Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM THỊ MIỀN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG LỤC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã đề tài: CNTP13B-15 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN THANH HẰNG Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Phạm Thị Miền Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Người hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Thanh Hằng Tên luận văn: Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân Rong Lục Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, suốt trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn Tôi tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Phạm Thị Miền i LỜI CẢM ƠN Trước hết xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng, người thầy trực tiếp giúp đỡ bảo tận tình suốt trình học tập thực nghiên cứu đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới tập thể Thầy giáo, Cô giáo Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm trường đại học Bách Khoa Hà Nội bảo cung cấp cho kiến thức bổ ích tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu thạc sĩ Cuối xin gửi lời cảm ơn đến người thân, bạn bè quan tâm giúp đỡ suốt trình nghiên cứu Học viên PHẠM THỊ MIỀN ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC BIỂU ĐỔ vi MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN .2 1.1 Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol giới .2 1.1.2 Những nghiên cứu triển vọng sản xuất ethanol sinh học từ rong biển Việt Nam 1.2 Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển 1.2.1 Thành phần hóa học đặc điểm bật Rong Lục .5 1.2.2 Tiềm rong biển sản xuất ethanol 1.3 Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 10 1.3.1 Quá trình thủy phân rong biển 11 1.3.2 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 13 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men ethanol 16 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Vi sinh vật lên men ethanol 19 2.2 Phƣơng pháp phân tích 20 2.2.1 Xác định thành phần môi trường lên men .20 2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Carbonhydrat tổng số theo phương pháp Dubois .22 2.2.3 Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp Bennet 1971 24 2.2.4 Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp sắc ký lỏng 26 2.2.5 Xác định hiệu suất lên men 26 2.2.6 Phân tích xử lý số liệu phần mềm excel 2003 .27 iii 2.3 Quá trình thực nghiệm khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục .27 2.3.1 Thủy phân rong biển axit 27 2.3.2 Hoạt hóa chủng nấm men môi trường Hasen .27 2.3.3 Xác định số lượng tế bào nấm men 27 2.3.4 Tiến hành lên men chủng nấm men 27 2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 28 2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng pH .28 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng thời gian 28 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định thành phần dịch thủy phân rong lục 29 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men lên men từ dịch thủy phân rong Lục 30 3.2.1 Xác định số lượng tế bào nấm men 30 3.2.2 Theo dõi số tế bào chủng nấm men trình lên men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 30 3.2.3 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Thermosacch 31 3.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Red ethanol 32 3.2.5 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Candida ablican .33 3.2.6 So sánh trình sử dụng Cacbonhydrate hòa tan ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 34 3.2.7 So sánh trình sinh ethanol ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 35 3.2.8 Xác định hiệu suất lên men ba chủng nấm men 36 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men Red Ethanol 36 3.3.1.Ảnh hưởng thời gian 36 3.3.2 Ảnh hưởng pH 37 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 38 3.4 Phân tích săc ký trình lên men Red Ethanol 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học tế bào rong .6 Bảng 1.2 So sánh suất nuôi trồng nguồn sinh khối Bảng 1.3 Vi sinh vật lên men ethanol, buthanol từ sinh khối rong biển 15 Bảng 2.1 Các mức nồng độ đường glucose pha loãng giá trị OD tương ứng đo bước sóng 490 nm .23 Bảng 2.2 Các mức nồng độ ethanol pha loãng giá trị OD tương ứng đo bước sóng 580 nm .25 Hình 2.2 Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo từ mẫu chuẩn .26 Bảng 3.1 Thành phần dịch thủy phân rong lục 29 Bảng 3.2 Số lượng tế bào nấm men chủng nấm men nghiên cứu .30 Bảng 3.3 Hiệu suất lên men ba chủng nấm men .36 v DANH MỤC BIỂU ĐỔ Hình 1.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 10 Hình 2.1 Biểu đồ đường chuẩn từ kết đo mẫu chuẩn 24 Hình 2.2 Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo từ mẫu chuẩn .26 Hình 3.2 Sơ đồ thể trình lên men Thermosacch dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 31 Hình 3.3 Sơ đồ thể trình lên men Red ethanol dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 32 Hình 3.4 Sơ đồ thể trình lên men Candida ablican dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 33 Hình 3.5 Quá trình sử dụng cacbonhydrate hòa tan ba chủng nấm men 34 Hình 3.6 Quá trình sinh ethanol ba chủng nấm men 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến trình lên men .37 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH đến trình lên men 37 Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men 38 vi MỞ ĐẦU Việt nam có hệ động vật, thực vật vô phong phú, có nhiều gen quý đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Một điều kiện tạo nên phong phú giàu có vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài 3000 km bao bọc hết phía đông nam đất nước Một nguồn tài nguyên phong phú có giá trị mà vùng biển ban tặng cho rong biển Trên giới Rong biển thuộc vào loại tài nguyên có giá trị kinh tế khai thác từ nhiều năm phục vụ nhiều mục đích khác kinh tế quốc dân Một lĩnh vực sản xuất giới quan tâm sản xuất nhiên liệu sinh học nhằm thay cho nhiên liệu hóa thạch dần cạn kiệt Rong biển đa dạng chủng loại, phong phú sản lượng, khả sinh sản, sinh trưởng nhanh, chúng chứa thành phần hóa học quan trọng như: chất khoáng vô cơ, lipid, protein, cacbonhydrate…Hầu hết sinh khối từ thực vật cạn gỗ có chứa nhiều lignin, mà phương pháp thủy phân lignin gặp nhiều khó khăn Rong biển lignin, qui trình sản xuất nhiên liệu từ rong biển đơn giản thuận lợi Đặc biệt hàm lượng carbonhydrate số loài rong cao từ 40%- 79,4% với hiệu suất chuyển hóa trình lên men ethanol khoảng 70% Bên cạnh đó, rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ, không cạnh tranh với đất nông nghiệp, không sử dụng nước Đây nguồn nguyên liệu tiềm cho công nghệ sản xuất cồn sinh học Việt Nam Mục đích nghiên cứu: nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Ý nghĩa khoa học đề tài: Góp phần tìm nguồn nguyên liệu thay cho nguồn nguyên liệu phổ biến sản xuất bioethanol ảnh hưởng đến an ninh lương thực chất đốt Tìm điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất ethanol giới Xã hội ngày phát triển, nhu cầu lượng ngày tăng, kéo theo nguồn cung dầu mỏ ngày lớn Nhằm đối phó với giá dầu không ngừng tăng, nhiều quốc gia giới đề biện pháp khẩn cấp nhằm khuyến khích phát triển nguồn nhiên liệu thay thế, sản