THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM TRÊN CHẤT MANG KAPPA –CARRAGEENAN ĐỂ ỨNG DỤNG THU NHẬN L- LYSINE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH - Nguyễn Thị Hồng Sương THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM TRÊN CHẤT MANG KAPPA –CARRAGEENAN ĐỂ ỨNG DỤNG THU NHẬN L- LYSINE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Hồng Sương THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM TRÊN CHẤT MANG KAPPA -CARRAGEENAN ĐỂ ỨNG DỤNG THU NHẬN L- LYSINE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng tơi Kết trình bày luận văn trung thực chưa tác giả công bố cơng trình Các trích dẫn bảng biểu, kết nghiên cứu tác giả khác; tài liệu tham khảo luận văn có nguồn gốc rõ ràng theo quy định TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Hồng Sương LỜI CÁM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn giáo viên hướng dẫn Cơ PGS.TS Nguyễn Thúy Hương - người tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu hồn thiện luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Giáo sư, Phó giáo sư, Tiến sĩ Hội đồng cấp đọc góp ý cho luận văn tơi Tơi xin gửi lời cảm ơn đến NCS Trần Thị Minh Tâm, Trường Đại học Bách khoa TP HCM cho nhiều ý kiến quý báu trình làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, môn công nghệ sinh học - Trường Đại học Sư phạm TP HCM Trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Qua đây, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thị Hồng Sương MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CÁM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH Trang MỞ ĐẦU I Lí chọn đề tài II Mục đích nghiên cứu III Đối tượng nghiên cứu IV Phạm vi nghiên cứu V Nhiệm vụ nghiên cứu Chương 1.TỔNG QUAN 1.1 ACID AMIN L-LYSINE .3 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Bản chất trình sinh tổng hợp L- lysine 1.2 VI KHUẨN C GLUTAMICUM 1.2.1 Nguồn gốc chủng giống 1.2.2 Hệ thống phân loại 10 1.2.3 Đặc điểm vi khuẩn C glutamicum 10 1.3 LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE 11 1.3.1 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng 11 1.3.2 Ảnh hưởng số điều kiện ngoại cảnh 13 1.4 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO CHỦNG GIỐNG C GLUTAMICUM 14 1.4.1 Định nghĩa cố định tế bào vi sinh vật 14 1.4.2 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật .15 1.4.3 Yêu cầu phân loại chất mang 16 1.4.4 Ưu điểm nhược điểm tế bào cố định 17 1.4.5 Chất mang Carrageenan 19 1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 21 Chương VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 ĐỊA ĐIỂM - THỜI GIAN THỰC HIỆN 26 2.2 VẬT LIỆU 26 2.2.1 Môi trường sử dụng nghiên cứu 26 2.2.2 Hóa chất - thiết bị 26 2.3 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 27 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 29 2.4 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 35 2.4.1 Phương pháp vi sinh .35 2.4.2 Phương pháp hóa sinh 37 2.4.3 Phương pháp phân tích số liệu 38 Chương KẾT QUẢ -BÀN LUẬN 39 3.1 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CHỦNG GIỐNG 39 3.1.1 Đặc điểm đại thể, vi thể, sinh lý sinh hóa 39 3.1.2 Biến động sinh trưởng khả trao đổi chất chủng giống .41 3.2 TỐI ƯU HĨA QUY TRÌNH CỐ ĐỊNH CHỦNG GIỐNG TRÊN CHẤT MANG K-CARRAGEENAN 43 3.2.1 Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định 43 3.2.2 Tối ưu hóa q trình cố định chủng C glutamicum chất mang k- carrageenan 46 3.3 ỨNG DỤNG CHỦNG C GLUTAMICUM CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG K-CARRAGEENAN ĐỂ LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE 52 3.3.1 Khả tái sử dụng C glutamicum cố định lên men thu nhận L- lysine .52 3.3.2 Ảnh hưởng điều kiện bảo quản chế ph�y Lys Codon Lysine AAA AAG Hình 1.1 Cấu trúc khơng gian Lysine [43] 1.1.2 Bản chất trình sinh tổng hợp L- lysine Cơ chế điều hòa sinh tổng hợp L-lysine vi khuẩn C glutamicum diễn hai giai đoạn qua sơ đồ hình 1.2 Giai