- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các dòng vi tảo phân lập được.
-Quan sát, mô tả hình thái tế bào của các dòng vi tảo phân lập được dưới kính hiển vi.
-Các bước tiến hành quan sát hình thái tế bào vi tảo:
Chuẩn bị lame sạch, hơ dưới ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi tảo hòa tan vào giọt nước cất vô trùng.
Dùng lamen đậy lên giọt nước cất vô trùng - vi tảo bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100-1000 lần, chụp lại hình ảnh quan sát được.
3.2.3. Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập đƣợc
Nhân sinh khối cấp 1: Chuyển cẩn thận một khuẩn lạc đang nuôi cấy trên môi trường GYPS đặc vào ống ống nghiệm 50ml chứa 10ml môi trường lỏng GYPSct+Strep+Amp. Nuôi dung dịch trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ ủ là 28oC±1 với điều kiện tối trong 3-4 ngày.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau nhân giống cấp 1, mật độ vi tảo được chỉnh về OD600nm =0,5, chuyển 1ml dịch tảo sang bình tam giác 250ml có chứa 99ml môi trường GYPSct+Strep+Amp lỏng. Tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 28oC±1 trong 10-12 ngày.
3.2.4. Xác định trọng lƣợng khô tế bào vi tảo
Trọng lượng khô tế bào (TLKTB) vi tảo được xác định như sau: Thu hoạch tế bào trong 100ml dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm dung dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC. Đổ bỏ phần dịch lỏng lấy phần tủa là sinh khối tảo, rửa với 50 ml nước cất vô trùng, lặp lại hai lần. Chuyển dung dịch tảo sang đĩa petri có đặt một tấm giấy lọc bên trong đĩa (đã cân trọng lượng đĩa petri và giấy lọc trước đó) sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi.
3.2.5. Xây dựng đƣờng chuẩn giữa trọng lƣợng khô tế bào và chỉ số OD
Dựa theo phương pháp của Taha et al. (2013). Để xác định trọng lượng khô của các dòng vi tảo phân lập được, tiến hành dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ dịch tảo đo được ở bước sóng λ= 600nm và trọng lượng khô tế bào (TLKTB) của các dòng vi tảo phân lập được trên môi trường NM-8
Các bước tiến hành như sau:
- Sau khi nhân sinh khối các dòng vi tảo đến khi OD đạt được giá trị ≥2,0 với thể tích 500 ml, tiến hành pha loãng dịch tảo ở nồng độ từ 0,2-1,8 bằng chính môi trường nuôi cấy của vi tảo (thể tích dịch tảo ở mỗi nồng độ pha loãng là 100 ml).
- Đo quang phổ các nồng độ pha loãng ở bước sóng 600 nm.
- Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch tảo ở các nồng độ pha loãng đem ly tâm có thể tích bằng nhau (100 ml).
- Đổ bỏ phần dịch lỏng, lấy phần tủa là sinh khối tảo.
- Sinh khối tảo được sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi. - Cân và ghi nhận sinh khối khô của các dòng vi tảo.
- Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft excel để xây dựng đường chuẩn. Từ những thông số thu được xây dựng đường chuẩn qua phương trình hồi quy tuyến tính giữa chỉ số OD và TLKTB của vi tảo có dạng y = ax + b. Trong đó y là chỉ số OD và x là TLKTB tương ứng của vi tảo (g/100 ml).
3.2.6. Xác định hàm lƣợng carotenoid
Hàm lượng carotenoid được xác định theo phương pháp của Hoàng Thị Lan Anh et al. (2010) có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Carotenoid được trích với dung môi ethanol 90%.
Các bước tiến hành trích carotenoid với dung môi ethanol 90%:
- Nghiền sinh khối tảo tươi với cát thủy tinh và chiết với 10 ml ethanol 90%. - Lọc lấy dịch trong bằng giấy lọc chuyên biệt Whatman GF/C.
- Định mức lên 10 ml bằng ethanol 90%.
