Nghiên cứu tinh sạnh pectinase từ canh trường aspergillus ficuum và khảo sát một số đặc tính của chế phẩm thu được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -O0O - NGUYỄN VÂN NGỌC PHƯNG Đề tài NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PECTINASE TỪ CANH TRƯỜNG ASPERGILLUS FICUUM VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mà SỐ NGÀNH : 2.11.00 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2002 CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học : PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU TS LÊ VĂN VIỆT MẪN Người chấm nhận xét : TS TRỊNH THỊ HỒNG Người chấm nhận xét : TS NGUYỄN KÍNH Luận văn thạc só bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ngày tháng năm 2002 LỜI CẢM ƠN Chân Thành Cám Ơn Cô Đồng Thị Thanh Thu, thầy Lê Văn Việt Mẫn nhiệt tình hướng dẫn truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực luận văn Quý Thầy, Cô môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách khoa TP Hồ Chí Minh trang bị kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho học tập năm qua Thành thật cám ơn Các anh, chị cán phòng thí nghiệm giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành thí nghiệm Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Tiền Giang tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực luận văn Gửi lời chào thân đến bạn học viên cao học khóa 10 thảo luận, ủng hộ, động viên thời gian thực luận văn ABSTRACT In this study, some technological parameters of the pectinase extraction and precipetation from the Aspergillus ficuum surface culture were determined The enzyme extraction can be carried out by the culture/water ratio 1/3 in 60 minutes with continious agitation Absolute ethanol can precipitate 78% pectinase from the enzyme aqueous solution and specific activity of the precipitated enzyme is about 0,22 units/mg protein The enzymes were then purified by gel filtration (Sephadex G-75), peak with hight pectinase activity were observed The pH and temperature optimum of the produced pectinases were also determined (pHopt =4,4, topt = 450C) Pectinase application to fruit juice treatment in order to reduce the pectin quanltily in juice gave the good effect MUÏC LỤC Trang Danh mục bảng - Danh mục hình Lời mở đầu - PHAÀN I: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT Khái niệm chung enzym 1.1 Định nghóa - 1.2 Hoạt tính enzym - 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym - Pectin - 2.1 Giới thiệu 2.2 Cấu tạo pectin 2.3 Tính chất pectin Enzym pectinase 10 3.1 Phân loại enzym pectinase 10 3.2 Cơ chế tác dụng enzym pectinase 12 Pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật điều kiện sinh tổng hợp enzym 17 4.1 Enzym pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vaät 17 4.2 Điều kiện sinh tổng hợp enzym pectinase vi sinh vật 19 Trích ly làm chế phẩm enzym -21 5.1 Trích ly enzym từ môi trường rắn -21 5.2 Kết tủa enzym 22 5.3 Loïc gel 24 5.4 Các phương pháp khác 27 Ứng dụng enzym pectinase -28 6.1 Ứng dụng sản xuất nước 28 6.2 Ứng dụng sản xuất rượu vang -29 6.3 Ứng dụng trích ly dược liệu đông y 29 6.4 Ứng dụng sản xuất sợi đay, gay -30 