phân lập, khảo sát một số đặc điểm sinh học và tuyển chọn môi trường nuôi cấy giúp tăng sinh khối vi tảo thraustochytrid

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TUYỂN CHỌN MÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TUYỂN CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY GIÚP TĂNG SINH

KHỐI VI TẢO THRAUSTOCHYTRID

MSSV: 3102771 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 12/2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÂN LẬP, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TUYỂN CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY GIÚP TĂNG SINH

KHỐI VI TẢO THRAUSTOCHYTRID

MSSV: 3102771 LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 12/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký tên) (Ký tên)

Trần Thị Xuân Mai Nguyễn Duy Phương

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký tên)

LỜI CẢM TẠ

Qua quá trình học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn Tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Công nghệ Sinh học Trong suốt quá trình nghiên cứu, luôn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình, quý thầy cô, bạn bè đã giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Cán bộ hướng dẫn – Cô Trần Thị Xuân Mai đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cũng như luôn động viên, khuyến khích tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi học tập và thực hiện

đề tài

Các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến K36 và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Duy Phương

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập, khảo sát một số đặc điểm sinh học và tuyển chọn môi trường nuôi cấy giúp tăng sinh khối vi tảo Thraustochytrid” đã được thực hiện với mục tiêu phân lập được một số dòng vi tảo biển dị dưỡng có khả năng sản xuất carotenoid và chọn ra môi trường giúp tăng sinh khối vi tảo ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Trà Vinh và Bến Tre), từ đó tuyển chọn được những dòng có hàm lượng carotenoid cao

Trong nghiên cứu này mười lăm dòng vi tảo Thraustochytrid đã được phân lập

từ các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata Blume), lá bần (Sonneratia caseolaris) và

lá mắm (Avicennia officinalis) tại các vùng biển của hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre dựa vào các đặc điểm khuẩn lạc và tế bào Bốn dòng vi tảo B3, M6, M10 và Đ14 được chọn để khảo sát trên 5 loại môi trường GYPS cải tiến (3g/L glucose, 1,25g/L yeast extract, 1,25g/L peptone và 500ml/L), NM-5(50g/L glucose, 10g/L yeast extract, 10g/L peptone, 1g/L NaCl, 10g/L MgSO 4 ), NM-8(80g/L glucose, 10g/L yeast extract, 10g/L peptone, 1g/L NaCl, 10g/L MgSO 4 ), F-5(50g/L glucose, 10g/L yeast extract, 10g/L peptone, 500ml NSW/L) và F-8(80g/L glucose, 10g/L yeast extract, 10g/L peptone, 500ml NSW/L), kết quả NM-5 là môi trường tiềm năng cho nuôi tăng sinh khối vi tảo, đồng thời khi phân tích hàm lượng carotenoid tổng số thì dòng M10 có hàm lượng carotenoid cao nhất với 3849 µg/kg trọng lượng khô, tiếp theo là dòng M6 với 3000 µg/kg Hai dòng Đ14 và B3 có hàm lượng carotenoid thấp hơn với 1811 và 1797 µg/kg Với điều kiện nuôi cấy đơn giản, phát triển nhanh, và có hàm lượng carotenoid tổng số cao, dòng M10 có thể được xem là nguồn vi tảo tiềm năng để sản xuất carotenoid với số lượng lớn

Từ khóa: carotenoid, môi trường, sinh khối, vi tảo biển dị dưỡng

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG v

DANH SÁCH HÌNH vi

TỪ VIẾT TẮT vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về vi tảo 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái 3

2.1.2 Cấu tạo tế bào 4

2.1.3 Hình thức sinh sản 5

2.1.4 Phân loại 6

2.1.5 Giá trị dinh dưỡng của vi tảo 7

2.1.6 Sơ lược về vi tảo nhóm Thraustochytrid và tình hình nghiên cứu 8

2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi sinh khối vi tảo 12

2.2.1 Nhiệt độ và độ mặn 12

2.2.2 pH 13

2.3 Một số phương pháp xác định quá trình sinh trưởng của vi tảo 14

2.3.1 Đo mật độ thông qua giá trị OD 14

2.3.2 Đếm mật số tế bào 14

2.4 Sắc tố carotenoid 14

2.4.1 Khái niệm và phân bố 14

2.4.2 Phân loại và cấu tạo 14

2.4.3 Tính chất vật lý 15

2.4.4 Tính chất hóa học 16

2.4.5 Chức năng 16

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Phương tiện nghiên cứu……… 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.2 Nguyên vật liệu 18

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị 18

3.1.5 Hóa chất 18

3.1.6 Môi trường nuôi cấy vi tảo biển 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Quy trình phân lập vi tảo 20

3.2.2 Mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi tảo 21

3.2.3 Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập được 22

3.2.4 Xác định trọng lượng khô tế bào vi tảo 22

3.2.5 Dựng đường chuẩn giữa trọng lượng khô tế bào và chỉ số OD 22

3.2.6 Xác định hàm lượng carotenoid 23

3.2.7 Tuyển chọn môi trường nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào 24

3.2.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả phân lập vi tảo 25

4.2 Mô tả hình thái vi tảo 26

4.3 Kết quả dựng đường chuẩn giữa trọng lượng khô và chỉ số OD 29

4.4 Kết quả đánh giá hiệu quả chọn lọc môi trường để tăng sinh khối vi tảo 31

4.5 Hàm lượng carotenoid của các dòng vi tảo phân lập được 34

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Đề xuất 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG

Bảng3.1 Thành phần môi trường GYPS cơ bản………… 19

Bảng 3.2 Thành phần môi trường GYPS cải tiến………… 19

Bảng 3.3 Thành phần kháng sinh…… 19

Bảng 3.4 Thành phần 4 loại môi trường chọn lọc………20

Bảng 4.1 Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập 26

Bảng 4.2 Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập được 27

Bảng 4.3 Hàm lượng carotenoid tổng số của các dòng vi tảo phân lập được……… 38

DANH SÁCH HÌNH

Hình2.1.Tế bào vi tảo Thraustochytrid E100……… … 9 Hình2.2.Cấu trúc của một số loại sắc tố carotenoid……… 16 Hình4.1.Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi tảo phân lập được (A)

B3; (B) M6; (C) M10; (D) Đ14……….28 Hình4.2.Hình thái tế bào của một số dòng vi tảo dưới kính hiển vi

(E100)(A)M7;(B)B8;(C)M6;(D)M10;(E)B3;(F)Đ14……… 29

Hình 4.3.Biểu đồ sinh trưởng của 4 dòng vi tảo theo thời gian (A: B3; B:

M6; C: M10; D: Đ14)……… 31 Hình4.4 Đường chuẩn OD 600 nm – trọng lượng khô dòng Đ14……… 31 Hình4.5 Đường chuẩn OD 600 nm – trọng lượng khô dòng B3……… 32 Hình4.6 Đường chuẩn OD 600 nm – trọng lượng khô dòng M6…… 32 Hình4.7 Đường chuẩn OD 600 nm – trọng lượng khô dòng M10…… 35 Hình4.8.Sự khác nhau về hàm lượng carotenoid giữa các dòng vi tảo phân

lập được……… 38

TỪ VIẾT TẮT

FAMEs Fatty acid methyl esters

GYPSct Glucose Yeast extract Peptone Seawater cải tiến

NSW Natural Sea Water

OD Optical Density

PUTAs Polyunsaturated fatty acids

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

có giá trị thương mại

Nắm bắt được điều đó, có rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu trên đối tượng này và một số ứng dụng của vi tảo cũng đã đi vào thực tiễn đời sống Riêng ở các hệ sinh thái như cửa sông, cửa biển hay các đầm ngập mặn nhiều cây đước, mắm và bần thì vi tảo biển thuộc nhóm Thraustochytrid có mặt rất phong phú và đa dạng Riêng ở Việt Nam thì điều kiện tự nhiên với bờ biển dài, nước mặn phong phú vô cùng thuận lợi cho vi tảo phát triển nhưng trong thời gian qua thì nguồn vi tảo phục vụ nuôi trồng thủy sản và nguồn dược liệu vẫn còn hạn chế, chủ yếu phải nhập từ nước ngoài, do đó khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu nước ta kém, khó phát huy giá trị vốn có của chúng Vi tảo có những ưu điểm nổi bật như: tốc độ sinh trưởng nhanh, năng suất thu sinh khối và thu dầu cao hơn các loại thực vật có dầu khác, dễ nuôi trồng, ít cạnh tranh với đất nông nghiệp, không cần nguồn nước sạch, thân thiện với môi trường Những năm gần đây, mặc dù trong nước có nhiều công trình nghiên cứu về vi tảo biển nhóm Thraustochytrid với khả năng sản xuất carotenoid, lipid nhưng còn hạn chế và chưa có tính tổng thể

