Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β galactosidase và khảo sát một số đặc tính enzyme từ bộ sưu tập vi khuẩn lactic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN NGỌC DUY TUYỂN CHỌN, TỐI ƯU MÔI TRƯỜNG – ĐIỀU KIỆN LÊN MEN β-GALACTOSIDASE VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH ENZYME TỪ BỘ SƯU TẬP VI KHUẨN LACTIC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2014 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Cán chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hữu Phúc Cán chấm nhận xét 2: TS Phan Ngọc Hòa Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 15 tháng 08 năm 2014 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Chủ tịch: PGS TS Nguyễn Tiến Thắng Thư ký: Phản biện 1: Phản biện 2: Ủy viên: TS Hoàng Văn Hoàng TS Nguyễn Hữu Phúc TS Phan Ngọc Hòa PGS TS Nguyễn Thúy Hương Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KTHH ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN NGỌC DUY MSHV: 12310725 Ngày, tháng, năm sinh: 12/03/1989 Nơi sinh: Thành phố Hồ Chí Minh Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.80 I TÊN ĐỀ TÀI: “Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β-galactosidase khảo sát số đặc tính enzyme từ sưu tập vi khuẩn lactic” II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao  Tối ưu mơi trường lên men β-galactosidase sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD)  Tối ưu số điều kiện lên men β-galactosidase  Khảo sát số đặc tính enzyme β-galactosidase bước đầu thăm dò khả ứng dụng enzyme tạo sữa nghèo lactose III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 24/06/2013 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 23/05/2014 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn đến đoạn đường này, thật biết ơn khắc ghi giúp đỡ người sau: Đầu tiên, cho em gửi đến cô, PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, người thầy hướng dẫn, dạy dỗ đồng hành chúng em, từ ngày tháng học đại học mong muốn sau Người cho chúng em chữ, kinh nghiệm làm việc mà giúp đỡ, tình cảm cô dành cho chúng em Em thật biết ơn tất thầy cô, người truyền đạt kiến thức chuyên ngành, dẫn tận tình giúp đỡ suốt trình học làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ hỗ trợ nhiệt tình cán phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Em xin cảm ơn anh Tính, chị Phúc, anh Hiệp, chị Kim, chị Như, Chị Hiền, chị Hịa… Mình xin cảm ơn bạn Trung, Kỳ Văn, Thiện, Khánh Vân, em Tú, Thanh… Những người bạn đồng hành, giúp đỡ nhiều công việc, chia sẻ bao nhiều niềm vui chuyện buồn Em xin gửi đến thầy cô phản biện, thầy cô hội đồng dành thời gian quý báu để đọc nhận xét luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ, gia đình Pé Những người quan trọng động viên tinh thần hỗ trợ mặt để an tâm thực đề tài Lời cuối, lần xin gửi đến tất người yêu thương biết ơn chân thành i TÓM TẮT LUẬN VĂN Enzyme β-galactosidase loại enzyme quan trọng sử dụng trình chế biến sản phẩm từ sữa Ngồi ra, enzyme cịn có nhiều ứng dụng khác lĩnh vực cơng nghiệp, y học, thực phẩm… Do đó, cần phải có nguồn thu enzyme với số lượng lớn, thời gian sản xuất ngắn, hoạt tính cao, ổn định phù hợp với việc sản xuất quy mô công nghiệp Trong nghiên cứu này, với đề tài “Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β-galactosidase khảo sát số đặc tính enzyme từ sưu tập vi khuẩn lactic”, thực nhằm mục đích sàng lọc để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao; tiến hành tối ưu mơi trường điều kiện lên men thu nhận enzyme cách sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm (RSM-CCD); sau đó, nghiên cứu số đặc tính enzyme β-galactosidase thu bước đầu đánh giá khả ứng dụng enzyme tạo sản phẩm sữa nghèo lactose Kết thu được, sưu tập bảy chủng vi khuẩn lactic định danh