tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ bacillus subtilis s20

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA ENDOGLUCANASE TỪ BACILLUS SUBTILIS S20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN HÀ CÔNG THẮNG TS. DƢƠNG THỊ HƢƠNG GIANG MSSV: 3092509 LỚP: CNSH TT K35 Cần Thơ, 12/2013 Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Ths. Võ Văn Song Toàn Hà Công Thắng TS. Dương Thị Hương Giang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Trải qua bốn năm học tập rèn luyện trường Đại học Cần Thơ, nhận nhiều quan tâm động viên gia đình, hướng dẫn dạy tận tình quý thầy cô với giúp đỡ nhiệt tình bạn. Với việc hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn Tiến sĩ Dương Thị Hương Giang, hai cán hướng dẫn tận tình dạy, truyền đạt kinh nghiệm quý báu việc thực thí nghiệm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học tận tình giảng dạy, giúp có kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực đề tài. Xin chân thành cảm ơn bạn sinh viên anh chị học viên cao học phòng thí nghiệm Sinh hóa phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme tập thể lớp Công nghệ sinh học tiên tiến Khóa 35 nhiệt tình giúp đỡ chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu suốt thời gian học tập thực đề tài này. Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình người thân động viên, khích lệ ủng hộ mặt vật chất tinh thần suốt thời gian học tập thực đề tài nghiên cứu này. Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 10 tháng 12 năm 2013 Hà Công Thắng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT TÓM LƢỢC Đề tài “Tinh khảo sát số đặc điểm endoglucanase từ Bacillus subtilis S20” thực nhằm mục tiêu thiết lập quy trình tinh endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 xác định số đặc điểm endoglucanase tinh sạch. Dịch nuôi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis S20, sau ủ kỵ khí ngày 38oC, thu nhận ly tâm để loại chất tế bào. Endoglucanase tinh cách tủa phân đoạn với AS sắc ký trao đổi ion gel Uno Sphere Q. Kết quả, bước tủa phân đoạn, hai phân đoạn 70% 80% có hoạt tính riêng cao 105 119 (U/mg), hai phân đoạn giữ lại tinh tiếp tục. Sau qua cột sắc ký, phân đoạn F1 thể hoạt tính riêng cao (720 U/mg) với hàm lượng protein tổng 0,24 mg. Toàn trình tinh đạt hiệu suất độ tinh 24,3 23 lần. Endoglucanase thu đồng phân với trọng lượng phân tử 79,6 kDa 74 kDa. Endoglucanase tinh có nhiệt độ pH tối ưu 60oC 8. Hoạt tính endoglucanase kích hoạt ion K+ (đạt 148% so với mẫu đối chứng 100%) bị bất hoạt ion Cu2+, Fe3+ Mn2+ (hoạt tính lại 41,2%, 51,9% 81,2% so với mẫu đối chứng 100%). Endoglucanase thể hoạt tính cao chất CMC, nhiên, enzyme có hoạt tính avicel giấy lọc không đáng kể. Từ khóa: Bacillus subtilis S20, đặc hiệu chất, endoglucanase, khảo sát, tinh sạch. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ . TÓM LƢỢC i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH .vi TỪ VIẾT TẮT vii CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU .1 1.1. Đặt vấn đề .1 1.2. Mục tiêu đề tài .2 CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát .3 2.1.2. Phân loại .3 2.1.3. Đặc điểm Bacillus subtilis 2.2. Tổng quan Endoglucanase .4 2.2.1. Cấu trúc chế hoạt động endoglucanase 2.2.2. Ảnh hưởng số yếu tố đến hoạt tính endoglucanase 2.2.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ .7 2.2.2.2. Ảnh hưởng pH .7 2.2.2.3. Tính đặc hiệu chất endoglucanase 2.2.2.4. Ảnh hưởng số chất ức chế hoạt hóa .7 2.2.3. Một số đặc điểm khác endoglucanase 2.3. Các phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp kết tủa protein .8 2.3.2. Phương pháp sắc ký Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT 2.3.3. Phương pháp điện di gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) .11 2.3.4.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme .13 2.3.5. Tình hình nghiên cứu nước .13 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Phương tiện nghiên cứu 16 3.1.1. Thời gian địa điểm .16 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị .16 3.1.3. Nguyên vật liệu .16 3.1.4. Hóa chất 16 3.2. Phương pháp nghiên cứu .17 3.2.1. Tinh endoglucanase phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate .17 3.2.2. Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion 17 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh .18 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh 19 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh 19 3.2.6. Khảo sát tính đặc hiệu chất endoglucanase tinh .20 3.3. Xử lý số liệu 20 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1. Tinh endoglucanase phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulphate 21 4.2. Tinh endoglucanase phương pháp sắc ký trao đổi ion .24 4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh 27 4.4. Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh .28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT 4.5. Khảo sát ảnh hưởng số ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh .29 4.6. Khảo sát tính đặc hiệu chất endoglucanase tinh .30 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .31 5.1. Kết luận .31 5.2. Kiến nghị .31 TÀI LIỆU THAM KHẢO .32 PHỤ LỤC . Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Kết tủa phân đoạn với ammonium sulphate 21 Bảng 2. Kết sắc ký gel Uno Sphere Q .24 Bảng 3. Tóm tắt quy trình tinh 26 Bảng 4. Ảnh hưởng số ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh .29 Bảng 5. Tính đặc hiệu chất endogluclanase tinh .30 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Mô hình cấu trúc endoglucanase Hình 2. Cơ chế hoạt động endoglucanase .5 Hình 3. Giản đồ minh họa tâm hoạt động endoglucanase gắn với cellobiose .6 Hình 4. Cơ chế lập thể phản ứng thủy phân cellulose Hình 5. Biểu đồ minh họa trình tủa muối Hình 6. Minh họa sắc ký trao đổi ion 10 Hình 8. Công thức cấu tạo Coomassie Brilliant Blue G-250 12 Hình 9. Kết định tính hoạt tính phân đoạn tủa với AS 22 Hình 10. Kết điện di SDS-PAGE .23 Hình 11. Sắc ký đồ gel Uno Sphere Q .24 Hình 12. Kết định tính endoglucanase tinh 25 Hình 13. Kết điện di SDS-PAGE .25 Hình 14. Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh sạch27 Hình 15. Biểu đồ ảnh hưởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh .28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT APS Ammonium persulfate AS Ammonium sulphate BSA Bovine serum albumin CD Catalytic domain CMC Carboxymetyl cellulose CBD Cellulose binding domain DTT Dithiotheitol IEF Isoelectric focusing NBS N-Bromosuccinimide pI Isoelectric point SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED Tetramethylethylenediamine UB Unbound Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Ogawa, K., D. Toyama, N. Fujii. 1991. Microcrystalline cellulosehydrolyzing cellulase (endo-cellulase) from Trichoderma reesei CDU-11. J Gen Appl Microbiol, Vol. 37, No. 3, pp. 249-259. Park, S. H., H. K. Kim M. Y. Pack. 1991 Characterisation and structure of the cellulase gene of Bacillus subtilis BSE616. Agric Biol Chem, 55, 441 – 448. Puls, J., S.A. Wilson D. Holter. 2010. Degradation of Cellulose Acetate-Based Materials: A Review. J Polym Environ, 19, 152:165. Ryckeboer, J., J. Megaert, J. Coosemans, K. Deprins J. Swings. 2003. Microbiological aspects of biowaste during composting in monitored compost bin. J Appl Microbiol, 94:127-137. Schülein, M. 2000. Protein engineering of cellulases. Acta Biochim Biophys Sin, 1543: 239 – 252. Sukumaran, R.K., Singhania, R.R. Pandey Ashok. 2005. Microbial cellulases Production, applications and challenges. JSIR, 64:832-844. Teather, R. P.T. Wood. 1981. Use the Congo Red-Polysaccharide interaction in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from Bovine rumen. Appl Environ Microbiol , 43: 777-780. Vijayaraghavan, P. S.G.P. Vincent. 2011. Purification and Characterization of Carboxymethyl Cellulase from Bacillus sp. Isolated from a Paddy Field. Pol J Microbiol, 61: 51–55. Wood, T.M. K.M. Bhat. 1988. Methods for measuring cellulose activities. Methods Enzymol, 160:87-112. Yan, H., Y. Dai, Y. Zhang, L. Yan D. Liu. 2011. Purification and characterization of an endo-1,4-β-glucanase from Bacillus cereus. Afr J Biotechnol. 10: 1627716285. Yin, L.J., H.H. Lin Z.R. Xiao. 2010. Purification and characterization of a cellulase from Bacillus subtilis YJ1. J Mar Sci Technol,18:466-471. Sargent, M.G. 1975. Control of Cell Length in Bacillus subtilis. J Bacteriol, 123: 7-19. Zvidzai, C. Johnson. 2012. Isolation and characterisation of a bacteria with cellulase activity from local hot springs. University of Zimbabwe e-Theses. Từ http://ir.uz.ac.zw/jspui/handle/10646/829. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Trang web http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis-va-dac-tinh-tri-lieu-0 (ngày 30/06/2013) Lorie. 2011. The Bacillus Subtilis story. http://rense.com/general4/bac.htm (ngày 30/06/2013) http://discovery.kcpc.usyd.edu.au/9.2.2-short/9.2.2_CellulosetoEthene.html (ngày 15/02/2013) http://www.lsbu.ac.uk/water/hofmeist.html (ngày 10/07/2013) http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences/ products/hydrophobic-interaction-chromatography-hic/ (ngày 12/07/2013) http://www.jkirkbrown.com/images/Hydrop.gif (ngày 12/07/2013) http://congnghesinhhoc24h.com/tai-lieu/thiet-lap-quy-trinh-dien-di-protein-sds-pageva-ung-dung-danh-gia-phan-427.html (ngày 15/07/2013) http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=02051005 (ngày 14/07/2013) http://menvisinh.org/content/bacillus-subtilis (ngày 28/07/2013) http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/gellab3.html (ngày 22/11/2013) http://www.chem.fsu.edu/chemlab/bch4053l/enzymes/activity/index.html (ngày 29/11/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HÓA 1. Phƣơng pháp Bradford a. Chuẩn bị: + Dung dịch BSA chuẩn + Thuốc thử Bradford b. Dựng đường chuẩn BSA: + Chuẩn bị dãy protein BSA với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240, 300μl/ml. + Lấy 100μl dung dịch BSA từ nồng độ trên, cho phản ứng với 2ml thuốc thử, 10 phút. Dung dịch sau phản ứng đo quang phổ bước song 595nm. Mỗi nồng độ thực lần lập lại. + Ghi nhận lại kết tính giá trị trung bình lần lặp lại. + Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (μl/ml) với độ hấp thụ bước sóng 595nm. c. Định lượng protein có mẫu: + Hàm lượng protein mẫu tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn. + Mẫu tiến hành đo đường chuẩn. + Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình ống + Từ phương trình đường chuẩn ta suy hàm lượng protein dung dịch đo. 2. Phƣơng pháp Nelson a. Chuẩn bị + Dung dịch Glucose chuẩn + Thuốc thử đồng + Thuốc thử Arsenomolybdate b. Dựng đường chuẩn glucose + Pha dung dịch glucose với nồng độ sau 0, 36, 72, 108, 144, 180 μg/ml. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT + 150 μl dung dịch glucose nồng độ cho phản ứng với 150 μl dung dịch thuốc thử đồng 100oC 10 phút, để nguội nhiệt độ phòng. + Hỗn hợp thêm tiếp 150 μl dung dịch thuốc thử arsenomolybdate 1ml nước cất, ủ 20oC. Đo quang phổ bước sóng 520nm. Mỗi nồng độ thực lần lặp lại. + Ghi nhận lại kết tính giá trị trung bình lần lặp lại thí nghiệm. + Vẽ đường tuyến tính nồng độ glucose với độ hấp thụ bước sóng 520nm. c. Xác định hoạt tính enzyme + Hỗn hợp enzyme chất (đã đun nóng đến 50oC) với tỉ lệ định. + Ủ 50oC 30 phút + Xác định hàm lượng đường khử sinh tương tự đường chuẩn Mẫu enzyme bất hoạt (được đun nóng đến 100oC) tiến hành song song. + Hoạt tính enzyme xác định theo công thức: Trong đó: U: hoạt tính enzyme (U/ml) X: hàm lượng glucose dung dịch đo T: thời gian phản ứng VE: thể tích enzyme k: hệ số pha loãng * Hoạt tính tƣơng đối: Hoạt tính tương đối xác định công thức sau Khi hoạt tính cao xem 100%. 3. Phƣơng pháp điện di gel polyacrylamide (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE) a. Chuẩn bị gel: gel phân tích 12% gel tập trung 4%. b. Chuẩn bị mẫu protein: Hỗn hợp mẫu sample buffer (đã chuẩn bị sẵn) với tỉ lệ 1:1 eppendorf đun sôi 100oC 10 phút. Để nguội nhiệt phòng. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT c. Đưa mẫu vào giếng: Bơm 10 – 20 μl mẫu vào giếng. d. Chạy điện di: Sau hoàn tất việc load mẫu, tiến hành chạy điện di với d ng điện có cường độ 25mA thời gian 2-3 giờ. 4. Phƣơng pháp nhuộm bạc a. Hóa chất Chuẩn bị hóa chất sau: Fixative I, Fixative II, Sensitizer, Developer, Stopper. b. Phương pháp nhuộm Gel điện di nhuộm với hóa chất trên. * Chú ý: Toàn quy trình nhuộm gel thực máy lắc. Sau nhuộm gel tiến hành quan sát phân tích gel. Dựng phương trình tuyến tính trọng lượng phân tử khoảng cách di chuyển tướng đối protein chuẩn. Dựa vào phương trình xác định trọng lượng phân tử protein gel điện di. 5. Phƣơng pháp nhuộm hoạt tính * Để tiến hành nhuộm hoạt tính, protein phân tách gel SDS-PAGE tương tự nhiên sample buffer sử dụng không bổ sung -mercatoethanol. * Quy trình nhuộm: - Sau điện di, tiến hành kiểm tra hoạt tính endoglucanase cách ủ gel với dung dịch CMC 0,2%. - Gel sau ủ nhuộm với dung dịch congo red rửa gel băng hoạt tính màu trắng ra. Sau ngâm gel vào dung dịch acid loãng để phần lại gel chuyển sang màu xanh. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 1. Đƣờng chuẩn Bradford Bảng 6. Giá trị OD 595nm đƣờng chuẩn BSA Nồng độ BSA OD (μg/ml) Trung bình 30 0,070 0,103 0,112 0,1 60 0,190 0,167 0,167 0,18 120 0,309 0,380 0,277 0,32 180 0,495 0,453 0,437 0,47 240 0,614 0,577 0,574 0,59 300 0,701 0,741 0,652 0,7 Hình 16. Biểu đồ đƣờng chuẩn Bradford Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT 2. Đƣờng chuẩn Nelson Bảng 7. Giá trị OD 520nm đƣờng chuẩn Nelson Nồng độ glucose OD (μg/ml) TB 36 0,063 0,081 0,056 0,07 72 0,119 0,115 0,133 0,12 108 0,173 0,162 0,191 0,18 144 0,249 0,212 0,238 0,23 180 0,268 0,286 0,288 0,28 Hình 17. Biểu đồ đƣờng chuẩn Nelson Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT 3. Kết thí nghiệm Bảng 8. Kết đo OD 595nm định lƣợng protein phân đoạn tủa với ammonium sulphate Mẫu H2O (DC): 0,777 Mẫu Trung bình TB-DC Thô 0,855 0,08 60% 1,183 0,4 70% 1,043 0,27 80% 0,961 