Khảo sát một số đặc điểm hóa học và tác dụng chống oxy hóa antioxydant của các hợp chất flavonoid chiết xuất từ một số loài lan kim tuyến của việt nam

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 Khảo sát số đặc điểm hóa học tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) hợp chất Flavonoid chiết xuất từ số loài lan Kim tuyến Việt Nam Đỗ Thị Gấm1,*, Hà Việt Hải2, Chu Hoàng Hà3, Phạm Bích Ngọc3 Trung tâm Phát triển Cơng nghệ cao, VAST, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, VAST, 18 Hồng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Viện Cơng nghệ Sinh học, VAST, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 16 tháng năm 2017 Chỉnh sửa ngày 12 tháng năm 2017; Chấp nhận đăng ngày 10 tháng 10 năm 2017 Tóm tắt: Chiết xuất định lượng Flavonoid tổng số từ loài lan Kim tuyến Việt Nam, kết cho thấy hàm lượng Flavonoid tổng số cao loài Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl (1.345%), sau đến lồi Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex (1.044%) thấp loài Anoectochilus aff anamensis Aver (0.903%) Hợp chất Flavonoid tích lũy chủ yếu lan Kim tuyến Tiến hành sắc ký lớp mỏng chế phẩm Flavonoid tổng số thu từ lồi lan Kim tuyến hệ dung mơi Ethylaxetat: Toluen: Axit formic: Nước = 7:3:1,5:1 (v:v:v:v) nhận thấy có từ 9-14 cấu tử tách ra, cấu tử tách rõ ràng, riêng biệt có đặc điểm định tính đặc trưng nhóm chất Flavonoid Hợp chất Flavonoid chiết xuất từ loài lan Kim tuyến thể hoạt tính chống oxy hóa tốt thơng qua phản ứng oxy hóa indigocarmin enzym peroxydaza nhóm máu O Thứ tự chống oxy hóa lồi lan Kim tuyến nghiên cứu sau: Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl > Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex > Anoectochilus aff anamensis Aver Từ khóa: Lan Kim tuyến, Flavonoid, hoạt tính chống oxy hóa Mở đầu* lồi lan Kim tuyến gồm chủ yếu nhóm chất như: chất béo, Flavonoid, Glycoside, Axit hữu cơ, Polysaccharid, Triterpen Steroid [1] Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật, đặc biệt dược liệu Những Flavonoid có hoạt tính sinh học gọi Bioflavonoid Một hoạt tính sinh học trội Bioflavonoid tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) Tác dụng chống oxy hóa khả tiêu diệt hay gọi khả “triệt tiêu” “gốc tự do” có hại thể người Đây tác dụng quan trọng việc ngăn chặn hủy hoại thể “gốc tự do” gây ngăn chặn phát triển Chi lan Kim tuyến Anoectochilus, thuộc họ Lan - Orchidaceae có khoảng 40 - 50 lồi, biết đến nhiều khơng giá trị làm cảnh, mà giá trị làm thuốc Theo y học cổ truyền Trung Hoa, lan Kim tuyến dùng để điều trị đau bụng, viêm thận, sốt, huyết áp cao, liệt dương, điều trị bệnh tiểu đường, làm tan khối u, giảm lipase máu, chữa viêm gan, [5] Nhiều cơng trình nghiên cứu giới cho biết thành phần hóa học _ * Tác giả liên hệ ĐT: 84-983963138 Email: honggamitc@gmail.com https://doi.org/10.25073/2588-1140/vnunst.4559 104 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 phát sinh nhiều loại bệnh hiểm nghèo bệnh tim mạch, ung thư, thần kinh, lão hóa, Hiện nước ta có khoảng từ 12-15 lồi lan Kim tuyến, phân bố rộng, từ tỉnh miền núi phía Bắc Hịa Bình (Mai châu), Sơn La, Lào Cai (Sapa, Văn Bàn), Hà Tĩnh (Hương Sơn) đến tỉnh miền thuộc Trung Tây Nguyên Quảng Trị, Kontum (núi Ngọc