- Đo quang phổ dung dịch sau khi định mức ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid trong dung dịch được tính theo công thức của Strickland và Parsons. (1972):
Trong đó:
V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (L) C (carotenoid tổng số) = 4,0 * E480 (µg) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với E480 là giá trị OD đo được ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid tính theo trọng lượng khô dựa vào carotenoid tổng số thu được từ dịch trích, chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và đường chuẩn (phương trình hồi quy tuyến tính) thể hiện mối tương quan giữa OD 600 nm và trọng lượng khô của vi tảo có dạng y= ax + b.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.7. Tuyển chọn môi trƣờng nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào.
- Khảo sát sự sinh trưởng của các dòng vi tảo được chọn trên cả năm loại môi trường: GYPSct, NM-5, NM-8, F-5 và F-8.
- Cách tiến hành như sau:
Nhân sinh khối cấp 1 như phần 3.4.2.
Dùng bình tam giác 100ml để khảo sát, mỗi môi trường lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị môi trường lỏng GYPSct, NM-5, NM-8. F-5, F-8 như Bảng 3.3 có kháng sinh Strep và Amp như Bảng 3.2 với dung tích mỗi bình 50ml/100ml.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau 4 ngày kiểm tra mẫu trong ống fancol bằng kính hiển vi, khi đạt điều kiện không bị nhiễm thì lắc đều chỉnh mật số về OD600nm=0,5 và với thể tích 0,5ml/bình. Điều kiện vô trùng.
Nuôi lắc 200vong/phút ở nhiệt độ phòng 28oC±1 bằng máy waterpath. - Hàng ngày chọn một mốc thời gian lúc 10 giờ để đo OD các bình tam giác, đo liên tục để thấy sự thay đổi OD theo thời gian. Điều kiện vô trùng.
- Tính toán và dùng thống kê để cho thấy sự khác biệt về sinh khối giữa các ngày trong 1 môi trường và giữa các môi trường với nhau. Kết quả này cho phép kết luận 1 môi trường ưu thế hơn so với 4 loại môi trường còn lại.
3.2.8. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu
Kết quả nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel. Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL).
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi tảo
Tổng cộng có 38 dòng đã được phân lập và tách ròng từ các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata Blume), lá bần (Sonneratia caseolaris) và lá mắm (Avicennia officinalis) thu tại các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Trong đó có 20 dòng ở Bến Tre và 18 dòng ở Trà Vinh. Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al., (2011), mười lăm dòng vi tảo đã được nhận diện như là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Các dòng tảo được đặt tên theo nguyên tắc: chữ cái đầu tiên là nguồn mẫu lá được sử dụng để phân lập, hai chữ cái kế tiếp là nguồn gốc xuất xứ nơi thu mẫu và số nguyên là thứ tự từ nhỏ đến lớn của các dòng tảo đã phân lập (Bảng 4.1).
Danh sách các dòng vi tảo đã phân lập ròng được trình bày trong Bảng 4.1:
Bảng 4.1: Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập
STT Dòng vi tảo Ký hiệu Nguồn Địa điểm thu mẫu
1 BBT01 B1 Lá Bần Bến Tre 2 BBT03 B3 Lá Bần Bến Tre 3 BBT04. B4 Lá Bần Bến Tre 4 BBT05 B5 Lá Bần Bến Tre 5 BBT08 B8 Lá Bần Bến Tre 6 MBT01 M1 Lá Mắm Bến Tre 7 MBT06 M6 Lá Mắm Bến Tre 8 MBT07 M7 Lá Mắm Bến Tre 9 MBT08 M8 Lá Mắm Bến Tre 10 MTV09 M9 Lá Mắm Trà Vinh 11 MTV10 M10 Lá Mắm Trà Vinh 12 MTV18 M18 Lá Mắm Trà Vinh 13 MTV19 M19 Lá Mắm Trà Vinh 14 MTV27 M27 Lá Mắm Trà Vinh 15 ĐTV14 Đ14 Lá Đước Trà Vinh
4.2. Mô tả hình thái vi tảo
Dựa vào các đặc tính cơ bản của vi tảo, các dòng đã phân lập được xác định bước đầu là nhóm Thraustochuytrid và được miêu tả như bảng 4.2.