bảo quản đông sâu, tuyển chọn chủng Lactobacillus acidophlus AS186 cho kết hoạt tính β-galactosidase cao Ma trận Plackett-Burman đánh giá mức độ ảnh hưởng thành phần môi trường MRS cảm ứng q trình lên men β-galactosidase; theo lactose, cao nấm men tri-ammonium citrate ba thành phần có tác động cao Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng phương án cấu trúc có tâm (RSM-CCD) tìm giá trị tối ưu lactose 27,89 g/L; cao nấm men 11,81 g/L tri-ammonium citrate 4,91 (g/L) cho hoạt tính enzyme cao theo mơ hình 27,66 U/100 mL Đồng thời, kết thực nghiệm cho hoạt tính enzyme 28,18 U/100 mL sau 24 lên men, đạt độ tương đồng cao so với mơ hình Tuy nhiên, hoạt tính enzyme β-galactosidase cao đạt 28,42 U/100 mL sau 20 lên men điều kiện lên men tối ưu: tỷ lệ cấy giống 5% (v/v); pH ban đầu môi trường lên men 6,5-7,0 nhiệt độ lên men 32°C Một số đặc tính enzyme β-galactosidase từ chủng Lb acidophilus AS186 khảo sát cho kết quả: pH ii tối ưu 6,6-7,4; nhiệt độ phản ứng tối ưu 35-37°C; ion Mg2+ 1-10 mM giúp làm tăng hoạt tính enzyme số động học Michaelis-Menten Vmax Km xác định 1,71 μmol/phút 1,66 mM Sau đó, chế độ bảo quản enzyme khảo sát, kết xác định chế phẩm bảo quản lạnh đông enzyme β-galactosidase glycerol cho hiệu cao với hoạt tính enzyme cịn lại sau bốn tuần đạt 70,04% so với ban đầu Trong thí nghiệm thăm dò khả ứng dụng enzyme β-galactosidase thu nhận từ chủng Lb acidophilus AS186 tạo sữa nghèo lactose, kết xác định enzyme β-galactosidase cho hiệu suất thủy phân lactose đạt 69,95% sản phẩm sữa nghèo lactose thử nghiệm đảm bảo tiêu hóa lý – vi sinh iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzyme β-galactosidase 1.1.1 Hiện tượng không dung nạp lactose 1.1.2 Giới thiệu enzyme β-galactosidase 1.1.3 Thủy phân lactose enzyme β-galactosidase 1.1.3.1 Cơ chế phản ứng 1.1.3.2 Thủy phân lactose sữa enzyme 1.1.3.3 Thủy phân lactose whey enzyme 1.1.4 Nguồn thu nhận enzyme β-galactosidase 1.1.5 Ứng dụng enzyme β-galactosidase 1.1.5.1 Ứng dụng β-galactosidase công nghiệp sản xuất sản phẩm từ sữa 1.1.5.2 Ứng dụng β-galactosidase công nghiệp 1.1.5.3 Sản xuất Galacto-oligosaccharide β-galactosidase 10 1.1.5.4 Ứng dụng β-galactosidase y học 11 1.2 Vi khuẩn lactic 12 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 12 1.2.2 Nhóm Lactobacillus 13 1.2.3 Vai trò sinh tổng hợp hợp chất sinh học vi khuẩn lactic thực phẩm 14 iv 1.2.4 Khả hấp thu lactose chủng probiotic Lactobacillus 16 1.2.5 Cơ chế vận chuyển lactose vi khuẩn lactic 16 1.3 Một số phương pháp phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme 17 1.3.1 Các phương pháp học 18 1.3.1.1 Phương pháp nghiền 18 1.3.1.2 Phương pháp đồng hóa 19 1.3.1.3 Phương pháp sóng siêu âm 20 1.3.2 Các phương pháp học 20 1.3.2.1 Phương pháp vật lý (sốc thẩm thấu) 20 1.3.2.2 Phương pháp hóa học 21 1.3.2.3 Phương pháp sinh học 21 1.4 Các hướng nghiên cứu liên quan đến đề tài 22 1.4.1 Một số giống vi khuẩn lactic sinh tổng hợp β-galactosidase 22 1.4.2 Tối ưu thành phần môi trường điều kiện lên men β-galactosidase 23 1.4.3 Ứng dụng enzyme β-galactosidase tạo sản phẩm sữa nghèo lactose 26 CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 28 2.1 Địa điểm – Thời gian thực 28 2.2 Vật liệu – Hóa chất – Thiết bị – Môi trường 28 2.2.1 Giống vi sinh vật 28 2.2.2 Hóa chất 28 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 28 2.2.4 Môi trường 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 29 2.3.2 Nội dung nghiên cứu 30 2.3.2.1 Khảo sát đặc điểm đại thể – vi thể chủng vi khuẩn lactic 30 2.3.2.