Tóm tắt Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và đánh giá hiệu quả của các chủng nấm Beauveria và Paecilomyces ký sinh trên côn trùng gây hại được phân lập tại Đồng bằng Sông Cửu Long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bảo Vệ Thực Vật Mã ngành: 9620112 HUỲNH HỮU ĐỨC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA CÁC CHỦNG NẤM Beauveria VÀ Paecilomyces KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI ĐƯỢC PHÂN LẬP TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trần Văn Hai Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Vào lúc … … ngày … tháng … năm … Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Huỳnh Hữu Đức Trần Văn Hai, 2016 Xác định loài, đặc diểm sinh học bước đầu đánh giá hiệu trừ sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) điều kiện phịng thí nghiệm chủng nấm Beauveria ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp ISSN 1859-2333 (3): 36-46 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2016 Phân lập, định danh bước đầu đánh giá hiệu phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus chủng nấm Paecilomyces javanicus thu thập Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn Số chuyên đề: Nông Nghiệp Xanh ISSN 1859-4581: 109-116 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Hiệu chế phẩm nấm Paecilomyces javanicus (Friedrichs and Bally) phòng trừ rệp sáp Planococcus lilacinus (Cockerell) điều kiện phịng thí nghiệm nhà lưới Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 32-37 Huỳnh Hữu Đức, Trần Văn Hai, 2018 Ảnh hưởng số loài thuốc trừ nấm đến tỷ lệ nảy mầm, phát triển tản nấm khả hình thành bào tử nấm Beauveria bassiana (Bals.) Vuill Tạp chí Bảo vệ thực vật ISSN 2354-0710 1(276): 42-48 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết nghiên cứu Một tập hợp đa dạng vi sinh vật khác xem xét tác nhân sinh học kiểm sốt trùng như: virus, vi khuẩn, động vật nguyên sinh nấm Trong giới nấm, theo ước tính nhà khoa học có khoảng 1,5 triệu lồi (Hawksworth, 2001; Mueller and Schmit, 2007; Schmit and Mueller, 2007), với khoảng 110.000 loài mô tả (Kirk et al., 2008) Trong số này, 700 lồi 90 chi cơng nhận tác nhân gây bệnh côn trùng (Roberts and Humber, 1981), khoảng 170 sản phẩm kiểm soát dịch hại phát triển dựa 12 lồi nấm ký sinh côn trùng (De Faria and Wraight, 2007) Các nghiên cứu tập trung phát triển ứng dụng loài ký sinh trùng thuộc Hyphomycetes có nấm Beauveria Paecilomyces Nấm ký sinh gây bệnh trùng Beauveria bassiana Paecilomyces javanicus lồi nấm quan tâm nghiên cứu phát triển ứng dụng nhiều có phổ ký chủ rộng, ký sinh gây chết nhiều loại côn trùng gây hại nông lâm nghiệp, nghiên cứu ứng dụng rộng rãi giới tác nhân phòng trừ sinh học Nấm B bassiana nhiều nước giới Mỹ, Canada, Anh, Úc, Nhật, Philippines, Trung Quốc… sử dụng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại trồng bọ hại mía, bọ hại củ cải đường, ruồi hại rễ bắp cải, củ cải… đạt kết tốt, đặc biệt loài sâu hại rừng sâu róm thơng, bọ hại dừa, châu chấu hại tre, mía, mối đất hại ăn quả, sùng hại mía (Ferron, 1978; Rombach et al., 1988; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004) Chủng nấm P javanicus kết hợp hoạt chất Azadirachtin (tỷ lệ 100:0,05-0,25) dạng bột hòa nước, huyền phù dạng nhũ dầu để phòng trừ số loại sâu hại trồng sâu tơ, rầy phấn trắng, rầy mềm… Việc kết hợp nấm tím P javanicus hoạt chất Azadirzachtin