Hiện nay, theo thống kê của WHO (2001) thì có khoảng hơn 500 loại carotenoid được biết đến và chúng được chia thành 2 loại xanthophylls (có chứa oxy)
và carotenes (chỉ có hydrocacbon, không có oxy). Trong đó, có 5 loại sắc tố đã được tổng hợp và sản xuất quy mô công nghiêp là lycopene, β-carotene, canthaxanthin, zeaxanthin và astaxanthin (Del Campo et al., 2007; Jackson et al., 2008).
Hầu hết carotenoid đều có cấu trúc polyisoprenoid, là một chuỗi liên hợp của những nối đôi. Cũng chính vì thế mà cấu hình không gian của nó tồn tại ở cả hai dạng
cis-trans.
(Nguồn: Pharmacological Research 55, 2007, 207–216)
Hình2.2. Cấu trúc của một số loại sắc tố carotenoid 2.4.3. Tính chất vật lý
- Kết tinh ở dạng tinh thể, hình kim, hình khối lăng trụ, đa diện hoặc hình thoi. - Nhiệt độ nóng chảy 130-220oC (Harry, 1993).
- Hòa tan trong chất béo, các dung môi chứa clo và các dung môi không phân cực khác, làm cho hoa quả có màu da cam, màu vàng và màu đỏ (Britton, 1995).
- Tính hấp thụ ánh sáng: Chuỗi polyene liên hợp đặc trưng cho màu thấy được của carotenoid. Dựa vào quang phổ hấp thụ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch thẳng hay mạch vòng. Ngoài ra trong mỗi dung môi hòa tan khác nhau, khả năng hấp thụ ánh sáng tối đa cũng khác nhau với cùng một loại. Khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh, chỉ cần 1 gam cũng có thể thấy được bằng mắt thường (Zur et al., 2000).
- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ carotenoid, có thể kể đến như quá trình biến đổi của thực phẩm, quá trình đun nấu,.v.v. và chúng được hấp thụ ở niêm mạc của đường tiêu hóa bằng con đường khuếch tán thụ động. Hợp chất
astaxanthin được xác định bằng phương pháp biến đổi của Fontana et al. (1996) và những đồng phân của astaxanthin được xác định bằng các màng sắc ký theo Donkin (1976).
2.4.4. Tính chất hóa học
- Không hòa tan trong nước, rất nhạy với acid và chất oxy hóa, bền vững với kiềm. Do có hệ thống nối đôi liên hợp nên nó dễ bị oxy hóa mất màu hoặc đồng phân hóa, hydro hóa tạo màu khác.
- Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu: nhiệt độ, ánh sáng, phản ứng oxy hóa trực tiếp, tác dụng của ion kim loại, ion, nước.
- Dễ bị oxy hóa trong không khí nên cần bảo quản trong khí trơ, chân không. Ở nhiệt độ thấp nên tránh ánh sáng mặt trời (Harry, 1993).
- Carotenoid khi bị oxy hóa tạo hợp chất có mùi thơm như các aldehyde không no hoặc ketone đóng vai trò tạo hương thơm cho trà (Fannyet al., 2012).
2.4.5. Chức năng
Isoprenoids là chất hóa học hữu cơ trong tự nhiên được biết đến là tiền chất để tổng hợp các chất như stocopherols,chlorophylls, phylloquinone (PhQ), gibberellins, abscisic acid, monoterpenes và plastoquinone (PQ).
- Carotenoid được xem là tiền vitamin A gồm α-carotenoid và β-carotenoid, đồng thời là chất chống oxy hóa (Johnson, 2002; Krinsky và Johnson, 2005).
- Chúng được sử dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm như vitamin bổ sung, thực phẩm chức năng và dùng làm thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm, cá và các loài giáp xác (Del Campo et al., 2007; Jackson et al., 2008). Một trong các loại sắc tố phổ biến nhất là astaxanthin, nó được tổng hợp chủ yếu bởi vi sinh vật biển, chẳng hạn như tảo lục Haematococcus pluvialis và tích lũy trong cá như cá hồi, đó là lý do cá thu có thịt màu đỏ tươi. Astaxanthin liên quan tới khả năng chữa trị bệnh ung thư, tim mạch (Fassett và Coombes, 2011).
- Có nhiều bằng chứng chứng minh rằng β-carotene, lutein kể cả lycopene có khả năng ngăn chặn sự ảnh hưởng của tia Ultraviolet (UV) - tia gây nên chứng hồng ban và giúp con người cũng như động vật giảm bớt sự ảnh hưởng xấu ánh sáng mặt trời (Stahl và Sies, 2007).
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ 06/2014 đến 11/2014.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ gen thực vật và phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên vật liệu
- Các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata blume), lá bần (Sonneratia caseolaris)
và lá mắm (Avicennia officinalis) đang trong giai đoạn phân hủy, trôi dạt trên bãi biển hoặc ở đầm ngập mặn hoặc nằm trên lớp bùn ở rừng ngập mặn của các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre.
- Thời gian thu mẫu: 06/2014
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dụng cụ: Can nhựa 20 L, bọc nilon, thau nhựa, màng bọc thực phẩm, gòn thấm
nước, kéo, kẹp, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, lame, lamen, micropipette, đầu cone, đèn cồn, bình tam giác, type...
Thiết bị: Cân điện tử Orion và Sartorius, máy đo pH, máy khuấy từ HB502, nồi
khử trùng nhiệt ướt, lò vi song, tủ cấy vi sinh vật LABCAIRE (Anh Quốc), tủ mát 4- 10oC (Alaska-Mỹ), tủ lạnh -20oC (Akira), kính hiển vi OLYMPUS ( ×10, ×40, ×100) (Nhật Bản), máy lắc ủ (water bath) Heidolph titramax 1000, máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417R, tủ sấy WTC Binder, máy đo quang phổ Genesys 10UV (Mỹ), thiết bị đo độ mặn
3.1.4. Hóa chất
Cồn 96% và 70%, D-glucose, yeast extract, peptone, NaCl, MgSO4, nước biển tự nhiên, dung dịch KOH, HCl, kháng sinh: Streptomycine, Ampiciline, agar, nước cất 1 lần.
3.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi tảo biển
Bảng 3.1: Môi trƣờng GYPS cơ bản (Arafiles et al., 2011)
Thành phần Nồng độ D – Glucose 10,0 g/L Yeast extract 5.0 g/L Peptone 10.0 g/L NSW (nƣớc biển tự nhiên) 500 ml/L Agar 15 g/L
Nƣớc cất thêm vào cho đủ 1L
Bảng 3.2. Môi trƣờng GYPSct (Arafiles et al., 2011)
Thành phần Nồng độ
D – Glucose 3,0 g/L
Yeast extract 1,25 g/L
Peptone 1,25 g/L
NSW (15%0) 500 ml/L
Nƣớc cất Thêm vào cho đủ 1 lít
Agar 15 g/L
Kháng sinh pH
Bảng 3.3 6,0
Bảng 3.3. Thành phần kháng sinh trong môi trƣờng GYPSct (Arafiles et al., 2011) có cải tiến
Thành phần Nồng độ
Streptomycin (Strep) 300 mg/ml 1ml/L môi trường GYPS
Bảng3.4. Thành phần 4 môi trƣờng chọn lọc NM – 5 (Nghiên cứu này) NM – 8 (Taha et al. 2013) F – 5 (Perveen et al. 2006) F – 8 (Taha et al. 2013) Glucose 50g/L 80g/L 50g/L 80g/L Peptone 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L Yeast extract 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L Nƣớcbiển 50% 50% NaCl 1g/L 1g/L MgSO4 10g/L 10g/L Nƣớc cất Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Kháng sinh Bảng 3.2 Bảng 3.2 Bảng 3.2 Bảng 3.2 pH 6 6 6 6
Ghi chú: Nước biển NSW sử dụng 15%o
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Quy trình phân lập vi tảo 3.2.1. Quy trình phân lập vi tảo
Các dòng vi tảo biển được phân lập theo quy trình của Bremer et al., (2000) có một số cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
3.2.1.1. Thu mẫu
Mẫu được chọn là ba loại lá đước, bần và mắm rụng đang trong giai đoạn phân hủy ở các đầm ngập mặn, trên mặt bùn hay trôi nổi ở các cửa sông, biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Thu mỗi loại 20 lá và rửa bùn sơ bộ những lá đã chọn với nước biển tại nơi lấy mẫu. Sau đó cho vào túi nylon và chuyển vào tủ mát 4oC trữ để phục vụ cho nghiên cứu.
3.2.1.2. Xử lý mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chọn những phần lá còn nguyên vẹn, loại bỏ những chỗ bị mục nát nhiều để dễ dàng loại bỏ bùn bám vào.
- Rửa các mẫu lá trong dung dịch nước biển tự nhiên (NSW) (1 NSW:1 nước máy) 2 lần để loại bỏ bùn đất bám vào lá.
- Cắt những mẫu lá này thành các mảnh nhỏ khoảng 2-3 mm2 và chuyển các mẫu lá vào lọ thủy tinh 250ml.
- Ngâm trong NSW đã khử trùng khoảng 15 phút.
- Đổ bỏ nước ngâm. Cho NSW và nước cất đã khử trùng (tỉ lệ 1:1) vào và rửa 4-5 lần. Mỗi lần rửa được đặt trên máy khuấy từ trong 20 phút. Thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
3.2.1.3. Phân lập vi tảo
Sau khi xử lý khử trùng mẫu xong, đổ bỏ nước rửa cuối cùng, dùng kẹp cấy trực tiếp 4-5 mẫu lá vào môi trường GYPSct đặc trong đĩa Petri. Những đĩa này cũng được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng 28oC±1 trong 24- 96 giờ. Khi nhận thấy có xuất hiện các khuẩn lạc, dùng que cấy vòng chuyển những khuẩn lạc vi tảo mọc quanh lá sang đĩa môi trường GYPSct mới. Quan sát bằng mắt thường thấy những khuẩn lạc khác nhau (màu sắc, hình dạng) thì cấy sang những đĩa khác nhau. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E40 phát hiện những khuẩn lạc nào là tảo ( tế bào có hinh cầu, đường kính trung bình từ 5 - 20 µm, bên trong tế bào có nhiều thể lipid) thì tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường mới. Việc cấy chuyển trên môi trường GYPSct nhiều lần cho phép thu được các khuẩn lạc thuần của các dòng vi tảo.
Sau khi phân lập, các dòng vi tảo được lưu giữ trong tủ mát 4-6o
C và cấy chuyển trên môi trường mới GYPSct đặc với mỗi tháng/lần.
3.2.2. Mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi tảo
- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các dòng vi tảo phân lập được.
-Quan sát, mô tả hình thái tế bào của các dòng vi tảo phân lập được dưới kính hiển vi.
-Các bước tiến hành quan sát hình thái tế bào vi tảo:
Chuẩn bị lame sạch, hơ dưới ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi tảo hòa tan vào giọt nước cất vô trùng.
Dùng lamen đậy lên giọt nước cất vô trùng - vi tảo bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100-1000 lần, chụp lại hình ảnh quan sát được.
3.2.3. Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập đƣợc
Nhân sinh khối cấp 1: Chuyển cẩn thận một khuẩn lạc đang nuôi cấy trên môi trường GYPS đặc vào ống ống nghiệm 50ml chứa 10ml môi trường lỏng GYPSct+Strep+Amp. Nuôi dung dịch trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ ủ là 28oC±1 với điều kiện tối trong 3-4 ngày.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau nhân giống cấp 1, mật độ vi tảo được chỉnh về OD600nm =0,5, chuyển 1ml dịch tảo sang bình tam giác 250ml có chứa 99ml môi trường GYPSct+Strep+Amp lỏng. Tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 28oC±1 trong 10-12 ngày.
3.2.4. Xác định trọng lƣợng khô tế bào vi tảo
Trọng lượng khô tế bào (TLKTB) vi tảo được xác định như sau: Thu hoạch tế bào trong 100ml dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm dung dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC. Đổ bỏ phần dịch lỏng lấy phần tủa là sinh khối tảo, rửa với 50 ml nước cất vô trùng, lặp lại hai lần. Chuyển dung dịch tảo sang đĩa petri có đặt một tấm giấy lọc bên trong đĩa (đã cân trọng lượng đĩa petri và giấy lọc trước đó) sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi.
3.2.5. Xây dựng đƣờng chuẩn giữa trọng lƣợng khô tế bào và chỉ số OD
Dựa theo phương pháp của Taha et al. (2013). Để xác định trọng lượng khô của các dòng vi tảo phân lập được, tiến hành dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ dịch tảo đo được ở bước sóng λ= 600nm và trọng lượng khô tế bào (TLKTB) của các dòng vi tảo phân lập được trên môi trường NM-8
Các bước tiến hành như sau:
- Sau khi nhân sinh khối các dòng vi tảo đến khi OD đạt được giá trị ≥2,0 với thể tích 500 ml, tiến hành pha loãng dịch tảo ở nồng độ từ 0,2-1,8 bằng chính môi trường nuôi cấy của vi tảo (thể tích dịch tảo ở mỗi nồng độ pha loãng là 100 ml).
- Đo quang phổ các nồng độ pha loãng ở bước sóng 600 nm.
- Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch tảo ở các nồng độ pha loãng đem ly tâm có thể tích bằng nhau (100 ml).
- Đổ bỏ phần dịch lỏng, lấy phần tủa là sinh khối tảo. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Sinh khối tảo được sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi. - Cân và ghi nhận sinh khối khô của các dòng vi tảo.
- Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft excel để xây dựng đường chuẩn. Từ những thông số thu được xây dựng đường chuẩn qua phương trình hồi quy tuyến tính giữa chỉ số OD và TLKTB của vi tảo có dạng y = ax + b. Trong đó y là chỉ số OD và x là TLKTB tương ứng của vi tảo (g/100 ml).
3.2.6. Xác định hàm lƣợng carotenoid
Hàm lượng carotenoid được xác định theo phương pháp của Hoàng Thị Lan Anh et al. (2010) có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Carotenoid được trích với dung môi ethanol 90%.
Các bước tiến hành trích carotenoid với dung môi ethanol 90%:
- Nghiền sinh khối tảo tươi với cát thủy tinh và chiết với 10 ml ethanol 90%. - Lọc lấy dịch trong bằng giấy lọc chuyên biệt Whatman GF/C.
- Định mức lên 10 ml bằng ethanol 90%.
- Đo quang phổ dung dịch sau khi định mức ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid trong dung dịch được tính theo công thức của Strickland và Parsons. (1972):
Trong đó:
V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (L) C (carotenoid tổng số) = 4,0 * E480 (µg)
Với E480 là giá trị OD đo được ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid tính theo trọng lượng khô dựa vào carotenoid tổng số thu được từ dịch trích, chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và đường chuẩn (phương trình hồi quy tuyến tính) thể hiện mối tương quan giữa OD 600 nm và trọng lượng khô của vi tảo có dạng y= ax + b.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.7. Tuyển chọn môi trƣờng nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào.
- Khảo sát sự sinh trưởng của các dòng vi tảo được chọn trên cả năm loại môi trường: GYPSct, NM-5, NM-8, F-5 và F-8.
- Cách tiến hành như sau:
Nhân sinh khối cấp 1 như phần 3.4.2.
Dùng bình tam giác 100ml để khảo sát, mỗi môi trường lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị môi trường lỏng GYPSct, NM-5, NM-8. F-5, F-8 như Bảng 3.3 có kháng sinh Strep và Amp như Bảng 3.2 với dung tích mỗi bình 50ml/100ml.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau 4 ngày kiểm tra mẫu trong ống fancol bằng kính hiển vi, khi đạt điều kiện không bị nhiễm thì lắc đều chỉnh mật số về OD600nm=0,5 và với thể tích 0,5ml/bình. Điều kiện vô trùng.
Nuôi lắc 200vong/phút ở nhiệt độ phòng 28oC±1 bằng máy waterpath. - Hàng ngày chọn một mốc thời gian lúc 10 giờ để đo OD các bình tam giác, đo liên tục để thấy sự thay đổi OD theo thời gian. Điều kiện vô trùng.
- Tính toán và dùng thống kê để cho thấy sự khác biệt về sinh khối giữa các ngày trong 1 môi trường và giữa các môi trường với nhau. Kết quả này cho phép kết luận 1 môi trường ưu thế hơn so với 4 loại môi trường còn lại.
3.2.8. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu
Kết quả nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel. Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL).
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi tảo
Tổng cộng có 38 dòng đã được phân lập và tách ròng từ các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata Blume), lá bần (Sonneratia caseolaris) và lá mắm (Avicennia officinalis) thu tại các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Trong đó có 20 dòng ở Bến Tre và 18 dòng ở Trà Vinh. Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al., (2011), mười lăm dòng vi tảo đã được nhận diện như là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Các dòng tảo được đặt tên theo nguyên tắc: chữ cái đầu tiên là nguồn mẫu lá được sử dụng để phân lập, hai chữ cái kế tiếp là nguồn gốc xuất xứ nơi thu mẫu và số nguyên là thứ tự từ nhỏ đến lớn của các dòng tảo đã phân
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});