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao 30 v 2.3.2.3 Xác định vị trí β-galactosidase tế bào vi khuẩn lactic 31 2.3.2.4 Tối ưu phương pháp phá vỡ tế bào sóng siêu âm 32 2.3.2.5 Tối ưu số thành phần môi trường MRS cảm ứng β-galactosidase theo phương pháp cổ điển – tối ưu đơn yếu tố 32 2.3.2.6 Tối ưu thành phần môi trường MRS cảm ứng lên men β-galactosidase từ chủng Lb acidophilus AS186 sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm 34 2.3.2.7 Tối ưu điều kiện lên men β-galactosidase từ chủng Lb acidophilus AS186 38 2.3.2.8 Nghiên cứu số đặc tính enzyme β-galactosidase 39 2.3.2.9 Khảo sát chế độ bảo quản chế phẩm enzyme β-galactosidase 40 2.3.2.10 Bước đầu khảo sát khả ứng dụng enzyme β-galactosidase tạo sữa nghèo lactose 40 2.3.3 Phương pháp phân tích 40 2.3.3.1 Phương pháp vi sinh 40 2.3.3.2 Phương pháp hóa lý 42 2.3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 47 CHƯƠNG KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 48 3.1 Đặc điểm đại thể – vi thể chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu 48 3.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase 50 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β-galactosidase cao 52 3.3.1 Đường cong sinh trưởng Lb casei VTCC 186 Lb acidophilus AS186 môi trường MRS 52 3.3.1.1 Đường tương quan tuyến tính OD mật độ tế bào vi sinh vật 52 3.3.1.2 Đường cong sinh trưởng Lb casei VTCC 186 Lb acidophilus AS186 53 3.3.2 Đường cong sinh trưởng đường cong hoạt tính β-galactosidase Lb casei VTCC 186 Lb acidophilus AS186 môi trường MRS cảm ứng 55 3.3.2.1 Đường tương quan tuyến tính OD mật độ tế bào vi sinh vật 55 vi 3.3.2.2 Đường cong sinh trưởng hoạt tính β-galactosidase Lb casei VTCC 186 Lb acidophilus AS186 57 3.4 Xác định vị trí β-galactosidase tế bào Lactobacillus acidophilus AS186 60 3.5 Tối ưu phương pháp phá vỡ tế bào thu β-galactosidase sóng siêu âm 61 3.5.1 Khảo sát lượng phát sóng siêu âm 61 3.5.2 Khảo sát chế độ xử lý 62 3.6 Tối ưu số thành phần môi trường MRS cảm ứng β-galactosidase theo phương pháp cổ điển – tối ưu đơn yếu tố 64 3.6.1 Tối ưu nồng độ lactose cho trình lên men β-galactosidase 64 3.6.2 Tối ưu nồng độ glucose cho trình lên men β-galactosidase 65 3.6.3 Tối ưu nồng độ peptone cho trình lên men β-galactosidase 66 3.6.4 Tối ưu nồng độ cao thịt cho trình lên men β-galactosidase 67 3.6.5 Tối ưu nồng độ cao nấm men cho trình lên men β-galactosidase 68 3.6.6 Tối ưu nồng độ tri-ammonium citrate cho trình lên men β-galactosidase 69 3.6.7 Tối ưu nồng độ CH3COONa.H2O cho trình lên men β-galactosidase 70 3.7 Tối ưu thành phần môi trường MRS cảm ứng lên men β-galactosidase từ chủng Lactobacillus acidophilus AS186 sử dụng ma trận Plackett-Burman phương pháp bề mặt đáp ứng – thiết kế cấu trúc có tâm 70 3.7.1 Sàng lọc thành phần môi trường quan trọng theo ma trận Plakett-Burman 71 3.7.2 Tối ưu giá trị ba yếu tố theo phương pháp bề mặt đáp ứng thiết kế cấu trúc có tâm 74 3.8 Tối ưu số điều kiện lên men β-galactosidase từ chủng Lactobacillus acidophilus AS186 82 3.8.1 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống 82 3.8.2 Ảnh hưởng pH ban đầu môi trường lên men 84 3.8.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên men 85 3.9 Khảo sát lại thời gian lên men β-galactosidase môi trường điều kiện lên men tối ưu chủng Lactobacillus acidophilus AS186 87 vii ... Học Mã số: 60.42.80 I TÊN ĐỀ TÀI: ? ?Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β- galactosidase khảo sát số đặc tính enzyme từ sưu tập vi khuẩn lactic? ?? II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:  Tuyển chọn... hợp với vi? ??c sản xuất quy mô công nghiệp Trong nghiên cứu này, với đề tài ? ?Tuyển chọn, tối ưu môi trường – điều kiện lên men β- galactosidase khảo sát số đặc tính enzyme từ sưu tập vi khuẩn lactic? ??,... β- galactosidase khảo sát số đặc tính enzyme từ sưu tập vi khuẩn lactic? ?? thực nhằm mục đích sàng lọc để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính β- galactosidase cao từ số chủng vi khuẩn lactic Tiến