giúp tăng hiệu lực nấm ký sinh đồng thời giảm lượng hoạt chất Azadirachtin phòng trừ sâu hại, ngồi cịn kết hợp với hoạt chất Cypermethrin (100 : 0,25 - 0,56) Acetamiprid (tỉ lệ 100 : 1,5 - 10) dạng bột hòa nước để phòng trừ sâu hại, đặc biệt lồi chích hút, cịn có tác dụng ngăn ngừa tốt lồi dịch hại bướm sâu tơ, rầy mềm, bọ trĩ., (Huang Zhen and Ren Shunxiang, 2008a, 2008b, 2008c) Tại Đồng Sông Cửu Long, khoai lang ăn trái chiếm diện tích tương đối lớn Dịch hại thường xuất sùng (Cylas formicarius Fabricius) gây hại khoai lang rệp sáp (Planococcus lilacinus Cockerell) gây hại nhiều loại ăn trái (mãng cầu, sầu riêng, khóm,…) gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm nên nông dân sử dụng nhiều thuốc bảo vệ thực vật để quản lý đối tượng trên, làm lưu tồn lượng lớn thuốc BVTV sản phẩm có ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe người tiêu dùng Vì thế, việc nghiên cứu tác nhân phịng trừ sinh học để quản lý trùng gây hại có hiệu thay dần thuốc BVTV cần thiết thực tế sản xuất Xuất phát từ thực tế, đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu chủng nấm Beauveria Paecilomyces ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng Sông Cửu Long” thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Thu thập định danh đến loài chủng nấm thuộc hai chi Beauveria Paecilomyces ký sinh số lồi trùng gây hại tỉnh vùng ĐBSCL Nghiên cứu số đặc điểm sinh học, khả ký sinh gây bệnh, yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng nấm Beauveria Paecilomyces định danh đến loài Tuyển chọn chủng nấm Beauveria có khả ký sinh cao sùng khoai lang C formicarius Fabricius điều kiện phịng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu chế phẩm nấm Beauveria ký sinh SKL điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng Tuyển chọn chủng nấm Paecilomyces có khả ký sinh cao rệp sáp P lilacinus điều kiện phịng thí nghiệm để sản xuất chế phẩm Đánh giá hiệu chế phẩm nấm Paecilomyces ký sinh rệp sáp P lilacinus điều kiện phịng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn Đề tài có ý nghĩa khoa học cao nghiên cứu chi tiết có hệ thống từ phịng thí nghiệm, nhà lưới đến đồng ruộng nên cung cấp nhiều số liệu khoa học đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu lực nấm B bassiana P javanicus (I javanica) nhằm thiết lập thông tin chủng nấm phân lập ĐBSCL Ngoài ra, kết đề tài mở hướng quản lý phịng trừ số lồi trùng gây hại trồng theo IPM, để thay loại thuốc hóa học sở cho hướng nghiên cứu đấu tranh sinh học trùng 1.4 Những đóng góp luận án Phân lập 16 chủng nấm Beauveria ký sinh trùng tỉnh ĐBSCL thuộc lồi B bassiana Trong đó, tuyển chọn hai chủng Bb4(SKL-VL) Bb5(SKL-HG) để sản xuất chế phẩm Phân lập 22 chủng nấm Paecilomyces ký sinh côn trùng tỉnh ĐBSCL định danh 14 chủng nấm thuộc loài P javanicus chủng nấm thuộc loài Purpureocillum lilacinum Kết quả, tuyển chọn hai chủng Pj6(Pl-TG) Pj8(PlCT) để sản xuất chế phẩm Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển nấm B bassiana P javanicus điều kiện phịng thí nghiệm Xác định số hoạt chất hố học trừ nấm vơ hại phát triển nấm B bassiana nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) ảnh hưởng vừa (ở nồng độ liều khuyến cáo) Metalaxyl, Fenoxanil Validamycin Đối với P javanicus hợp chất Fenxanil, Kasugamycin Picoxystrobin tỏ vô hại ảnh hưởng vừa Tuy nhiên, nấm B bassiana dễ bị ảnh hưởng nồng độ thấp (½ nồng độ liều khuyến