xuất nhiên liệu sinh học nhiều nước lựa chọn lợi ích lớn kinh tế môi trường Với phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật nhiều loại nhiên liệu có nguồn gốc sinh học phát ứng dụng rộng rãi Phân tích tổng thể toàn trình sản xuất cho thấy nhiên liệu sinh học có lợi so với nhiên liệu hóa thạch Từ việc giảm lượng Carbon khí thải dẫn đến hiệu ứng nhà kính đến việc nhiên liệu sinh học độc hại phân hủy tạo chất gây ô nhiễm so với nhiên liệu dầu khí Trong tất loại nhiên liệu phát hiện, ethanol nhiên liệu sử dụng phổ biến nhiều quốc gia Ethanol nhiên liệu sinh học dễ sản xuất, có nguồn nguyên liệu sản suất đa dạng phong phú Các nguồn nguyên liệu nghiên cứu sản xuất ethanol bao gồm lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, tinh bột từ loại hạt, đường mía, rong tảo Trong nguồn sinh khối từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, đường mía, tinh bột nguyên liệu gây tác động đến an ninh lương thực, kỹ thuật sản xuất môi trường sản xuất Do rong tảo biển nguồn sinh khối thích hợp cho sản xuất bioethanol Rong biển coi vũ khí chống lại ấm dần Trái Đất Sinh khối rong biển nguồn polysaccharid vô tận rong Lục rong có chứa nhiều loại đường thích hợp cho sản xuất ethanol Trên giới, nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối rong biển, số lượng nghiên cứu ngày gia tăng quy mô ngày lớn Ở Đan Mạch, viện nghiên cứu trường đại học National Evironmental Research Institute (NERI), Technological University of Denmark (Rio DTU), Danish Technology Institute chuẩn bị dự án nghiên cứu tiềm sản xuất Ethanol từ rong lục Ulva sp Ở Irael, với dự án kỹ thuật xanh “Green Technology”, sản xuất thành công ethanol từ rong biển tính toán kg rong khô sản xuất lít nhiên liệu sinh học (Irael Seambiotic Ltd) Dự án Indonesia Hàn Quốc phát triển nhiên liệu sinh học dựa nguồn nguyên liệu rong biển Indonesia sử dụng công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học Hàn Quốc Tương tự dự án phủ Philippin Viện Kỹ thuật công nghệ Hàn Quốc, đầu tư triệu USD để trồng 250 acre rong biển sản xuất ethanol từ công nghệ Hàn Quốc Dự án Sea Gardens Project trường University of Costa Rica với tài trợ World Bank để nuôi trồng rong biển sản xuất bioethanol Dự án Biomara, phối hợp Hiệp hội Khoa học Biển Scotland Liên minh châu Âu với điều hành phủ Ailen Scotland, với mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học hệ thứ ba từ sinh khối tảo Đã đầu tư triệu USD vào năm 2009, để đánh giá tiềm rong biển chọn dòng miccroalgae để sản xuất quy mô công nghiệp Tại Hàn Quốc, dự án 275 triệu USD 10 năm để sản xuất 400 triệu gallon vào năm 2020 xấp xỉ 13% nhu cầu tiêu thụ nước Dự án nuôi trồng rong biển diện tích 8.600 Tại Chile, dự án sản xuất ethanol từ rong biển Chile BioArchitecture Lab (BAL) với Công ty dầu khí ENAP trường Đại học Los Angeles Đã đầu tư triệu USD từ năm 2010 để sản xuất 165 triệu lít ethanol vào năm 2012 Tại Ý, dự án thành phố Venice JV Nhà máy điện, đầu tư 200 triệu Euro để sản xuất 40 MW nhiên liệu từ rong biển cung cấp cho 1/2 nhu cầu Theo kết thể hình 3.8, pH khoảng 3,5 – 4,5 nồng độ ethanol tạo thành tăng từ 1,15 – 2,34%v/v pH 4,5 nồng độ ethanol tạo thành lại giảm Điều lý giải nồng độ H+ môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động nấm men Chúng có khả làm thay đổi mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng vỏ tế bào chiều hướng trình lên men pH cao làm tăng khả nhiễm khuẩn tạo thành glycerin làm giảm hiệu suất lên men Kết thực nghiệm cho thấy pH 4,5 nồng độ ethanol đạt cao 2,34%v/v Như vậy, chọn pH thích hợp cho trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục 4,5 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ Khảo sát yếu tố nhiệt độ trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục mốc nhiệt độ 20, 25, 30, 35, 40 oC Kết thể hình 3.8 Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình lên men Theo kết thể hình 3.9, nhiệt độ tăng từ 20 – 30o C lượng ethanol tạo thành tăng nhiệt độ lớn 30oC lượng rượu tạo thành giảm Điều lý giải bới nhiệt độ cao 30o C, trình lên men diễn nhanh kết thúc sớm, nhiên kéo theo hình thành sản phẩm phụ 38 glycerin este …dẫn đến hiệu suất trình lên men giảm Tại nhiệt độ 30oC, nồng độ ethanol đạt cao 2,34% v/v Như chọn nhiệt độ thích hợp cho trình lên men 30 0C 3.4 Phân tích săc ký trình lên men Red Ethanol A C B D A: Sắc ký đồ dịch thủy phân trước lên men; B: Sắc ký đồ dịch lên men sau 24 giờ; C: Sắc ký đồ dịch lên men sau 48 giờ; D: Sắc ký đồ dịch lên men sau 72 Thời gian lưu peak: Glucose: 8,9 phút, Galactose: 9,49 phút; Ethanol 21,5 phút Dịch thủy phân từ rong Chaetomorpha sp có thành phần đường Glucose Galactose hình (A), trình lên men Red Ethanol đường 39 glucose galactose giảm theo thời gian điều thể rõ hình (B),(C) (D) Trong 24 đầu lên men hàm lượng glucose giảm nhanh đến 48 glucose hoàn toàn hết, bên cạnh lượng galactose giảm từ từ loại đường giảm không nhanh, đường galactose giảm nhanh sau hết glucose sau 48 lên men đến 72 loại đường giảm hết Bên cạnh hàm lượng ethanol tăng theo thời gian, sau 72 lượng ethanol 18,18 g/l tương đương với 2,3 (% v/v) đo theo phương pháp Bennet, 1971 Quá trình lên men dịch thủy phân rong lục Chaetomorpha linum diễn thuận lợi thành phần đường dịch thủy phân đường glucose galactose Kết lên men ethanol dịch thủy phân rong Lục Chaetomorpha linum nhóm nghiên cứu 18,18 g/l tương đương so với nhóm tác giả [24], lên men từ rong Chaetomorpha linum 18,1 g/l nhóm tác giả [30], lên men từ rong Ulva pertusa 18,5 g/l 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: - Đã khảo sát khả lên men ethanol ba chủng nấm men Thermosacch, Red Ethanol, Candida ablican môi trường dịch thủy phân rong Lục Kết cho thấy ba chủng có khả lên men, chủng Red Ethanol có khả lên men cao với hiệu suất lên men 69,6%, chủng Thermosacch hiệu suất lên men 57,1%, Candida ablican hiệu suất lên men 54,1% - Đã nghiên cứu điều kiện lên men ethanol thích hợp chủng Red Ethanol môi trường dịch thủy phân rong lục nhiệt độ 30 oC, pH = 4,5, thời gian 72 cho hiệu suất lên men 69,6% Kiến nghị: Cần nghiên cứu thêm số yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục chủng Red Ethanol 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Kim Anh, Trần Thạnh Phong, Vũ Văn Độ, Nguyễn Minh Hải, Bruce Dien (2011), Nghiên cứu trình tiền xử lý chuyển hóa sinh khối rong Lục (Enteromorpha intestinalis) thành đường lên men Kỷ yếu Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc khu vực phía nam Lần II- năm 2011 Lê Như Hậu (2011), “Nghiên cứu đánh giá tiềm rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu (Biofuel)”, Hội nghị kỷ niệm 35 năm thành lập viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, 120-125 Lê Như Hậu, Nguyễn Hữu Đại (2010), Rong câu Việt Nam nguồn lợi sử dụng, NXB Khoa Học Tự Nhiên công Nghệ 247 tr Phạm Hoàng Hộ,1969, Rong biển Việt Nam (phần phía Nam), Trung tâm học liệu Sài Gòn: 558 tr Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2004) Các phương pháp phân tích ngành công nghe lên men, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 336 tr Nguyễn Văn Mùi, “Thực hành hóa sinh học” Hà Nội, 205 tr., (2007) Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng (2007), Công nghệ sản xuất phân tích cồn etylic, Nhà xuất KHKT Tiếng anh Adams, J.M.et al.