Trong hàng loạt các chất có khả năng chống oxy hóa trong tự nhiên như flavonoid, vitamin C, vitamin E… được quan tâm và nghiên cứu về tiềm năng sử dụng

làm thực phẩm chức năng thì carotenoid là nhóm sắc tố được tìm thấy đa dạng trong tự nhiên nhất ở sinh vật sống như thực vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm… Kể từ khi được phát hiện đến nay carotenoid được biết đến có tác dụng ngăn chặn một số loại bệnh ở người như bệnh về tim mạch, ung thư và một số bệnh mãn tính Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh carotenoid còn có tính chống oxy hóa Hiện nay, carotenoid được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học Ngoài ra, các yếu tố kinh tế khác như rẻ tiền, năng suất cao cũng làm cho việc sản xuất carotenoid từ nguồn tự nhiên ngày càng được ưu tiên Hơn nữa, nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng ưa chuộng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên, do đó các nghiên cứu và ứng dụng vi tảo ngày càng được quan tâm hơn Xuất phát từ xu hướng chung và những thuận lợi của nước

ta, đề tài nghiên cứu “Phân lập, khảo sát một số đặc điểm sinh học và tuyển chọn môi trường nuôi cấy giúp tăng sinh khối vi tảo Thraustochytrid” được thực hiện

mang tính cấp thiết trong giải quyết các yêu cầu thực tiễn đặt ra hiện nay

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập được một số dòng vi tảo biển dị dưỡng Thraustochytrid ở hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre)

Tuyển chọn được môi trường nuôi cấy giúp tăng sinh khối vi tảo biển dị dưỡng

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về vi tảo

Vi tảo (Microalgae) là tất cả các tảo có kích thước hiển vi, chúng có nhiều đặc điểm giống với sinh vật chân hạch hơn là sơ hạch Phần lớn các loài tảo trong tế bào có chất diệp lục nên chủ yếu là quang tự dưỡng, một số ít sống dị dưỡng, một số ít cộng sinh với Nấm thành Địa y Vi tảo sống chủ yếu trong nước, là thành phần chủ yếu tạo nên năng suất sơ cấp của thuỷ vực và giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự phát triển của hệ sinh thái nước, một số ít sống trên đất ẩm hoặc trên vỏ cây (Dương Đức Tiến, 2006) Tảo có cơ thể dạng tản chưa phân hóa thành thân, rễ, lá gọi là tản thực vật (Thallophyta) và cũng chưa có các loại mô điển hình trong cấu trúc của tản (Barbosa, 2003) Vi tảo là mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn nên chúng là nguồn thức ăn không thể thiếu của nhiều đối tượng sinh vật Đồng thời, Vi tảo còn là nguồn thực phẩm chức năng quan trọng cho con người và động vật nuôi, là nguồn phân bón, có vai trò quan trọng bảo vệ môi trường và cố định CO2 Hàng năm trên thế giới sản xuất

6000 tấn vi tảo khô và đã cho doanh thu 1,25 tỷ USD (Pulz O và Gross W, 2004) Hiện nay, trong số khoảng 50.000 loài tảo trên thế giới thì vi tảo chiếm đến khoảng 2/3 (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006), nhưng cho đến nay chỉ khoảng hơn 40 loài tảo đơn bào được phân lập và nuôi cấy thuần chủng (Brown MR, 2002) có kích thước từ vài µm đến hơn 100 µm (Gachon CM et al., 2007)

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Tảo nói chung và vi tảo nói riêng có hình thái cơ thể rất đa dạng Có thể chia

thành 8 kiểu hình thái như sau (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006):

- Kiểu Monad: Tảo đơn bào, sống đơn độc hay thành tập đoàn, chuyển động nhờ lông roi

- Kiểu Pamella: Tảo đơn bào, không có lông roi, sống chung trong bọc chất keo

thành tập đoàn dạng khối có hình dạng nhất định hoặc không Các tế bào trong tập

đoàn không có liên hệ phụ thuộc nhau

- Kiểu Hạt: Tảo đơn bào, không có lông roi, sống đơn độc

- Kiểu Tập đoàn: Các tế bào sống thành tập đoàn và giữa các tế bào có liên hệ với nhau nhờ tiếp xúc trực tiếp hay thông qua các sợi sinh chất

- Kiểu Sợi: Cấu tạo thành tản (thallus) đa bào do tế bào chỉ phân đôi theo cùng một mặt phẳng ngang, sợi có phân nhánh hoặc không

- Kiểu Bản: Tản đa bào hình lá do tế bào sinh trưởng ở đỉnh hay ở gốc phân đôi theo các mặt phẳng cả ngang lẫn dọc Bản cấu tạo bởi một hay nhiều lớp tế bào

- Kiểu Ống: Tản là một ống chứa nhiều nhân, có dạng sợi phân nhánh hay dạng

cây có thân, lá và rễ giả (rhizoid) Các tế bào thông với nhau vì tuy phân chia nhưng

không hình thành vách ngăn

- Kiểu Cây: Tản dạng sợi hay dạng bản phân nhánh, hoặc có dạng thân - lá - rễ

giả Thường mang cơ quan sinh sản có mức độ phân hóa cao

2.1.2 Cấu tạo tế bào

Tế bào của vi tảo có nhiều đặc điểm chung của các sinh vật có nhân thật

(Eukarya) (Becker, 1994) Theo Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà (2006), thành

tế bào của vi tảo cấu tạo bởi polysaccharide Thành tế bào gồm các sợi cellulose liên kết thành bộ xương (skeleton) nhằm bảo vệ và duy trì hình dạng ổn định cho tế bào Một số vi tảo có mannan hay xylan thay thế cho cellulose Ngoài ra còn có phần vô định hình tạo nên chất nền của thành tế bào Bên ngoài thành tế bào ở một số vi tảo có màng keo chứa các polysaccharide có giá trị thực tiễn như alginate, fucoidine, agar, carragenan, porphyrane, furcelleran, funoran Nhiều vi tảo đơn bào có thành tế bào chỉ là chất nguyên sinh đậm đặc hay chu chất (periplast) Tế bào của nhiều vi tảo vận động được là nhờ lông roi (flagella) Roi cấu tạo bởi 9 cặp vi ống bao quanh 2 vi ống ở giữa và được bao bọc bởi màng sinh chất Hai vi ống giữa xuất phát từ đĩa gốc (dense

plates) và thể gốc (basal body)

Màng sinh chất cũng giống như ở các sinh vật khác Trong tế bào chất có nhiều bào quan khác nhau Sắc lạp (chromoplast) của vi tảo có cấu tạo như ở thực vật, gồm hai lớp màng bao bọc, bên trong có chất nền (stroma) cùng với hệ thống các túi dẹt gọi

là thylakoid Các thylakoid xếp chồng lên nhau tạo thành loại cấu trúc giống như grana