0,18 90% 0,885 0,11 Bảng 9. Kết định lƣợng protein phân đoạn tủa với ammonium sulphate Mẫu Thể tích mẫu (ml) μg/ml Protein tổng (mg) Thô 1000 22,6 22,6 60% 24 165 3,97 70% 20 104 2,09 80% 17 68,7 1,17 90% 34 35,7 1,21 Bảng 10. Kết đo OD 520nm định lƣợng hoạt tính phân đoạn tủa với ammonium sulphate Mẫu Trung bình Đối chứng TB-DC Thô 0,190 0,180 0,01 60% 0,198 0,188 0,01 70% 0,237 0,178 0,06 80% 0,224 0,178 0,05 90% 0,188 0,190 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 11. Kết định lƣợng hoạt tính phân đoạn tủa với ammonium sulphate Thể tích mẫu Hàm lƣợng Hoạt tính Hoạt tính Hoạt tính (ml) glucose (μg/ml) (U/ml) tổng (U) riêng (U/mg) Thô 1000 2,13 0,708 708 31,3 60% 24 2,13 0,71 17 4,29 70% 20 32,8 10,9 218 105 80% 17 24,6 8,21 140 119 90% 34 Mẫu 4. Kết thí nghiệm Bảng 12. Kết OD 280nm phân đoạn sắc ký gel Uno Sphere Q Ống OD280 Ống OD280 Ống OD280 Ống OD280 Ống OD280 0,065 16 0,058 31 0,178 46 0,151 61 0,136 0,066 17 0,059 32 0,149 47 0,153 62 0,126 0,064 18 0,057 33 0,137 48 0,148 63 0,115 0,070 19 0,056 34 0,140 49 0,145 64 0,110 0,074 20 0,056 35 0,145 50 0,137 65 0,110 0,092 21 0,061 36 0,151 51 0,134 0,099 22 0,058 37 0,150 52 0,132 0,092 23 0,056 38 0,148 53 0,132 0,082 24 0,056 39 0,141 54 0,131 10 0,067 25 0,06 40 0,139 55 0,130 11 0,062 26 0,118 41 0,134 56 0,122 12 0,059 27 0,191 42 0,140 57 0,112 13 0,059 28 0,157 43 0,141 58 0,104 14 0,057 29 0,123 44 0,140 59 0,109 15 0,058 30 0,135 45 0,144 60 0,121 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 13. Kết đo OD 595nm định lƣợng protein phân đoạn sắc ký Mẫu H2O (DC): 0,776 Phân đoạn Trung bình TB-DC UB 0,807 0,03 F1 0,940 0,16 F2 0,898 0,12 F3 0,858 0,08 F4 0,939 0,16 F5 0,854 0,08 Bảng 14. Kết định lƣợng protein phân đoạn sắc ký Phân đoạn Thể tích mẫu (ml) μg/ml Protein tổng (mg) UB 3,2 2,03 F1 59,9 0,24 F2 3,2 41,6 0,13 F3 3,2 24,1 0,08 F4 3,2 59,6 0,19 F5 3,2 22,8 0,07 Bảng 15. Kết đo OD 520nm định lƣợng hoạt tính phân đoạn sắc ký Mẫu Trung bình Đối chứng TB-DC UB 0,215 0,209 F1 0,398 0,185 0,21 F2 0,192 0,206 F3 0,204 0,189 0,02 F4 0,188 0,194 F5 0,197 0,200 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 16. Kết định lƣợng hoạt tính phân đoạn sắc ký Phân Thể tích Hàm lƣợng glucose Hoạt tính Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng đoạn mẫu (ml) (μg/ml) (U/ml) (U) (U/mg) UB 3,2 F1 129 43 172 720 F2 3,2 F3 3,2 5,25 1,75 5,6 72,73 F4 3,2 F5 3,2 Bảng 17. Số liệu đƣờng tuyến tính trọng lƣợng phân tử khoảng cách di chuyển protein chuẩn Băng Rf Log MW MW (kDa) 0,06 2,06 116 0,15 1,82 66,2 0,28 1,65 45 0,38 1,54 35 0,53 1,39 25 0,70 1,27 18,4 0,79 1,16 14,4 Hình 18. Biểu đồ đƣờng chuẩn trọng lƣợng phân tử protein chuẩn Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 18. Trọng lƣợng phân tử băng protein mẫu enzyme tinh Băng Rf 0,08 1,95 88,5 0,12 1,9 79,6 0,14 1,88 74 0,4 1,57 37,5 0,44 1,53 34 LogMW MW 5. Kết thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh Bảng 19. Kết đo OD 520nm thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh Nhiệt độ Trung bình DC TB-DC 30 0,231 0,211 0,02 40 0,245 0,203 0,04 50 0,262 0,215 0,05 60 0,272 0,194 0,08 70 0,240 0,206 0,03 80 0,213 0,205 0,01 90 0,190 0,200 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 20. Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase tinh Hàm lƣợng glucose Hoạt tính Hoạt tính (μg/ml) U tƣơng đối (%) 30 8,38 5,58 18,8 40 22,1 14,8 49,6 50 25,3 16,8 56,6 60 44,6 29,8 100 70 17,1 11,4 38,4 80 0,88 0,6 1,96 90 Nhiệt độ 6. Kết thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh Bảng 21. Kết đo OD 520nm thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học pH Trung bình DC TB-DC 0,150 0,152 0,150 0,15 0,169 0,165 0,01 0,179 0,16 0,02 0,207 0,185 0,02 0,240 0,185 0,06 0,193 0,183 0,01 10 0,192 0,184 0,01 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 22. Khảo sát ảnh hƣởng pH đến hoạt tính endoglucanase tinh pH Hàm lƣợng glucose (μg/ml) Hoạt tính(U) Hoạt tính tƣơng đối(%) 7,75 5,17 25,6 9,63 6,41 31,8 30,25 20,17 100 2,13 1,42 7,03 10 0,88 0,58 2,89 7. Kết thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng số ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh Bảng 23. Kết đo OD 520nm thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng số ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh Kim loại Trung bình DC TB-DC Mn2+ 0,220 0,183 0,04 K+ 0,245 0,183 0,06 Fe3+ 0,209 0,183 0,03 Cu2+ 0,237 0,215 0,02 Không 0,227 0,183 0,04 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT Bảng 24. Khảo sát ảnh hƣởng số ion kim loại đến hoạt tính endoglucanase tinh Kim loại Hàm lƣợng glucose (μg/ml) Hoạt tính (U) Hoạt tính tƣơng đối (%) Mn2+ 19 12,7 81,3 K+ 34,6 23,1 148 Fe3+ 12,1 8,08 51,9 Cu2+ 9,63 6,42 41,2 Không 23,4 15,6 100 8. Kết thí nghiệm: Khảo sát tính đặc hiệu chất endoglucanase tinh Bảng 25. Kết đo OD 520nm thí nghiệm khảo sát tính đặc hiệu chất endoglucanase tinh Cơ chất Trung bình DC TB-DC CMC 0,221 0,192 0,03 Avicel 0,215 0,205 0,01 0,145 0,141 0,141 0,132 0,01 Cellulose acetate Fiter paper Bảng 26. Khảo sát tính đặc hiệu chất endoglucanase tinh Hàm lƣợng glucose Hoạt tính Hoạt tính tƣơng đối (μg/ml) (U) (%) CMC 14 14 100 Avicel 2,13 2,13 15,2 1,5 1,5 10,7 Cơ chất Cellulose acetate Fiter paper Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 35- 2013 Trường ĐHCT LÝ LỊCH KHOA HỌC I. LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên sinh viên: Hà Công Thắng Ngày, tháng năm sinh: 29/09/1991 Nơi sinh: Long Phú, Sóc Trăng Địa nay: Ấp Trường An, Xã Trường Khánh, Huyện Long Phú, Tỉnh Sóc Trăng. Điện thoại: 01215486256 E-mail: hcthang509@student.ctu.edu.vn II. QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO 1. Đại học Hệ đào tạo: Chính quy (Chương trình tiên tiến) Ngành đào tạo: Công nghệ sinh học Nơi đào tạo: Đại học Cần Thơ 2. Trình độ ngoại ngữ: Bằng C Anh văn trung tâm ngoại ngữ Đại học Cần Thơ. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... trên đối tượng là các loài nấm Với những vấn đề và tồn tại nêu trên đề tài Tinh sạch và khảo sát một số đặc điểm của endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 được đề xuất thực hiện nhằm mở ra hướng nghiên cứu mới về cellulase từ vi khuẩn trong nước ta 1.2 Mục tiêu đề tài Tinh sạch endoglucanase từ Bacillus subtilis S20 và xác định một số đặc điểm cơ bản của nó Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT... cellulase từ vi khuẩn Bacillus vẫn còn hạn chế Enzyme cellulase từ hai chủng Bacillus subtilis là CH43 và HR68 đã được tinh sạch và khảo sát trong nghiên cứu của Mawadza et al (2000) Kết quả cho thấy đối với chủng Bacillus subtilis CH43 sau khi trải qua quá trình tinh sạch gồm tủa bằng acetone, sắc ký tương tác kị nước, sắc ký lọc gel và sắc ký trao đổi ion đã thu được enzyme endoglucanase với độ tinh sạch. .. tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944), (Phụ lục 1) - Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của endoglucanase bằng phương pháp SDS-PAGE - Lập bảng đánh giá kết quả tinh sạch 