đoạn 1: Glucose tổng hợp nên oxaloacetate (do oxaloacetate tiền chất để tổng hợp aspartate) Để cho trình sinh tổng hợp diễn cần phải cung cấp nguồn nguyên liệu giàu carbon glucose, thơng qua chu trình đường phân, glucose chuyển hóa thành pyruvate, phần pyruvate tham gia vào chu trình Krebs để tạo lượng cung cấp cho hoạt động sống tế bào, phần cịn lại chuyển hóa thành oxaloacetate chất tổng hợp aspartate Giai đoạn 2: Tổng hợp L-lysine từ aspartate Aspartate - β- semialdehyde tổng hợp từ aspartate thông qua sản phẩm trung gian β- aspartyl phosphate Aspartate - β- semialdehyde tiền chất chung để tổng hợp L-lysine homoserine (hình 1.2) Hoạt động enzym homoserine dehydrogenase chuyển hóa homoserrine thành methionine, threonine isoleucine cần cho sinh trưởng vi khuẩn 5 Glucose Pyruvat Oxalaxetate Aspartate β- Aspartyl - phosphate Aspartate - β – semialdehyde Homoserine L-lysine Methionine Threonine Isoleucine Hình 1.2 Cơ chế điều hịa sinh tổng hợp L-lysine [5] Khi threonine tạo dư, chất kết hợp với L-lysine vừa tổng hợp để ức chế hoạt động enzym aspartate kinase, làm cho cấu trúc tâm hoạt động enzym aspartate kinase bị thay đổi, nên enzym không gắn với aspartate để xúc tác q trình phản ứng Do khơng chuyển hóa aspartate thành aspartate β - semialdehyde để giảm không tổng hợp L-lysine methionine, threonine isoleucine Khi lượng threonine hết enzym aspartate kinase hoạt động bình thường trình lại tiếp tục diễn theo giai đoạn nêu 6 L-Aspartate LysC L-Aspartyl - phosphate Threonine L - Aspartyl - semialdehyde DapA Pyruvate L-2,3Dihydro-picolnate L-lysine LysE L-lysine (ngoại bào) Hình 1.3 Sơ đồ ức chế ngược tổng hợp L-lysine C glutamicum [42] Vấn đề đặt muốn tạo nhiều L-lysine phải điều chỉnh cho Laspartate - β - semialdehyde khơng chuyển hóa thành homoserine Muốn ta phải làm bất hoạt enzym homoserine dehydrogenase để enzym khơng có khả chuyển hóa L –aspartate - β - semialdehyde thành homoserine Đến đường sinh tổng hợp L-lysine diễn nhánh, khởi đầu từ aspartate nhờ enzym aspartate kinase enzym quan trọng trình biến đổi Vậy làm để lượng L-lysine vi khuẩn tiết nhiều hơn? Nhiều tác giả nghiên cứu tác động vào hệ gen vi khuẩn để gây biến đổi gen tác động vào gen LysC, gen tổng hợp nên enzym aspartate kinase tăng hoạt tính hoạt động enzym aspartate kinase gen khác Để tổng hợp thành L-lysine phải có tham gia nhiều gen, gen tổng hợp nên enzym tương ứng, enzym tạo có tác dụng xúc tác cho q trình chuyển hóa để tổng hợp L-lysine thể bảng 1.1 Bảng 1.1 Các gen mã hóa enzym tham gia vào tổng hợp L-lysine Tên enzym mã hóa STT Gen lysC Aspartate kinase asd Aspartate semialdehyde dehydrogenase dapA Dihydrodi - picolinate synthase dapB Dihydrodi - picolinate reductase dapD Tetrahydrodi - picolinate succinylase dapC Succinyl - amino ketopimelate transaminase dapE Succinyl - amino pimelate succinylase dapF Diaminopimelate epimerase lysA Diaminopimelate decarboxylase 10 ddh Diamino - pimelate dehydrogenase 11 lysE Permease Chú thích: STT: số thứ tự [17] Qua sơ đồ hình 1.4, từ L - Aspartate trải qua trình biến đổi tác dụng enzym tạo từ gen LysC, asd, L - Aspartate tạo thành L - Aspartate - semialdehyde Để tạo nhiều L-lysine, giải pháp đặt cần bất hoạt enzym homoserine dehydrogenase để enzym khơng có khả chuyển hóa L- aspartate - β - semialdehyde thành homoserine threonine, isoleucine Khi đường sinh tổng hợp L-lysine C glutamicum aspartate diễn theo đường để tạo L-lysine, với tham gia hoạt động nhiều enzym mã hóa gen (bảng 1.1) trải qua nhiều phản ứng trung gian Cuối Llysine xuất tế bào nhờ enzym permease (lysE) 8 L- Aspartate lysC L- -Aspartyl phosphate asd L-Aspartate -semialdehyde dapA Methionine threonine isoleucine L-2,3 - Dihydrodipicolinate dapB L- piperideine -2-6-dicarboxylate dapD Succinyl – 2- amino – 6- ketopimelate dapC Succinyl – 2,6- L,L–diaminopimelate diamino - pimelate dehydrogenase (ddh) dapE L, L–diaminopimelate dapF D, L- Diaminopimelate Màng tế bào LysA L - lysine (tế bào) LysE L - lysine (tiết bên ngồi) Hình 1.4 Con đường sinh tổng hợp L-lysine C glutamicum [17] Quan sát hình 1.4, để trình tổng hợp L-lysine diễn nhanh ta tác động vào enzym diamino - pimelate dehydrogenase (ddh), để enzym (ddh) chuyển L-piperideine -2,6 - dicarboxylate thành D, L - diaminopimelate với tác động enzym diaminopimelate decarboxylase (lysA), với enzym permease (lysE) L-lysine tiết [17] Xuất phát từ chế điều hịa sinh tổng hợp L-lysine ta thấy có hướng sau để cải thiện sản lượng L-lysine: Cải tạo giống C glutamicum cho enzym aspartate kinase khơng cịn bị ức chế hỗn hợp L-lysine threonine tạo Năm 1990, Jetten cs., tạo đột biến kháng AEC (amino-ethyl-cysteine) gen lysC Các nghiên cứu cho thấy locus lysC mã hóa aspartate kinase gồm hai gene chồng chéo lên nhau, lysC lysC với lysCβ có vai trị giúp cho enzym aspartate kinase kháng ức chế ngược [25] Làm bất hoạt enzym homoserine dehydrogenase để enzym khơng cịn khả chuyển hóa aspartate - β - semialdehyde thành homoserine cách tác động vào gen để tạo chủng giống đột biến gen có bị bất hoạt Tăng biểu gen dapA mã hóa enzym dihydrodipicolinate synthase làm tăng khả sản xuất L-lysine Kết giống việc nâng cao biểu enzym aspartate kinase Qua nghiên cứu, tác giả thấy mức độ biểu gen dapA làm giảm hoạt tính enzym homoserine dehydrogenase [25] 1.2 VI KHUẨN C GLUTAMICUM 1.2.1 Nguồn gốc chủng giống Năm 1950, Kinoshita cs., phát C glutamicum có khả sản xuất acid amin L-glutamic Trong nửa đầu kỉ 20, bột sản xuất chiết xuất từ lúa mì, đậu tương nguồn protein thực vật khác sau thủy phân acid HCl đậm đặc Một thời gian ngắn sau phát Kinoshita‘ S vào năm 1957, Kyowa - Hakko bắt đầu lên men sản xuất bột ứng dụng Micrococcus glutamicus (sau đổi tên Corynebacterium glutamicum ) (Kumagai, 2000) Từ quy trình 10 cơng nghệ sinh học với loài vi khuẩn Corynebacterium phát triển sản xuất acid L-glutamic L-lysine [37] 1.2.2 Hệ thống phân loại Theo khóa phân loại Stackebrandt E cs., (1997) [17], C glutamicum thuộc: Giới: Bacteria Lớp: Actinobacteria Phân lớp: Actinobacteridae Bộ: Actinomycetales Phân bộ: Corynebacterineae Họ: Corynebacteriaceae Giống: Corynebacterium Loài: Corynebacterium glutamicum 1.2.3 Đặc điểm vi khuẩn C glutamicum Trong tự nhiên chủng C glutamicum tìm thấy đất, chất thải, phân bón Hầu hết chủng có khuẩn lạc màu vàng nhạt đến vàng, vài có màu trắng kem [17] Collins Cummins (1986), mô tả vi khuẩn C glutamicum với đặc điểm sau: Gram dương, khơng bào tử, khơng di động, có dạng hình que kích thước (0,8 -1,2) x (1,5-8 , hình chữ V hai tế bào xếp lại với kỵ khí khơng bắt buộc đến hiếu khí, có enzym catalase, vách tế bào có chứa acid mycolic arabino – galactan chứa 26 – 36 C [17] Điều kiện sinh trưởng chủng C glutamicum chịu nhiệt độ khoảng 200C - 400C, sinh trưởng tốt nhiệt độ 300C, sống môi trường có pH dao động khoảng 6,8 - 8,0, sinh trưởng tốt pH có giá trị từ 7,0 -7,2 [17] 11 Trong trình tăng trưởng, vi khuẩn phải cung cấp nguồn dưỡng chất carbon, nitơ, khống, vitamin biotine (vitamin H) Vi khuẩn C glutamicum sử dụng nhiều loại carbohydrat glucose, fructose, sucrose, maltose,…[17] Hình 1.5 Vi khuẩn C glutamicum [17] Trình tự gen vi khuẩn C glutamicum xác lập Kyowa Hakko Kitasato, nghiên cứu tác giả xác định vi khuẩn C glutamicum có khoảng 3.099 gen coi mã hóa protein Phân tử ADN chủng vi khuẩn có dạng vịng, tỷ lệ GC 53%, có 3.138 gen khác [17] 1.3 LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE 1.3.1 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng 1.3.1.1 Ảnh hưởng nguồn hydratcarbon Trong nhiều loại carbohydrat, đường glucose chất chủng sử dụng hiệu Năm 2005, Georgi cs., khẳng định chất glucose khả phân giải vi khuẩn cao hiệu suất thu nhận L-lysine cao chất khác [35] Trần Thị Minh Tâm (2009), khảo sát vi khuẩn C glutamicum nhiều nguồn carbon khác khẳng định chất glucose cho hiệu suất cao chất khác Ở nồng độ glucose 10%, suất L-lysine cải thiện tốt