cáo) so với P javanicus hợp chất thuốc hoá học trừ nấm Đối với chế phẩm nấm B bassiana dạng tươi để phòng trừ SKL chế phẩm nấm P javanicus dạng tươi để phòng trừ rệp sáp P lilacinus gây hại mãng cầu xiêm cho kết phòng trừ tốt sử dụng liều lượng 3,0 - 3,5 kg/ha với mật số bào tử chế phẩm khoảng > 108 bt/gram CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian: từ tháng 9/2013 - 9/2017 Địa điểm: Các thí nghiệm phịng, nhà lưới thực Phịng thí nghiệm phịng trừ sinh học, Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ Ly trích DNA phản ứng PCR thực Viện Công Nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ Giải trình tự DNA gởi thực công ty MacroGen Hàn Quốc Các thí nghiệm ngồi đồng thực tỉnh Vĩnh Long 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Thu thập định danh loài nấm ký sinh từ chi Beauveria Paecilomyces phương pháp truyền thống dựa đặc điểm hình thái học kỹ thuật công nghệ sinh học phân tử 3.2.1.1 Phân lập định danh loài nấm ký sinh số sâu hại trồng thuộc chi nấm Beauveria Paecilomyces theo phương pháp truyền thống Thu thập côn trùng gây hại bị nhiễm nấm ký sinh tỉnh vùng Đồng Sông Cửu Long như: Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, An Giang, Kiên Giang, Sóc Trăng Trà Vinh phịng thí nghiệm Bộ mơn BVTV để phân lập tác nhân Nấm nuôi cấy môi trường PDA, tạo dịng phương pháp ni cấy đơn bào tử nấm Beauveria Paecilomyces môi trường PDA, lưu trữ trực tiếp môi trường nhiệt độ -37oC Định danh nấm theo Barnett and Barry (1972), Lawrence (1994), De Hoog (1972), Luangsa-Ard et al (2006) Các chủng nấm Beauveria Paecilomyces sau tách dòng nuôi cấy môi trường PDA đĩa petri (đường kính 9cm) nhiệt độ 27±2oC 12 sáng tối Lấy khoanh sợi nấm từ rìa mép tản nấm ngày tuổi đặt vào đĩa petri chứa khoảng 10 mL môi trường nuôi cấy vị trí úp ngược cho sợi nấm tiếp xúc trực tiếp với mơi trường ni cấy, tất thí nghiệm lập lại lần cho mẫu phân lập Đặc điểm nhận dạng tiêu theo dõi: đặc điểm tản nấm, đặc điểm quan sinh bào tử hình dạng bào tử kích thước bào tử 3.2.1.2 Định danh lồi phân tích số khác biệt di truyền chủng nấm Beauveria sp Paecilomyces spp dựa trình tự DNA vùng ITS-rDNA Chiết xuất DNA tổng số theo quy trình Saitoh et al (2006) Sau có lượng DNA thực phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS-rDNA, đọc kết giải trình tự vùng ITS-rDNA Vùng ITS-rDNA nhân lên phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS5 (5’- GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G - 3’) ITS4 (5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC - 3’) Các sản phẩm PCR giải trình tự dựa vào kết giải trình tự để so sánh với trình tự vùng ITS-rDNA chủng nấm Beauveria Paecilomyces giới biết tên loài từ sở liệu Genbank làm sở xác định tên loài chủng nấm Beauveria Paecilomyces thu thập Sơ đồ phân nhóm xác định lồi nấm thuộc chi Beauveria Paecilomyces xử lý phương pháp Maximum likelihood dựa tình tự vùng ITS-rDNA phân tích bootstrap với 1.000 lần lập lại Sử dụng chương trình phylogenetic (BioEdit, Clustalx 3.1 Treeview) để quan sát mối quan hệ di truyền qua phả hệ lồi nấm tính tỷ lệ tương đồng DNA mẫu nấm thu thập 3.2.