Linh, núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông), Lâm Đồng (núi Bidoup) [7] Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy dược liệu phân bố vùng sinh thái có điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, khí hậu thành phần mơi trường dinh dưỡng khác có chất lượng khác nhau, cụ thể thành phần hàm lượng hợp chất tự nhiên khác nhau, từ dẫn đến tác dụng sinh dược học khác Do nghiên cứu thành phần, hàm lượng chất tự nhiên đánh giá tác dụng sinh dược học loài lan Kim tuyến vùng sinh thái khác nghiên cứu cần thiết, có giá trị mặt khoa học kinh tế Để tăng thêm hiểu biết bản, giúp cho việc định hướng khai thác sử dụng hiệu loài lan Kim tuyến Việt Nam vào lĩnh vực y dược, tiến hành khảo sát số đặc điểm hóa học tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) hợp chất Flavonoid chiết xuất từ số loài lan Kim tuyến Việt Nam Phương pháp nghiêncứu 2.1 Phương pháp xử lý mẫu Xác định trọng lượng khô tuyệt đối nguyên liệu: Cân xác 100g mẫu nguyên liệu, sấy khô kiệt 100oC, cân xác định đến trọng lượng khơng đổi (thí nghiệm lặp lại lần) Xử lý mẫu: Ngâm mẫu qua đêm, sau chiết máy siêu âm Power Sonic 410 điều kiện nhiệt độ 50oC, thời gian 90 phút (chiết mẫu lặp lại lần) Gộp dịch chiết lại để làm dịch nghiên cứu 105 2.2 Phương pháp định tính [6] Phản ứng FeCl3 5%: Nhỏ 50µl dịch chiết Ethanol 96o mẫu lan Kim tuyến vào giấy thấm, sấy khơ Sau đó, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lên sấy khơ Phản ứng dương tính cho màu lục, xanh đen, xanh lam nâu tùy theo nhóm Flavonoid số lượng, vị trí nhóm OH phân tử Phản ứng NaOH 10%: Nhỏ 50µl dịch chiết Ethanol 96o mẫu lan Kim tuyến vào giấy thấm, sấy khơ Sau đó, nhỏ 2-3 giọt thuốc thử NaOH 10% lên sấy khô Phản ứng tạo muối phenolat có màu khác tùy thuộc vào nồng độ Flavonoid tùy theo nhóm Flavonoid Nhóm Flavon Flavonol cho màu vàng sáng, Anthocyanidin cho màu xanh dương, Chalcon Auron cho màu đỏ da cam Phản ứng Diazo: Đây phản ứng khử đặc hiệu Flavonoid có OH vị trí 7, nhóm OH vị trí phản ứng với muối diazo để tạo thành chất màu azoic có màu vàng cam đến đỏ cam Lấy 1ml dịch chiết Ethanol 96o mẫu lan Kim tuyến cho vào ống nghiệm, sau nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Diazo vào, phản ứng dương tính cho màu màu vàng cam đến đỏ cam Phản ứng Shinoda (phản ứng Cyanidin): Phản ứng có mặt nhân γ-penzopyron đa số Flavonoid Lấy ml dịch chiết Ethanol 96o mẫu lan Kim tuyến cho vào ống nghiệm, sau cho vào ống nghiệm viên kẽm 2-3 giọt dung dịch HCl đặc Đun cách thủy đến dung dịch phản ứng sơi Phản ứng dương tính cho màu đỏ cam hay đỏ thẫm 2.3 Chiết xuất định lượng Flavonoid tổng số theo phương pháp B.C Talli [2, 4] a Qui trình chiết (B.C Talli) Tách chiết Flavonoid theo qui trình B.C Talli [2, 4], bước qui trình mơ tả chi tiết (Hình 1) b Định lượng Flavonoid tổng số Cân 10g bột nguyên liệu, chiết n-Hexan máy siêu âm để loại 106 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 nhựa, chất béo, carotenoid Bỏ phần dịch chiết n-Hexan, thu phần bã nguyên liệu, sấy khô chiết Ethanol 96o (hoặc Ethanol 60o h nước) máy siêu âm đến dịch chiết khơng cịn phản ứng Shinoda Xác định thể tích dịch chiết Ethanol 96o Bột nguyên liệu Chiết n-Hexan B1: Chiết n-Hexan (loại tạp) Sấy khô 600C B2: Bột nguyên liệu sấy khô Dịch chiết n-Hexan Chiết Ethanol B3: Dịch chiết Ethanol Cô cạn áp suất giảm máy cất quay B4: Cao Ethanol Chiết nước cất nóng (chỉnh pH = -4) B5: Hoạt chất dịch chiết nước Chiết Ethylaxetat B6: Dịch chiết Ethylaxetat Cô cạn áp suất giảm máy cất quay Chế phẩm Flavonoid hoà tan Ethanol Hịa tan Ethanol 960 Flavonoid tồn phần Đông khô Chế phẩmFlavonoid dạng bột khô (bột vơ định hình) Hình Qui trình B.C Talli Lấy 100 ml dịch chiết Ethanol 96o, cô cạn điều kiện áp suất giảm máy cất quay chân không Thu cặn chiết Ethanol, hịa tan nước cất nóng, lọc thu dịch chiết nước chỉnh pH = 3-4 Dùng Ethylaxetat chiết nhiều lần, thu dịch chiết Ethylaxetat đem cô cạn máy cất quay chân không, cặn thu Flavonoid tổng số Cân xác định trọng lượng, hàm lượng Flavonoid chứa mẫu phân tích tính theo công thức: X % = [(M2 – M1) x V/v x 10] / 100 Trong đó: V: thể tích dịch chiết Ethanol từ 10g bột nguyên liệu; v: thể tích dịch chiết Ethanol dùng định lượng (100 ml); M2: trọng lượng cân cặn Flavonoid bì; M1: trọng lượng bì 2.4 Phân tích thành phần Flavonoid sắc ký lớp mỏng [4, 6] Dùng mỏng Silicagel F 254 để chạy sắc ký chiều chế phẩm Flavonoid với hệ dung môi triển khai khác Quan sát sắc Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 ký đồ điều kiện: ánh sáng tự nhiên, phun thuốc thử đặc hiệu (FeCl3, AlCl3, Willson, Diazo), đèn tử ngoại (UV-254 UV-365 nm) 2.5 Xác định hoạt độ peroxydaza máu Máu tươi chống đông EDTA (do khoa huyết học Bệnh viện giao thông vận tải Hà Nội cung cấp) pha loãng 500 lần dung dịch NaCl 0,9% Thí nghiệm tiến hành nhóm máu O người khỏe mạnh Hoạt độ peroxydaza máu xác định theo phương pháp E.C Xavron [2, 3] Phản ứng gồm: 60 l đệm axetat natri pH 4,7 nồng độ 0,1N+ 60 l máu pha loãng 500 lần+ 60 l H2O2 0,2N+ 20 l Indigocarmin 0,001N + chất thử chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ mẫu lan kim Tuyến khác Để thời gian phản ứng 20 phút, sau đọc kết bước sóng 610nm, máy quang phổ UV/VIS Camspec M108 Kết thảo luận 3.1 Chiết xuất định lượng Flavonoid tổng số lan Kim tuyến 107 3.1.1 Định tính nhóm chất Flavonoid mẫu lan Kim tuyến phản ứng đặc trưng Tiến hành thu hái mẫu lan Kim tuyến từ Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà - tỉnh Lâm Đồng, Vườn thực nghiệm Kon Plong - tỉnh Kon Tum huyện Mai Châu - tỉnh Hịa Bình, tất mẫu giám định tên khoa học phòng Thực vật Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Dựa vào đặc điểm hình thái thân, rễ, hoa mẫu thu kết hợp với việc tra cứu, so sánh với loài lan Kim tuyến công bố “Sách đỏ Việt Nam, phần II Thực Vật” loài lan Kim tuyến “Cây cỏ Việt Nam” GS Phạm Hoàng Hộ Đồng thời phân tích mối quan hệ di truyền mẫu nghiên cứu thơng qua việc phân tích thị barcode matK, psbA-trnH ITS Đã xác định loài lan Kim tuyến khác từ mẫu thu hái, cụ thể loài: Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex (LKT1, thu từ Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà), Anoectochilus aff anamensis Aver (LKT2, thu từ Vườn quốc gia Bidoup Núi Bà), Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl (LKT3, thu từ Vườn thực nghiệm Kon Plong) l Hình Hình ảnh lồi lan Kim tuyến nghiên cứu kết định tính nhóm chất Flavonoid a, b, c: LKT1, LKT2, LKT3 d, e: kết phản ứng Shinoda mẫu LKT3, kết phản ứng Diazo mẫu LKT3 Dùng dịch chiết Etanol 96o mẫu lan Kim tuyến để tiến hành kiểm tra phản ứng định tính đặc trưng (NaOH 10%, FeCl 5%, Shinoda, Diazo) phát nhóm chất Flavonoid, kết thu trình bày bảng Các kết thu bảng cho thấy: dịch chiết Ethanol 96o mẫu nghiên cứu cho phản ứng dương tính với thuốc thử đặc hiệu nhóm chất Flavonoid, chứng tỏ lan Kim tuyến nghiên cứu có nhóm chất Flavonoid 108 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 Bảng Kết định tính nhóm chất Flavonoid mẫu lan Kim tuyến STT Tên mẫu LKT1 LKT2 LKT3 NaOH 10% Vàng nhạt 2+ Vàng nhạt 1+ Vàng nhạt 2+ FeCl35% Shinoda Diazo Xanh đen 2+ Xanh đen 2+ Xanh đen 2+ Đỏ nâu 3+ Đỏ nâu 2+ Đỏ nâu 4+ Vàng cam 3+ Vàng cam 2+ Vàng cam 3+ Ghi chú: (Dấu +: phản ứng dương tính; số: mức độ đậm nhạt màu phản ứng) Phản ứng FeCl3 có màu xanh đen đặc trưng cho thấy có mặt Flavonoid có cấu tạo orthodiphenol Phản ứng Shinoda có màu nâu đỏ phản ứng Diazo có màu vàng cam điển hình có mặt chất Flavonoid mang nhóm cacbonyl (>C = 0) vị trí C4 đặc điểm cấu tạo hoá học quan trọng cần có Bioflavonoid 3.1.2 Ảnh hưởng dung môi chiết xuất đến hàm lượng Flavonoid tổng số lan Kim tuyến Dung môi chiết yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đến trình chiết xuất hợp chất tự nhiên thực vật Cả hiệu chiết xuất hoạt tính chất chiết xuất phụ thuộc lớn vào dung môi nồng độ dung môi chiết [8] Để lựa chọn dung môi chiết xuất, người ta thường dựa vào mục đích chiết xuất, khả phân cực nhóm chất cần chiết xuất, độ phân cực thành khơng mong muốn, tổng chi phí, vấn đề an tồn mơi trường [9] Ethanol dung môi thường sử dụng rộng rãi để chiết xuất nhóm chất Flavonoid từ nguyên liệu thực vật lẽ nhiều hợp chất Flavonoid tan tốt dung môi so với dung mơi khác độc chi phí rẻ [4, 6] Do vậy, nghiên cứu tiến hành chiết xuất định lượng Flavonoid tổng số từ mẫu lan Kim tuyến thu theo qui trình B.C Talli điều kiện dung môi (trong giai đoạn B3 qui trình) khác như: Ethanol 96o, Ethanol 60o nước Bảng Ảnh hưởng dung môi chiết xuất đến hàm lượng Flavonoid tổng số lan Kim tuyến TT Mẫu nghiên cứu Trọng lượng khô tuyệt đối (%) LKT1 LKT2 LKT3 16,34 16,41 16,65 Các kết thu bảng cho thấy: ba mẫu lan Kim tuyến có % trọng lượng khô tuyệt đối tương đương nhau; tất mẫu sử dụng dung môi chiết Ethanol 60o cho hàm lượng Flavonoid cao đáng kể so với dung môi chiết Ethanol 96o nước (P 0,5 tách không rõ ràng, gần sát vào 110 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 Bảng Đặc điểm sắc ký lớp mỏng hợp chất Flavonoid chiết xuất từ mẫu lan Kim tuyến triển khai Hệ quan sát điều kiện khác Vàng + C/T 6: 0.42 - C/T 7: 0.46 Vàng 2+ C/T 8: 0.52 Vàng + Vết 9: 0.57 Vàng + C/T 10: 0.61 C/T 11: 0.67 C/T 12: 0.70 C/T 13: 0.73 C/T 14: 0.83 Vàng 2+ - P/q tím lơ P/q tím lơ P/q VX Vàng + Vàng + - - Đen xám + Đen xám + Đen xám + - Vàng + - Vàng 2+ P/q tím lơ Vàng 3+ - Vàng + - - - Xanh đen + Vàng + - Vàng 2+ - - - Vàng + Xanh đen + Vàng + - Vàng + Hồn g tím 2+ Vàng cam + Vàng cam + Vàng cam + Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 3+ Đen xám 4+ Đen xám 2+ Xanh đen 4+ Xanh đen 2+ Xanh đen 4+ Xanh đen 4+ Xanh đen 2+ - - Đen xám 3+ Đen xám + Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 3+ Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen 2+ Willson - Vàng 2+ Diazo - - FeCl3 Đen xám 4+ Đen xám 2+ C/T 5: 0.38 - Vàng + UV-254 Vàng đậm 4+ Vàng nâu 2+ Vàng + Vàng + Xanh đen 2+ Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen 2+ ASTN - C/T 4: 0.31 - Hồn g tím 4+ Vàng cam 3+ Vàng cam 2+ Vàng cam + Đen xám + Đen xám + Đen xám + Đen xám + Đen xám 2+ Willson - Vàng + Vàng + Diazo Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen + Xanh đen 2+ C/T 3: 0.20 - FeCl3 Đen xám 3+ Đen xám + Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 3+ Vàng + Vàng 2+ F-LKT3 UV-254 - C/T2: 0.12 ASTN - Vàng + Willson Xanh đen 4+ Xanh đen 2+ Xanh đen 4+ Xanh đen 4+ Xanh đen 2+ C/T 1: 0.08 Diazo FeCl3 Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 2+ Đen xám 2+ ASTN Rf F-LKT2 UV-254 F-LKT1 Vàng 2+ Hồn g tím 2+ Vàng cam 3+ Vàng cam 4+ Vàng cam + - P/q tím lơ P/q tím lơ P/q VX Vàng + - Vàng + Vàng + - - Vàng + - - Vàng + - - - - - - - Vàng nâu 3+ P/q VX Vàng + - - - - Vàng 2+ - - P/q VX - - - - - - - - - P/q VX Nâu 3+ Vàng cam 4+ P/q tím lơ Đen xám 2+ Nâu 3+ Vàng cam + P/q tím lơ P/q tím lơ - - - - - Đen xám 4+ Đen xám 2+ Vàng cam 4+ Vàng 2+ Vàng đậm 4+ Vàng nâu 2+ Nâu 3+ Vàng nâu 3+ Vàng đậm 2+ Vàng nâu + Vàng 2+ - Vàng nâu 3+ Vàng + - Vàng + - Vàng + - Vàng + - Vàng nâu 3+ P/q VX Ghi chú: Dấu +: phản ứng dương tính; Dấu -: phản ứng âm tính; số: mức độ đậm nhạt màu phản ứng; P/q VX: phát quang màu vàng xanh; C/T: cấu tử Tại hệ dung môi (Hệ 3) (Hệ 4), thấy tách 12 cấu tử quan sát ánh sáng tự nhiên (ASTN), cấu tử tách rõ ràng, gọn riêng biệt Tại Hệ 4, nhận thấy cấu tử có Rf < 0.4 tách rõ có khoảng cách xa so với Hệ Như chọn hệ dung mơi để triển khai sắc ký mỏng cho hợp chất Flavonoid chiết xuất từ lan Kim tuyến Trên ảnh sắc ký đồ (ảnh a2, b2, c2) kết Bảng cho thấy: sắc ký đồ chế phẩm Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 F-LKT1 F-LKT3 hoàn toàn giống nhau, quan sát UV-254 UV-365 nhận xuất 14 cấu tử, ứng với giá trị Rf = 0.08; 0.12; 0.20; 0.31; 0.38; 0.42; 0.46; 0.52; 0.57; 0.61; 0.67; 0.70; 0.73; 0.83 Trong đó, cấu tử số (Rf=0.42) cấu tử 12 (Rf=0.7) không thấy xuất ánh sáng tự nhiên (ASTN) UV-254, lại phát quang vàng xanh UV=365; cấu tử lại có màu đen xám soi UV-254 nm Các cấu tử 2, 3, tách sắc ký đồ chế phẩm F-LKT3 rõ có màu đậm so với chế phẩm F-LKT1 Tất cấu tử tách sắc ký đồ có phản ứng dương tính phun thuốc thử FeCl3, Diazo Willson chứng tỏ hợp chất Flavonoid Sắc ký đồ chế phẩm F-LKT2 ln xuất mờ có màu nhạt so với chế phẩm F-LKT1 F-LKT3, có cấu tử xuất hiện, có cấu tử khơng thấy xuất sắc ký đồ như: cấu tử số (Rf=0.42), cấu tử số (Rf=0.61), cấu tử 11 (Rf=0.67), cấu tử 12 (Rf=0.70) cấu tử số 14 (Rf=0.83), điều lý giải mẫu LKT2 ln có hàm lượng Flavonnoid tổng số thấp mẫu LKT1 LKT3 Kết ảnh d2, cho biết sắc ký đồ chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ thân lan Kim tuyến cấu tử tách rõ so với chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ rễ lan Kim tuyến 3.3 Khảo sát tác dụng chống oxy hoá chế phẩm Flavonoid thu từ loài lan Kim tuyến Việc bổ sung cho thể chất “triệt tiêu” gốc tự (gọi chất chống oxy hóa - antioxydant) biện pháp lý tưởng việc phòng chống nhiều loại bệnh tật Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên thường nói đến là: β-caroten, Vitamin E, Vitamin C, Selen, Flavonoid… Hiện nhiều nghiên cứu cho biết Flavonoid chất chống oxy hoá hữu hiệu người Một số Flavonoid có lực cao enzym peroxydase tham gia vào phản ứng enzym với vai trị chất bị oxy hố từ dạng khử (hydroquinon) thành dạng semiquinon 111 quinon Quinon semiquinon sinh từ Flavonoid tương ứng gốc tự bền, có khả “triệt tiêu” gốc tự hoạt động có hại thể Trong phản ứng oxy hoá Indigocarmin hoạt độ enzym giảm số lượng semiquinon quinon tạo thành nhiều điều thể khả chống oxy hoá Flavonoid Trong phản ứng Flavonoid đóng vai trị chất cạnh tranh với Indigocarmin Dựa vào việc xác định cường độ màu phản ứng oxy hoá chất Indigocarmin H2O2 mơi trường axit yếu có tham gia enzym peroxydaza bước sóng 610nm tính hoạt tính enzym (từ tính % ức chế hoạt động enzym) Hoạt tính enzym peroxydaza mẫu đối chứng (khơng có mẫu thử) 100%, có chất thử hoạt tính enzym thay đổi Trong thí nghiệm này, chúng tơi bước đầu đánh giá hoạt tính chống oxy hố chế phẩm F-LKT1, F-LKT2 F-LKT3 với nồng độ thay đổi từ 10µg/ml-200µg/ml nhóm máu O người - nhóm máu chiếm tỷ lệ cao cộng đồng người Việt Nam Tác dụng chống oxy hóa chế phẩm thể thông qua % ức chế hoạt động enzym peroxydaza (% ức chế hoạt động enzym cao hoạt tính chống oxy hóa mẫu thử mạnh ngược lại) Các kết thu hình cho thấy, từ nồng độ 50µg/ml trở lên chế phẩm có tác dụng làm hoạt độ enzym giảm mạnh chế phẩm F-LKT3 có tác dụng ức chế hoạt động enzym tốt thể nồng độ 150µg/ml ức chế 88,2±2,34% hoạt động enzym; chế phẩm F-LKT1 ức chế 79,68±1,74% hoạt động enzym chế phẩm F-LKT2 ức chế 75,35±3,12% hoạt động enzym Cịn nồng độ 200µg/ml, chế phẩm F-LKT1 F-LKT3 gần kìm hãm hồn tồn hoạt động enzym (% ức chế hoạt động enzym ≥ 99,86%), chế phẩm F-LKT2 có % ức chế hoạt động enzym 83,5 ±3,06% Như vậy, chế phẩm F-LKT3 có tác dụng chống oxy hóa tốt thứ tự chống oxy hóa chế phẩm sau: F-LKT3 > F-LKT1 > F-LKT2 112 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 Hình Ảnh hưởng nồng độ Flavonoid chiết xuất từ mẫu lan Kim Tuyến lên % ức chế hoạt động enzym Peroxydaza Kết luận Trong dịch chiết Ethanol mẫu lan Kim tuyến nghiên cứu có chứa hợp chất Flavonoid Ethanol 60o dung môi phù hợp (sử dụng giai đoạn B3 qui trình B.C Talli) để chiết xuất nhóm hợp chất Flavonoid từ lan Kim tuyến Loài A roxburghii (Wall.) Lindl có hàm lượng Flavonoid tổng số cao (1.345%), sau lồi A lylei Rolfe ex Downiex (1.044%) thấp loài A aff anamensis Aver (0.903%) Hợp chất Flavonoid tích lũy chủ yếu lá, Lan kim tuyến có hàm lượng Flavonoid cao gấp 5,4 lần thân 6,67 lần rễ Chế phẩm Flavonoid tổng số lan Kim tuyến tách 14 cấu tử triển khai sắc ký mỏng hệ dung môi Ethylaxetat: Toluen: Axit formic: Nước = 7: 3: 1,5: (v:v:v:v) Các cấu tử tách có màu sắc đặc điểm định tính đặc trưng chất Flavonoid Các chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ loài lan Kim tuyến thể hoạt tính chống oxy hóa tốt thơng qua phản ứng oxy hóa indigocarmin enzym peroxydaza nhóm máu O Thứ tự chống oxy hóa lồi lan Kim tuyến nghiên cứu sau: A roxburghii (Wall.) Lindl > A lylei Rolfe ex Downiex > A aff anamensis Aver Từ kết nghiên cứu trên, nhận thấy số loài lan Kim tuyến Việt Nam lồi Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl lồi có giá trị nhất, cần tiếp tục thực nghiên cứu theo hướng bảo tồn phát triển để khai thác lồi lan làm dược liệu Tài liệu tham khảo [1] Chun-Nian He, Chun-Lan Wang, Shun-Xing Guo, Jun-Shan Yang and Pei-Gen Xiao, A novel flavonoid glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl, J Integrat Plant Biol 48 (2006) 359-363 [2] Đào Kim Nhung, Đỗ Thị Gấm, Trần Quỳnh Hoa, Trần Nam Thái, Nghiên cứu số hoạt tính sinh học Flavonoid chiết xuất từ vải (Litchi chinensisi Sonn) nhãn (Dimocarpus longan Lour), Tạp chí Dược học, 394 (2009) 39-43 [3] Epmakov A.U.u gp, Phytobiochemical method, Leningrat Publishing House, 1972 [4] Gressman, The chemistry of flavonoid compounds, Academic press, Lon don, 1975 [5] Lin W C, Study of health keeping effects of anoectochilus formosanus Hayata,Agriculture World, Vol 288 (2007) 8-13 [6] Ngô Văn Thu, Bài giảng Dược liệu - Tập 1, Bộ Môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998 [7] Nguyễn Tiến Bân, Danh lục loài thực vật Việt Nam, Tập III, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2005 [8] Tan M.C., Tan C.P and Ho C.W., Effects of extraction solvent system, time and temperature on total phenolic content of henna (Lawsonia inermis) stems, International Food Research Journal 20 (2013) 3117-3123 [9] Wang J., Sun B.G., Cao Y., Tian Y and Li X H., Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran, Food Chemistry 106 (2008) 804-810 Đ.T Gấm nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S (2017) 104-113 113 Investigation of some Chemical Characteristics and Antioxidant Effects of Flavonoids Compounds Extracted from the Species of Anoectochilus in Vietnam Do Thi Gam1, Ha Viet Hai2, Chu Hoang Ha3, Pham Bich Ngoc3 Center for High Technology Development, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Institute of Natural Products Chemistry, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Institute of Biotechnology, VAST, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam Abstract: There are flavonoids compositions with high content in Anoectochilus: Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl: 1.345% (dry weitgh); Anoectochilus lylei Rolfe ex Downiex: 1.044% (dry weitgh); Anoectochilus anamensis Aver: 0.903% (dry weitgh) There are 9-14 flavonoids from A roxburghii, A lylei and A anamensis in preliminary analysis the total flavonoids samples by solvent system Ethylaxetate: Toluene: Formic acid: H2O = 7: 3: 1,5: (v:v:v:v) All three extracted flavonoids from A roxburghii, A lylei and A aff Anamensis showed anti - oxidative activity (HTCO) through improving response to indigocarmin reaction by enzyme peroxydase in human blood groups O The inhibitive rate shown as following order: A roxburghii (Wall.) Lindl > A lylei Rolfe ex Downiex > A aff anamensis Aver Keywords: Anoectochilus, Flavonoid, Antioxydant  ... lan Kim tuyến Việt Nam vào lĩnh vực y dược, tiến hành khảo sát số đặc điểm hóa học tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) hợp chất Flavonoid chiết xuất từ số loài lan Kim tuyến Việt Nam Phương pháp... (v:v:v:v) Các cấu tử tách có màu sắc đặc điểm định tính đặc trưng chất Flavonoid Các chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ loài lan Kim tuyến thể hoạt tính chống oxy hóa tốt thơng qua phản ứng oxy hóa indigocarmin... số thấp mẫu LKT1 LKT3 Kết ảnh d2, cho biết sắc ký đồ chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ thân lan Kim tuyến cấu tử tách rõ so với chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ rễ lan Kim tuyến 3.3 Khảo sát tác