Tinh sạch và đánh giá khả năng thủy ngân arabinoxylan của enzym xylanase tự nhiên và tái tổ hợp

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU NGÂN TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN ARABINOXYLAN CỦA ENZYM XYLANASE TỰ NHIÊN VÀ TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU NGÂN MÃ SINH VIÊN: 1501346 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN ARABINOXYLAN CỦA ENZYM XYLANASE TỰ NHIÊN VÀ TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh TS Đỗ Thị Tuyên Nơi thực hiện: Viện Cơng nghệ sinh học Bộ mơn Hóa Sinh HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời dạy dỗ cho em kiến thức quý báu suốt thời gian năm học tập trƣờng Em xin chân thành cảm ơn thầy mơn Hóa Sinh nhƣ anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Enzym tạo điều kiện thuận lợi tận tình hƣớng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em muốn gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Đào Mai Anh, ngƣời vừa ngƣời thầy tâm huyết, vừa ngƣời bạn chia sẻ, vừa ngƣời truyền cảm hứng sống làm việc bất tận cho em nhƣ nhiều hệ học sinh Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội Em cảm ơn cô suốt thời gian qua động viên, quan tâm giúp em lĩnh hội đƣợc nhiều điều quý giá kiến thức Những lời khuyên học cô kim nam giúp em định hƣớng đƣợc thân đƣờng tƣơng lai Em xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, ngƣời tận tình bảo em kiến thức chun mơn, giúp em hình thành ý tƣởng nghiên cứu thực nghiệm tạo môi trƣờng nghiên cứu khoa học thân thiện tuyệt vời Sự khích lệ suốt q trình nghiên cứu phịng Cơng nghệ sinh học Enzym tiếp thêm động lực cho em, giúp em tự tin bƣớc tiếp đƣờng khám phá khoa học Em khơng thể qn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Th.S Mai Văn Hiên, ngƣời thầy vô thân thiện nhiệt huyết, ngƣời đóng vai trị quan trọng bƣớc đầu tiên, giúp em kết nối với giới khoa học mà cịn bảo em tận tình suốt q trình làm thực nghiệm phịng Cơng nghệ sinh học Enzym Mình chân thành cảm ơn Quyên Bình, hai ngƣời bạn thân Dƣợc hai bạn, nhờ có bạn mà cảm thấy Dƣợc dễ chịu đáng yêu Cảm ơn hai bạn năm qua bên cạnh mình, “chịu đựng” u thƣơng Tơi xin cảm ơn tất đồng chí “labmates” Linh, L.Anh, Nhung Hồng đồng hành tôi, dù 8h sáng hay 11h đêm, dù thứ Chủ Nhật Cảm ơn đồng chí cho quãng thời gian thực vui vẻ đáng nhớ đời Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ gia đình ln động viên bên cạnh thời điểm khó khăn nhất, ln điểm tựa vững cho tất chặng đƣờng đời Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thu Ngân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Arabinoxylan 1.1.1 Định nghĩa, cấu tạo 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Tác dụng sinh học arabinoxylan sản phẩm thủy phân 1.2 Xylanase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Cấu trúc 1.2.4 Cơ chế xúc tác 10 1.2.5 Phân bố tự nhiên 12 1.2.6 Ứng dụng 14 1.3 Tình hình nghiên cứu tinh xylanase 16 1.3.1 Xylanase tự nhiên 16 1.3.2 Xylanase tái tổ hợp 17 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 19 2.1.1 Chủng giống 19 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Môi trƣờng 21 2.1.4 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase 23 2.3.2 Xác định hoạt tính xylanase 24 2.3.3 Xác định hàm lƣợng protein 25 2.3.4 Tinh xylanase 26 2.3.5 Điện di SDS-PAGE 28 2.3.6 Đánh giá khả thủy phân arabinoxylan 29 2.3.7 Xử lý số liệu 31 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32 3.1 Kết 32 3.1.1 Kết tinh xylanase tự nhiên 32 3.1.2 Kết tinh xylanase tái tổ hợp 39 3.1.3 Đánh giá khả thủy phân arabinoxylan 42 3.2 Bàn luận 45 3.2.1 Về kết tinh xylanase tự nhiên tái tổ hợp 45 3.2.2 Về kết đánh giá khả thủy phân arabinoxylan xylanase 48 CHƢƠNG KẾT LUẬN 50 CHƢƠNG KIẾN NGHỊ 51 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt APS Ammonium persulfate Ammonium persulphat AX Arabinoxylan Arabinoxylan AXOS Arabinoxylan oligosaccharide Arabinoxylan dạng oligosaccharid BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CBB Coomassie brilliant blue Chất nhuộm xanh Cộng cs DEAE Diethylaminoethyl DNS Dinitro salysilic acid Acid dinitro salysilic EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid Acid ethylen diamin tetraacetic FOS Feruloyl oligosaccharide Oligosaccharid có đơn phân acid ferulic GH Glycosid hydrolase KP Kali phosphate Kali phosphat Khối lƣợng phân tử KLPT mg protein MW Miligram protein Miligam protein Molecular weight Khối lƣợng phân tử OD Optical density Mật độ quang PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis Điện di gel polyacrylamid SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamin Tài liệu TL Tris Tris -(hydroxymethyl)-aminomethan VTCC Vietnam Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tính chất họ GH chứa enzym có hoạt tính xylan Bảng 1.2 Hoạt tính xylanase chủng vi sinh vật tự nhiên 13 Bảng 1.3 Ứng dụng xylanase công nghiệp 15 Bảng 1.4 Một số kết tinh xylanase tự nhiên 16 Bảng 1.5 Một số kết tinh xylanase tái tổ hợp 18 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 20 Bảng 2.3 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.4 Thành phần gel cô gel tách 29 10 Bảng 3.1 Kết xác định hoạt độ xylanase từ chủng A niger VTCC-017 theo 11 Bảng 3.2 Hoạt tính xylanase tự nhiên phân đoạn sau qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100 12 Bảng 3.3 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE-Sephadex 13 Bảng 3.4 Tóm tắt trình tinh xylanase từ chủng A niger VTCC-017 14 Bảng 3.5 Kết xác định hoạt độ xylanase tái tổ hợp dịch 33 34 37 39 39 15 Bảng 3.6 Hoạt tính xylanase phân đoạn sau qua cột ProbondTM 40 16 Bảng 3.7 Bảng tóm tắt q trình tinh xylanase tái tổ hợp 42 17 Bảng 3.8 Tổng hợp đánh giá kết thủy phân arabinoxylan xylanase 45 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Hình 1.1 Cấu trúc phân tử arabinoxylan Hình 1.2 Vị trí xúc tác endoxylanase enzym khác trình thủy phân xylan Trang Hình 1.3 Cấu trúc xylanase GH10 nhìn từ (a) bên cạnh (b) Hình 1.4 Cấu trúc xylanase GH11 Hình 1.5 Cơ chế xúc tác xylanase chủng Bacillus circulans 11 Hình 1.6 Xylanase xúc tác kiểu bảo tồn 11 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 23 Hình 2.2 Đƣờng chuẩn xylose 25 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 26 10 Hình 2.4 Sơ đồ quy trình tinh xylanase tự nhiên 26 11 Hình 2.5 Sơ đồ quy trình tinh xylanase tái tổ hợp 28 12 Hình 3.1 Hoạt tính đĩa thạch xylanase tự nhiên 32 13 Hình 3.2 Khảo sát hoạt tính hoạt tính riêng enzym tự nhiên thơ theo 14 Hình 3.3 Sắc kí đồ xylanase tự nhiên qua cột Sephadex G-100 15 Hình 3.4 Điện di đồ SDS-PAGE xylanase tự nhiên qua cột Sephadex G-100 16 Hình 3.5 Sắc kí đồ tinh xylanase tự nhiên qua cột DEAE 17 Hình 3.6 Điện di đồ SDS-PAGE xylanase tự nhiên qua cột DEAESephadex 18 Hình 3.7 Định tính xylanase tái tổ hợp đĩa thạch xylan 19 Hình 3.8 Điện di đồ SDS-PAGE xylanase tái tổ hợp qua cột ProBondTM 20 33 35 36 37 38 40 41 Hình 3.9 Sắc ký mỏng thủy phân arabinoxylan thƣơng mại (A) arabinoxylan hãng Megazyme (B) đệm CH3COONa 50 mM, pH 43 5,0 xylanase tự nhiên xylanase tái tổ hợp 21 Hình 3.10 Sắc ký mỏng thủy phân arabinoxylan thƣơng mại (A) arabinoxylan hãng Megazyme (B) đệm KP 20 mM, pH 7,0 xylanase tự nhiên xylanase tái tổ hợp 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Arabinoxylan (AX) nhóm hemicellulose đƣợc tìm thấy nhiều thành tế bào nội nhũ loại hạt ngũ cốc Chúng polysaccharid có đặc tính nhớt, giữ nƣớc đƣợc coi loại chất xơ có lợi cho hệ tiêu hóa ngƣời [70] Khơng vậy, nhóm polysaccharid cịn có nhiều tác dụng sinh học quan trọng nhƣ kích thích hệ miễn dịch, loại bỏ gốc tự hay làm giảm nồng độ glucose máu [55, 70] Những tác dụng sinh học quý báu khiến cho AX trở thành đối tƣợng nghiên cứu tiềm lĩnh vực y dƣợc Đặc biệt, năm gần đây, nhiều nghiên cứu sản phẩm thủy phân AX nhƣ arabinoxylan oligosaccharid, sản phẩm đƣờng thủy phân (xylose, arabinose…) cịn có hoạt tính sinh học tiềm ứng dụng cao nhiều so với AX có khối lƣợng phân tử lớn [69, 70] Do đó, ngƣời ta tìm cách thủy phân AX để tạo sản phẩm có giá trị kinh tế giá trị sử dụng cao so với polysaccharid thơ Có nhiều phƣơng pháp khác đƣợc sử dụng để thủy phân AX Trong đó, sử dụng kiềm mạnh axit mạnh biện pháp phổ biến hiệu thủy phân cao giá thành rẻ [80] Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất cơng nghiệp ngày làm cho vấn đề ô nhiễm môi trƣờng gia tăng, đòi hòi nhà khoa học phải tìm tịi, nghiên cứu phƣơng pháp thủy phân polysaccharid nói chung AX nói riêng enzym sinh học Hệ enzym thủy phân AX phong phú đa dạng, endo-1,4-βxylanase (EC 3.2.1.8) nhóm enzym quan trọng nhất, công ngẫu nhiên vào mạch khung xylan giải phóng arabinoxylan oligosaccharid nhƣ loại đƣờng xylose, xylobiose, arabinose [12, 55] Nhóm enzym dễ dàng đƣợc sản xuất từ chủng vi sinh vật tự nhiên nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi, đồng thời, đƣợc nghiên cứu sử dụng công nghệ tái tổ hợp để chuyển gen vào vật chủ thích hợp nhằm tăng hiệu chủ động sản xuất [17, 35, 41, 59] Tuy nhiên, q trình sinh tổng hợp, ngồi xylanase, vi sinh vật sản xuất nhiều loại protein khác nhau, dẫn đến độ khả thủy phân chất dịch enzym thô cịn hạn chế Do đó, q trình tinh để thu đƣợc sản phẩm enzym có độ cao hiệu suất thu hồi lớn điều kiện cần thiết để đƣa enzym vào sử dụng thực tế Trên giới, có chế phẩm xylanase đƣợc thƣơng mại hóa sử dụng nhiều lĩnh vực với mục đích khác Tuy nhiên, việc nghiên cứu để 53 Kapilan, R (2014), "Purification of xylanase produced by Bacillus pumilus", Journal of the National Science Foundation of Sri Lanka, 42, pp 365-368 54 Kataoka, M., et al (2014), "Crystal structure of Talaromyces cellulolyticus (formerly known as Acremonium cellulolyticus) GH family 11 xylanase", Applied biochemistry and biotechnology, 174(4), pp 1599-1612 55 Kellow, N.J., K.Z Walker (2018), 13 - Authorised EU health claim for arabinoxylan, Woodhead Publishing pp 201-218 56 Khandeparkar, R.D.S., N.B Bhosle (2006), "Isolation, purification and characterization of the xylanase produced by Arthrobacter sp MTCC 5214 when grown in solid-state fermentation", Enzyme and Microbial Technology, 39(4), pp 732-742 57 Kiddinamoorthy, J., et al (2008), "Production, purification and characterization of Bacillus sp GRE7 xylanase and its application in eucalyptus Kraft pulp biobleaching", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(5), pp 605-612 58 Kim, E., et al (2016), "D-Xylose as a sugar complement regulates blood glucose levels by suppressing phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCK) in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic rats and by enhancing glucose uptake in vitro", Nutrition research and practice, 10(1), pp 11-18 59 Kirikyali, N., J Wood, I.F Connerton (2014), "Characterisation of a recombinant β-xylosidase (xylA) from Aspergillus oryzae expressed in Pichia pastoris", AMB Express, 4(1), pp 68 60 Knob, A., E.C Carmona (2010), "Purification and characterization of two extracellular xylanases from Penicillium sclerotiorum: a novel acidophilic xylanase", Appl Biochem Biotechnol, 162(2), pp 429-43 61 Lagaert, S., et al (2014), "β-xylosidases and α-L-arabinofuranosidases: accessory enzymes for arabinoxylan degradation", Biotechnol Adv, 32(2), pp 316-32 62 Lin, Q., S Ou, Q Wen (2014), "In vitro antioxidant activity of feruloyl arabinose isolated from maize bran by acid hydrolysis", Journal of food science and technology, 51(7), pp 1356-1362 63 Liu, M.-Q., X.-Y Weng, J.-Y Sun (2006), "Expression of recombinant Aspergillus niger xylanase A in Pichia pastoris and its action on xylan", Protein expression and purification, 48(2), pp 292-299 64 Liu X, Kokare C (2017), Chapter 11—microbial enzymes of use in industry, Cambridge 65 Liu, Y., et al (2019), "Characterization of a novel multi-domain xylanase from Clostridium clariflavum with application in hydrolysis of corn cobs", Biotechnol Lett, 41(10), pp 1177-1186 66 Lu, F., et al (2008), "Purification and characterization of xylanase from Aspergillus ficuum AF-98", Bioresour Technol, 99(13), pp 5938-41 67 Luo, H., et al (2010), "Molecular cloning and characterization of the novel acidic xylanase XYLD from Bispora sp MEY-1 that is homologous to family 30 glycosyl hydrolases", Applied microbiology and biotechnology, 86(6), pp 1829-1839 68 Maes, C., J.A Delcour (2002), "Structural Characterisation of Waterextractable and Water-unextractable Arabinoxylans in Wheat Bran", Journal of Cereal Science, 35(3), pp 315-326 69 Méndez-Encinas, M., et al (2018), "Ferulated Arabinoxylans and Their Gels: Functional Properties and Potential Application as Antioxidant and Anticancer Agent", Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2018, pp 1-22 70 Mendis, M., S Simsek (2014), "Arabinoxylans and human health", Food Hydrocolloids, 42, pp 239-243 71 Miller, G.L (1959), "Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar", Analytical Chemistry, 31(3), pp 426-428 72 Nair, S.G., R Sindhu, S Shashidhar (2008), "Purification and biochemical characterization of two xylanases from Aspergillus sydowii SBS 45", Appl Biochem Biotechnol, 149(3), pp 229-43 73 Paës, G., J.-G Berrin, J Beaugrand (2012), "GH11 xylanases: Structure/function/properties relationships and applications", Biotechnology Advances, 30(3), pp 564-592 74 Pal, A., F Khanum (2011), "Purification of Xylanase from Aspergillus niger DFR-5: Individual and Interactive Effect of Temperature and pH on its Stability", Process Biochemistry - PROCESS BIOCHEM, 46, pp 879-887 75 Palmer, R., et al (2014), "Comparative in situ analyses of cell wall matrix polysaccharide dynamics in developing rice and wheat grain", Planta, 241 76 Paridah, et al (2011), "Retting process of some bast plant fibres and its effect on fibre quality : a review.", BioResources 6, pp 5260–5281 77 Pollet, A., J.A Delcour, C.M Courtin (2010), "Structural determinants of the substrate specificities of xylanases from different glycoside hydrolase families", Critical reviews in biotechnology, 30(3), pp 176-191 78 Qaisrani, T., et al (2016), "Arabinoxylans from psyllium husk: A review", Journal of Environmental and Agricultural Sciences 2313-8629, 6, pp 33-39 79 Rahimi, S., et al (2007), "Degumming of Persian silk with mixed proteolytic enzymes", Journal of Applied Polymer Science, 106, pp 267-275 80 Reilly, P.J (1981), Xylanases: structure and function pp 111-129 81 Roels, S.P., et al (1999), "Variation in the degree of D-xylose substitution in water-extractable European durum wheat (Triticum durum desf.) semolina arabinoxylans", Journal of agricultural and food chemistry, 47(5), pp 18131816 82 Rose, D., G Inglett (2011), "A Method for the Determination of Soluble Arabinoxylan Released from Insoluble Substrates by Xylanases", Food Analytical Methods, 4, pp 66-72 83 Sá-Pereira, P., et al (2003), "A new look at xylanases: an overview of purification strategies", Mol Biotechnol, 24(3), pp 257-81 84 Sakka, K., et al (1994), "Purification and characterization of xylanase A from Clostridium stercorarium F-9 and a recombinant Escherichia coli", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 58(8), pp 1496-1499 85 Samanta, A.K., et al (2011), "A simple and efficient diffusion technique for assay of endo-1,4-xylanase activity", Brazilian Journal of Microbiology, 42, pp 1349-1353 86 Sanjivkumar, M., et al (2017), "Biosynthesis, purification and characterization of β-1,4-xylanase from a novel mangrove associated actinobacterium Streptomyces olivaceus (MSU3) and its applications", Protein Expr Purif, 130, pp 1-12 87 Santiago, M., S Strobel (2013), "Thin layer chromatography", Methods Enzymol, 533, pp 303-24 88 Schmitt, J., H Hess, H.G Stunnenberg (1993), "Affinity purification of histidine-tagged proteins", Mol Biol Rep, 18(3), pp 223-30 89 Shahi, N., et al (2016), "Xylanase: A promising enzyme", 8, pp 334-339 90 Shekhar, C., S.S Thakur, S.K Shelke (2010), "Effect of exogenous fibrolytic enzymes supplementation on milk production and nutrient utilization in Murrah buffaloes", Tropical animal health and production, 42(7), pp 1465-1470 91 Shi, H., et al (2014), "Cloning, over-expression and characterization of a thermo-tolerant xylanase from Thermotoga thermarum", Biotechnology letters, 36(3), pp 587-593 92 Subramaniyan, S., P Prema (2002), "Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application", Critical reviews in biotechnology, 22(1), pp 33-64 93 Sutay Kocabaş, D., S Güder, N Özben (2015), "Purification strategies and properties of a low-molecular weight xylanase and its application in agricultural waste biomass hydrolysis", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 115, pp 66-75 94 Suzuki, M., K Yoshida, K Ashida (1991), "Purification and Characterization of Xylanase from the Mid-gut Gland of the Apple Snail (Pomacea canaliculata)", Agricultural and Biological Chemistry, 55(3), pp 693-700 95 Tanaka, H., et al (2005), "Purification and properties of an extracellular endo1,4-beta-xylanase from Penicillium citrinum and characterization of the encoding gene", Journal of bioscience and bioengineering, 100(6), pp 623630 96 Thomas, L., M.V Ushasree, A Pandey (2014), "An alkali-thermostable xylanase from Bacillus pumilus functionally expressed in Kluyveromyces lactis and evaluation of its deinking efficiency", Bioresour Technol, 165, pp 309-13 97 Tran Huu Phong, et al (2008), "Purification and characterization of xylanase from Aspergillus niger DB 106", Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(3) 98 Tung, M.-Y., C.-T Chang, Y.-C Chung (2007), "Biochemical properties of genetic recombinant xylanase II", Applied biochemistry and biotechnology, 136, pp 1-16 99 Verma, D., T Satyanarayana (2012), "Molecular approaches for ameliorating microbial xylanases", Bioresour Technol, 117, pp 360-7 100 Wong, K.K., L.U Tan, J.N Saddler (1988), "Multiplicity of beta-1,4-xylanase in microorganisms: functions and applications", Microbiol Rev, 52(3), pp 30517 101 Yadav, P., et al (2018), "Production, Purification, and Characterization of Thermostable Alkaline Xylanase From Anoxybacillus kamchatkensis NASTPD13", Frontiers in bioengineering and biotechnology, 6, pp 65-65 102 Yamaura, I., et al (1997), "Purification and Some Properties of Endo-l,4-β-dxylanase from a Fresh-water Mollusc, Pomacea insularus (de Ordigny)", Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 61(4), pp 615-620 103 Zafar, A., et al (2015), "Cloning, Expression, and Purification of Xylanase Gene from Bacillus licheniformis for Use in Saccharification of Plant Biomass", Applied biochemistry and biotechnology, 178 104 Zhang, P., et al (2004), "Effects of Arabinoxylans on Activation of Murine Macrophages and Growth Performance of Broiler Chicks", Cereal Chem, 81 105 Zhang, S., et al (2014), "Cereal-Derived Arabinoxylans as Biological Response Modifiers: Extraction, Molecular Features, and Immune-Stimulating Properties", Critical reviews in food science and nutrition, 55 106 Zheng, J., et al (2013), "Characterization and constitutive expression of a novel endo-1,4-β-D-xylanohydrolase from Aspergillus niger in Pichia pastoris", Biotechnology letters, 35(9), pp 1433-1440 Website 107 www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g100120?lang=en®ion=VN Retrieved 19/06/2020 108 www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Guide+for+Gel+Filtration.pdf Retrieved 17/06/2020 109 http://www.chembio.uoguelph.ca/educmat/chm357/sephadex.pdf Retrieved 18/06/2020 110 www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a50120?lang=en®ion=VN Retrieved 21/06/2020 111 http://www.nutrientsreview.com/carbs/monosaccharides-xylose.html Retrieved 23/05/2020 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn protein BSA y = 0,0036x + 0,0507 R2=0,0094 BSA (µg/ml) 20 40 60 80 100 150 200 OD1 0,081 0,22 0,296 0,32 0,373 0,608 0,792 OD2 0,096 0,183 0,315 0,326 0,396 0,603 0,693 OD3 0,097 0,22 0,276 0,341 0,408 0,598 0,763 ODtb 0,091 0,208 0,296 0,329 0,392 0,603 0,749 Bảng 4.2 Đƣờng chuẩn xylose y = 0,0037x – 0,1363 R2 = 0,9965 Xylose (µg) 25 30 35 40 50 60 75 80 90 100 Đệm KP (µl) 475 470 465 460 450 440 425 420 410 400 µg/ml OD1 OD2 OD3 Odtb 50 60 70 80 100 120 150 160 180 200 0,071 0,082 0,103 0,138 0,22 0,305 0,411 0,45 0,512 0,619 0,062 0,082 0,111 0,168 0,235 0,296 0,412 0,452 0,52 0,623 0,082 0,091 0,111 0,171 0,219 0,297 0,396 0,447 0,554 0,607 0,072 0,085 0,108 0,159 0,225 0,299 0,406 0,450 0,529 0,616 Bảng 4.3 Hàm lƣợng protein phân đoạn qua cột Sephadex G-100 Công thức: y= 0,0036x + 0,0507 Hàm lƣợng protein OD (595 nm) Phân đoạn OD1 OD2 OD TB (µg/ml) 0,040 0,030 0,035 0,000 0,034 0,032 0,033 0,000 0,035 0,041 0,038 0,000 0,045 0,049 0,047 0,000 0,113 0,113 0,113 17,306 0,139 0,145 0,142 25,361 0,184 0,190 0,187 37,861 0,188 0,196 0,192 39,250 0,175 0,189 0,182 36,472 10 0,171 0,177 0,174 34,250 11 0,168 0,180 0,174 34,250 12 0,168 0,162 0,165 31,750 13 0,139 0,151 0,145 26,194 14 0,125 0,132 0,129 21,611 15 0,116 0,124 0,120 19,250 16 0,119 0,125 0,122 19,806 17 0,031 0,043 0,037 0,000 18 0,140 0,150 0,145 26,194 19 0,141 0,144 0,143 25,500 20 0,030 0,050 0,040 0,000 21 0,045 0,055 0,050 0,000 22 0,036 0,045 0,041 0,000 23 0,042 0,052 0,047 0,000 24 0,039 0,042 0,041 0,000 25 0,028 0,036 0,032 0,000 26 0,025 0,030 0,028 0,000 27 0,031 0,040 0,036 0,000 28 0,030 0,036 0,033 0,000 29 0,027 0,032 0,030 0,000 30 0,025 0,033 0,029 0,000 Bảng 4 Hoạt tính xylanase phân đoạn qua cột Sephadex G-100 Công thức: y= 0,0037x + 0,1363 Hoạt độ IU/ml = OD (540 nm) Phân D Hoạt tính Hoạt tính riêng (IU/ml) (IU/mg protein) đoạn OD1 OD2 OD TB 0,000 0,000 0,000 0,981 0,000 0,000 0,000 0,000 0,981 0,000 0,000 0,000 0,000 0,981 0,000 0,000 0,000 0,000 0,981 0,000 1,090 1,081 1,086 8,798 508,400 0,599 0,625 0,612 26,942 1062,352 1,052 1,129 1,091 70,673 1866,643 1,371 1,415 1,393 88,100 2244,573 1,476 1,514 1,495 93,975 2576,632 10 1,485 1,412 1,449 91,297 2665,598 11 1,206 1,259 1,233 78,853 2302,291 12 1,095 1,114 1,105 71,480 2251,328 13 0,974 0,904 0,939 61,946 2364,837 14 0,503 0,536 0,520 37,779 1748,135 15 0,834 0,867 0,851 14,212 738,277 16 0,710 0,718 0,714 12,246 618,310 17 0,651 0,769 0,710 12,188 0,000 18 0,499 0,462 0,481 8,883 339,122 19 0,328 0,328 0,328 6,687 262,228 20 0,167 0,188 0,178 4,519 0,000 21 0,323 0,376 0,350 3,498 0,000 22 0,388 0,293 0,341 3,433 0,000 23 0,266 0,220 0,243 2,731 0,000 24 0,242 0,181 0,212 2,504 0,000 25 0,183 0,126 0,155 2,094 0,000 26 0,160 0,161 0,161 2,137 0,000 27 0,112 0,190 0,151 2,069 0,000 28 0,092 0,082 0,087 1,608 0,000 29 0,095 0,050 0,073 1,504 0,000 30 0,046 0,063 0,055 1,374 0,000 Bảng Hàm lƣợng protein phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex Công thức: y= 0,0036x + 0,0507 Hàm lƣợng protein OD (595 nm) Phân đoạn OD1 OD2 OD TB (µg/ml) 10 0,055 0,055 0,055 1,194 11 0,060 0,058 0,059 2,306 12 0,066 0,069 0,068 4,667 13 0,065 0,080 0,073 6,056 14 0,090 0,060 0,075 6,750 15 0,061 0,069 0,065 3,972 16 0,063 0,065 0,064 3,694 17 0,060 0,066 0,063 3,417 18 0,057 0,058 0,058 1,889 19 0,056 0,050 0,053 0,736 20 0,045 0,046 0,046 0,000 21 0,045 0,050 0,048 0,000 22 0,034 0,035 0,035 0,000 23 0,033 0,040 0,037 0,000 24 0,029 0,033 0,031 0,000 25 0,028 0,034 0,031 0,000 Bảng Hoạt tính phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex Công thức: y= 0,0037x + 0,1363 Hoạt độ IU/ml = OD (540 nm) Phân Hoạt tính Hoạt tính riêng (IU/ml) (IU/mg) D đoạn OD1 OD2 OD TB 10 0,000 0,000 0,000 0,981 821,714 11 0,737 0,675 0,706 6,065 2630,765 12 0,388 0,578 0,483 13,379 2866,859 13 0,963 1,023 0,993 24,396 4028,723 14 1,200 1,070 1,135 27,464 4068,706 15 0,912 0,895 0,904 22,463 5654,944 16 0,695 0,697 0,696 17,980 4866,792 17 0,341 0,276 0,309 9,609 2812,381 18 1,045 1,179 1,112 8,989 4758,865 19 0,811 0,797 0,804 6,771 9198,433 20 0,546 0,533 0,540 4,866 0,000 21 0,673 0,667 0,670 5,806 0,000 22 0,558 0,622 0,590 5,230 0,000 23 0,334 0,356 0,345 3,466 0,000 24 0,225 0,292 0,259 2,843 0,000 25 0,275 0,256 0,266 2,893 0,000 Bảng Hàm lƣợng protein qua cột ProbondTM Công thức: y= 0,0036x + 0,0507 OD(595 nm) STT X (µg/ml) Dịch Protein tổng số (mg) OD1 OD2 ODTB 0,43 0,448 0,439 107,861 0,863 Phân đoạn 0,095 0,107 0,101 13,972 0,021 0,085 0,079 0,082 8,694 0,013 0,079 0,083 0,081 8,417 0,013 0,077 0,073 0,075 6,750 0,010 0,005 0,001 0,003 0,000 0,000 Protein tổng phân đoạn sau tinh (mg) 0,057 Bảng 4.8 Hoạt tính xylanase qua cột ProbondTM Công thức: y= 0,0037x + 0,1363 Hoạt độ IU/ml = Hoạt tính xylanase OD(540 nm) STT Dịch D OD1 OD2 ODTB 0,647 0,667 0,657 IU/ml Hoạt tính tổng (IU) 17,882 114,251 Phân đoạn 0,625 0,627 0,626 5,489 8,234 0,508 0,586 0,547 4,920 7,381 0,718 0,696 0,707 3,036 4,554 0,303 0,382 0,343 1,724 2,586 0,156 0,098 0,127 0,948 1,422 Hoạt tính tổng phân đoạn sau tinh (IU) 24,177 Bảng 4.9 Kết kiểm tra độ băng protein sau tinh xylanase tự nhiên qua cột DEAE-Sephadex phần mềm Dolphin 1D Lane Band Rf O,D, AmplOD IntOD OD % 0,26 0,118 0,004 0,018 0,000072 0,2 0,507 0,148 0,039 0,783 0,030537 90,6 0,688 0,116 0,009 0,086 0,000774 2,3 0,726 0,116 0,009 0,145 0,001305 3,9 0,865 0,118 0,011 0,031 0,000341 1,0 0,884 0,114 0,007 0,02 0,00014 0,4 0,935 0,114 0,007 0,074 0,000518 1,5 0,098 0,218 0,035 0,188 0,00658 0,4 0,135 0,221 0,038 0,343 0,013034 0,8 0,205 0,235 0,05 0,507 0,02535 1,5 0,251 0,265 0,08 0,587 0,04696 2,7 0,502 0,421 0,241 6,777 1,633257 94,7 0,088 0,265 0,074 0,475 0,03515 0,5 0,126 0,294 0,101 0,833 0,084133 1,1 0,2 0,322 0,118 1,256 0,148208 1,9 0,247 0,344 0,134 1,265 0,16951 2,2 0,409 0,484 0,258 2,646 0,682668 8,9 0,498 0,795 0,557 11,759 6,549763 85,4 0,205 0,153 0,019 0,185 0,003515 0,6 0,256 0,165 0,031 0,167 0,005177 0,9 0,33 0,146 0,016 0,07 0,00112 0,2 0,498 0,275 0,15 3,937 0,59055 98,4 0,26 0,118 0,004 0,018 0,000072 0,2 0,507 0,148 0,039 0,783 0,030537 92,5 0,688 0,116 0,009 0,086 0,000774 2,3 0,726 0,116 0,009 0,145 0,001305 4,0 0,865 0,118 0,011 0,031 0,000341 1,0 Bảng 4.10 Kết kiểm tra độ băng protein sau tinh xylanase tái tổ hợp qua cột Probond phần mềm Dolphin 1D Lane Band Rf O,D, AmplOD IntOD OD % 0,04 0,072 0,012 0,217 0,002604 0,53 0,472 0,188 0,118 4,107 0,484626 99,47 0,113 0,06 0,002 0,039 0,000078 0,02 0,217 0,06 0,002 0,000 0,000000 0,00 0,468 0,173 0,107 3,892 0,416444 99,98 0,278 0,06 0,004 0,139 0,000556 0,10 0,465 0,186 0,12 4,600 0,552000 99,93 0,796 0,088 0,002 0,201 0,000402 0,07 PHỤ LỤC Phƣơng pháp nhuộm gel protein bạc Nhuộm gel protein bạc có độ nhạy cao so với nhuộm Comassie, phát 10-50 ng protein (Jeff Brodsky, Tamara prototol) Nguyên liệu: Dung dịch vừa đủ gel:  Dung dịch A: 100 ml gồm ethanol (50 ml), acid acetic (12 ml), H2O (38 ml), formaldehyd 37% (50 µl)  Dung dịch B: 200 ml ethanol 50%  Dung dịch C: 100 ml gồm 10mg Na2S2O3 100ml H2O  Dung dịch D: 100 mg AgNO3 100ml H2O  Dung dịch E: 100 ml gồm Na2CO3 (3 g), formaldehyd 37% (50 µl), dung dịch C (2 ml), H2O (98 ml)  Dung dịch F: 100 ml EDTA 25mM Tiến hành: Rửa gel với dung dịch A Loại bỏ dịch Rửa gel lần lần 70 ml dung dịch B 20 phút Loại bỏ dịch Rửa gel với dung dịch C vòng phút ( rửa lâu làm giảm khả nhuộm bạc) Loại bỏ dịch Rửa lại lần với nƣớc cất, lầ 20 giây Nhuộm gel 30 phút dung dịch D Loại bỏ dịch Rửa lại lần với nƣớc cất lần 20 giây Hiện gel dung dịch E từ 10 phút đến Theo dõi cẩn thận gel, tránh để màu mức Dừng nhuộm dung dịch F 20 phút Rửa gel nƣớc cất ... pH 5,0 Dịch mẫu sau thủy phân đƣợc bất hoạt enzym 100°C 10 phút Đánh giá khả thủy phân mẫu enzym: xylanase tự nhiên tinh sạch, xylanase tái tổ hợp tinh sạch, xylanase tự nhiên thƣơng 29 mại (Novozyme)... tinh xylanase tái tổ hợp 39 3.1.3 Đánh giá khả thủy phân arabinoxylan 42 3.2 Bàn luận 45 3.2.1 Về kết tinh xylanase tự nhiên tái tổ hợp 45 3.2.2 Về kết đánh giá khả. .. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THU NGÂN MÃ SINH VIÊN: 1501346 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN ARABINOXYLAN CỦA ENZYM XYLANASE TỰ NHIÊN VÀ TÁI TỔ HỢP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người