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu -31 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc -32 Sơ đồ nghiên cứu 32 Phương pháp tách chiết tinh enzym -34 4.1 Trích ly enzym 34 4.2 Kết tủa enzym 34 4.3 Phương pháp lọc gel Sephadex 36 Xác định ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt tính enzym pectinase38 Ứng dụng chế phẩm pectinase làm giảm hàm lượng pectin nước ép trái -39 Phương pháp phân tích 40 7.1 Xác định hoạt tính enzym pectinase phương pháp so màu 40 7.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry -42 7.3 Xác định hoạt tính riêng 44 7.4 Xác định mức độ tinh 44 7.5 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến -44 7.6 Xác định hàm lượng pectin nguyên liệu -46 7.7 Xác định độ nhớt nước ép trái 47 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát trình sinh tổng hợp hệ enzym pectinase theo thời gian -48 Trích ly enzym 49 2.1 Xác định tỷ lệ canh trường/dung môi (nước) thời gian trích ly tối ưu -49 2.2 Ảnh hưởng pH đến trình trích ly enym 52 Kết tủa enzym 53 3.1 Bằng dung môi hữu -53 3.2 Kết tủa enzym polyetylenglycol 58 3.3 Kết tủa enzym muối sulfat amon 60 Phân đoạn chế phẩm enzym PC phương pháp lọc gel Sephadex G-75 65 Xác định ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt tính enzym pectinase 68 5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền enzym 68 5.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính độ bền enzym 71 Ứng dụng enzym pectinase -74 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luaän 77 Đề nghị -78 Tài liệu tham khaûo -79 DANH MUÏC CÁC BẢNG Trang Bảng Tính chất vài enzym pectinase từ thực vật vi sinh vật -12 Bảng Tính chất enzym pectinesterase -13 Bảng Tính chất enzym endopolygalacturonase -15 Bảng Tính chất enzym polygalacturonatlyase 17 Baûng Khaû sinh tổng hợp loại enzym pectinase vi sinh vật -18 Bảng Bản chất lưới lọc gel 25 Bảng Pha dung dịch đệm phosphat -39 Bảng Hàm lượng chất khô dung dịch theo thời gian trích ly -50 Bảng Hoạt tính enzym pectinase trích ly tỷ lệ canh trường/dung môi khác - 51 Baûng 10 Hoạt tính hàm lượng protein dung dịch trích ly giá trị pH khác -52 Bảng 11 Hiệu suất thu hồi enzym tủa cồn tuyệt đối 54 Bảng 12 Hiệu suất thu hồi enzym tủa isopropanol 55 Baûng 13 Hiệu suất thu hồi enzym tủa aceton -55 Bảng 14 Hàm lượng protein chế phẩm thu kết tủa enzym dung môi hữu với tỷ lệ khaùc 56 Bảng 15 Hoạt tính chế phẩm sau kết tủa PEG 58 Bảng 16 Hiệu suất thu hồi enzym tủa muoái sulfat amon -61 Bảng 17 Độ tinh chế phẩm tủa tác nhân khác -62 Bảng 18 Hoạt tính riêng enzym số phân đoạn sau qua cột gel 67 Bảng 19 Độ tinh pectinase qua bước thí nghiệm -68 Bảng 20 Kết khảo sát phụ thuộc hoạt tính enzym theo nhiệt độ 69 Bảng 21 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính enzym 70 Baûng 22 Kết khảo sát hoạt tính enzym giá trị pH khác -72 Bảng 23 Ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính enzym 73 Bảng 24 Sự thay đổi độ nhớt tương đối nước ổi trình xử lý enzym 75 Baûng 25 Sự thay đổi hàm lượng pectin dịch sau xử lý enzym -76 -1- DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Các đơn vị cấu tạo hợp chất pectin - Hình Những phân đoạn phân tử pectin điểm công enzym pectinesterase 13 Hình Sự kết hợp ion Ca++ với acid pectic để tạo thành kết tủa Ca-pectat 14 Hình Sự xúc tác trình thủy phân enzym polygalacturonase treân acid pectic -15 Hình Sự phân hủy pectin enzym pecticlyase 16 Hình Sự phân tách phân tử phương pháp lọc gel 24 Hình Sơ đồ nghiên cứu 33 Hình Quy trình kết tủa enzym muối sulfat amon thẩm tích -35 Hình Sắc ký lọc gel 37 Hình 10 Đồ thị biểu diễn trình sinh tổng hợp pectinase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt 48 Hình 11 Sự thay đổi hàm lượng protein dung dịch trình trích ly 50 Hình 12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ canh trường/ dung môi đến trình trích ly enzym pectinase 51 Hình 13 Ảnh hưởng pH đến trình trích ly enzym pectinase -53 Hình 14 Hiệu suất thu hồi enzym pectinase trình tủa dung môi hữu -56 Hình 15 Hoạt tính riêng chế phẩm thu kết tủa enzym dung môi hữu khác -57 Hình 16 Ảnh hưởng nồng độ PEG đến hiệu suất thu hồi enzym hoạt tính riêng chế phẩm 59 Hình 17 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi enzym cao sử dụng tác nhân tủa khác -62 Hình 18 Quy trình tách chiết enzym pectinase -64 -2- Hình 19 Chế phẩm enzym pectinase PC sau qua cột lọc gel Sephadex - G75 -66 Hình 20 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) vào nhiệt độ 69 Hình 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) - 71 Hình 22 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) vào pH 72 Hình 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến ổn định hoạt tính enzym pectinase (chế phaåm PC) 74 Hình 24 Đồ thị biểu diễn giảm độ nhớt nước ổi trình xử lý enzym 75 -3- 0.14 0.36 Độ hấp thu bước sóng 280 nm Hoạt tính enzym 0.32 0.12 0.1 0.28 0.24 0.2 0.08 0.06 0.16 0.12 Hoạt tính enzym (đvht/ml) OD 280nm 0.4 0.04 0.08 0.02 0.04 0 10 20 30 40 Số thứ tự phân đoạn 50 Hình19: Chế phẩm enzym pectinase PC sau qua cột lọc gel Sephadex – G75 Từ hình 18 nhận thấy , chế phẩm PC sau qua lọc gel cho đỉnh có độ hấp thu cao đo bước sóng λ = 280nm ( phân đoạn số 5, 7, 17, 20, 24, 32, 42) đỉnh có hoạt tính cao, cụ thể (phân đoạn số [0,02 đvht/ml], phân đoạn số 17 [0,0996 đvht/ml], phân đoạn 20 [0,11455 đvht/ml], phân đoạn 33 [0,047 đvht/ml]) Riêng peak cuối cùng, chiếm diện tích lớn [ từ phân đoạn 38 đến phân đọan 48] có độ hấp thu tương đối cao hoạt tính enzym thấp (0,005) Có lẽ peak chứa protein phi enzym tạp chất lạ khác - 66 - Bảng 18: Hoạt tính riêng enzym số phân đoạn sau qua cột gel Đỉnh Hoạt tính Hàm lượng Hoạt tính riêng (đvht/ml) protein (mg/ml) (đvht/mg protein) 0,008 0,056 0,142 0,02 0,056 0,357 0,0996 0,4076 0,244 0,1145 0,3136 0,365 0,03 0,086 0,348 0,047 0,0876 0,536 0,005 0,166 0,03 2,948 13,26 0,223 (Phân đoạn 5) Đỉnh (Phân đoạn 7) Đỉnh3 (Phân đoạn 17) Đỉnh (Phân đoạn 20) Đỉnh (Phân đoạn 24) Đỉnh (Phân đoạn 33) Đỉnh (Phân đoạn 42) Dịch enzym trước qua lọc gel Nhận xét: Sau trình lọc gel ta thấy, hoạt tính riêng số phân đoạn lớn hoạt tính riêng chế phẩm enzym chưa qua lọc gel (đỉnh 2, 3, 4, 5, 6) Riêng đỉnh có hoạt tính riêng cao (0,536 đvht/ mg protein-enzym)- cao gấp 2,4 lần so với chế phẩm enzym chưa qua lọc gel Như phân đoạn có chứa enzym có độ tinh cao bao gồm protein enzym có phân tử lượng - 67 - trung bình so sánh với phân tử lượng protein khác có chế phẩm PC Bảng 19:Độ tinh pectinase qua bước thí nghiệm Bước tinh Hoạt tính riêng Mức độ tinh (đvht/mg protein) Dịch enzym trích ly từ 0,044 Tủa cồn tuyệt đối 0,223 5,068 Lọc gel 0,536 12,180 canh trường nấm mốc (Phân đoạn 33- đỉnh 6) Từ bảng trên, nhận thấy sau qua bước thí nghiệm mức độ tinh tăng lên, cụ thể qua lọc gel tăng lên gấp 12,18 lần so với dịch trích ly enzym ban đầu Do kết luận phương pháp lọc gel phương pháp hữu hiệu để tinh enzym Tuy nhiên nghiên cứu chưa xác định cụ thể tên enzym chế phẩm PC tương ứng với peak kết lọc gel khối lượng phân tử chúng XÁC ĐỊNH SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYM PECTINASE: 5.1 nh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính độ bền enzym: 5.1.1 Xác định nhiệt độ tối ưu chế phẩm pectinase (chế phẩm PC): Hầu hết enzym hoạt tính nhiệt độ t0 >700C Ta thử khảo sát hoạt tính chế phẩm PC nhiệt độ 20â, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,700C ** Tiến hành: Cân 1g enzym chế phẩm PC pha 100ml nước cất - 68 - Lấy 10 ml dung dịch enzym 1% đem thử hoạt tính phương pháp so màu nhiệt độ khác Bảng 20: Kết khảo sát phụ thuộc hoạt tính enzym theo nhiệt độ Hoạt tính (đvht/g chế phẩm) Nhiệt độ (0C) 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Hoạt tính (đvht/ g chế phẩm) 11,45 17,7 19,61 21,16 23,56 22,74 21,38 18,66 14,2 26 22 18 14 10 20 30 40 50 60 70 Nhiệt độ C Hình20: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) vào nhiệt độ Kết luận: Dựa kết khảo sát, nhận thấy hoạt tính enzym pectinase cao 450C Do kết luận, nhiệt độ tối ưu enzym pectinase sinh tổng hợp từ loài Asp ficuum 450C Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu - 69 - trước giới thiệu phần tổng quan Thông thường chế phẩm pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật có nhiệt độ tối ưu nằm khoảng 40- 450C 5.1.2 nh hưởng nhiệt độ đến độ bền enzym: Tiến hành khảo sát độ bền enzym nhiệt độ khác 35, 45, 55, 650C khoảng thời gian Giữ dung dịch enzym 1% nhiệt độ khác trên, lấy 10 ml dung dịch enzym 1% đem thử hoạt tính phương pháp so màu Bảng 21: Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính enzym Thời gian (giờ) 19,80 19,62 19,54 19,30 19,01 100 99,09 98,68 97,47 96,01 23,89 23,56 23,21 22,94 22,22 100 98,62 97,15 96,02 93,00 20,91 18,79 17,16 16,28 14,92 100 89,86 82,06 77,85 71,35 20,02 10,17 8,21 7,25 6,01 100 50,79 41,00 36,21 30,00 Nhiệt độ 0C Hoạt tính enzym (đvht/g) 35 % Hoạt tính lại Hoạt tính 45 enzym (đvht/g) % Hoạt tính lại Hoạt tính 55 enzym (đvht/g) % Hoạt tính lại Hoạt tính 65 enzym (đvht/g) % Hoạt tính lại - 70 - %Hoạt tính laïi 95 85 35 75 45 65 55 55 65 45 35 25 Thời gian (giờ) Hình 21 : Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) Từ hình 21, nhận thấy nhiệt độ 350C 450C hoạt tính enzym tương đối ổn định sau giờ, hoạt tính lại khoảng 93-96% so với hoạt tính ban đầu Nhưng nhiệt độ 650C, hoạt tính enzym giảm nhanh Sau hoạt tính pectinase dung dịch lại khỏang 50% sau lại 30% so với hoạt tính ban đầu 5.2 nh hưởng pH đến hoạt tính độ bền enzym: 5.2.1 Xác định pH tối ưu chế phẩm pectinase (chế phẩm PC): Khi nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzym, sử dụng khoảng pH nghiên cứu từ 2,2 đến 7,0 Pha dung dịch enzym 1% (chế phẩm enzym PC) dung dịch đệm khác có giá trị pH nằm khoảng từ 2,2-7.0 Lấy 10 ml dung dịch enzym dung dịch đệm đem thử hoạt tính phương pháp so màu Dung dịch chất pectin 1% pha dung dịch đệm có giá trị pH khác tương ứng Kết thực nghiệm thu được: - 71 - Bảng 22:Kết khảo sát hoạt tính enzym giá trị pH khác Hoạt tính (đvht/g chế phẩm) PH 2,2 3,4 4,0 4,4 5,0 6.0 7,0 Hoạt tính (đvht/ g chế phaåm) 16,96 17,77 21,38 25,25 26,48 24,16 23,08 16,28 30 26 22 18 14 10 pH Hình 22: Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) vào pH Kết luận: Dựa kết khảo sát, nhận thấy hoạt tính enzym pectinase cao pH =4,4 Do kết luận, pH tối ưu enzym pectinase sinh tổng hợp từ loài Asp ficuum 4,4 Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước giới thiệu phần tổng quan Hầu hết chế phẩm pectinase từ vi sinh vật có pH tối ưu nằm vùng acid yếu - 72 - 4.2.2 nh hưởng pH đến độ bền enzym Tiến hành khảo sát độ bền enzym pH khác 3,4,5,6 khoảng thời gian Pha dung dịch enzym 1% dung dịch đệm có giá trị pH 3,4,5,6 Giữ enzym dung dịch đệm khoảng thời gian giờ, 1giờ lấy 10 ml dung dịch enzym 1% đem thử hoạt tính phương pháp so màu Bảng 23: Ảnh hưởng pH đến độ bền hoạt tính enzym Thời gian (giờ) Hoạt tính 16,41 16,14 15,66 15,46 14,92 100 98,35 95,42 94,21 90,92 25,25 25,12 24,69 24,26 23,94 100 99,48 97,78 96,09 94,09 24,57 24,35 24,00 23,66 23,46 100 99,11 97,69 96,31 95,48 23,49 23,21 22,74 22,54 22,26 100 98,81 96,80 95,95 94,76 enzym (ñvht/g) pH =3 % Hoạt tính lại Hoạt tính enzym (đvht/g) pH =4 % Hoạt tính lại Hoạt tính enzym (đvht/g) pH =5 % Hoạt tính lại Hoạt tính enzym (đvht/g) pH =6 % Hoạt tính lại - 73 - % Hoạt tính lại 100 90 80 pH=3 70 pH=4 pH=5 60 pH=6 50 Thời gian (giờ) Hình 23: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến ổn định hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC) Từ đồ thị nhận thấy khoảng thời gian khảo sát khoảng hoạt tính enzym tương đối bền giá trị pH Sau hoạt tính giảm khoảng từ 4-10% so với hoạt tính ban đầu ỨNG DỤNG ENZYM PECTINASE : 6.1 Khảo sát trình sử dụng chế phẩm pectinase xử lý nước ổi ép nhằm mục đích làm giảm độ nhớt dịch quả: Nước ổi tươi có pH = 4,42 Hàm lïng chất khô: 6,80 brix Thể tích nước ổi dùng thí nghiệm 50 ml Pha dung dịch chế phẩm enzym PC 1% Bổ sung chế phẩm enzym vào nước ổi với thể tích dịch enzym PC sử dụng 0,08, 0,12, 0,16, 0,2% so với thể tích dung dịch nước ổi nghiên cứu Giữ nước 450C (tạo điều kiện cho enzym hoạt động tốt nhất), 30 phút xác định độ nhớt tương đối nước lần Độ nhớt tương đối tính theo công thức mục 7.7 phần nguyên liệu phướng pháp nghiên cứu Kết thực nghiệm thu được: - 74 - Bảng24: Sự thay đổi độ nhớt tương đối nước ổi trình xử lý enzym (%) Vdd ENZYM Độ nhớt tương đối nước ổi theo thời gian ( phút ) 30 60 90 120 5,63 5,57 5,5 5,45 5,41 0,08 5,63 3,66 3,47 3,38 3,32 0,12 5,63 3,24 3,05 2,95 2,88 0,16 5,63 2,98 2,81 2,76 2,71 0,2 5,63 2,64 2,52 2,45 2,40 VNƯỚC ỔI Mẫu kiểm chứng (0%) Độ nhớt tương đối K iểm chứn g 0.08%Enzym 0.12%Enzym 0.16%Enzym 0.2%Enzym 30 60 90 120 Thời gian (phút ) Hình 24: Đồ thị biểu diễn giảm độ nhớt nước ổi trình xử lý enzym Kết luận: Từ hình 24 nhận thấy, sử dụng chế phẩm enzym PC để thủy phân pectin dịch nước ổi ép, độ nhớt tương đối nước ổi giảm nhanh 30 phút Sau 60 phút xử lý, độ nhớt nước giảm chậm Ta chọn thời gian tối ưu cho phản ứng enzym từ 30 đến 60 phút Việc giảm độ nhớt nước quả, giúp ta rút ngắn thời gian lọc Điều mang lại hiệu kinh tế - 75 - định sản xuất công nghiệp Việc thủy phân pectin – chất có phân tử lượng lớn thành chất có phân tử lượng nhỏ trình xử lý dịch chế phẩm pectinase góp phần làm dịch quả, tăng độ bền hóa lý sản phẩm trình bảo quản sản phẩm 6.2 Xác định hàm lượng pectin nước ổi: Bảng 25: Sự thay đổi hàm lượng pectin dịch sau xử lý enzym (%) Vdd ENZYM VNƯỚC ỔI Lượng pectin lại dịch ổi sau trình xử lý g/ml % so với kiểm chứng Kiểm chứng 0,0298 100 0,08 0,0217 72,8 0,12 0,0172 57,7 0,16 0,0112 37,5 0,2 0,008 26,8 ** Kết luận : Dựa vào bảng 25, nhận thấy hàm lượng pectin nước ép trái giảm nhiều sau trình xử lý nước ổi chế phẩm enzym pectinase thu từ loài nấm mốc Asp ficuum - 76 - KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trình bày trên, có kết luận sau đây: ¾ Thời gian nuôi cấy tối ưu (theo phương pháp bề mặt) để thu nhận enzym pectinase từ Aspergillus ficuum 44 ¾ Các điều kiện kỹ thuật tối ưu để trích ly tinh enzym pectinase để đạt hoạt tính enzym cực đại • Tỷ lệ canh trường/ nước 1:3, thời gian trích ly tối ưu 60 phút, hoạt tính dung dịch enzym thu 1,575 đvht/g canh trường • Sử dụng dung dịch đệm phosphat có pH=3,44 để trích ly cho dung dịch enzym có hoạt tính cao 2,021 đvht/g canh trường ♦ Cồn tuyệt đối (với tỷ lệ dung môi/ dung dịch enzym 80%) tác nhân kết tủa cho hiệu suất thu hồi enzym cao (78%) Khi chế phẩm thu có hoạt tính riêng tương ứng (0,22 đvht/mg protein chế phẩm) ♦ Sử dụng PEG với nồng độ 12% để kết tủa enzym cho hiệu suất thu hồi thấp đạt 29%, enzym thu có hoạt tính riêng cao 1,08 đvht/mg protein-enzym ♦ Khi tủa enzym muối sulfat amon, sau thẩm tích qua túi celophan, độ tinh chế phẩm cao chế phẩm với tác nhân tủa khác (độ tinh tăng 5,5 lần so với chưa kết tủa) ♦ Chế phẩm PC sau qua lọc gel Sephadex G-75 thu peak có hoạt tính pectinase [Riêng phân đoạn thứ 33 có hoạt tính riêng (0,536 đvht/mg proteinenzym) cao gấp 2,4 so với chế phẩm chưa qua lọc gel] ¾ Các tính chất chế phẩm pectinase ♦ Nhiệt độ tối ưu 450C ♦ pH tối ưu 4,4 ¾ Ứng dụng chế phẩm pectinase Sử dụng chế phẩm PC (với thể tích dịch enzym so với thểå tích nước ổi 0,2%) - 77 - để làm giảm độ nhớt dịch ổi Sau 60 phút xử lý enzym, độ nhớt dịch ổi giảm 42,63% so với độ nhớt ban đầu, từ giúp ta rút ngắn thời gian lọc sản xuất nước ổi nâng cao độ bền hóa lý, giá trị cảm quan sản phẩm ĐỀ NGHỊ: Vì thời gian nghiên cứu có hạn, có điều kiện thấy cần tiếp tục nghiên cứu sau ™ Nghiên cứu phương pháp khác tinh enzym pectinase ™ Nghiên cứu xác định thông số kỹ thuật trình sấy chân không, nhằm mục đích giảm lượng ẩm chế phẩm dạng bột ™ Nghiên cứu tìm chất độn thích hợp bổ sung vào chế phẩm dạng bột để bảo quản sản phẩm ™ Nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế phẩm pectinase để làm số nước ép trái (dạng tự nhiên, dạng lên men) ™ Nghiên cứu thăm dò khả tổng hợp pectinase số