ở thực vật Trên màng của thylakoid có nhiều chất diệp lục (chlorophyll) và các enzyme tham gia vào quá trình quang hợp Ngoài chất diệp lục (a,b,c,d) còn có các sắc

tố carotenoid, phổ biến nhất là β-carotene Nhiều vi tảo chứa sắc tố xanthophyll, phycobiliprotein Trong chất nền của sắc lạp còn có DNA dạng vòng và ribosome Đôi khi sắc lạp có một vùng đậm đặc protein liên kết với các sản phẩm dự trữ tạo thành một cấu trúc gọi là nhân tinh bột hay nhân protein (pyranoid) Sắc lạp còn có

chứa các giọt lipid nhỏ nằm giữa các thylakoid Một số vi tảo còn có thêm một hai lớp mạng lưới nội chất lục lạp (CER- chloroplast endoplasmic reticulum) Ngoài ra, còn có

vô sắc lạp gồm leucoplast và amyloplast Chúng làm nhiệm vụ tích lũy chất dự trữ Ty thể của vi tảo cũng tương tự như ty thể của các sinh vật khác Đó là bào quan có hai lớp màng bao bọc, màng ngoài trơn nhẵn còn màng trong ăn sâu vào phía trong chất nền và tạo thành những mào (crista) trên đó mang nhiều loại enzyme hô hấp Chất nền của ty thể có chứa DNA và ribosome Tế bào của vi tảo cũng có thể Golgi (Golgi body) như ở tế bào nhiều sinh vật khác Đó là các túi dẹp xếp hầu như song song với

nhau và có hình vòng cung, phía lồi gọi là mặt trans còn phía lõm gọi là mặt cis Thể

Golgi ở vi tảo làm nhiệm vụ tổng hợp và tiết ra polysaccharide Tế bào chất (cytoplasm) của vi tảo có chứa ribosome 80S và các giọt lipid Một số vi tảo di động

có các nhóm hạt lipid màu vàng cam cấu tạo nên các điểm mắt (stigma) Vi tảo còn có không bào co bóp (contractile vacuoles) giúp cho việc duy trì nước trong tế bào và loại

bỏ chất thải ra khỏi tế bào

Nhân tế bào ở vi tảo không khác biệt rõ rệt so với các tế bào nhân thực khác nhưng hầu hết là nhân đơn bội Nhân có màng kép bao bọc, trong nhân có DNA (Oh-Hama và Miyachi, 1992)

Ở các vi tảo đơn bào, sinh sản sinh dưỡng thực hiện bằng cách phân đôi tế bào

Ở các vi tảo tập đoàn có một số tế bào phân chia nhanh hình thành những tập

đoàn nhỏ bên trong tập đoàn mẹ

- Sinh sản vô tính: Được thực hiện bằng các bào tử chuyên hóa, có roi (bào tử

động) hay không roi (bào tử bất động), hình thành trong túi bào tử, về sau bào tử nảy

mầm thành tản mới

- Sinh sản hữu tính: Được thực hiện bằng sự kết hợp của những tế bào chuyên hóa gọi là giao tử, hình thành trong các túi giao tử đơn bào

2.1.4 Phân loại

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều hệ thống phân loại vi tảo Các hệ thống phân loại này đều dựa vào màu sắc, cấu trúc tản Vi tảo chủ yếu thuộc về các chi trong các ngành sau đây:

Ngành tảo lông roi (Heterokonta): Theo Gordon và Giovannoni (1996) ngành này còn là ranh giới giữa nấm và tảo Một khác biệt rõ rệt nhất của ngành này với các ngành trong hướng tiến hoá sắc tố vàng và có roi lệch là động bào tử có điểm mắt gồm các hạt nhỏ không đều nhau gắn ở đỉnh trước của động bào tử, sát với roi, nhưng không có màng tách biệt như điểm mắt ở tảo mắt Động bào tử giống amíp, luôn có một roi hướng về phía trước và có hai hàng lỏng Khác biệt về siêu cấu trúc của ngành này là thể golgi không có ở tế bào chuyển động Khác biệt nữa là sắc tố violaxanthin là một trong các sắc tố chính của ngành lại không có ở các ngành khác và chỉ có diệp lục

a với b carotin mà không có diệp lục b Tế bào dinh dưỡng khi già có thể có nhiều nhân và vài thể màu Động bào tử trần và hơi có dạng amíp Một số chi thuộc nhóm

này thường gặp: Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium

và Ulkenia (Hoàng Thị Lan Anh et al., 2010)

Ngành tảo đỏ (Rhodophyta): phần lớn tảo đỏ sống ở biển, phân bố ở mực nước

sâu hơn 200m (Carvalho et al., 2006), tản đa bào hình sợi phân nhánh hay hình bản dẹp

có kích thước <0,5m và gồm một số đại diện Porphyridium, Rhodella (Nguyễn Lân

Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006)

Ngành tảo lục (Chlorophyta): là ngành lớn và đa dạng nhất, dễ phân biệt với ngành khác vì có màu lục giống thực vật (Lothar et al., 2004), có cấu tạo đơn bào, tập đoàn hay đa bào hình sợi đơn, phân nhánh hay hình bản mỏng (Lothar et al., 2012)

gồm một số đại diện Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcus, Closterium, Volvox…

(Tatyana et al., 2006)

Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): sống riêng rẽ, tế bào kiểu monad có một hay hai lông roi Thành tế bào chỉ là chất nguyên sinh đậm đặc lại do đó hình dạng có thể thay đổi Có không bào co bóp làm nhiệm vụ thải nước và các chất bài tiết Nhân nằm ở phần sau của tế bào Lục lạp hình khay hay hình phiến nằm rải rác hay tập trung Sắc

tố là chlorophyll a, b và carotenoid Hình thức sinh sản thường là phân đôi Tảo phân

bố chủ yếu ở các thủy vực nước ngọt, môi trường có dinh dưỡng cao Một số ít sống ở môi trường nước lợ có nồng độ muối dưới 0,5% Phần lớn có đời sống dị dưỡng Một

số chi thường gặp Euglena gracilis, Euglena polymorpha, Menoidium

tortuosum,…(Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Hoài Hà, 2006)

2.1.5 Giá trị dinh dƣỡng của vi tảo

Ưu điểm của vi tảo là có kích thước phù hợp, dễ tiêu hóa, ít gây ô nhiễm môi trường, không có độc tố, có thể chuyển hóa trong chuỗi thức ăn, có tỷ lệ phát triển nhanh, có khả năng nuôi sinh khối lớn, cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi Theo Brown et al (1997) thì hàm lượng protein của vi tảo dao động từ

6 - 52%, carbohydrate 5 - 23% và lipid 7 - 23% Tất cả các loài vi tảo có thành phần axit amin tương tự nhau, giàu các axit amin không thay thế và không bị thay đổi nhiều trong các pha phát triển và điều kiện nuôi trồng Polysaccharides của vi tảo có biến động về thành phần đường, trong đó hàm lượng về glucose cao đạt từ 21 - 87% Các acid béo không bảo hòa đa nối đôi (PUTA) chiếm hàm lượng khá cao trong sinh khối

vi tảo (Apt EK và Behrens WP, 1999) Vi tảo còn góp phần bảo vệ môi trường nuôi thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa (Nguyễn Như Thanh et al., 2004) Hơn nữa, vi tảo có thể sống trong môi trường nước thải, tiêu thụ các hợp chất hữu cơ làm sạch nước thải (Scragg et al., 2002)

Vi tảo có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa nhiều protein và acid amine Tổng các acid amine không thay thế có thể chiếm tới 42%, đặc biệt là lysine cao hơn nhiều so với lúa mạch Giá trị về vitamin trong tảo lam cũng rất lớn, hàm lượng vitamin A, B,

K và nhiều yếu tố sinh trưởng khác, cao hơn nhiều so với các loại thức ăn khác (Fradique et al., 2010) Nhiều tảo đơn bào được nuôi trồng công nghiệp để tạo ra thuốc

bổ trợ giàu protein, vitamin và vi khoáng dùng cho người Ngoài ra một số tảo lam còn chứa hoạt chất có giá trị y học (Mišurcová et al., 2012)