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập
Dòng vi tảo
Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch GYPS
Đặc điểm hình thái tế bào vi tảo
B1 Tốc độ mọc nhanh khoảng 1 ngày, bề mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-8 µm, sống riêng lẻ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B3 Tốc độ mọc trung bình khoảng 2 ngày, bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20 µm, sống tập đoàn.
B4 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già chuyển sang vàng nhạt.
Hình elip, đường kính khoảng 4 - 10 µm, sống tập đoàn.
B5 Tốc độ mọc chậm khoảng 3-4 ngày, bề mặt khô, khuẩn lạc có màu vàng nhạt.
Hình elip, đường kính khoảng 10µm, sống riêng lẻ.
B8 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt trơn, nhô lên, khuẩn lạc có màu vàng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 6 µm, sống tập đoàn
M1 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt khô,
khuẩn lạc có màu hồng đậm. Hình cầu, đường kính khoảng 8 - 12 µm, sống thành tập đoàn. M6 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt nhẵn, ướt,
khuẩn lạc có màu trắng đục sau đó chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 12 µm, sống riêng lẻ.
M7 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt nhẵn, khô, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu hồng nhạt, khi già có màu hồng đậm hơn.
Hình bầu dục, đường kính khoảng 3- 7 µm, sống tập đoàn.
M8 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt bóng, ướt, khuẩn lạc có màu hồng nhạt sau đó chuyển sang màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 3 - 8 µm, sống tập đoàn
M9 Tốc độ mọc chậm, bề mặt bóng ướt, khuẩn lạc có màu trắng đục.
Hình elip, đường kính khoảng 4 - 18 µm, sống tập đoàn.
M10 Tốc độ mọc chậm, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 15 - 20 µm, sống tập đoàn.
Hầu hết các dòng vi tảo này phát triển khá tốt trên môi trường thạch GYPSct, thời gian để khuẩn lạc xuất hiện là từ 2 đến 3 ngày ủ tối ở 28oC±1. Màu sắc khuẩn lạc của các dòng đa số là trắng đục và trắng ngà ngoại trừ một số dòng M10, M1, M6, B8, Đ14 và B3 là khuẩn lạc có màu đặc trưng (hồng, vàng, vàng cam) và có sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo tuổi của khuẩn lạc. Điều này là do sự tích lũy carotenoid nội bào của vi tảo. Đây cũng là đặc điểm đặc trưng của khuẩn lạc của nhiều dòng vi tảo dị dưỡng như Thraustochytrium và Schizochytrium đã được phân lập trong những
khi già có màu vàng đậm.
M19 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi già có màu vàng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 2 - 14 µm, sống riêng lẻ.
M27 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt nhẵn,
khô, khuẩn lạc có màu vàng nhạt. Hình bầu dục, đường kính khoảng 3-14 µm, sống tập đoàn.
Đ14 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt khô, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 3 - 6 µm, sống tập đoàn
nghiên cứu trước đó (Aki et al., 2003; Chatdumrong et al., 2007; Hoàng Thị Lan Anh et al., 2010; Arafiles et al., 2011). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình thái tế bào các của 15 dòng vi tảo cũng đa dạng, đa số dòng có hình cầu, số ít dòng có hình elip và số còn lại có hình bầu dục. Đặc biệt tế bào của dòng Đ14 có khả năng phát triển và phân chia thành từng cụm gồm 2, 4, 8 tế bào hay nhiều hơn. Đây cũng là đặc điểm đặc trưng của các dòng vi tảo thuộc vi tảo Thraustochytrid (Goldstein và Belsky, 1964).
Những dòng vi tảo phân lập được khác nhau về cả hình dạng khuẩn lạc, tế bào và nguồn gốc mẫu phân lập, chứng tỏ rằng hệ vi tảo sống rất đa dạng trên các mẫu lá ở các vùng nước mặn.
Dựa vào các đặc điểm của khuẩn lạc, hình dạng tế bào, 15 dòng vi tảo được nhận diện thuộc nhóm vi tảo Thraustochytrid. Trong đó 4 dòng vi tảo B3, M6, M10 và Đ14
Hình 4.2: Hình thái tế bào của một số dòng vi tảo dƣới kính hiển vi (×1000) (A)M7; (B)B8; (C)M6; (D)M10; (E)B3; (F)Đ14 D C A B E F
có màu vàng hoặc hồng và được phân lập từ các nguồn lá khác nhau như lá bần (B3), lá mắm (M6, M10), lá đước (Đ14) được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
4.3. Kết quả dựng đƣờng chuẩn giữa trọng lƣợng khô và chỉ số OD
Sau khi xử lý kết quả bằng phần mềm excel, thu được kết quả như sau:
- Dòng Đ14
Đường chuẩn OD 600 nm - trọng lượng khô của dòng Đ14 có phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 0,902x + 0,133 với hệ số tương quan R2
= 0,995.
Hình 4.3. Đƣờng chuẩn OD 600 nm – trọng lƣợng khô dòng Đ14
- Dòng B3
Đường chuẩn OD 600 nm - trọng lượng khô của dòng B3có phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 1,034x + 0,054 với hệ số tương quan R2 = 0,995.
- Dòng M6
Đường chuẩn OD 600 nm - trọng lượng khô của dòng B3.1 có phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 1,019x + 0,032 với hệ số tương quan R2 = 0,995.
Hình 4.5. Đƣờng chuẩn OD 600 nm – trọng lƣợng khô dòng M6
- Dòng M10
Đường chuẩn OD 600 nm - trọng lượng khô của dòng B3.1 có phương trình hồi quy tuyến tính là: y = 0,807x + 0,050 với hệ số tương quan R2
= 0,995.
Hình 4.6. Đƣờng chuẩn OD 600 nm – trọng lƣợng khô dòng M10
Việc xây dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và trọng lượng khô của sinh khối tảo có ý nghĩa rất lớn, nó giúp xác định được trọng lượng khô của sinh khối tảo một cách nhanh chóng thông qua việc đo quang phổ dịch tảo ở bước sóng 600 nm mà không cần phải ly tâm thu sinh khối, sấy khô và cân khối lượng - một quá trình mất nhiều thời gian.
4.4. Kết quả đánh giá hiệu quả chọn lọc môi trƣờng để tăng sinh khối vi tảo.
Sau khi xử lý bằng phần mềm Excel thu được các biểu đồ sinh trưởng của bốn dòng vi tảo như sau:
B ct A ct , , ,
Hình4.7. Đƣờng sinh trƣởng của 4 dòng vi tảo A:B3; B:M6; C:M10 và D:Đ14
Dựa vào kết quả phân tích TLKTB đã cho thấy sinh khối tế bào của các dòng vi tảo khi được nuôi cấy trong môi trường GYPSct đạt cao nhất vào ngày thứ năm (0,542gTLK/100ml ở dòng B3, 0,578g TLK/100ml ở dòng M6, 0,348gTLK/100ml ở dòng M10 và 0,552gTLK/100ml ở dòng Đ14). Sau đó thì sự phát triển của các dòng tảo bị giảm dần theo thời gian (Hình A, B, C, D). Trong khi đó bốn môi trường còn lại đã gia tăng đáng kể sinh khối tế bào các dòng vi tảo, ở ngày thứ năm thì sinh khối tế
D
ct
C
bào các dòng vi tảo B3 và Đ14 đạt từ 0,9-1gTLK/100ml cao hơn gấp 2 lần so với môi trường GYPSct. Đặc biệt hơn, đỉnh sinh trưởng các dòng vi tảo khi nuôi trên bốn loại môi trường này là vào ngày thứ 10 - 11, mặc dù từ ngày thứ 12 sinh khối tế bào vẫn còn gia tăng nhưng sự gia tăng này khác biệt không ý nghĩa so với ngày thứ 10 (Hình A, B, C và D). Xét tại thời điểm 10 ngày thì sinh khối vi tảo ở môi trường NM-5 cao hơn các môi trường còn lại, cụ thể sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê ở dòng B3 hay M10. Môi trường NM-8%glucose và môi trường F-8%glucose có các thành phần môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});