8,55 x 107 Tốt A343.2 1,79 x 103 5,91 x 107 Tốt A343.3 1,37 x 103 4,35 x 107 Tốt A343.1 2,63 x 103 1,45 x 108 Tốt A309.1 2,57 x 103 2,32 x 108 Tốt A307.2 1,44 x 103 3,22 x 107 Tốt A502.1 1,53 x 103 7,30 x 108 Tốt A302.4 2,31 x 103 8,47 x 107 Tốt a b c Bacillus subtilis 345t.2 b a c Sphingomonas pseudosanguinis A343.2 Hình 3.10 Khả sinh trưởng số chủng vi khuẩn dịch nuôi cấy chủng Dietzia sp A343.4 a Không sinh trưởng nuôi lắc đơn chủng b Sinh trưởng tốt nuôi lắc đơn chủng dịch nuôi cấy Dietzia sp A343.4 c Gạt dịch nuôi cấy để kiểm tra sinh trưởng tốt khiết chủng thí nghiệm Như vậy, sản phẩm trao đổi chất Dietzia sp A343.4 trở thành nguồn thức ăn giàu dinh dưỡng kéo theo sinh trưởng tốt hàng loạt vi khuẩn cịn lại Ngồi sản phẩm hỗ trợ - 19 - vi khuẩn sử dụng nhiên liệu dễ dàng CHHBMSH Vấn đề trình bày phần 3.5 Khả tạo CHHBMSH chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 3.5.1 Đặc điểm CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 tạo Bằng phương pháp đánh giá CHHBMSH, xác định Dietzia sp 343.4 có khả tạo CHHBMSH tốt, dễ thu hồi Kiểm tra sinh trưởng nhiên liệu vi khuẩn khác điều kiện có 0,5 % (v/v) CHHBMSH, % Jet A1 % dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis A345t.2 Sphingomonas pseudosanguinis A343.2 Sau ngày, chủng vi khuẩn sinh trưởng tốt mơi trường có Jet A1 làm nguồn carbon Qua kết luận, CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 tạo giúp vi sinh vật khác dễ dàng việc sử dụng nhiên liệu làm nguồn carbon cho sinh trưởng Do vậy, Dietzia sp thực đối tượng vi sinh vật nguy hiểm nhiên liệu máy bay Vì vừa sử dụng tốt nhiên liệu, vừa kéo theo sinh trưởng sử dụng hydrocarbon hàng loạt vi sinh vật khác nhiên liệu 3.5.2 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 Ảnh hưởng pH đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 Chủng Dietzia sp A343.4 sinh trưởng sinh tổng hợp CHHBMSH tốt pH trung tính đến axit, từ 6,5 đến Chỉ số nhũ hóa E24 cao sau ngày đạt gần 60 % giảm dần ngày thứ (Hình 3.11a) Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 Chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 sinh trưởng tạo CHHBMSH tốt 28 oC Sau đến ngày, số nhũ hóa E24 dịch ni cấy đạt 60 % (Hình 3.11b) Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 - 20 - Chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 có khả sinh trưởng tốt điều kiện có nồng độ NaCl khác Ở nồng độ NaCl 1; 1,5 vi khuẩn sinh trưởng tốt, tạo nhiều sản phẩm CHHBMSH, số hóa E24 sau đến ngày đạt từ 75 đến 80 % (Hình 3.11c) Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 Chủng Dietzia sp A343.4 có khả sinh tổng hợp CHHBMSH tốt môi trường sử dụng dầu olive làm nguồn carbon, với số E24 lên tới 90 % sau ngày nuôi cấy đạt cực đại 100 % sau ngày nuôi cấy Chủng Dietzia sp A343.4 sử dụng hai loại nhiên liệu Jet A1 dầu DO tốt khơng sử dụng glycerol (Hình 3.11d) E 24-pH E - p H ,5 E 24-pH O D - p H ,5 O D -p H O D - p H ,5 O D -p H E -2 0 C O D -2 0 C 70 E -3 C O D -3 C 60 60 50 30 20 O D 540 nm 40 C h Ø sè E 24 50 C h Ø sè E E -2 C O D -2 C 70 30 20 10 40 10 0 T h ê i g ia n ( n g μ y ) a E -0 % E - ,5 % E -1 % E - ,5 % E -2 % O D -0 % O D - ,5 % O D -1 % O D - ,5 % O D -2 % E - o liv e O D - o liv e 70 40 30 20 O D 540 nm C h Ø sè E 50 C h Ø sè E 60 5 b T h ê i g ia n ( n g μ y ) 90 80 E - g ly O D - g ly E - J e tA O D - J e tA O D 54 n m E - p H ,5 O D -pH E -D O O D -D O 120 100 80 60 40 20 O D 540 nm E -p H 10 0 T h ê i g ia n ( n g μ y ) c T h ê i g ia n ( n g μ y ) d Hình 3.11 Ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả tạo CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 3.5.3 Xác định có mặt CHHBMSH vi khuẩn Dietzia sinh tổng hợp CHHBMSH Dietzia sp A343.4 sinh tách chiết tinh sắc ký mỏng (TLC) sử dụng sắc ký khí (GC) để xác định đặc điểm pic (peak) thời gian lưu (Hình 3.12a) - 21 - 44,33 ‘ 1a 62,67‘ 1a 1b 2b 2a 47,78‘ C11 2a C13 C14 61,49‘ C23 C21 1a 2a Hình 3.12 Sắc ký đồ CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 sinh tổng hợp a Tách chiết riêng CHBMSH b Dịch nuôi cấy chủng Dietzia sp A343.4 c Dịch nuôi cấy chủng Dietzia sp A343.4, sau sử dụng để ni cấy chủng B subtilis A345t.2 Từ kết nhận thấy, mẫu sắc ký đồ xuất từ đến pic đặc trưng Hai pic lớn 1a 2a thường xuyên có mặt tất mẫu sắc ký có CHHBMSH Hai pic nhỏ 1b 2b không xuất thường xuyên mẫu chạy sắc ký Như vậy, sắc ký đồ CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 sinh tổng hợp có đặc điểm pic ổn định đặc trưng Tuy nhiên, để xác định cấu trúc CHHBMSH chủng tạo ra, cần phải tiếp tục có nghiên cứu sâu - 22 - 3.5.4 Xác định cấu trúc CHHBMSH chủng Dietzia sp A343.4 tạo sắc ký khối phổ (GC–MS) CHHBMSH chủng vi khuẩn Dietzia sp sinh tổng hợp phân tích GC–MS (Hình 3.13) có chứa vịng benzene, hai mạch hydrocarbon C12 có vị trí nhóm COO− nằm cuối mạch (giống với chất chuẩn 85 %) a O O O O b Hình 3.13 Xác định cấu trúc CHHBMSH chủng vi khuẩn Dietzia sp A343.4 sinh tổng hợp GC–MS a CHHBMSH bị cắt thành mảnh nhỏ b So sánh với sở liệu, CHHBMSH giống với chất chuẩn 85 % 3.6 Đánh giá hiệu lực chất diệt khuẩn Biobor JF vi sinh vật gây hại nhiên liệu máy bay Jet A1 3.6.1 Loại trừ vi sinh vật nhiễm nhiên liệu chất diệt khuẩn Biobor JF Hiện nay, Vietnam Airlines sử dụng loại chất diệt khuẩn Biobor JF (Hammonds) Thử nghiệm liều diệt khuẩn 270 ppm (liều tối đa phép sử dụng) số mẫu nhiên liệu cho kết Bảng 3.14 Với liều lượng diệt khuẩn 270 ppm, Biobor JF diệt hồn tồn tất nhóm vi sinh vật nhiên liệu Biobor JF có hiệu lực nấm mốc hiệu lực với vi khuẩn, mẫu có nhiều nước hẳn so với mẫu nhiên liệu nước - 23 - Bảng 3.14 Hiệu lực diệt vi sinh vật nhiên liệu máy bay Jet A1 chất diệt khuẩn Biobor JF, nồng độ diệt khuẩn 270 ppm STT Loại máy bay Trước xử lý (CFU/ml) Sau xử lý (CFU/ml) 7,1 x 104 2,2 x 101 102 101 Nấm mốc 3,2 x 103 – Vi khuẩn hiếu khí 1,7 x 104 – Nhóm vi sinh vật Vi khuẩn hiếu khí S7–ASA Vi khuẩn sử dụng Jet A1 S7–ASD Vi khuẩn sử dụng Jet A1 10 – 5,5 x 105 3,0 x 101 103 101 Nấm mốc 6,1 x 101 1,1 x 101 Nấm men 2,9 x 103 – Xạ khuẩn 3,1 x 102 – Vi khuẩn hiếu khí 2,8 x 103 – 101 – Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn sử dụng Jet A1 S7–ASE S7–ASG Vi khuẩn sử dụng Jet A1 Nấm mốc 2,1 x 10 – Nấm men 2,4 x 101 – Vi khuẩn hiếu khí 1,2 x 107 9,7 x 101 103 101 101 – 1,0 x 103 – 101 – S7–ASH Vi khuẩn sử dụng Jet A1 Vi khuẩn kị khí S7– ASI Vi khuẩn hiếu khí Vi khuẩn sử dụng Jet A1 Ghi khơng nước khơng nước có nước không nước vết nước không nước 3.6.2 Đề xuất biện pháp kiểm soát vi sinh vật gây hại nhiên liệu máy bay Việt Nam Tăng cường kiểm tra vi sinh vật nhiên liệu Áp dụng kít phát nhanh vi sinh vật nhiên liệu Xả nước, xử lý lọc, vệ sinh thùng chứa nhằm hạn chế mức thấp có mặt nước nhiên liệu Xử lý nhiên liệu thùng chứa nhiên liệu máy bay bị nhiễm vi sinh vật quy trình - 24 - KẾT LUẬN Đã xác định số lượng nhóm vi sinh vật 50 mẫu nhiên liệu máy bay sử dụng Việt Nam Vi khuẩn hiếu khí từ 0,2 x 101 đến 1,1 x 106 CFU/ml; nấm mốc từ 0,2 x 101 đến 6,3 x 102 CFU/ml; nấm men từ 0,2 x 101 đến 101 CFU/ml; vi sinh vật sử dụng nhiên liệu