chủng nấm mốc khác - 78 - TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] NGUYỄN TRỌNG CẨN ( Chủ biên) Công nghệ enzym, NXB Nông nghiệp TPHCM, 1998 [2 ] NGUYỄN HỮU CHẤN Hóa sinh, NXB Y học, 2001 [3] NGUYỄN HỮU CHẤN Enzym xúc tác sinh học, NXB Y học, 1983 [4] LÂM THỊ KIM CHÂU VÀ CÁC CỘNG TÁC Thưc tập lớn sinh hóa, Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiên TPHCM, 1998 [5] PHẠM THỊ TRÂN CHÂU (Chủ biên) Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo dục,1997 [6] NGUYỄN LÂN DŨNG, NGUYỄN ĐÌNH QUYẾN Vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1977 [7] VŨ ĐĂNG KHÁNH Nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase từ số chủng nấm mốc ứng dụng, Luận văn tốt nghiệp, ĐHKHTN TPHCM, 1998 [8] NGUYỄN ĐỨC LƯNG Công nghệ sinh học, Đại học Kỹ thuật, 1998 [9] LÊ VĂN NHƯƠNG Thu nhận ứng dụng chất hoạt động sinh học từ vi sinh vật, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1978 [10] LƯƠNG ĐỨC PHẨM Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội , 1998 [11] LƯƠNG ĐỨC PHẨM – HỒ SƯỞNG, Vi sinh tổng hợp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1978 [12] LÊ THỊ THANH TÂM, Thu nhận enzym pectinase từ số chủng nấm mốc bước đầu tinh chế phẩm enzym, Luận văn tốt nghiệp, ĐHKHTN TPHCM, 2000 [13] LÊ DUY THẮNG, Thực tập lớn vi sinh, Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiênTPHCM, 1998 - 79 - [14] ĐỒNG THỊ THANH THU.Hóa sinh ứng dụng, Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiênTPHCM, 1998 [15] ĐỒNG THỊ THANH THU Sinh hoá , Tủ sách Đại học Khoa học tự nhiênTPHCM, 1998 [16] LÊ NGỌC TÚ, chủ biên Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1997 [17] LÊ NGỌC TÚ cộng tác Enzym vi sinh vật, tập 2, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1982 [18] A.M BEZBOORODOV, NGUYỄN VĂN UYỂN VÀ CÁC TÁC GIẢ Công nghệ sinh học số ứng dụng Việt nam.Tập 2, NXB Nông nghiệp, 1994 [19] FOGARTY, Microbial enzymes and biotechnology, Applied science publishers London & New york, 1983 [20] G.REED and T.W.NAGODAWITHANA, Enzymes, Biomass, Food and Feed, Volum 9, Weinheim.New York Basel Cambridge Tokyo,1991 [21] PAUL R MATHEWSON, Enzymes, Eagan press, 1998 [22]P.F.FOX, Food enzymology, Volum 1, Elsevier Applied,1992 [23]RODOEY F BOYER, Modern experimental biochemistry, The Bejamin/Cummings publishing company, Inc,1993 [24]V.L.KRETOVITS, V.L.IAROVENKO Sử dụng chế phẩm enzym công nghiệp thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật Hà nội, 1982 [25] Tạp chí khoa học công nghệ, tập 36, số 3, 1998 (trang 17-23) - 80 - ... biểu diễn phụ thu? ??c hoạt tính pectinase chế phẩm enzym theo pH, từ xác định pH tối ưu chế phẩm enzym nghiên cứu 5.4 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính pectinase: Tiến hành khảo sát độ bền enzym... yếu tố đến hoạt tính enzym pectinase: Trong nghiên cứu này, thực thí nghiệm với mẫu chế phẩm pectinase trích ly từ canh trường nuôi cấy bề mặt nấm mốc Aspergillus ficuum, sau kết tủa tác nhân... độ tối ưu chế phẩm nghiên cứu 5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền hoạt tính enzym: Tiến hành khảo sát độ bền enzym nhiệt độ khác 35, 45, 55, 650C khoảng thời gian Dựa vào kết thu được,