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học nấm Beauveria Paecilomyces 3.2.2.1 Xác định thời gian nẩy mầm bào tử nấm Beauveria Paecilomyces Trải 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL dung dịch nước cất trùng có chứa 0,05% Tween 20) lame có phủ lớp mơi trường ni cấy, đặt nhiệt độ phịng tối Mỗi mẫu phân lập thực lame tương ứng với lần lặp lại Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) đánh giá lần vịng 24 kính hiển vi OLYMPUS DP20 với độ phóng đại 400 lần Quan sát thị trường/lame 25 bào tử/thị trường, tổng số bào tử quan sát 400 cho mẫu phân lập 3.2.2.2 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng đến phát triển nấm Beauveria Paecilomyces Thí nghiệm thực theo phương pháp bố trí hai nhân tố, nhân tố A chủng nấm Beauveria Paecilomyces phân lập nhân tố B năm loại môi trường dinh dưỡng khác PDA, CDA, SDAY1, SDAY3, SDAY - Chitin với lần lặp lại Mỗi lần lặp lại sử dụng đĩa petri có chứa 10 mL môi trường cần khảo sát Cấy khoanh nấm có đường kính khoảng 10 mm vào đĩa môi trường để úp ngược tiếp xúc trực tiếp môi trường ni cấy đặt nhiệt độ phịng 12 sáng tối Các tiêu theo dõi: (d1+d2) Đường kính tản nấm (cm) = Trong đó: d1 d2 độ dài hai đường chéo phần tản nấm phân bố Thời gian theo dõi: sau ngày ni cấy đo khơng có khác biệt Tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày): trung bình lần đo đường kính tản nấm từ - 7, - - 11 ngày sau cấy Mật số bào tử/cm2: tính lần thời điểm 15 ngày sau nuôi cấy theo phương pháp sau: Tính mật số bào tử theo phương pháp đếm mật số bào tử trực tiếp buồng đếm Thoma Số bào tử/mL = (4 a x 106) / b Trong đó: a: số bào tử có thể tích huyền phù ứng với diện tích ô nhỏ (= 1/400 mm2) x độ sâu 0,1 mm; b: hệ số pha loãng Mật số bào tử/cm2= Số bào tử (bt/mL) * V (mL) huyền phù thu đĩa Diện tích tản nấm (cm2) 3.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển hình thành bào tử nấm Beauveria Paecilomyces Thí nghiệm thực theo phương pháp Uma et al (2005), Võ Thị Thu Oanh (2010) Thí nghiệm lập lại lần cho mẫu phân lập, cấy khoanh nấm (10 mm) lên bề mặt đĩa petri có chứa khoảng 10ml môi trường nuôi cấy lựa chọn từ thí nghiệm 3.2.2.2 đặt mức nhiệt độ 20, 25, 28, 30, 35oC tủ ổn định Các tiêu theo dõi: tốc độ phát triển trung bình (mm/ngày), số lượng bào tử/cm2 (tương tự thí nghiệm 3.2.2.2) Khả bào tử nẩy mầm nhiệt độ cao (%) Đánh giá khả nẩy mầm chủng nấm Beauveria Paecilomyces mức nhiệt độ cao, bao gồm nghiệm thức sau: 25o - 30o - 35o - 38oC, đó, nghiệm thức 25oC nhiệt độ đối chứng Trải 0,1 mL dịch bào tử (106 bào tử/mL) lame có phủ lớp môi trường nuôi cấy đặt đĩa petri có lót giấy thấm để giữ ẩm, mẫu phân lập thực lame tương ứng với lần lặp lại Tiếp theo, tiến hành đặt đĩa petri vào tủ định ôn cài đặt mức nhiệt độ cao (30o - 35o - 38o) giờ, sau chuyển nhiệt độ đối chứng 25oC 16 Tỷ lệ bào tử nẩy mầm (%) đánh giá lần sau 24 (8 nhiệt độ cao (30o - 35o - 38oC) 16 nhiệt độ đối chứng 25oC) Phương pháp lấy tiêu tương tự thí nghiệm 3.2.2.1 ... sinh học để quản lý côn trùng gây hại có hiệu thay dần thuốc BVTV cần thiết thực tế sản xuất Xuất phát từ thực tế, đề tài ? ?Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học đánh giá hiệu chủng nấm Beauveria. .. Beauveria Paecilomyces ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng Sông Cửu Long? ?? thực 1.2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài Thu thập định danh đến loài chủng nấm thuộc hai chi Beauveria Paecilomyces ký sinh số. .. bước đầu đánh giá hiệu trừ sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) điều kiện phịng thí nghiệm chủng nấm Beauveria ký sinh côn trùng gây hại phân lập Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường