Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu khả năng tái sử dụng nấm men cố định trên các loại chất mang Alginate và Cellulose vi khuẩn (BC) vào quá trình lên men chính rượu vang nho

29 hợp không ngâm hạt gel alginate trong dung dịch CaCl2, có ngâm hạt gel alginate trong dung dịch CaCl2 sau mỗi chu kỳ lên men và mẫu đối chứng sử dụng nấm men tự do.... 24 Hình 4.2: Tố

TỔNG QUAN

Alginate

Acid alginic là một polysaccharide đặc biệt có nhiều ở các loại rong nâu Ascophyllum,

Fucus, Laminaria, Macrococystys, Sargassum , Alginate là tên gọi chung của các loại muối của acid alginic Trong rong biển, acid alginic thường tồn tại dưới dạng muối alginate calcium, magnesium, sắt [4, 19, 21]

2.1.1 Cấu tạo phân tử alginate:

−2 gốc monomer là -D-mannuroinic acid (M) và -L-guluronic acid (G)

Hình 2.1 Công thức 2 gốc monomer trong phân tử acid alginic

−Hai gốc M và G phân bố trong mạch alginate theo các block Có 3 loại block:

Block homopolyguluronate: gồm các gốc guluronic nối tiếp nhau, G.G.G.G

Block homopolymannuronate: gồm các gốc mannuronic nối tiếp nhau, M.M.M.M

Block luân phiên (alternating): gồm 2 gốc luân phiên nối tiếp nhau, M.G.M.G

Hình 2.2 Cấu trúc của phân tử alginate

Chiều dài của các block và sự phân bố của chúng trong mạch alginate khác nhau tùy thuộc vào loài rong, giai đoạn sinh trưởng, bộ phận và môi trường sống của rong Do đó, các phân tử alginate rất đa dạng và sở hữu nhiều tính chất khác nhau.

Bảng 2.1 Tỷ lệ M/G của acid alginic từ một số loại rong nâu [21]

STT Loài rong % acid mannuronic % acid guluronic Tỷ lệ M/G

2.1.2 Tính chất của alginate Độ nhớt: Dung dịch alginate có độ nhớt rất cao khi còn nằm trong vách tế bào, nhưng khi được tách chiết, độ nhớt của dung dịch alginate giảm đi đáng kể và phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp tách chiết

Khi kết hợp với các cation hóa trị 1 như Na + , K + , NH4 +,… alginate tan trong nước tạo thành một dung dịch có độ nhớt cao Alginate có khối lượng phân tử trung bình càng lớn thì độ nhớt dung dịch càng cao Trong sản xuất người ta có thể tạo ra alginate có độ nhớt theo yêu cầu, biến thiên trong dải rộng từ 10 – 1000 mPa.s (ở dung dịch 1%) Độ nhớt của dung dịch alginate còn phụ thuộc vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt giảm 2,5% cho mỗi độ C Khi đun nóng rồi làm nguội thì độ nhớt của alginate quay về thấp hơn giá trị ban đầu một ít Ngược lại, khi hạ thấp nhiệt độ đến điểm đông đặc, sau đó rã đông không làm thay đổi độ nhớt của alginate

Alginate ở dạng bột thành phẩm vẫn tiếp tục bị thủy phân và sau một thời gian bảo quản, độ nhớt của dung dịch alginate giảm đáng kể, (như alginate có độ nhớt trung bình, sau một năm bảo quản ở 33 0 C, độ nhớt giảm 45%) (Dennis, 1987) pH cũng ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch alginate Ở pH < 5, nhóm COO - bắt đầu bị proton hóa thành COOH, làm cho lực đẩy tĩnh điện giữa các chuỗi bị giảm, chúng trở nên gần nhau và tạo liên kết hydro làm tăng độ nhớt của dung dịch Nếu tiếp tục giảm pH xuống 3 – 4 thì chúng sẽ tạo gel Độ nhớt của dung dịch alginate không bị ảnh hưởng trong khoảng pH = 5 – 11 Nhưng khi pH > 11, alginate bị depolymer hóa từ từ và làm giảm độ nhớt do liên kết glycosite dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm Bên cạnh đó, những tác nhân mang gốc tự do cũng có tác dụng oxy hóa làm cho dung dịch alginate giảm độ nhớt [77]

Alginate là một chất tạo độ nhớt hiệu quả, được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chăm sóc da như kem để giữ độ ổn định của dung dịch Trong thực phẩm, alginate đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mềm mại và độ quánh, góp phần nâng cao chất lượng của các sản phẩm thực phẩm chế biến.

Khả năng tạo gel: Khi cho kết hợp với cation hóa trị cao, sẽ xuất hiện các vùng nối giữa các mạch phân tử trong alginate và tạo gel Các gel này được hình thành ở nhiệt độ phòng hay bất cứ nhiệt độ nào nhỏ hơn 100 0 C Ion Ca 2+ thường được sử dụng tạo gel alginate do giá thành thấp và ít độc hại, thích hợp cho các quy trình công nghiệp hay chuyển hóa sinh học

Tuy nhiên, quá trình tạo gel cũng có thể xảy ra với sự có mặt của một số các ion khác [77]

Phương pháp tạo gel từ bên ngoài sử dụng dung dịch alginate và dung dịch chứa cation tạo gel như Ca2+ Dung dịch alginate khi tiếp xúc với cation sẽ tạo gel ở bề mặt hạt Sau đó, cation khuếch tán vào bên trong hạt, tiếp tục quá trình tạo gel cho phân tử alginate Phương pháp này tạo gel nhanh chóng và dễ dàng, thường dùng để cố định enzyme hoặc tế bào Tuy nhiên, hạt gel tạo ra không đồng nhất, phân tử alginate chủ yếu tập trung ở bề mặt hạt, mật độ giảm dần vào trong tâm, dẫn đến hiện tượng co rút trong quá trình hình thành hạt.

Ph ươ ng pháp t ạ o gel t ừ bên trong: cho các muối có chứa các cation tạo gel như CaCO3, CaSO4, EDTA – Ca, calcium citrate vào dung dịch alginate Sau đó ta sẽ hiệu chỉnh giá trị pH bằng các tác nhân acid hóa như D–glucono– –lacton Do độ hòa tan của các muối trên phụ thuộc vào pH, nên khi ta thay đổi pH thì ion Ca 2+ sẽ được giải phóng dần vào trong dung dịch và tạo gel với alginate (hình 2.3b) Hạt gel tạo thành có tính đồng nhất cao hơn, có thể tạo gel với nhiều hình dạng khác nhau [19, 77, 80]

Với mỗi ion khác nhau thì cấu trúc cơ học của các hạt gel cũng khác nhau, các ion có ái lực càng cao thì có khả năng tạo gel càng chắc: Pb 2+ > Cu 2+ > Cd 2+ > Ba 2+ >Sr 2+ > Ca 2+ > Co 2+

Cellulose vi khuẩn (BC)

(a) Phương pháp khuếch tán; (b) Phương pháp tạo gel từ bên trong

Các y ế u t ố ả nh h ưở ng đế n độ b ề n c ủ a h ạ t gel alginate

Do quá trình tạo gel được thực hiện bởi sự liên kết giữa các phân tử alginate và ion Ca 2+ nên nồng độ Ca 2+ sẽ ảnh hưởng đáng kể đến việc tạo gel Nồng độ dung dịch alginate cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo gel, khi nồng độ tăng, số liên kết tạo thành sẽ nhiều, mạng lưới gel nhiều hơn, xốp hơn và giữ nước tốt hơn, sự co rút của hạt gel giảm Theo một số tác giả, khi khối lượng phân tử alginate lớn hơn 2,4.10 5 thì độ bền hạt gel không phụ thuộc vào khối lượng phân tử

Gel alginate thường không tạo thành nếu hàm lượng acid guluronic nhỏ hơn 20-25% Tính chất của gel alginate phụ thuộc rất lớn vào thành phần của nó Nếu tỉ lệ mannuronic so với guluronic thấp thì sẽ tạo thành gel rắn chắc; nếu tỉ lệ này cao sẽ tạo thành gel đàn hồi Độ bền chắc của gel tăng tỉ lệ với khối lượng phân tử polysaccharide khi tăng từ 400-500 kDa [87]

Cấu trúc của hạt gel alginate không bị ảnh hưởng khi pH nằm trong khoảng từ 4 – 10 Khi pH < 4 thì thể tích của hạt sẽ giảm, trong trường hợp pH rất thấp (< 2) thì alginate sẽ kết tủa hình thành các hạt gel rất nhỏ, màu trắng và không đàn hồi Khi pH > 10 thì thể tích của hạt tăng lên [77] Độ bền của gel Ca-alginate sẽ giảm khi có mặt của các hợp chất chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phối trí với các kim loại trong dung dịch) như phosphate, citrate và lactate vì chúng cạnh tranh với Ca trong việc tạo gel Độ bền của gel Ca-alginate cũng sẽ giảm bởi một số các ion không có khả năng tạo gel khác như Na + hay Mg 2+ Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho các hạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước lỗ xốp, giảm tính ổn định và làm phá vỡ cấu trúc gel Để đạt hiệu quả như mong muốn thì nên để cho nấm men tăng sinh khối trực tiếp trong hạt gel hơn là chuẩn bị tạo gel với mật độ nấm men cao ngay từ đầu [21, 34, 87, 88]

2.2 BACTERIAL CELLULOSE – BC 2.2.1 Cấu trúc

Cellulose được tạo thành từ các chuỗi β-1,4-glucan liên kết với nhau bằng liên kết Van der Waals Các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo nên cấu trúc tiền sợi có chiều rộng 1,5nm Những tiền sợi này kết tinh lại tạo thành sợi Các sợi kết hợp với nhau tạo thành bó Các bó sau đó kết hợp với nhau tạo thành dải

Những dói siờu nhỏ của BC cú chiều dài nằm trong khoảng 1-9 àm cú chứa từ 2000 đến 18000 đơn phân glucose (Ross và cộng sự, 1991) hình thành nên một mạng lưới cấu trúc dày đặc được giữ ổn định bằng những liên kết hydro [119] BC được phân biệt với PC (Plant cellulose – cellulose thực vật) nhờ vào chỉ số kết tinh cao (trên 60%) và sự khác nhau của độ trùng hợp (DP), thông thường DP của BC nằm giữa khoảng 2000 và 6000 (Jonas và Farah, 1998), nhưng trong vài trường hợp đạt đến 16000 hoặc thậm chí 20000 (Watanabe và cộng sự, 1998 b) trong khi DP trung bình của polymer ở PC chỉ nằm trong khoảng13 000 đến 14000 (Teeri,1997) Ngoài ra, đường kính của BC chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật [4, 51]

Hình 2.4 So sánh cellulose vi khuẩn (trái) và cellulose thực vật (phải) [4]

BC I: được tạo thành trong mụi trường nuụi cấy tĩnh, cú đường kớnh từ 0,05-0,1àm BC I có dạng màng dày trên bề mặt môi trường, có độ chịu lực cao, ứng dụng để tạo màng, sử dụng trong thiết bị lên men [4, 6, 51, 61, 85]

BC II: được tạo thành trong môi trường nuôi cấy bề sâu Các sợi BC II có dạng uốn cong, sắp xếp đối song song với nhau, đường kớnh 0,1-0,2àm, phõn bố khắp mụi trường nuụi cấy hoặc kết hợp lại với nhau thành hạt nhỏ hay các hạt hình sao BC II tuy có độ chịu lực không cao bằng BC I nhưng có ưu thế ở độ trương nở và ngậm nước cao [4, 6, 51, 85]

Hình 2.5 Cấu trúc BC trong điều kiện nuôi cấy bề mặt (trái) và nuôi cấy bề sâu (phải)

Tính tinh khiết: Bacterial cellulose là loại cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không chứa lignin hay hemicellulose, thành phần môi trường có thể được loại bỏ để thu được BC với độ tinh sạch cao Nhưng một ưu điểm lớn hơn là những sợi cellulose còn lại sau xử lý không sứt mẻ, và như vậy cellulose bền hơn và vẫn giữ lại những đặc tính quan trọng [27]

Tính giữ nước: Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút lượng nước gấp 60 tới

Ngoài ra, BC có khả năng hấp thụ và giữ nước gấp 700 lần trọng lượng của nó và tùy chỉnh độ xốp để tăng diện tích bề mặt Đặc biệt, khi kết hợp carboxymethyl cellulose trong quá trình hình thành BC, khả năng giữ nước của BC tăng ấn tượng lên đến 1000 lần so với trọng lượng khô của nó, qua đó thể hiện tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực liên quan đến hấp thụ và lưu trữ nước.

Tính bền cơ học: BC I có độ bền cơ học cao, sức căng lớn, nhẹ, kích thước ổn định Giá trị

Young’s modulus của BC khoảng 30GPa, xấp xỉ 4 lần so với sợị hữu cơ khác [51, 136]

2.2.4 Các phương pháp cố định vi sinh vật trên chất mang BC Phương pháp hấp phụ: dựa vào lực hấp phụ trên bề mặt chất mang có cấu trúc xốp, nhiều mao quản Phương pháp được thực hiện bằng cách ngâm chất mang BC trong dung dịch huyền phù vi sinh vật, BC sẽ trương nở dần và vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó [66]

BC là chất mang sạch, rẻ tiền, sản phẩm lên men có hương vị tốt, đồng thời có khả năng ứng dụng lên men ở nhiệt độ thấp Trong quá trình cố định, BC sẽ trương nở hoàn toàn tạo điều kiện hấp phụ tốt hơn những chất mang có cấu trúc cellulose thực vật Theo Nguyễn Thúy Hương (2006), khi sử dụng BC để cố định vi khuẩn Acetobacter xylinum, hiệu suất cố định đạt 73%, cao hơn hẳn các chất mang hấp phụ khác [6, 19, 66, 85]

Tuy nhiên, phương pháp hấp phụ tốn khá nhiều thời gian Với các chất mang là các miếng trái cây, thời gian cố định thường kéo dài khoảng 133h, các chất mang cellulose, vỏ trái cây thường được cố định trong 5-8h Trong khi đó thời gian thực hiện cố định với Na-alginates chỉ khoảng vài chục phút [19, 66, 85]

Hình 2.6 thể hiện kết quả của chụp SEM trên bề mặt và bên trong hạt chất mang BC sau khi cố định nấm men bằng phương pháp hấp phụ không ủ.

Phương pháp hấp phụ- ủ: vi sinh vật cố định trên BC sau thời gian hấp phụ có thể sử dụng chất dinh dưỡng còn lại của BC để sinh trưởng tăng sinh khối Phương pháp cố định hấp phụ- ủ gồm hai giai đoạn chính:

- Giai đoạn 1: BC đóng vai trò là chất nền (matrix) để hấp phụ vi sinh vật Sau khi ngâm BC trong dịch giống vi sinh vật, BC trương nở, vi sinh vật sẽ bám xung quanh mặt ngoài và một phần nhỏ len lỏi vào bên trong mạng cellulose

Tái sử dụng tế bào nấm men cố định

Một trong các ưu điểm của việc sử dụng nấm men cố định đó là hoạt tính và khả năng tái sử dụng cao hơn so với nấm men tự do Việc tái sử dụng đem lại các ưu điểm như giảm thời gian lên men, giảm chi phí cho quá trình nhân giống và năng lượng Vì vậy tái sử dụng nấm men trong sản xuất rượu vang là hướng nghiên cứu được quan tâm trong thời gian gần đây [19, 34, 38, 43, 44]

2.3.1 Thời gian lên men trong quá trình tái sử dụng tế bào

So với quy trình lên men sử dụng nấm men tự do thông thường, tái sử dụng nấm men cố định giúp rút ngắn đáng kể thời gian lên men Nghiên cứu của Reddy (2006) đã chứng minh rằng nấm men cố định trên ổi Ấn Độ có thể được tái sử dụng tới 15 lần Quá trình lên men sử dụng nấm men tái sử dụng cho thấy tốc độ lên men tương đương và các chỉ tiêu khác không khác biệt so với quá trình sử dụng nấm men tự do, ngay cả ở các nhiệt độ khác nhau.

Bảng 2.2 Các giá trị phân tích thu được trong quá trình lên men tĩnh qua 15 chu kỳ khảo sát tại các nhiệt độ khác nhau [51]

Nhiệt độ Chu kỳ Thời gian Hàm lượng Tốc độ tổng hợp ( 0 C) lên men (h) ethanol (% v/v) ethanol (gL -1 h) 30 (C) 3 72 12 1.32

Việc tái sử dụng rút ngắn đáng kể thời gian lên men, sau 3 chu kỳ tái sử dụng thời gian lên men giảm 2 - 3 lần Kết quả này cũng được thu nhận từ các nghiên cứu khác về tái sử dụng nấm men cố định như Mallouchos (2002) cố định trên vỏ nho, Bekatorou (2002) cố định trên quả sung khô, Kourkoutas (2003), Tsakiris (2003) cố định trên nho khô, Rosini & Ciani (1991) cố định trên alginate [10, 19, 34, 38,43, 44, 51, 89]

2.3.2 Hoạt tính nấm men trong quá trình tái sử dụng tế bào

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng cố định tế bào nấm men giúp duy trì hoạt tính của chúng trong thời gian dài hơn Kourkoutas (2003) đã chứng minh điều này khi sử dụng nấm men cố định trên quả mộc qua để lên men rượu vang theo phương pháp lên men tĩnh nhiều chu kỳ, cho thấy quá trình lên men có thể kéo dài tới 8 tháng mà không làm giảm đáng kể hoạt tính của nấm men Tương tự, Tsakiris (2003) cũng sử dụng nấm men cố định trên nho khô và phát hiện rằng hệ thống lên men có thể hoạt động trong 4 tháng trước khi cần phải thay tế bào cố định mới.

2.3.3 Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm trong quá trình tái sử dung tế bào

Cơ chất trong môi trường được sử dụng vào 2 mục đích chính là tăng sinh khối và sinh tổng hợp các sản phẩm Các nghiên cứu về tái sử dụng nấm men cho thấy không có sự khác biệt lớn về hàm lượng cồn cuối cùng giữa nấm men cố định tái sử dụng và nấm men tự do

Mặt khác, do thời gian lên men ngắn hơn nên nấm men cố định có tốc độ sinh tổng hợp cồn cao hơn hẳn nấm men tự do [10, 34, 38, 44, 59, 89]

Tsakiris (2004) sử dụng nấm men cố định trên nho khô và tái sử dụng trong 12 chu kỳ

Kết quả (bảng 2.3) cho thấy không có sự khác biệt giữa tế bào cố định và tự do

Bảng 2.3 Hàm lượng cồn qua các chu kỳ sử dụng nấm men cố định trên nho khô [89]

Chu kỳ Nhiệt độ ( 0 C) Thời gian lên men (ngày) Hàm lượng ethanol(%v/v)

−Kết quả nghiên cứu của Reddy (bảng 2.3) cho thấy, so với quá trình lên men bằng nấm men tự do thông thường, tốc độ sinh tổng hợp cồn của tế bào cố định tái sử dụng đều cao hơn khi tái sử dụng tế bào tự do Tuy nhiên khi so sánh giữa các chu kỳ tái sử dụng, sau 3 chu kỳ đầu, tốc độ sinh tổng hợp cồn có xu hướng giảm khi tăng số chu kỳ tái sử dụng Reddy giải thích hiện tượng này là do sự giảm thể tích của miếng ổi (chất mang cố định) dẫn đến việc giảm đường kính các ống mao quản nên khó khăn cho sự truyền khối của cơ chất vào bên trong [51] Kết quả cũng phù hợp với kết luận của Kourkoutas (2006) khi sử dụng nấm men cố định trên táo [43,44]

−Ciani & Rosini (1993) cố định nấm men trên alginate và nghiên cứu tái sử dụng tế bào cố định Trong các chu kỳ tái sử dụng, mặc dù hàm lượng acid dễ bay hơi cao hơn nhưng thời gian lên men tương đối ngắn và hàm lượng cồn cao hơn so với chu kỳ đầu [19] Cũng cố định trên chất mang alginate, Suzzi (1995) đã so sánh giữa 5 chủng nấm men ở 2 điều kiện tự do và cố định Kết quả cho thấy qua các chu kỳ tái sử dụng, hàm lượng ethanol và các sản phẩm phụ thay đổi tùy theo các chủng nấm men sử dụng hơn và ít phụ thuộc vào 2 điều kiện cố định hay tự do [29]

Cũng khảo sát ảnh hưởng của việc tái sử dụng nấm men đến khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ, các nghiên cứu cho thấy rượu vang sản xuất bằng phương pháp tái sử dụng nấm men cố định có chất lượng tương tự như rượu vang sản xuất theo phương pháp truyền thống

Trong một số trường hợp, tái sử dụng còn ảnh hưởng tích cực làm tăng chất lượng rượu vang

−Kourkoutas (2006) tái sử dụng nấm men cố định trên táo trong 30 chu kỳ Kết quả thu được cho thấy hàm lượng các rượu bậc cao và acetandedehyde là tương đối thấp 13mg/l Bên cạnh đó hàm lượng ethyl acetate khá cao lên đến 154 mg/l Điều này rất có ý nghĩa vì ethyl acetate có tác dụng giúp rượu vang có mùi trái cây và vị đặc trưng [43,44]

−Tsakiris (2003) cố định trên nho khô Kết quả phân tích sản phẩm phụ thu được được tóm tắt trong bảng 2.4

Bảng 2.4 Thành phần các sản phẩm phụ qua các chu kỳ tái sử dụng trên nấm men cố định và tự do

Chu kỳ Nhiệt độ Acetaldehyde Ethyl 1-Propanol Isobutyl Amyl Methanol Tổng lên men ( 0 C) (mg/l) acetate (mg/l) acohols alcohols (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l) (mg/l)

Kết quả cho thấy ở nhiệt độ lên men là 25 0 C, 2 phương pháp cố định và tự do cho kết quả tương đương nhau về thành phần các sản phẩm phụ (acid tổng, rượu bậc cao, ester, ) Nhưng khi nhiệt độ lên men giảm, tái sử dụng nấm men cố định thể hiện ưu điểm hơn so với nấm men tự do bằng cách giảm hàm lượng acetaldehyde, tăng hàm lượng ethylacetate [89]

−Panalgiotis & A Koutinas (2008) khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần cấu tử hương của tái sử dụng nấm men cố định trên khoai tây và so sánh với nấm men tự do ở cùng nhiệt độ cũng rút ra kết luận tương tự như Tsakiris Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng nấm men cố định tái sử dụng có tác dụng tích cực nâng cao chất lượng rượu vang với hàm lượng và chủng loại ester tạo thành cao hơn hẳn nấm men tự do [73].

NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi sử dụng giống nho Red Cardinal được trồng tại Ninh Thuận Sau khi thu hoạch, nho được ép lấy dịch rồi trữ đông để sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm Quy trình ép nho được mô tả chi tiết trong Hình 3.1 Bảng 3.1 trình bày thành phần dinh dưỡng của dịch nho sau khi ép, cung cấp thông tin về các chất dinh dưỡng thiết yếu có sẵn trong nguyên liệu này.

Gia nhieọt 70 o C, 2ph Lọc chân không

Hình 3.1 Quy trình ép nho

Bảng 3.1 Thành phần của dịch nho sau khi ép

Thông số Đơn vị Giá trị pH 3,71 Độ chua g acid tartaric/100mL 0,65 Đường tổng g/L 121 Đường khử g/L 120

Hàm lượng chất khô o Bx 12

Chúng tôi sử dụng loài nấm men Saccharomyces cerevisiae do phòng thí nghiệm Vi sinh, bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa cung cấp

Chúng tôi sử dụng Alginate được tách chiết từ rong mơ, thuộc giống Sargassum do TS

Ngô Đăng Nghĩa, Đại học thủy sản Nha Trang cung cấp Chế phẩm dạng rắn, độ ẩm 20,05%, độ nhớt của dung dịch 2% ở 25 o C là 423,6cP

Chúng tôi sử dụng BC sản xuất từ quá trình lên men nước dừa già bằng vi khuẩn Acetobacter Xilinium theo phương pháp lên men bề mặt Loài vi khuẩn Acetobacter xylinum do cô Nguyễn Thúy Hương, bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa cung cấp BC sau khi xử lý có màu trắng, độ ẩm khoảng 97%.

Phương pháp nghiên cứu

3.2.1.1 Quy trình c ố đị nh n ấ m men trong gel alginate

H t t bào c đ nh n m men N c vô khu n

Hình 3.2 Quy trình cố định nấm men trong gel alginate Nhân gi ố ng n ấ m men:

− Cấp 1: lấy từ một đến hai vòng que cấy nấm men từ ống giống gốc để cấy vào 10mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30 o C

− Cấp 2: cho toàn bộ canh trường nhân giống cấp 1 vào 100mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN, hiệu chỉnh đến nồng độ chất khô là 15 o Bx và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30 o C

Ly tâm: Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, ở nhiệt độ

40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối

Pha loãng: Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt 50ml dung dịch huyền phù nấm men với mật độ 100.10 6 tế bào/ml

T ạ o dung d ị ch alginate: Bổ sung nước cất vào trong alginate để thu 50ml dung dịch có nồng độ alginate là 4%

H ấ p ti ệ t trùng: Vô khuẩn dung dịch alginate ở 121 o C, trong 20 phút

Làm ngu ộ i: Làm nguội dung dịch alginate sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường

Tr ộ n: Trộn dịch huyền phù tế bào nấm men đã pha loãng ở trên với dung dịch alginate 4% theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng nhất

T ạ o h ạ t: Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate-nấm men vào dung dịch CaCl2 2% Đường kính ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dịch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành có đường kính khoảng 4÷5mm Dung dịch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút Mỗi giọt hỗn hợp alginate-nấm men rơi xuống dung dịch sẽ tạo thành một hạt nấm men cố định

Ngâm h ạ t: Hạt nấm men cố định tạo ra được ngâm trong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ, tốc độ khuấy đảo hạt vẫn giữ từ 100÷200 vòng/phút Ta phải thay mới dung dịch CaCl2 2% sau mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca 2+ trong dung dịch không bị giảm xuống quá thấp

R ử a h ạ t: Chắt bỏ dung dịch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước vô khuẩn ở nhiệt độ phòng và dịch lên men để muối CaCl2 không còn bám trên bề mặt hạt gel Tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước vô khuẩn và một lần bằng dịch lên men cho tất cả các thí nghiệm

Nếu muốn bảo quản hạt thì cho hạt gel chứa nấm men cố định vào dung dịch CaCl2 0,4%, bảo quản ở 5 o C trong vòng tối đa là 24h

3.2.1.2 Nghiên c ứ u tái s ử d ụ ng n ấ m men c ố đị nh trong gel alginate

−Quá trình lên men được thực hiện trong erlen 3L, mỗi erlen chứa 2L môi trường dịch nho với mật độ giống cấy ban đầu 5×10 6 tế bào/mL môi trường dịch nho, nhiệt độ lên men khoảng 22 ÷ 25 o C Môi trường dịch nho được hiệu chỉnh các thông số như trong bảng 3.2

Sau khi bổ sung nồng độ chất khô đạt được là 22 o Bx

Bảng 3.2 Các chất bổ sung vào dịch nho trước khi lên men mỗi chu kỳ

Thông số Chất bổ sung Giá trị đã hiệu chỉnh Đường tổng Glucose 241g/L Nitơ ammonium (NH 4 ) 2 HPO 4 195ppm N

SO 2 Na 2 S 2 O 5 112ppm SO 2 pH NaOH 4

−Cho các hạt gel alginate đã cố định nấm men lần lượt lên men vang qua nhiều chu kì liên tiếp Sau mỗi chu kì lên men, chúng tôi sẽ tiến hành tách các hạt gel ra khỏi dịch nho sau đó rửa bằng nước vô khuẩn rồi chuyển toàn bộ vào môi trường dịch nho mới để tiến hành lên men chu kì tiếp theo

−Khảo sát ảnh hưởng của giải pháp ngâm hạt gel alginate trong dung dịch CaCl2 đến độ bền của hạt: tiến hành cũng tương tự như trên, sau khi tách hạt gel alginate ra khỏi dịch lên men và rửa bằng nước vô khuẩn, chúng tôi sẽ ngâm toàn bộ hạt vào trong dung dịch CaCl2 2% để ion Ca 2+ khuếch tán vào bên trong hạt làm tăng độ bền của chúng Quá trình ngâm sẽ kết thúc khi hàm lượng Ca 2+ tồn tại trong hạt gel alginate ngang bằng với hàm lượng Ca 2+ trong hạt gel khi bắt đầu chu kì 1 của quá trình lên men Kết thúc quá trình ngâm hạt gel, chúng tôi sẽ tiến hành rửa hạt bằng nước vô khuẩn, sau đó chuyển chúng vào trong môi trường dịch nho mới để tiến hành lên men chu kì tiếp theo

−Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần để kiểm tra ý nghĩa sự khác biệt của các kết quả theo phương pháp ANOVA

3.2.2 Nghiên cứu tái sử dụng nấm men cố định trên chất mang BC

3.2.2.1 Quy trình c ố đị nh n ấ m men trên BC Chu ẩ n b ị n ấ m men:

Dùng dịch nho đã chỉnh pH về 4,0 pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 185.10 6 tế bào/mL

Hình 3.3 Quy trình cố định nấm men trên chất mang BC bằng phương pháp hấp phụ - ủ

Tế bào đã cố định Nước vô trùng

− Sấy: Thực hiện sấy nhẹ ở 70 o C trong 5 phút nhằm làm ráo chất mang

− Cắt miếng: Cắt chất mang BC thành những miếng hình vuông kích thước 1cm x 1cm

− Hấp tiệt trùng: Vô khuẩn chất mang BC ở 121 0 C, trong 20 phút

− Làm nguội: Làm nguội chất mang sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường

C ố đị nh n ấ m men trên ch ấ t mang BC:

− Phối trộn- cố định: Phối trộn chất mang đã cắt miếng nhỏ vào huyền phù giống đã chuẩn bị

Sau đó, đem hỗn hợp đi lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong 4h 45phút để các tế bào nấm men bám lên bề mặt chất mang

− Rửa chất mang: Sau thời gian cố định, vớt chất mang ra khỏi dung dịch và rửa bằng nước vô khuẩn

− Ủ: Nấm men sau khi được cố định trên chất mang sẽ được ủ ở 30 o C trong 48h Trong thời gian ủ, nấm men sẽ sinh trưởng trong lòng chất mang BC, làm tăng mật độ tế bào cố định

3.2.2.2 Nghiên c ứ u tái s ử d ụ ng n ấ m men c ố đị nh trên BC

−Quá trình lên men được thực hiện trong erlen 3L, mỗi erlen chứa 2L môi trường dịch nho với mật độ giống cấy ban đầu 5×10 6 tế bào/mL môi trường dịch nho, nhiệt độ lên men khoảng 22 ÷ 25 o C Môi trường dịch nho được hiệu chỉnh các thông số như trong bảng 3.2

Sau khi bổ sung các cơ chất, tổng nồng độ chất khô đạt được là 22 o Bx

−Sau mỗi chu kỳ lên men, nấm men cố định được tách ra bằng cách vớt các miếng chất mang ra khỏi dịch lên men, sau đó các miếng chất mang được rửa bằng nước vô khuẩn và cho vào bình lên men chu kỳ tiếp theo

3.2.3 Xử lý kết quả thí nghiệm

3.2.3.1 T ố c độ s ử d ụ ng đườ ng trung bình

−Dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian: S = S(t)

− Xác định tốc độ sử dụng đường trung bình: τ

S ∆S τ: thời gian lên men (h) được xác định dựa vào độ lên men

∆S: lượng đường nấm men tiêu thụ trong thời gian lên men, (g/l) Độ lên men:

So: hàm lượng đường ban đầu, g/l

3.2.3.2 T ố c độ sinh t ổ ng h ợ p c ồ n trung bình

−Dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi hàm lượng ethanol theo thời gian: P = P(t)

−Xác định tốc độ sinh tổng hợp ethanol trung bình: τ

P= ∆P τ: thời gian lên men (h) được xác định dựa vào độ lên men 

∆P: lượng ethanol nấm men sinh tổng hợp được trong thời gian lên men, (g/l)

3.2.3.3 T ố c độ sinh tr ưở ng trung bình c ủ a n ấ m men:

Xác định tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men: τ

X ∆X τ: thời gian số lượng tế bào nấm men trong dịch lên men đạt cực đại (h)

∆X: số lượng nm đạt cực đại – số lượng nm ban đầu, (triệu tb/ml dịch lên men).

Phương pháp phân tích

3.3.3 Nồng độ đường khử (phương pháp AOAC) : So màu trên máy đo quang phổ dùng thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid Dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose, bước song hấp thu 540-600nm

3.3.4 Hàm lượng ethanol ( phương pháp AOAC) Chưng cất thu cồn 3.3.5 Mật độ tế bào nấm men: buồng đếm Thoma Đối với nấm men cố định trong hạt gel, rã hạt bằng dd Na citrate (C6H5Na3O7.2H2O) 0,1M, sau đó pha loãng mẫu đến tỉ lệ cần thiết rồi đếm trên buồng đếm Thoma

3.3.6 Hàm lượng cấu tử hương: phương pháp sắc ký khí

KẾT QUẢ – BÀN LUẬN

Nghiên cứu tái sử dụng nấm men cố định trên BC

4.2.1 Khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm men cố định trên BC qua mỗi chu kỳ tái sử dụng

Dựa vào kết quả trên hình 4.13 ta thấy:

Từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 5, tốc độ sinh trưởng của nấm men tăng do tế bào đã thích nghi với môi trường Thời gian pha lag giảm xuống sau mỗi chu kỳ lên men đầu tiên Điều này tạo điều kiện cho tế bào sinh trưởng nhanh hơn, rút ngắn thời gian cần thiết để tổng số tế bào trong canh lên cực đại.

- Từ chu kỳ 7 đến chu kỳ 10: Tốc độ sinh trưởng giảm Sau một thời gian tái sử dụng, mật độ tế bào trong chất mang quá cao dẫn đến sự cản trở quá trình này chồi của nấm men làm giám tốc độ phát triển Do đặc tính cấu trúc của BC nên tế bào nấm men vừa có khả năng hấp phụ trên bề mặt, vừa có khả năng phát triển ở bên trong chất mang Khi vùng không gian bên trong bị hạn chế do sự tăng sinh khối cũng sẽ ức chế sự phát triển của tế bào, đồng thời cản trở sự truyền cơ chất vào bên trong chất mang Mật độ tế bào cao cũng khiến cho sự tiếp xúc với cơ chất khó khăn hơn [72]

T ố c độ sinh tr ưở ng tr ung bình c ủ a nm (tri ệ u t ế bào/m l d ị ch nho/h)

Hình 4.13 Tốc độ sinh trưởng trung bình của nấm men qua các chu kỳ khảo sát động học

M ậ t độ t ế bào tron g d ị ch lên men ( tr /ml)

Hình 4.14 Động học sinh trưởng của nấm men ở các chu kỳ 1, 3, 5, 7, 10

Hình 4.15 Tỷ lệ nấm men bên ngoài và bên trong chất mang so với tổng số trong dịch lên men qua các chu kỳ khảo sát

Khi so sánh động học sinh trưởng của nấm men qua các chu kỳ (hình 4.14) ta thấy mật độ nấm men cực đại tăng dần từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 10 Nguyên nhân là sau mỗi chu kỳ lên men, mật độ nấm men trên miếng BC tăng lên do quá trình sinh trưởng của nấm men, dẫn đến mật độ nấm men vào thời điểm ban đầu của mỗi chu kỳ lên men là khác nhau Do đó mật độ cực đại ở các chu kỳ sau luôn cao hơn các chu kỳ trước, mặc dù có hiện tượng ức chế sự sinh trưởng của nấm men do mật độ tế bào tăng cao Tuy nhiên điều này có thể ảnh hưởng đến thời gian đạt cực đại, thể hiện qua việc thời gian để số tế bào đạt cực đại tăng từ 48 giờ (ở chu kỳ 7) đến 72 giờ (ở chu kỳ 10) (nguyên nhân đã được giải thích ở phần trên)

Hình 4.15 biểu diễn sự thay đổi về tỷ lệ nấm men ở trong và ngoài chất mang qua các chu kỳ lên men Sự thay đổi được thể hiện rõ thông qua tỷ lệ phần trăm nấm men thoát bào giảm dần từ chu kỳ 1 đến chu kỳ 6 sau đó tỷ lệ nàn được giữ ổn định vào các chu kỳ tiếp theo (kết quả được phân tích bằng phương pháp ANOVA đã khẳng định điều này)

Lượng nấm men bên ngoài chất mang bao gồm nấm men thoát từ chất mang và nấm men mới sinh từ tế bào nấm men tự do Khi kết thúc chu kỳ 1, tỷ lệ nấm men thoát bào cao (60,15%) do mật độ nấm men trên chất mang thấp, nấm men chủ yếu phát triển trên bề mặt chưa phát triển bên trong chất mang, dễ bị rửa trôi dẫn đến tỷ lệ nấm men tăng ngoài chất mang.

Trong quá trình tái sử dụng, mật độ nấm men gia tăng ở chất mang cùng sự phát triển bên trong cấu trúc chất mang Điều này làm giảm tỉ lệ tế bào nấm men bên ngoài chất mang, chỉ còn 20,8% ở chu kỳ thứ 6 Thực tế này có ý nghĩa quan trọng trong sản xuất rượu vang vì khi kết thúc lên men chính, một lượng nấm men vẫn còn trong rượu non để tiếp tục lên men phụ sau khi tách chất mang chứa nấm men.

Các chu kỳ 7, 8, 9, 10, 11 và 12 tỷ lệ số tế bào bên ngoài chất mang được giữ ổn định ở mức xấp xỉ 30% Kết hợp với quan sát của chúng tôi, điều này cho thấy sau 12 chu kỳ cấu trúc miếng BC vẫn được giữ ổn định, chưa xuất hiện hiện tượng cấu trúc bị phá vỡ (Nếu cấu trúc bị phá vỡ, tỷ lệ tế bào bên ngoài chất mang sẽ tăng cao do tế bào bên trong được giải thoát ra bên ngoài nhiều hơn) Tuy vậy, khi so sánh với một số chất mang cố định theo phương pháp nhốt nấm men vào trong cấu trúc gel (ví dụ như cố định trên alginate) thì tỷ lệ thoát bào này là khá cao Một thí nghiệm khác của chúng tôi cũng được tiến hành song song với thí nghiệm này khảo sát quá trình tái sử dụng nấm men cố định trong alginate thu được tỷ lệ tế bào bên ngoài chất mang chỉ chiếm khoảng 15% Đây cũng là đặc điểm chung của phương pháp cố định trên bề mặt chất mang [16, 18, 19, 24] a b c Hình 4.16 ảnh chụp SEM (x1000) (a) bề mặt miếng BC trước lên men chu kỳ 1; (b) bề mặt (c) và mặt cắt miếng BC trước lên men chu kỳ 10

K ế t lu ậ n: Qua các chu kỳ tái sử dụng, tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm men tăng dần, mật độ của nấm men tại các chu kỳ sau là khá cao Điều đó có ảnh hưởng tích cực tới tốc độ sử dụng cơ chất cũng như sinh tổng hợp sản phẩm

Kết quả cũng cho thấy tỷ lệ số tế bào bên ngoài chất mang ở các chu kỳ sau có xu hướng giảm so với chu kỳ đầu và được giữ ổn định sau một thời gian tái sử dụng Tuy tỷ lệ số tế bào bên ngoài chất mang là khá cao nhưng BC cũng hứa hẹn là một chất mang tiềm năng với độ bền cấu trúc và thời gian tái sử dụng không ít hơn 12 chu kỳ lên men liên tiếp

4.2.2 Khảo sát quá trình sử dụng cơ chất của nấm men cố định trên BC qua mỗi chu kỳ lên men

4.2.2.1 Kh ả o sát th ờ i gian lên men c ủ a m ỗ i chu k ỳ

Thời gian kết quá trình thúc lên men dựa vào độ lên men Độ lên men chúng tôi sử dụng trong trường hợp này là 97.5%

Bảng 4.4 Thời gian lên men (h) mỗi chu kì tái sử dụng của các mẫu lên men vang sử dụng nấm men cố định trên BC và mẫu đối chứng sử dụng nấm men tự do

Chu kì Thời gian (h) Tự do 140.6 a +1.12

Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba mẫu độc lập

Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P