Khảo sát, sàng lọc và tối ưu khả năng sinh bacteriocin từ bộ sưu tập vi khuẩn probiotic và thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học

I H C QU C GIA TP HCM I H C BÁCH KHOA NGUY N TH O KH O SÁT, SÀNG L C VÀ T KH T B VÀ TH P VI KHU N PROBIOTIC NGHI M T O CH PH M SINH H C Chuyên ngành: Công ngh Sinh h c Mã s : 604280 LU TP H CHÍ MINH, tháng 12 -HCM : - - NHI M V LU MSHV: 11310626 25/12/1987 Qu ng Nam : 604280 Chuyên ngành: I TÀI: Kh o sát, sàng l c t b t p vi khu n probiotic th nghi m t o ch ph m sinh h c II NHI M V VÀ N I DUNG: Tuy n ch n ch ng vi khu n có kh bacteriocin cao, t y ut n trình t ng h p bacteriocin th nghi m t o ch ph m bacteriocin III NGÀY GIAO NHI M V : 14/01/2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 22/11/2013 V CÁN B CÁN B NG D N: PGS.TS NGUY NG D N CH NHI M B (H tên ch ký) O L IC M ôi xin chân thành Cô Nguy tôi, t vi n vi c th c hi t ng, ti p c n tài Nh ng lúc g u ki n t t nh ng viên, ch d n em có th hồn thành lu Q th y b mơn cơng ngh sinh h tơi hồn thành lu t nh ng ki n th c t nghi p Cô Oanh, cô Tiên, cô Li Tao, cô Huy n, ch Thanh, em Tu n t u ki n thu n l s d quan tâm ch d n, v t ch t, máy móc thi t b phịng thí nghi m c a b môn Ba m , anh B ng, em Hi u i thân ch d a tinh th n v ng ch c, ngu n ng viên m nh m nh t giúp tơi có thêm ngh l hồn thành lu Các b n, anh ch h c viên l p cao h c 2011 nghi tr nhi i kinh ng hành su t th i gian qua Quý th y cô h ng ph n bi Tp HCM, ngày c nh n xét lu TÓM T T tài: " Kh o sát, sàng l c t b p vi khu n probiotic th nghi m t o ch ph m sinh h c." N i dung c tài: Sàng l c ch ng vi khu n có kh t p vi khu n probiotic ng h p bacteriocin cao t b nh danh ch ng sàng l Sàng l c y u t quan tr ng c n sinh t ng h p bacteriocin theo thi t k Plackett- Burman T u ki n lên men thu nh n bacteriocin theo b m t- ng c u trúc có tâm (RSM-CCD) Th nghi m t o ch ph m bacteriocin K t qu tài: Sàng l c ch ng có kh t tính bacteriocin cao nh t t b p vi khu n probiotic ch ng L13 K t qu nh danh t b kit API 50CHL c a ch ng L13: Lactobacillus acidophilus v ng 96,8% K t qu nh danh b Lactobacillus acidophilus v Lactobacillus acidophilus 6,0; nhi i trình t 16s rDNA c a ch ng L13: ng 100% i u ki n ni c y thích h u 32oC, t l c y gi ng 7% Bacteriocin c a Lactobacillus acidophilus có kh (Bacillus sp.) m nh c ch vi khu n Gram n Gram âm (Salmonella sp.) C th , u 6,0; t l c y gi ng 7%, sau 21gi nuôi c y 32oC, ho t tính bacteriocin c 1600AU/mL v i ch ng ch th Bacillus sp., 800 AU/mL v i ch ng ch th Salmonella sp K t qu sàng l c y u t quan tr ng ng nhi u nh t bacteriocin theo thi t k Plackett- Burman là: nhi n cao n m men b n ho t tính u, n K t qu t i u ki n lên men thu nh n bacteriocin theo ng b m t - c u trúc có tâm (RSM-CCD): Mơi 3,41 3,56g/L; pH mơi 33,87oC; thu Th nghi m t o ch ph m bacteriocin N ng ammonium sulfate thích h sau t a có ho t tính (6400AU/mL) t a bacteriocin 70% Bacteriocin g p 1,71 l n so v i bacteriocin thô (3733,33 AU/mL) nhiên hi u su t thu h i bacteriocin sau t a l c màng 50kDa 55,71% Ho t tính bacteriocin c a ch ph Tính ch t c a bacteriocin: ch c nhi t 40-80oC SUMMARY Topic: "Surveying, screening and optimizing ability bacteriocin from the collection of probiotic bacteria and testing biological products." Contents of the subject: Screening the bacteria