(2009) Fermentation study onSaccharina latissima for bioethanol production considering variable pre-treatments.J Appl Phycol.21, 569–574 Adams J.M.M., Toop T.A., Donnison I.S., Gallagher J.A (2011), “Seasonal variation in Laminaria digitata and its impact on biochemical conversion routes to biofuels”, Bioresource Technology 102, pp 9976–9984 10 Aiba , S., Humphrey , A E And Millis , N F (1973) Scale-up.In Biochemical Engineering (2nd edition), pp 195-217 Academic Press, New York 42 11 Aizawa M (2008) “Seaweed Bioethanol Production in Japan”, The Ocean Sunrise Project 5p (www.iedi.org/ronbun/file/32.doc) 12 Aizawa M., Asaoka K., Atsumi M and Sakou T (2007) “Seaweed bioethanol production in Japan”, The Ocean Sunrise Project., Vancouver, Canada 13 AOAC 1990 Official Methods of Analysis (16th ed.) Association of Official Analytical Chemists Washington D.C 14 Bennett C (1971), Spectrophotometric acid dichromate method for the determination of ethyl alcohol, The American journal of medical technology 37(6) p: 217-220, 1971 15 Bruton, T.et al.(2009) A Review of the Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland, Sustainable Energy Ireland 16 Horn S.J (2000), Bioenergy from brown seaweeds, Department of Biotechnology, Norwegian University of Science and Technology NTNU Trondheim, Norway November 2000, 93pp 17 Horn, S.J et al (2000) Production of ethanol from mannitol by Zymobacter palmae J Ind Microbiol Biotechnol.24, 51 18 Horn, S.J.et al.(2000) Ethanol production from seaweed extract J Ind Microbiol Biotechnol.25, 249–254 19 Hutner, s H (1972) Inorganic nutrition Ann Rev Microbiol 26, 313-346 20 Kim G.S., Shin M.K., Kim Y.J., Oh K.K., Kim J.S., Ryu H.J., Kim K.H (2008), Method of producing bioethanol using sea algae, Patent WO 2008/105618 A1 21 Kim, N.J et al (2011) Ethanol production from marine algal hydrolysates using Escherichia coli KO11.Bioresour Technol.102, 7466–7469 22 Lee S.M., Jae-Hwa Lee (2011), “The isolation and characterization of simultaneous saccharification and fermentation microorganisms for Laminaria japonica utilization”, Bioresource Technology 102, pp 5962–5967 23 Lee, K.S et al (2011) Improved galactose fermentation of Saccharomyces cerevisiae through inverse metabolic engineering Biotechnol Bioeng.108, 43 621–631 24 Nadja Schultz-Jensen, Anders Thygesen, Frank Leipold, Sune Tjalfe Thomsen, Christian Roslander, Hans Lilholt, Anne Belinda Bjerre (2013) Pretreatment of the macroalgae Chaetomorpha linum for the production of bioethanol – Comparison of five pretreatment technologies Bioresource Technology 140 (2013) 36–42 25 Park, J.H.et al (2012) Use of Gelidium amansiias a promising resource for bioethanol: a practical approach for continuous diluteacid hydrolysis and fermentation.Bioresour Technol.108, 83–88 26 Roesijadi G., Copping A.E., Huesemann M.H., Forster J and Benemann J.R., (2008), Techno-Economic Feasibility Analysis of Offshore Seaweed Farming for Bioenergy and Biobased Products, Battelle Pacific Northwest Division Report Number PNWD-3931 27 Samira A Ben Mussa*, Hawaa S Elferjani, Faiza A Haroun, Fatma F Abdelnabi (2009), Determination of Available Nitrate, Phosphate and Sulfate in Soil Samples International Journal of PharmTech Research Vol.1, No.3, pp 598-604 28 Sung-Mok Lee, Jae-Hwa Lee (2011) The isolation and characterization of simultaneous saccharification and fermentation microorganisms for Laminaria japonica utilization Bioresource Technology 102 (2011) 5962–5967 29 Wiley J (2001), Determination of reducing and nonreducing sugars using the phenol-sulfuric axit assay, Current Protocols in Food Analytical Chemistry E1.1.1-E1.1.8 30 Yanagisawa M, Nakamura K, Arigab O, Nakasaki K (2011) Production of high concentrations of bioethanol from seaweeds that contain easily ydrolysable polysaccharides, In: Process Biochemistry 46 pp 2111–2116 31 http://tailieu.vn/doc/chuong-3-phuong-phap-quang-pho-phat-xa-nguyen-tu1352648.html 32 http://www.thebioenergysite.com/news/3272 44 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quá trình phát triển tế bào nấm men Thời gian (giờ) 24 48 60 72 84 96 108 Số lượng tế bào nấm men x 106/ml vào thời điểm ban đầu Red Ethanol Thermosacch Candida 1 5±0,2 8±0,3 2±0,1 12±0,5 13±0,4 4±0,2 13±0,7 15±0,6 8±0,3 16±0,6 15±0,7 11±0,3 16±0,6 16±0,6 13±0,6 12±0,4 13±0,5 12±0,5 10±0,3 12±0,5 12±0,6 Phụ lục 2: Quá trình lên men Thermosacch dịch thủy phân rong Lục theo thời gian Thermosacch Thời gian Ethanol(%v/v) Cacbonhydrate hòa tan (mg/ml) 24 0,62±0,01 52,30 42,41±0,60 48 1,12± 0,02 29,33±1,12 60 1,52± 0,04 18,61±1,31 72 1,84± 0,06 12,35±1,33 84 1,92± 0,05 10,42±1,02 96 1,92± 0,02 4,41±0,64 108 1,88± 0,02 4,31±0,61 45 Phụ lục 3: Quá trình lên men Red ethanolđối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian Red Ethanol Thời gian Ethanol(%v/v) Đường (mg/ml) 0 52,30 24 0,85±0,01 46,05±0,81 48 1,4±0,012 26,75±1,21 60 1,9±0,11 16,13±1,83 72 2,34±0,12 3,84±0,32 84 2,26±0,13 3,43±0,31 96 2,23±0,14 3,15±0,30 108 2,05±0,18 2,92±0,24 Phụ lục 4: Quá trình lên men Candidas dịch thủy phân rong Lục theo thời gian Candidas Thời gian Ethanol(%v/v) Đường (mg/ml) 0 52,30 24 0,31±0,01 43,46±0,61 48 0,53±0,014 38,62±1,12 60 0,96±0,12 31,74±1,25 72 1,43±0,14 22,46±1,21 84 1,67±0,16 11,77±0,63 96 1,82±0,16 6,51±0,44 108 1,81±0,15 6,44±0,41 46 Phụ lục 5: Quá trình sử dụng cacbonhydrate hòa tan ba chủng nấm men cacbonhydrate hòa tan (%V/V) Thời gian Thermosacch Red ethanol Candidas 52,30 52,30 52,30 24 42,41±0,60 46,05±0,81 43,46±0,61 48 29,33±1,12 26,75±1,21 38,62±1,12 60 18,61±1,31 16,13±1,83 31,74±1,25 72 12,35±1,33 3,84±0,32 22,46±1,21 84 10,42±1,02 3,43±0,31 11,77±0,63 96 4,41±0,64 3,15±0,30 6,51±0,44 108 4,31±0,61 2,92±0,24 6,44±0,41 Phụ lục 6: Quá trình sinh ethanol ba chủng nấm men Ethanol (%V/V) Thời gian Thermosacch Red ethanol Candidas 0 0 24 0,62±0,01 0,85±0,01 0,31±0,01 48 1,12± 0,02 1,4±0,012 0,53±0,014 60 1,52± 0,04 1,9±0,11 0,96±0,12 72 1,84± 0,06 2,34±0,12 1,43±0,14 84 1,92± 0,05 2,26±0,13 1,67±0,16 96 1,92± 0,02 2,23±0,14 1,82±0,16 108 1,88± 0,02 2,05±0,18 1,81±0,15 47 Phụ lục 7: Ảnh hưởng thời gian đến trình lên men Thời gian (giờ) Ethanol (%V/V) 24 0,85±0,01 48 1,4±0,012 60 1,9±0,11 72 2,34±0,12 84 2,26±0,13 Phụ lục 8: Ảnh hưởng pH đến trình lên men pH Ethanol (%V/V) 3,5 1,15±0,08 2,13±0,13 4,5 2,31±0,16 1,75±0,12 6,5 1,26±0,09 0,75±0,06 Phụ lục 9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men Nhiệt độ (oC) Ethanol (%V/V) 20 0,57±0,04 25 2,03±0,11 30 2,32±0,16 35 1,40±0,09 40 0,43±0,04 48 Phụ lục 10: Sắc ký đồ lên men Mẫu dịch thủy phân acid 49 Mẫu dịch lên men sau 24 50 Mẫu dịch lên men sau 48 51 Mẫu dịch lên men sau 72 52 ... lên men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 30 3.2.3 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục Thermosacch 31 3.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục. .. sinh học Việt Nam Mục đích nghiên cứu: nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp Ý nghĩa... phần dịch thủy phân rong lục 29 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men lên men từ dịch thủy phân rong Lục 30 3.2.1 Xác định số lượng tế bào nấm men 30 3.2.2 Theo dõi số tế bào chủng nấm men