3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch Mục đích: Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu của endoglucanase Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một. .. enzyme thô ban đầu và hiệu suất tinh sạch đạt 12%; đối với chủng Bacillus subtilis HR68 sau khi trải qua quá trình tinh sạch gồm tủa bằng acetone, sắc ký tương tác kị nước và điện di điểm đẳng điện (Isoelectic focusing-IEF) đã thu được endoglucanase với độ tinh sạch là 113, 5 lần và hiệu suất đạt 35,3 %, Endoglucanase từ hai chủng vi khuẩn này có cùng trọng lượng phân tử và pI là 40kDa và 5,4 Cả hai có... sạch được đánh giá bằng kỹ thuật SDS-PAGE Kết quả cho thấy sau quá trình tinh sạch gồm ba bước kể trên độ tinh sạch là 14,5 lần và hiệu suất đạt 24% Carboxymethyl Cellulase tinh sạch từ chủng vi khuẩn này có trọng lượng phân tử 58 kDa, có nhiệt độ và pH tối ưu là 50oC và 6 Hoạt tính của enzyme này được cải thiện bởi ion Mn2+ và bị bất hoạt bởi các ion như Hg2+, Cu2+, Zn2+, Mg2+, Na2+ và Ca2+ Một endoglucanase. .. ĐHCT CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên bởi Ehrenberg vào năm 1835 với tên gọi là Vibrio subtilis, sau đó được đổi tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872 bởi Cohn Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa bởi Tổ chức y học Nazi của Đức Thời điểm này, Bacillus subtilis được sử... Hoạt tính đặc hiệu Hiệu suất Độ tinh sạch sạch (mg) (U) (U/mg) (%) (lần) Dịch thô 22,6 708 31,3 100 1 AS 70-80% 3,26 358 110 50,5 3,51 Unosphere Q 0,24 172 720 24,3 23 Qua hai bước tinh sạch, quá trình tinh sạch đạt được hiệu suất và độ tinh sạch lần lượt là 24,3% và 23 lần (Bảng 3) Từ kết quả nhuộm hoạt tính kết hợp và phương pháp nhuộm bạc (Hình 13) có thể kết luận rằng, mẫu enzyme tinh sạch bao gồm... pH 6-6,5 (Yin et al., 2010), trong khi của Bacillus subtilis CH43 và HR68 ở pH 6,5 (Mawadza et al., 2000) Endoglucanase bền trong khoảng pH 6-10 tùy vào từng loài cụ thể 2.2.2.3 Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase Endoglucanase thể hiện hoạt tính cao nhất với carboxmethyl cellulose (CMC) và β-glucan Ngoài ra, endoglucanase cũng thể hiện hoạt tính với một số cơ chất khác như avicel, cotton, giấy... đệm Tris-HCl 50mM) và 100 μl enzyme được ủ ở 50oC trong 30 phút Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính endoglucanase bằng phương pháp Nelson (1944), (Phụ lục 1) 3.2.5 Khảo sát ảnh hƣởng của ion kim loại đến hoạt tính của endoglucanase đã tinh sạch Mục đích: Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của endoglucanase Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, một nhân tố, 5 nghiệm... (Sukumaran et al., 2005);… Trong một số trường hợp ứng dụng nhất định, đặc biệt như trong y học, để sử dụng đạt hiệu quả và an toàn thì vấn đề đặt ra là enzyme được sử dụng phải có độ tinh sạch cao và các đặc điểm của enzyme phải được nghiên cứu Như vậy, tinh sạch là một bước rất cần thiết cho việc nghiên cứu và ứng dụng cellulase Theo Sukumaran et al (2005), cellulase có thể thu được từ nhiều nguồn như nấm, . (Henrissat et al., 1 98 9; Gilkes et al., 199 1; Kawaminami et al., 199 8; Gebler et al., 199 2). Tâm hong ca endoglucanase ca vi khung có trình t bo tn gm 8 amino acid, 2 tryptophan,. Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 23-146 kDa (Gilkes et al., 199 1). Tuy nhiên, endoglucanase ca Bacilli ng trong khong 35 -82 kDa (Park et al., 199 1; Han et al., 199 5; Kim. d 199 8) . Domain này ci thin kh  bám và h tr hot tính ct không nh t hòa tan (Linder và Teeri, 199 7). 2.2.2.