strain produces high antibacterial activity of bacterocin from the collection probiotic, identifying strain result Screening the important factors affects to bacteriocin biosynthesis using design of Plackett-Burman Optimizing the fermentation conditions to achieve bacteriocin follow Central composite design-Response surface methodology Testing to create bacteriocin preparation Result of the subject: Screening of bacteria strain has the active bacteriocin highest from the collection probiotic, is strain L13 Identification results from the API 50 CHL identification kit: strain L13 has a similarity 96.8 % to Lactobacillus acidophilus Identification results from of 16s rDNA sequencing: strain L13 has a similarity 100 % to Lactobacillus acidophilus The appropriate culture condition of L13 - Lactobacillus acidophilus, such as: initial pH 6.0, temperature 32oC, inoculation rate is % Antibacterial activity of bacterocin producing Lactobacillus acidophilus has capable inhibiting in Gram positive bacteria (Bacillus sp.) stronger than Gram negative bacteria (Salmonella sp.) Specifically, the basic MRS, initial pH 6.0, inoculation rate is %, after 21hours incubation at 32oC, the bacteriocin activity is 1600AU/mL with Bacillus sp indicator strain, and 800AU/mL for Salmonella sp strain indicator strain Survey results of important factors influence in bacteriocin activity follow the Plackett - Burman design: temperature, initial pH, concentration of yeast extract added to the basic MRS Results of the optimizing of fermentation conditions to obtain bacteriocin follow Central composite designs-Response surface methodology (RSM-CCD): Basic MRS supplemented yeast extract concentration of 3.41 3.56g/L, initial pH 5.66 6.20, incubation temperature is 32.21 33.87oC, antibacterial activity of bacterocin obtained 3733.33 AU/mL with Bacillus sp indicator strain, this result achieved 97.76% compared with model prediction (3818.52 AU/mL) Optimal bacteriocin activity (3733.33 AU/mL) compared with 2.3 times the initial activity of 1600 AU/mL Result of the testing to create bacteriocin preparation The concentration of appropriate ammonium sulfate to precipitate bacteriocin is 70% The precipitated bacteriocin activity (6400AU/mL) is higher than 1.71 times the crude bacteriocin (3733.33 AU/mL), however, retrieval yield of precipitated bacteriocin and 50kDa membrane filtration is 55.71% Bacteriocin activity of lyophilized preparation is 4000AU/g Characteristic of bacteriocin: Bacteriocin activity still active at temperatures 40-80oC L ng k t qu mà t tay làm N u có b t k s chép k t qu nào, tơi s hồn tồn ch u trách nhi m i M CL C M C L C i CÁC T VI T T T v DANH M C B NG vi DANH M C HÌNH viii L IM U NG QUAN 1.1 Bacteriocin 1.1.1 L ch s phát tri n 1.1.2 1.1.3 Phân lo i 1.1.3.1 L p I (Lantibiotic) 1.1.3.2 L p II (Non-Lantibiotic) 1.1.3.3 L p III 1.1.3.4 L p IV 1.1.4 1.1.5 c Quá trình sinh t ng h p bacteriocin 1.1.6 1.1.7 1.1.8 m sinh lý, sinh hóa c a bacteriocin ho Kh ng c a bacteriocin 10 mi n bacteriocin c a t bào ch 10 ng d ng bacteriocin 11 1.2 Vi khu n lactic 12 1.3 Các y u t 1.4 Các nghiên c n s sinh t ng h p bacteriocin 14 c 15 1.4.1 Các nghiên c c 15 1.4.2 Các nghiên c c 19 T LI 22 121 i v i ch ng ch th Bacillus sp i v i ch ng ch th Salmonella sp 122 Ph l c 11: nh ng c a Pepton (g/L) bacteriocin Bacillus sp bacteriocin Salmonella sp ng n ho t tính bacteriocin 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 3200 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 800 800 800 400 800 800 800 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 400 i v i ch ng ch th Bacillus sp i v i ch ng ch th Salmonella sp 123 Ph l c 12: nh ng c a Cao th t (g/L) bacteriocin Bacillus sp bacteriocin Salmonella sp ng cao th n ho t tính bacteriocin 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 3200 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 1600 1600 3200 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 400 800 800 800 800 1600 800 800 1600 1600 400 800 800 800 800 i v i ch ng ch th Bacillus sp 124 i v i ch ng ch th Salmonella sp Ph l c 13: nh ng c a NaCl (g/L) bacteriocin Bacillus sp bacteriocin Salmonella sp ng n ho t tính bacteriocin 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 1600 1600 1600 3200 1600 800 800 800 1600 1600 3200 1600 1600 1600 1600 800 800 800 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 i v i ch ng ch th Bacillus sp 125 i v i ch ng ch th Salmonella sp Ph l c 14: nh ng c Glucose (g/L) bacteriocin Bacillus sp bacteriocin Salmonella sp n ho t tính bacteriocin 1600 1600 1600 1600 3200 800 800 800 800 800 3200 3200 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 3200 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 800 800 1600 1600 1600 1600 800 800 800 800 400 126 i v i ch ng ch th Bacillus sp i v i ch ng ch th Salmonella sp 127 Ph l c 15: nh ng c Cao n m men (g/L) bacteriocin Bacillus sp bacteriocin Salmonella sp ng cao n m men n ho t tính bacteriocin 1600 3200 1600 1600 1600 800 1600 800 800 800 3200 3200 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 3200 3200 3200 3200 1600 1600 1600 1600 1600 1600 3200 1600 1600 1600 3200 1600 1600 1600 1600 1600 3200 1600 1600 1600 1600 1600 1600 800 800 800 i v i ch ng ch th Bacillus sp 128 i v i ch ng ch th Salmonella sp Ph l c 16: Sàng l c y u t theo thi t k Plackett- Burman i v i ch ng ch th Bacillus sp 129 i v i ch ng ch th Salmonella sp 130 Ph l c 17: T u ki X lý k t qu v i ch ng ch th Bacillus sp ng b m t 131 132 133 X lý k t qu v i ch ng ch th Salmonella sp 134 LÝ L CH TRÍCH NGANG H tên: Nguy n Th o ng Nam a ch liên l c: B392A1, T 8, Khu ph n, Qu n 12, Tp H Chí Minh O 09/2005 01/2010: h ih ct ih ih ng, Chuyên ngành Công ngh Th c ph m 09/2011 nay: h c cao h c t i h c Bách Khoa Tp H Chí Minh, Chun ngành Cơng ngh Sinh h c Q TRÌNH CƠNG TÁC 09/2010 08/2011: làm vi c t i Công ty CPHH Vedan Vi t Nam 09/2011 nay: làm vi c t i h c Công Nghi p Tp H Chí Minh ... o sát, sàng l c t b p vi khu n probiotic th nghi m t o ch ph m sinh h c." N i dung c tài: Sàng l c ch ng vi khu n có kh t p vi khu n probiotic ng h p bacteriocin cao t b nh danh ch ng sàng l Sàng. .. TÀI: Kh o sát, sàng l c t b t p vi khu n probiotic th nghi m t o ch ph m sinh h c II NHI M V VÀ N I DUNG: Tuy n ch n ch ng vi khu n có kh bacteriocin cao, t y ut n trình t ng h p bacteriocin. .. h p bacteriocin cao t LAB p vi khu n probiotic 2.3.1.1 lý thuy t h d a kh i kháng gi a vi sinh v t ki m nh vi sinh v t ch th L1 2.3.1.2 L28 B trí thí nghi m Ti n hành thí nghi m v i vi sinh