Nhiều tảo biển còn được khai thác để sản xuất thạch (agar), alginate, sản phẩm giàu iod (Lembi và Waaland, 1988) Một số vi tảo được dùng để sản xuất carotenoid,

astaxanthin, các acid béo không bão hòa (Christaki et al., 2012) Dựa vào các yếu tố

kinh tế khác như rẻ tiền, năng suất cao cũng làm cho việc sản xuất carotenoid từ nguồn

tự nhiên ngày càng được ưu tiên (Galano, 2007) Nguồn vi tảo sản xuất carotenoid phân bố rộng rãi trong tự nhiên Sắc tố carotenoid trong vi tảo đã được chứng minh tầm quan trọng của nó trong nhiều ứng dụng đời sống, đặc biệt là lĩnh vực y tế, thực phẩm dinh dưỡng và nuôi trồng thủy sản (Guedes et al., 2011) Vi tảo hiện nay được

sử dụng chính như thức ăn tươi sống trong nuôi trồng ấu trùng, cá hồi và cả động vật

nổi (zooplankton), thức ăn của các động vật nguyên sinh Các loài vi tảo như

Dunaliella salina, Haematococcus pluvialis và Spirulina thường được dùng để cung

cấp chất bổ sung dinh dưỡng trong thức ăn cho nuôi trồng thủy sản

Phần lớn vi tảo đều có hàm lượng cao về axit ascorbic (vitamin C) và riboflavin (vitamin B2) Vi tảo có hàm lượng vitamin cao được sử dụng trong thực phẩm chức

năng như Nannochloris atomus, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis sp.,

Pavlova lutheri, Pavlova pinguis, Stichococcus sp., Chaetoceros muelleri, Thalassiosira pseudonana, Isochrysis sp (T ISO) và Tetraselmis sp đã được Brown

et al (1999) công bố Vi tảo còn có hầu hết các loại vitamin quan trọng, đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật nuôi như vitamin B1, B2, B6, B12, H, C, E, K và carotenoid (tiền vitamin A)…Thành phần các vitamin giữa các loài vi tảo khác nhau là khác nhau

Thành phần dinh dưỡng trong vi tảo có thể khác nhau phụ thuộc vào từng loài, các pha phát triển và điều kiện nuôi trồng khác nhau như ánh sáng, nhiệt độ, pH, độ mặn, môi trường nuôi (Khalil ZI et al., 2010) Vi tảo ngày nay đang là thức ăn không thể thiếu và mang tính chất quyết định trong nuôi trồng thủy sản (thức ăn cho ấu trùng)

và là dược chất quan trọng đối với sức khỏe con người

Ngoài ra, vi tảo còn có tác dụng kích thích enzyme tiêu hóa và nâng cao tốc độ tăng trưởng của vật nuôi (Brown MR, 2002) Theo nghiên cứu của Spolaore et al (2006) cho thấy vi tảo còn hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc

nhóm Virio-thường là tác nhân gây bệnh cơ hội

Thraustochytrid nhìn chung được khai thác để làm nguồn nhiên liệu thay thế acid

béo và nguồn sắc tố carotenoid cho mục đích thương mại và công nghiệp trong bối cảnh các nguồn này có nguy cơ cạn kiệt So sánh sắc tố carotenoid trong một số thực vật thì Thraustochytrid cung cấp sắc tố này nhiều, ổn định và tinh khiết hơn

2.1.6 Sơ lƣợc về vi tảo nhóm Thraustochytrid và tình hình nghiên cứu

Thraustochytrid – nhóm vi tảo dị dưỡng gồm những vi sinh vật không quang

hợp, dị dưỡng được xếp vào ngành nấm và Chromista (Cavalier-Smith, 1993;

Cavalier-Smith et al., 1994) Họ này có một số chi như: Thraustochytrium,

Schizochytrium, Ulkenia Hiện tại nó được xếp vào ngành Stramenopila, cùng với

oomycetes và labyrinthulids (Eduardo M Leaño, 2004) hoặc theo Leander và Porter (2001) chúng là một trong ba nhóm của ngành Labyrinthulomycetes, hai nhóm còn lại

là Labyrinthulids và Aplanochytrids Sau đó Thraustochytrid được xếp vào giới Heterokon, ngành Chromophyta (Stramenopiles) (Cavalier-Smith, 1993; Honda et al., 1999) Trãi qua nhiều lần được phân loài và xác định thì thraustochytrid được phân

theo (Metz et al., 2010), cụ thể là thuộc bộ Eukaryota, ngành Chromophyta, giới

Heterokonta, họ Thraustochytriaceae, lớp Thraustochytriales

Hình 2.1 Tế bào vi tảo Thraustochytrid E100

(http://www.nio.org/index/option/com_newsdisplay/task/view/tid/4/sid/23/nid/24,

ngày 10/6/2014)

Đặc điểm đặc trưng của sinh vật này là màng tế bào không phải cellulose mà

được cấu thành từ L-glactose, với protein (Dar-ley et al., 1973) Nó sở hữu hệ thống

ectoplasmis để gắn vào vị trí nhằm phân hủy chất hữu cơ bằng việc tiết enzyme

(Eduardo M Leaño, 2004) Vi tảo có hình thức sinh sản bằng cách phân chia liên tiếp tạo thành 4 hay 8 hay một khối các tế bào; mỗi tế bào phát triển thành túi động bào tử

và giải phóng động bào tử; động bào tử biệt hóa thành tế bào non (Honda D et al., 1998) Theo nhiều nghiên cứu cho kết quả là vi tảo có khả năng phát triển nhanh và hàm lượng carotenoid cao Theo Tsunehiro Aki et al (2003) thì dòng vi tảo Thraustochytrid KH105 phân lập từ lá thông rụng có khả năng sản xuất carotenoid với đặc điểm dịch của KH105 màu cam hay vàng Điều đó cho thấy carotenoid tích trữ ở dạng nội sắc tố, sắc tố này được trích bằng chloroform hoặc acetone hay ethanol với đĩa có màng silic mỏng và β-carotene được xác định thông qua độ hấp thụ ở bước sóng

464 và 492 nm Theo Raghukuma và Schaumann (2003) kích thước của các loài

Thraustochytrid khoảng từ 5 - 20µm Hiện tại đã nhiều nghiên cứu phân lập sinh vật

phù du này, ở nước ta nhiều nghiên cứu gần đây tập trung nghiên cứu hai chi phổ biến

là Thraustochytrium và chi Schizochytrium Đối tượng phục vụ cho nghiên cứu thường

là lá đước, bần và mắm Trên môi trường lá rụng thì Thraustochytrid có vai trò quan trọng trong việc phân hủy chất hữu cơ từ loại lá này Đặc điểm nhận biết khuẩn lạc của

chi Schizochytrium và Thraustochytrium là khuẩn lạc có màu trắng sữa hoặc hồng hay

vàng được phân lập trên môi trường GYP thạch agar (Raghukuma và Schaumann, 2003)

Một sự đa dạng về môi trường sống tự nhiên của các loài thuộc nhóm này là chúng có thể sinh sống ở tầng mặt (Booth và Miller, 1968; Haythorn et al., 1980; Miller và Jones, 1983), ở các cửa sông (Ulken, 1981), trong nước biển (Goldstein và Belsky, 1964; Bahnweg, 1972; Sparrow, 1974; Gaertner, 1981) và trong các vùng đất mặn (Booth, 1971) Trong các tiềm năng của Thraustochytrid thì việc mà các loài của chi vi tảo này có khả năng sản xuất carotenoid như β - carotene, xanthophylls, astaxanthin và canthaxanthin (Aki et al., 2003; Carmona et al., 2003) được ứng dụng trong y học con người và trong nuôi trồng thủy sản là vấn đề được quan tâm trong nghiên cứu

Những nghiên cứu về vi tảo ngày càng được phát triển với các phương tiện nghiên cứu ngày một nâng cao, không dừng ở mức độ nghiên cứu hình thái, cấu trúc trước kia mà đi sâu vào mức độ vi mô, phân tử (Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)

2.1.6.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Đối tượng vi tảo nói chung và nhóm Thraustochytrid nói riêng đang ngày chứng

tỏ tầm quan trọng của mình trong đời sống Do đó việc nghiên cứu vi tảo ở nước ta hiện nay đang là xu hướng mới Việc nghiên cứu này được thực hiện rộng khắp từ các viện trường, các sở và đặc biệt ở Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam, việc nghiên cứu

vi tảo được tiến hành thường xuyên Dưới đây là một số nghiên cứu:

- Một nghiên cứu trước đây của Hoàng Thị Lan Anh et al (2010) đã phân lập được

chủng vi tảo biển dị dưỡng mới TN22 thuộc chi Thraustochytrium giàu DHA và

carotenoid từ mẫu lá đước ở đầm ngập mặn Thị Nại - Bình Định Sau 4 ngày nuôi cấy trong bình tam giác 1 lít, hàm lượng carotenoid đạt 5216 µg/kg sinh khối khô Với

kích thước nhỏ (khoảng 4 - 6 µm), hàm lượng carotenoid cao, T striatum TN22 được

xem là đối tượng tiềm năng cho việc sử dụng làm thức ăn tươi sống cho các đối tượng thủy sản

- Nghiên cứu vi tảo và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, thuốc chữa bệnh, khai thác các chất có hoạt tính sinh học (Đặng Diễm Hồng et al., 2007)

- Nghiên cứu về cơ chế chống chịu và bảo vệ của vi tảo dưới các điều kiện bất lợi của môi trường (Dương Trọng Hiền, 1999)

- Nghiên cứu vi tảo trong sản xuất nhiên liệu sinh học (Nguyễn Minh Tuấn et al., 2012; Trương Vĩnh et al., 2008; Trương Vĩnh, 2010; Ho et al., 2012)

2.1.6.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, vi tảo được nghiên cứu và khai thác từ rất sớm khoảng những năm

60 của thế kỷ 20 (Iwamoto, 2004) Hiện nay Hoa Kỳ và Ấn Độ là những quốc gia luôn

đi đầu về nghiên cứu và sản xuất vi tảo (Pulz et al, 2004) Riêng vi tảo nhóm Thraustochytrid đã và đang nhận được sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu Dưới đây là một số nghiên cứu:

- Tác giả Unagul et al (2007) đã sử dụng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi (khoảng 33% (v/v)) làm cho sinh khối vi tảo tăng từ 2 - 3 lần, hàm lượng DHA tăng đạt 28g/l

- Nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc và chức năng bộ máy quang hợp của vi tảo dưới các điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ tới hạn, nồng độ muối cao, khô hạn (Reger và Krauss, 1970; Jack và Jo-Ruth, 1971; MCBrien và Hassal, 1976; James và Ruby, 2009;Antonietta et al., 2012)

- Thraustochytrid – Nguồn carotenoid đầy tiềm năng (Tsunehiro Aki et al., 2003)

- Nghiên cứu về cơ chế chống chịu và bảo vệ của tảo dưới các điều kiện bất lợi của môi trường (Silverberg et al., 1976;MCBrien và Hassal, 1976)

- Giám sát in vivo trạng thái sinh lý của tảo dưới các điều kiện môi trường bất lợi (Blinks, 1951; Lewin, 1968)

- Khảo sát thực vật phù du, sự xuất hiện và tồn tại của tảo độc, tảo lam và thiết lập mối quan hệ giữa sự nở hoa của nước cùng với các yếu tố môi trường khác nhau (pH, nhiệt

độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, nước thải công nghiệp và nước thải dân dụng, thành phần dinh dưỡng của môi trường biển) (Lathrop et al., 1998; Landsberg, 2002; Sellner et al., 2003)

- Nghiên cứu sử dụng vi tảo trong xử lý nước, nước thải nuôi thủy sản tập trung và làm sạch nước thải sau quá trình đã nuôi thủy sản (Karin, 2006; Meng et al., 2009)

- Nghiên cứu vi tảo và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng, thuốc chữa bệnh, khai thác các chất có hoạt tính sinh học (Aki et al., 2003; Carmona et al., 2003; Burja et al., 2006; Graziani et al., 2012).

- Nghiên cứu vi tảo trong sản xuất nhiên liệu sinh học (Chisti, 2007), nguyên liệu cho công nghiệp như chất dẽo sinh học bioplastic, và sử dụng sinh khối vi tảo sau khi tách chiết các chất có hoạt tính sinh học để sản xuất agar, alginate, giấy,…(Lembi và Waaland, 1988)

2.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến nuôi sinh khối vi tảo

2.2.1 Nhiệt độ và độ mặn

Nhiệt độ và độ mặn là những chỉ tiêu sinh lý cần thiết để lựa chọn nhóm vi tảo

Thraustochytrid từ nhiều khu vực địa lý khác nhau Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên

quá trình quang hợp và khả năng tổng hợp chất của tế bào Theo K W Fan et al (2002) thì vi tảo Thraustochytrid có thể phát triển ở các nồng độ muối khác nhau 5 - 35%0 và sinh trưởng mạnh nhất ở nước biển (15 - 35%0) Điều đó chỉ ra rằng nồng độ muối ở vùng phân lập không ảnh hưởng đến khả năng chịu muối của vi tảo Theo báo

cáo của Bahnweg (1979) thì cả Schizochytrium và Thraustochytrium có thể phát triển

ở nồng độ muối thấp hơn 1%o, nhưng không có sự tồn tại nào của hai loài này trong nước cất tinh khiết Theo Goldsteinet Belsky (1963) thì những chi vi tảo này càng phát triển tốt khi nồng độ muối môi trường càng cao, trong khi đó nhiệt độ thì ngược lại, nghĩa là nhiệt độ càng cao ức chế sự phát triển của Thraustochytrid Tuy nhiên, chúng

có thể sinh trưởng ở điều kiện môi trường với nồng độ muối bằng 0 (Yokochi et al., 1998)

Nước biển là nhân tố quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của vi tảo chứa các nguyên tố Na, Ca, K, Mg trong thành phần , chúng cần thiết cho sự phát triển của các loài nấm biển, tảo biển (Jennings, 1983) Sự thiếu kim loại kali (K) là nguyên nhân làm cho Thraustochytrid không phát triển (Bahnweg, 1979) và theo Siegenthaler et al (1967) thì ion kim loại natri (Na) cần thiết cho tăng sinh khối mạnh ở Thraustochytrid Cũng theo một nghiên cứu của Garrill et al (1992) thì Na có thể thay thế K trong vai

trò giúp cho Thraustochytrid sinh trưởng tăng sinh khối và tổng hợp carotenoid Cũng

theo Barsanti và Gualtieri (2006), hầu hết các loài tảo có thể sinh trưởng tốt ở điều kiện nuôi cấy có nồng độ muối thấp hơn so với nơi thu mẫu và thường nồng độ tối ưu

là 20 – 24g/L

2.2.2 pH

Theo một số nghiên cứu thì các loài vi tảo thuộc Thraustochytrid sinh trưởng và phát triển trên một vùng rộng pH Điều thú vị khi thấy rằng mặc dù chúng tăng trưởng mạnh hơn ở các môi trường với pH ban đầu thấp, nhưng pH đo được ở hầu hết môi

trường nước lọc luôn kiềm, chỉ ngoại trừ Ulkenia sp (Kasetsart J, 2007)

Mỗi loài sinh vật sinh trưởng tốt ở vùng pH nhất định và riêng biệt pH môi trường nuôi cấy thường ảnh hưởng đến khả năng phân ly muối, phức chất và tính hòa tan các muối của kim loại (Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999) nên pH

sẻ ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng vi tảo nói riêng và vi sinh vật nói chung Theo Barsanti và Gualtieri (2006), ngưỡng pH của hầu hết các loài vi tảo được nuôi cấy từ 7

- 9 nhưng tối ưu là pH 8,2 - 8,7, mặc dù chúng được thu về từ những vùng có pH rất khác nhau

2.2.3 Dinh dưỡng môi trường

Mỗi loài tảo cần một môi trường sống và sinh trưởng thích hợp, hiện nay có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy tảo được sử dụng Đa số các môi trường có thành phần gồm các nguyên tố đa lượng (nitrat, phosphate,…), nguyên tố vi lượng (Fe, Mn, Cu, Si Bo,…) Tùy vào mục đích nghiên cứu mà chọn môi trường với thành phần dinh dưỡng thích hợp Một nghiên cứu của Leaño et al (2003); Arafiles et al (2011) thì tác giả đã dùng môi trường GYPS có cải tiến bổ sung kháng sinh steptomicine và ampiciline, thành phần cụ thể (g/l) là 3,0 g glucose, 1,25 g yeast extract, 1,25 g peptone, 1,0 L 50% nước biển tự nhiên (NSW) ở pH 6,0, 15,0 g agar (Biogel) (môi trường lỏng thì không cần agar) Theo Huang et al (2001) môi trường cơ bản để phân lập Thraustochytrid là GPY (g/l) gồm glucose 3,0g, polypepton 2,0g, cao nấm men (yeast

extract) 1,0g, agar 15,0g và 50% nước biển tự nhiên

Thông thường ở các môi trường khác nhau thì tốc độ tăng trưởng và khả năng sản xuất carotene cũng khác nhau Một báo cáo của Anbu et al (2007), các dòng vi tảo Thraustochytrid sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau về các thông số như nhiệt độ, pH, phần trăm nước biển, nồng độ glucose.v.v Kết quả của

việc khảo sát cho thấy vi tảo biển Thraustochytrium sp cho sinh khối lớn nhất sau 3

ngày ở môi trường được ủ 30oC, nồng độ nước biển là 60%, glucose 3% và pH = 6 còn

Schizochytrium sp cho sinh khối lớn nhất ở 20oC, nồng độ nước biển là 50%, nồng độ glucose 5%, pH môi trường 6

Ngoài các yếu tố về môi trường và ngoại cảnh trên thì nguồn đường như glucose, fructose, sucrose, đường mía,… và nguồn nitrogen như peptone, đậu nành, sữa (skimmed milk), ammonium sulfate, kali nitrát, natri nitrat hay monosodium glutamate (MSG) cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sinh trưởng và phát triển của vi tảo

2.3 Một số phương pháp xác định quá trình sinh trưởng của vi tảo

2.3.1 Đo mật độ thông qua giá trị OD

Mật độ tế bào cũng như sinh khối vi tảo có thể xác định bằng cách đo độ hấp thụ dịch tảo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, cho biết khả năng tăng sinh khối chứ không trực tiếp xác định được số lượng tế bào (Trương Vĩnh, 2010)

2.3.2 Đếm mật số tế bào

Thông qua buồng đếm hồng cầu (Neubauer) hoàn toàn có thể xác định được mật

số tế bào nhờ vào kính hiển vi Buồng đếm là một phiến kính đặc biệt, trên bề mặt chia thành các ô vuông nhỏ, cạnh ô vuông nhỏ là 1/20mm, khoảng cách giữa phiến kính và

lá kính là 0,1mm Ta có thể tích mỗi ô nhỏ là : 1/10*1/20*1/20mm3 =1/4000mm3

2.4 Sắc tố carotenoid

2.4.1 Khái niệm và phân bố

Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn Ở thực vật, sắc tố carotenoid tham gia vào quá trình quang hợp và bảo vệ chúng khỏi sự phá hủy của ánh sáng Còn ở con người thì nguồn carotenoid chủ yếu từ trái cây và hoa quả có màu vàng, cam hay đỏ trong các bữa ăn (A.V Rao và L.G Rao, 2007) Carotenoid thường tích lũy trong các mô phơi nhiễm ánh sáng như mô dưới da, qua đó làm tăng khả năng kháng nhiễm (Stahl và Sies, 2007) Với các loài vi tảo biển được nghiên cứu

từ lá đước, bần và mắm thì carotenoid chính trong Thraustochytrid là astaxanthin

(3,3’-dihydroxy-β,β-carotene-4,4’dione) (Vazquez et al., 1997) Có thể cải thiện sắc tố carotenoid thông qua phân tách hay kết hợp giữa gây đột biến và cải thiện môi trường lên men (Fontana et al., 1996)

2.4.2 Phân loại và cấu tạo

Hiện nay, theo thống kê của WHO (2001) thì có khoảng hơn 500 loại carotenoid được biết đến và chúng được chia thành 2 loại xanthophylls (có chứa oxy)

và carotenes (chỉ có hydrocacbon, không có oxy) Trong đó, có 5 loại sắc tố đã được tổng hợp và sản xuất quy mô công nghiêp là lycopene, β-carotene, canthaxanthin, zeaxanthin và astaxanthin (Del Campo et al., 2007; Jackson et al., 2008)

Hầu hết carotenoid đều có cấu trúc polyisoprenoid, là một chuỗi liên hợp của những nối đôi Cũng chính vì thế mà cấu hình không gian của nó tồn tại ở cả hai dạng

cis-trans

(Nguồn: Pharmacological Research 55, 2007, 207–216)

Hình2.2 Cấu trúc của một số loại sắc tố carotenoid 2.4.3 Tính chất vật lý

- Kết tinh ở dạng tinh thể, hình kim, hình khối lăng trụ, đa diện hoặc hình thoi

- Nhiệt độ nóng chảy 130-220oC (Harry, 1993)

- Hòa tan trong chất béo, các dung môi chứa clo và các dung môi không phân cực

khác, làm cho hoa quả có màu da cam, màu vàng và màu đỏ (Britton, 1995)

- Tính hấp thụ ánh sáng: Chuỗi polyene liên hợp đặc trưng cho màu thấy được của carotenoid Dựa vào quang phổ hấp thụ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch thẳng hay mạch vòng Ngoài ra trong mỗi dung môi hòa tan khác nhau, khả năng hấp thụ ánh sáng tối đa cũng khác nhau với cùng một loại Khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh, chỉ cần 1 gam cũng có thể thấy được bằng mắt thường (Zur et al., 2000)

- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ carotenoid, có thể kể đến như quá trình biến đổi của thực phẩm, quá trình đun nấu,.v.v và chúng được hấp thụ ở niêm mạc của đường tiêu hóa bằng con đường khuếch tán thụ động Hợp chất

astaxanthin được xác định bằng phương pháp biến đổi của Fontana et al (1996) và

những đồng phân của astaxanthin được xác định bằng các màng sắc ký theo Donkin (1976)

2.4.4 Tính chất hóa học

- Không hòa tan trong nước, rất nhạy với acid và chất oxy hóa, bền vững với kiềm Do có hệ thống nối đôi liên hợp nên nó dễ bị oxy hóa mất màu hoặc đồng phân hóa, hydro hóa tạo màu khác

- Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu: nhiệt độ, ánh sáng, phản ứng oxy hóa trực tiếp, tác dụng của ion kim loại, ion, nước

- Dễ bị oxy hóa trong không khí nên cần bảo quản trong khí trơ, chân không Ở nhiệt độ thấp nên tránh ánh sáng mặt trời (Harry, 1993)

- Carotenoid khi bị oxy hóa tạo hợp chất có mùi thơm như các aldehyde không

no hoặc ketone đóng vai trò tạo hương thơm cho trà (Fanny et al., 2012)

2.4.5 Chức năng

Isoprenoids là chất hóa học hữu cơ trong tự nhiên được biết đến là tiền chất để tổng hợp các chất như stocopherols,chlorophylls, phylloquinone (PhQ), gibberellins,

abscisic acid, monoterpenes và plastoquinone (PQ)

- Carotenoid được xem là tiền vitamin A gồm α-carotenoid và β-carotenoid, đồng thời là chất chống oxy hóa (Johnson, 2002; Krinsky và Johnson, 2005)

- Chúng được sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm như vitamin bổ sung, thực phẩm chức năng và dùng làm thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm, cá và các loài giáp xác (Del Campo et al., 2007; Jackson et al., 2008) Một trong các loại sắc tố phổ biến nhất là astaxanthin, nó được tổng hợp chủ yếu bởi vi sinh vật biển, chẳng hạn như tảo

lục Haematococcus pluvialis và tích lũy trong cá như cá hồi, đó là lý do cá thu có thịt

màu đỏ tươi Astaxanthin liên quan tới khả năng chữa trị bệnh ung thư, tim mạch (Fassett và Coombes, 2011)

- Có nhiều bằng chứng chứng minh rằng β-carotene, lutein kể cả lycopene có khả năng ngăn chặn sự ảnh hưởng của tia Ultraviolet (UV) - tia gây nên chứng hồng ban

và giúp con người cũng như động vật giảm bớt sự ảnh hưởng xấu ánh sáng mặt trời (Stahl và Sies, 2007)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 06/2014 đến 11/2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật và phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Nguyên vật liệu

- Các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata blume), lá bần (Sonneratia caseolaris)

và lá mắm (Avicennia officinalis) đang trong giai đoạn phân hủy, trôi dạt trên bãi biển

hoặc ở đầm ngập mặn hoặc nằm trên lớp bùn ở rừng ngập mặn của các tỉnh Trà Vinh

và Bến Tre

- Thời gian thu mẫu: 06/2014

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Can nhựa 20 L, bọc nilon, thau nhựa, màng bọc thực phẩm, gòn thấm

nước, kéo, kẹp, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, lame, lamen, micropipette, đầu cone, đèn cồn, bình tam giác, type

Thiết bị: Cân điện tử Orion và Sartorius, máy đo pH, máy khuấy từ HB502, nồi

khử trùng nhiệt ướt, lò vi song, tủ cấy vi sinh vật LABCAIRE (Anh Quốc), tủ mát

4-10oC (Alaska-Mỹ), tủ lạnh -20oC (Akira), kính hiển vi OLYMPUS ( ×10, ×40, ×100) (Nhật Bản), máy lắc ủ (water bath) Heidolph titramax 1000, máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417R, tủ sấy WTC Binder, máy đo quang phổ Genesys 10UV (Mỹ), thiết

bị đo độ mặn

3.1.4 Hóa chất

Cồn 96% và 70%, D-glucose, yeast extract, peptone, NaCl, MgSO4, nước biển tự nhiên, dung dịch KOH, HCl, kháng sinh: Streptomycine, Ampiciline, agar, nước cất 1 lần

3.1.5 Môi trường nuôi cấy vi tảo biển

Bảng 3.1: Môi trường GYPS cơ bản (Arafiles et al., 2011)

Bảng 3.2 Môi trường GYPSct (Arafiles et al., 2011)

Bảng 3.3 Thành phần kháng sinh trong môi trường GYPSct (Arafiles et al., 2011) có cải tiến

Bảng3.4 Thành phần 4 môi trường chọn lọc

NM – 5 (Nghiên cứu này)

NM – 8 (Taha et al

2013)

F – 5 (Perveen et

al 2006)

F – 8 (Taha et al 2013)

Ghi chú: Nước biển NSW sử dụng 15% o

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình phân lập vi tảo

Các dòng vi tảo biển được phân lập theo quy trình của Bremer et al., (2000) có một số cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

3.2.1.1 Thu mẫu

Mẫu được chọn là ba loại lá đước, bần và mắm rụng đang trong giai đoạn phân hủy ở các đầm ngập mặn, trên mặt bùn hay trôi nổi ở các cửa sông, biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Bến Tre Thu mỗi loại 20 lá và rửa bùn sơ bộ những lá đã chọn với nước biển tại nơi lấy mẫu Sau đó cho vào túi nylon và chuyển vào tủ mát 4oC trữ để phục vụ cho nghiên cứu

- Cắt những mẫu lá này thành các mảnh nhỏ khoảng 2-3 mm2 và chuyển các mẫu

lá vào lọ thủy tinh 250ml

- Ngâm trong NSW đã khử trùng khoảng 15 phút

- Đổ bỏ nước ngâm Cho NSW và nước cất đã khử trùng (tỉ lệ 1:1) vào và rửa 4-5 lần Mỗi lần rửa được đặt trên máy khuấy từ trong 20 phút Thực hiện trong tủ cấy vô trùng

Sau khi phân lập, các dòng vi tảo được lưu giữ trong tủ mát 4-6o

C và cấy chuyển trên môi trường mới GYPSct đặc với mỗi tháng/lần

3.2.2 Mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi tảo

- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các dòng vi tảo phân lập được

- Quan sát, mô tả hình thái tế bào của các dòng vi tảo phân lập được dưới kính hiển

vi

- Các bước tiến hành quan sát hình thái tế bào vi tảo:

 Chuẩn bị lame sạch, hơ dưới ngọn lửa đèn cồn

 Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame

 Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi tảo hòa tan vào giọt nước cất vô trùng

 Dùng lamen đậy lên giọt nước cất vô trùng - vi tảo bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí

Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100-1000 lần, chụp lại hình ảnh quan sát được

3.2.3 Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập được

Nhân sinh khối cấp 1: Chuyển cẩn thận một khuẩn lạc đang nuôi cấy trên môi trường GYPS đặc vào ống ống nghiệm 50ml chứa 10ml môi trường lỏng GYPSct+Strep+Amp Nuôi dung dịch trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ ủ là

28oC±1 với điều kiện tối trong 3-4 ngày

Nhân sinh khối cấp 2: Sau nhân giống cấp 1, mật độ vi tảo được chỉnh về

trường GYPSct+Strep+Amp lỏng Tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 28oC±1 trong 10-12 ngày

3.2.4 Xác định trọng lượng khô tế bào vi tảo

Trọng lượng khô tế bào (TLKTB) vi tảo được xác định như sau: Thu hoạch tế

bào trong 100ml dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm dung dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC Đổ bỏ phần dịch lỏng lấy phần tủa là sinh khối tảo, rửa với 50 ml nước cất vô trùng, lặp lại hai lần Chuyển dung dịch tảo sang đĩa petri có đặt một tấm giấy lọc bên trong đĩa (đã cân trọng lượng đĩa petri và giấy lọc trước đó) sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi

3.2.5 Xây dựng đường chuẩn giữa trọng lượng khô tế bào và chỉ số OD

Dựa theo phương pháp của Taha et al (2013) Để xác định trọng lượng khô của các dòng vi tảo phân lập được, tiến hành dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ dịch tảo đo được ở bước sóng λ= 600nm và trọng lượng khô tế bào (TLKTB) của các dòng vi tảo phân lập được trên môi trường NM-8

Các bước tiến hành như sau:

- Sau khi nhân sinh khối các dòng vi tảo đến khi OD đạt được giá trị ≥2,0 với thể tích 500 ml, tiến hành pha loãng dịch tảo ở nồng độ từ 0,2-1,8 bằng chính môi trường nuôi cấy của vi tảo (thể tích dịch tảo ở mỗi nồng độ pha loãng là 100 ml)

- Đo quang phổ các nồng độ pha loãng ở bước sóng 600 nm

- Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong

10 phút Dịch tảo ở các nồng độ pha loãng đem ly tâm có thể tích bằng nhau (100 ml)

- Đổ bỏ phần dịch lỏng, lấy phần tủa là sinh khối tảo

- Sinh khối tảo được sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi

- Cân và ghi nhận sinh khối khô của các dòng vi tảo

- Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft excel để xây dựng đường chuẩn Từ những thông số thu được xây dựng đường chuẩn qua phương trình hồi quy tuyến tính giữa chỉ số OD và TLKTB của vi tảo có dạng y = ax + b Trong đó y là chỉ số OD và

x là TLKTB tương ứng của vi tảo (g/100 ml)

3.2.6 Xác định hàm lƣợng carotenoid

Hàm lượng carotenoid được xác định theo phương pháp của Hoàng Thị Lan Anh

et al (2010) có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Carotenoid được trích với dung môi ethanol 90%

Các bước tiến hành trích carotenoid với dung môi ethanol 90%:

- Nghiền sinh khối tảo tươi với cát thủy tinh và chiết với 10 ml ethanol 90%

- Lọc lấy dịch trong bằng giấy lọc chuyên biệt Whatman GF/C

- Định mức lên 10 ml bằng ethanol 90%

- Đo quang phổ dung dịch sau khi định mức ở bước sóng 480 nm

Hàm lượng carotenoid trong dung dịch được tính theo công thức của Strickland

và Parsons (1972):

Trong đó:

V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (L)

C (carotenoid tổng số) = 4,0 * E480 (µg)

Với E480 là giá trị OD đo được ở bước sóng 480 nm

Hàm lượng carotenoid tính theo trọng lượng khô dựa vào carotenoid tổng số thu được từ dịch trích, chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và đường chuẩn (phương trình hồi quy tuyến tính) thể hiện mối tương quan giữa OD 600 nm và trọng lượng khô của vi tảo có dạng y= ax + b

Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Hàm lượng sắc tố (µg/L) = C/V

3.2.7 Tuyển chọn môi trường nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào

- Khảo sát sự sinh trưởng của các dòng vi tảo được chọn trên cả năm loại môi trường: GYPSct, NM-5, NM-8, F-5 và F-8

- Cách tiến hành như sau:

 Nhân sinh khối cấp 1 như phần 3.4.2

 Dùng bình tam giác 100ml để khảo sát, mỗi môi trường lặp lại 3 lần

 Chuẩn bị môi trường lỏng GYPSct, NM-5, NM-8 F-5, F-8 như Bảng 3.3

có kháng sinh Strep và Amp như Bảng 3.2 với dung tích mỗi bình 50ml/100ml

 Nhân sinh khối cấp 2: Sau 4 ngày kiểm tra mẫu trong ống fancol bằng kính hiển vi, khi đạt điều kiện không bị nhiễm thì lắc đều chỉnh mật số

về OD600nm=0,5 và với thể tích 0,5ml/bình Điều kiện vô trùng

 Nuôi lắc 200vong/phút ở nhiệt độ phòng 28oC±1 bằng máy waterpath

- Hàng ngày chọn một mốc thời gian lúc 10 giờ để đo OD các bình tam giác, đo liên tục để thấy sự thay đổi OD theo thời gian Điều kiện vô trùng

- Tính toán và dùng thống kê để cho thấy sự khác biệt về sinh khối giữa các ngày trong 1 môi trường và giữa các môi trường với nhau Kết quả này cho phép kết luận 1 môi trường ưu thế hơn so với 4 loại môi trường còn lại

3.2.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu

Kết quả nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL)

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi tảo

Tổng cộng có 38 dòng đã được phân lập và tách ròng từ các mẫu lá đước

(Rhizophora apiculata Blume), lá bần (Sonneratia caseolaris) và lá mắm (Avicennia

officinalis) thu tại các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre Trong đó có 20 dòng ở Bến Tre và 18

dòng ở Trà Vinh Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al., (2011), mười lăm dòng vi tảo đã được nhận diện như là

vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid Các dòng tảo được đặt tên theo nguyên tắc: chữ cái đầu tiên là nguồn mẫu lá được sử dụng để phân lập, hai chữ cái kế tiếp là nguồn gốc xuất xứ nơi thu mẫu và số nguyên là thứ tự từ nhỏ đến lớn của các dòng tảo đã phân

lập (Bảng 4.1)

Danh sách các dòng vi tảo đã phân lập ròng được trình bày trong Bảng 4.1:

Bảng 4.1: Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập

4.2 Mô tả hình thái vi tảo

Dựa vào các đặc tính cơ bản của vi tảo, các dòng đã phân lập được xác định bước đầu là nhóm Thraustochuytrid và được miêu tả như bảng 4.2

Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập

B1 Tốc độ mọc nhanh khoảng 1 ngày, bề

mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa

Hình cầu, đường kính khoảng 3-8

µm, sống riêng lẻ

B3 Tốc độ mọc trung bình khoảng 2 ngày,

bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam

Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20

mặt khô, khuẩn lạc có màu vàng nhạt

Hình elip, đường kính khoảng 10µm, sống riêng lẻ

B8 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt trơn, nhô

lên, khuẩn lạc có màu vàng nhạt

Hình cầu, đường kính khoảng 6 µm, sống tập đoàn

Hình bầu dục, đường kính khoảng

M18 Tốc độ mọc chậm, bề mặt bóng, khi mới

phát triển khuẩn lạc có màu vàng nhạt, Hình elip, đường kính khoảng 3 - 17 µm, sống riêng lẻ

Hầu hết các dòng vi tảo này phát triển khá tốt trên môi trường thạch GYPSct, thời gian để khuẩn lạc xuất hiện là từ 2 đến 3 ngày ủ tối ở 28oC±1 Màu sắc khuẩn lạc của các dòng đa số là trắng đục và trắng ngà ngoại trừ một số dòng M10, M1, M6, B8, Đ14 và B3 là khuẩn lạc có màu đặc trưng (hồng, vàng, vàng cam) và có sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo tuổi của khuẩn lạc Điều này là do sự tích lũy carotenoid nội bào của vi tảo Đây cũng là đặc điểm đặc trưng của khuẩn lạc của nhiều dòng vi

tảo dị dưỡng như Thraustochytrium và Schizochytrium đã được phân lập trong những

khi già có màu vàng đậm

khô, khuẩn lạc có màu vàng nhạt Hình bầu dục, đường kính khoảng 3-14 µm, sống tập đoàn

Đ14 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt khô, khi

mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng nhạt

Hình cầu, đường kính khoảng 3 - 6

µm, sống tập đoàn

Hình4.1 Hình thái khuẩn lạc vi tảo Thraustochytrid

nghiên cứu trước đó (Aki et al., 2003; Chatdumrong et al., 2007; Hoàng Thị Lan

Anh et al., 2010; Arafiles et al., 2011)

Hình thái tế bào các của 15 dòng vi tảo cũng đa dạng, đa số dòng có hình cầu, số

ít dòng có hình elip và số còn lại có hình bầu dục Đặc biệt tế bào của dòng Đ14 có khả năng phát triển và phân chia thành từng cụm gồm 2, 4, 8 tế bào hay nhiều hơn Đây cũng là đặc điểm đặc trưng của các dòng vi tảo thuộc vi tảo Thraustochytrid (Goldstein và Belsky, 1964)

Những dòng vi tảo phân lập được khác nhau về cả hình dạng khuẩn lạc, tế bào và nguồn gốc mẫu phân lập, chứng tỏ rằng hệ vi tảo sống rất đa dạng trên các mẫu lá ở các vùng nước mặn

Dựa vào các đặc điểm của khuẩn lạc, hình dạng tế bào, 15 dòng vi tảo được nhận diện thuộc nhóm vi tảo Thraustochytrid Trong đó 4 dòng vi tảo B3, M6, M10 và Đ14

Hình 4.2: Hình thái tế bào của một số dòng vi tảo dưới kính

có màu vàng hoặc hồng và được phân lập từ các nguồn lá khác nhau như lá bần (B3),

lá mắm (M6, M10), lá đước (Đ14) được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

4.3 Kết quả dựng đường chuẩn giữa trọng lượng khô và chỉ số OD

Sau khi xử lý kết quả bằng phần mềm excel, thu được kết quả như sau: