- Các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata blume), lá bần (Sonneratia caseolaris)
và lá mắm (Avicennia officinalis) đang trong giai đoạn phân hủy, trôi dạt trên bãi biển hoặc ở đầm ngập mặn hoặc nằm trên lớp bùn ở rừng ngập mặn của các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre.
- Thời gian thu mẫu: 06/2014
3.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ: Can nhựa 20 L, bọc nilon, thau nhựa, màng bọc thực phẩm, gòn thấm
nước, kéo, kẹp, que cấy, đĩa petri, ống nghiệm, lame, lamen, micropipette, đầu cone, đèn cồn, bình tam giác, type...
Thiết bị: Cân điện tử Orion và Sartorius, máy đo pH, máy khuấy từ HB502, nồi
khử trùng nhiệt ướt, lò vi song, tủ cấy vi sinh vật LABCAIRE (Anh Quốc), tủ mát 4- 10oC (Alaska-Mỹ), tủ lạnh -20oC (Akira), kính hiển vi OLYMPUS ( ×10, ×40, ×100) (Nhật Bản), máy lắc ủ (water bath) Heidolph titramax 1000, máy ly tâm Eppendorf centrifuge 5417R, tủ sấy WTC Binder, máy đo quang phổ Genesys 10UV (Mỹ), thiết bị đo độ mặn
3.1.4. Hóa chất
Cồn 96% và 70%, D-glucose, yeast extract, peptone, NaCl, MgSO4, nước biển tự nhiên, dung dịch KOH, HCl, kháng sinh: Streptomycine, Ampiciline, agar, nước cất 1 lần.
3.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi tảo biển
Bảng 3.1: Môi trƣờng GYPS cơ bản (Arafiles et al., 2011)
Thành phần Nồng độ D – Glucose 10,0 g/L Yeast extract 5.0 g/L Peptone 10.0 g/L NSW (nƣớc biển tự nhiên) 500 ml/L Agar 15 g/L
Nƣớc cất thêm vào cho đủ 1L
Bảng 3.2. Môi trƣờng GYPSct (Arafiles et al., 2011)
Thành phần Nồng độ
D – Glucose 3,0 g/L
Yeast extract 1,25 g/L
Peptone 1,25 g/L
NSW (15%0) 500 ml/L
Nƣớc cất Thêm vào cho đủ 1 lít
Agar 15 g/L
Kháng sinh pH
Bảng 3.3 6,0
Bảng 3.3. Thành phần kháng sinh trong môi trƣờng GYPSct (Arafiles et al., 2011) có cải tiến
Thành phần Nồng độ
Streptomycin (Strep) 300 mg/ml 1ml/L môi trường GYPS
Bảng3.4. Thành phần 4 môi trƣờng chọn lọc NM – 5 (Nghiên cứu này) NM – 8 (Taha et al. 2013) F – 5 (Perveen et al. 2006) F – 8 (Taha et al. 2013) Glucose 50g/L 80g/L 50g/L 80g/L Peptone 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L Yeast extract 10g/L 10g/L 10g/L 10g/L Nƣớcbiển 50% 50% NaCl 1g/L 1g/L MgSO4 10g/L 10g/L Nƣớc cất Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Thêm cho đủ 1 lít Kháng sinh Bảng 3.2 Bảng 3.2 Bảng 3.2 Bảng 3.2 pH 6 6 6 6
Ghi chú: Nước biển NSW sử dụng 15%o
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Quy trình phân lập vi tảo 3.2.1. Quy trình phân lập vi tảo
Các dòng vi tảo biển được phân lập theo quy trình của Bremer et al., (2000) có một số cải tiến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.1.1. Thu mẫu
Mẫu được chọn là ba loại lá đước, bần và mắm rụng đang trong giai đoạn phân hủy ở các đầm ngập mặn, trên mặt bùn hay trôi nổi ở các cửa sông, biển ở 2 tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Thu mỗi loại 20 lá và rửa bùn sơ bộ những lá đã chọn với nước biển tại nơi lấy mẫu. Sau đó cho vào túi nylon và chuyển vào tủ mát 4oC trữ để phục vụ cho nghiên cứu.
3.2.1.2. Xử lý mẫu
- Chọn những phần lá còn nguyên vẹn, loại bỏ những chỗ bị mục nát nhiều để dễ dàng loại bỏ bùn bám vào.
- Rửa các mẫu lá trong dung dịch nước biển tự nhiên (NSW) (1 NSW:1 nước máy) 2 lần để loại bỏ bùn đất bám vào lá.
- Cắt những mẫu lá này thành các mảnh nhỏ khoảng 2-3 mm2 và chuyển các mẫu lá vào lọ thủy tinh 250ml.
- Ngâm trong NSW đã khử trùng khoảng 15 phút.
- Đổ bỏ nước ngâm. Cho NSW và nước cất đã khử trùng (tỉ lệ 1:1) vào và rửa 4-5 lần. Mỗi lần rửa được đặt trên máy khuấy từ trong 20 phút. Thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
3.2.1.3. Phân lập vi tảo
Sau khi xử lý khử trùng mẫu xong, đổ bỏ nước rửa cuối cùng, dùng kẹp cấy trực tiếp 4-5 mẫu lá vào môi trường GYPSct đặc trong đĩa Petri. Những đĩa này cũng được ủ trong tối ở nhiệt độ phòng 28oC±1 trong 24- 96 giờ. Khi nhận thấy có xuất hiện các khuẩn lạc, dùng que cấy vòng chuyển những khuẩn lạc vi tảo mọc quanh lá sang đĩa môi trường GYPSct mới. Quan sát bằng mắt thường thấy những khuẩn lạc khác nhau (màu sắc, hình dạng) thì cấy sang những đĩa khác nhau. Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính E40 phát hiện những khuẩn lạc nào là tảo ( tế bào có hinh cầu, đường kính trung bình từ 5 - 20 µm, bên trong tế bào có nhiều thể lipid) thì tiếp tục cấy chuyển sang đĩa môi trường mới. Việc cấy chuyển trên môi trường GYPSct nhiều lần cho phép thu được các khuẩn lạc thuần của các dòng vi tảo.
Sau khi phân lập, các dòng vi tảo được lưu giữ trong tủ mát 4-6o
C và cấy chuyển trên môi trường mới GYPSct đặc với mỗi tháng/lần.
3.2.2. Mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào vi tảo
- Quan sát, mô tả hình thái khuẩn lạc của các dòng vi tảo phân lập được.
-Quan sát, mô tả hình thái tế bào của các dòng vi tảo phân lập được dưới kính hiển vi.
-Các bước tiến hành quan sát hình thái tế bào vi tảo:
Chuẩn bị lame sạch, hơ dưới ngọn lửa đèn cồn.
Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame.
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi tảo hòa tan vào giọt nước cất vô trùng.
Dùng lamen đậy lên giọt nước cất vô trùng - vi tảo bằng cách để một cạnh của lamen tiếp xúc với lame một góc 45o rồi hạ lamen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 100-1000 lần, chụp lại hình ảnh quan sát được.
3.2.3. Nhân sinh khối các dòng vi tảo phân lập đƣợc
Nhân sinh khối cấp 1: Chuyển cẩn thận một khuẩn lạc đang nuôi cấy trên môi trường GYPS đặc vào ống ống nghiệm 50ml chứa 10ml môi trường lỏng GYPSct+Strep+Amp. Nuôi dung dịch trên máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ ủ là 28oC±1 với điều kiện tối trong 3-4 ngày.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau nhân giống cấp 1, mật độ vi tảo được chỉnh về OD600nm =0,5, chuyển 1ml dịch tảo sang bình tam giác 250ml có chứa 99ml môi trường GYPSct+Strep+Amp lỏng. Tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 28oC±1 trong 10-12 ngày.
3.2.4. Xác định trọng lƣợng khô tế bào vi tảo
Trọng lượng khô tế bào (TLKTB) vi tảo được xác định như sau: Thu hoạch tế bào trong 100ml dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm dung dịch ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC. Đổ bỏ phần dịch lỏng lấy phần tủa là sinh khối tảo, rửa với 50 ml nước cất vô trùng, lặp lại hai lần. Chuyển dung dịch tảo sang đĩa petri có đặt một tấm giấy lọc bên trong đĩa (đã cân trọng lượng đĩa petri và giấy lọc trước đó) sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi.
3.2.5. Xây dựng đƣờng chuẩn giữa trọng lƣợng khô tế bào và chỉ số OD
Dựa theo phương pháp của Taha et al. (2013). Để xác định trọng lượng khô của các dòng vi tảo phân lập được, tiến hành dựng đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ dịch tảo đo được ở bước sóng λ= 600nm và trọng lượng khô tế bào (TLKTB) của các dòng vi tảo phân lập được trên môi trường NM-8
Các bước tiến hành như sau:
- Sau khi nhân sinh khối các dòng vi tảo đến khi OD đạt được giá trị ≥2,0 với thể tích 500 ml, tiến hành pha loãng dịch tảo ở nồng độ từ 0,2-1,8 bằng chính môi trường nuôi cấy của vi tảo (thể tích dịch tảo ở mỗi nồng độ pha loãng là 100 ml). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đo quang phổ các nồng độ pha loãng ở bước sóng 600 nm.
- Tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch tảo ở các nồng độ pha loãng đem ly tâm có thể tích bằng nhau (100 ml).
- Đổ bỏ phần dịch lỏng, lấy phần tủa là sinh khối tảo.
- Sinh khối tảo được sấy ở 60oC đến khi khối lượng không thay đổi. - Cân và ghi nhận sinh khối khô của các dòng vi tảo.
- Xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft excel để xây dựng đường chuẩn. Từ những thông số thu được xây dựng đường chuẩn qua phương trình hồi quy tuyến tính giữa chỉ số OD và TLKTB của vi tảo có dạng y = ax + b. Trong đó y là chỉ số OD và x là TLKTB tương ứng của vi tảo (g/100 ml).
3.2.6. Xác định hàm lƣợng carotenoid
Hàm lượng carotenoid được xác định theo phương pháp của Hoàng Thị Lan Anh et al. (2010) có một số thay đổi để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Carotenoid được trích với dung môi ethanol 90%.
Các bước tiến hành trích carotenoid với dung môi ethanol 90%:
- Nghiền sinh khối tảo tươi với cát thủy tinh và chiết với 10 ml ethanol 90%. - Lọc lấy dịch trong bằng giấy lọc chuyên biệt Whatman GF/C.
- Định mức lên 10 ml bằng ethanol 90%.
- Đo quang phổ dung dịch sau khi định mức ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid trong dung dịch được tính theo công thức của Strickland và Parsons. (1972):
Trong đó:
V là lượng thể tích dịch tảo đem lọc (L) C (carotenoid tổng số) = 4,0 * E480 (µg)
Với E480 là giá trị OD đo được ở bước sóng 480 nm.
Hàm lượng carotenoid tính theo trọng lượng khô dựa vào carotenoid tổng số thu được từ dịch trích, chỉ số OD mà dịch tảo hấp thu ở bước sóng 600 nm và đường chuẩn (phương trình hồi quy tuyến tính) thể hiện mối tương quan giữa OD 600 nm và trọng lượng khô của vi tảo có dạng y= ax + b.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
3.2.7. Tuyển chọn môi trƣờng nuôi cấy để tăng sinh khối tế bào.
- Khảo sát sự sinh trưởng của các dòng vi tảo được chọn trên cả năm loại môi trường: GYPSct, NM-5, NM-8, F-5 và F-8.
- Cách tiến hành như sau:
Nhân sinh khối cấp 1 như phần 3.4.2.
Dùng bình tam giác 100ml để khảo sát, mỗi môi trường lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị môi trường lỏng GYPSct, NM-5, NM-8. F-5, F-8 như Bảng 3.3 có kháng sinh Strep và Amp như Bảng 3.2 với dung tích mỗi bình 50ml/100ml.
Nhân sinh khối cấp 2: Sau 4 ngày kiểm tra mẫu trong ống fancol bằng kính hiển vi, khi đạt điều kiện không bị nhiễm thì lắc đều chỉnh mật số về OD600nm=0,5 và với thể tích 0,5ml/bình. Điều kiện vô trùng.
Nuôi lắc 200vong/phút ở nhiệt độ phòng 28oC±1 bằng máy waterpath. - Hàng ngày chọn một mốc thời gian lúc 10 giờ để đo OD các bình tam giác, đo liên tục để thấy sự thay đổi OD theo thời gian. Điều kiện vô trùng.
- Tính toán và dùng thống kê để cho thấy sự khác biệt về sinh khối giữa các ngày trong 1 môi trường và giữa các môi trường với nhau. Kết quả này cho phép kết luận 1 môi trường ưu thế hơn so với 4 loại môi trường còn lại.
3.2.8. Phƣơng pháp phân tích và xử lý số liệu
Kết quả nhận được là giá trị trung bình của các lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel. Các số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) version 16 (SPSS Inc., Chicago, IL).
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Kết quả phân lập vi tảo
Tổng cộng có 38 dòng đã được phân lập và tách ròng từ các mẫu lá đước (Rhizophora apiculata Blume), lá bần (Sonneratia caseolaris) và lá mắm (Avicennia officinalis) thu tại các tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Trong đó có 20 dòng ở Bến Tre và 18 dòng ở Trà Vinh. Dựa trên các đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào theo như mô tả của Arafiles et al., (2011), mười lăm dòng vi tảo đã được nhận diện như là vi tảo thuộc nhóm Thraustochytrid. Các dòng tảo được đặt tên theo nguyên tắc: chữ cái đầu tiên là nguồn mẫu lá được sử dụng để phân lập, hai chữ cái kế tiếp là nguồn gốc xuất xứ nơi thu mẫu và số nguyên là thứ tự từ nhỏ đến lớn của các dòng tảo đã phân lập (Bảng 4.1).
Danh sách các dòng vi tảo đã phân lập ròng được trình bày trong Bảng 4.1:
Bảng 4.1: Các dòng vi tảo và nguồn gốc các dòng vi tảo đã phân lập
STT Dòng vi tảo Ký hiệu Nguồn Địa điểm thu mẫu
1 BBT01 B1 Lá Bần Bến Tre 2 BBT03 B3 Lá Bần Bến Tre 3 BBT04. B4 Lá Bần Bến Tre 4 BBT05 B5 Lá Bần Bến Tre 5 BBT08 B8 Lá Bần Bến Tre 6 MBT01 M1 Lá Mắm Bến Tre 7 MBT06 M6 Lá Mắm Bến Tre 8 MBT07 M7 Lá Mắm Bến Tre 9 MBT08 M8 Lá Mắm Bến Tre 10 MTV09 M9 Lá Mắm Trà Vinh 11 MTV10 M10 Lá Mắm Trà Vinh 12 MTV18 M18 Lá Mắm Trà Vinh 13 MTV19 M19 Lá Mắm Trà Vinh 14 MTV27 M27 Lá Mắm Trà Vinh 15 ĐTV14 Đ14 Lá Đước Trà Vinh
4.2. Mô tả hình thái vi tảo
Dựa vào các đặc tính cơ bản của vi tảo, các dòng đã phân lập được xác định bước đầu là nhóm Thraustochuytrid và được miêu tả như bảng 4.2.
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi tảo phân lập
Dòng vi tảo
Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch GYPS
Đặc điểm hình thái tế bào vi tảo
B1 Tốc độ mọc nhanh khoảng 1 ngày, bề mặt trơn, ướt, khuẩn lạc có màu trắng sữa.
Hình cầu, đường kính khoảng 3-8 µm, sống riêng lẻ.
B3 Tốc độ mọc trung bình khoảng 2 ngày, bề mặt bóng ướt, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu trắng đục, khi già chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 20 µm, sống tập đoàn.
B4 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già chuyển sang vàng nhạt.
Hình elip, đường kính khoảng 4 - 10 µm, sống tập đoàn.
B5 Tốc độ mọc chậm khoảng 3-4 ngày, bề mặt khô, khuẩn lạc có màu vàng nhạt.
Hình elip, đường kính khoảng 10µm, sống riêng lẻ.
B8 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt trơn, nhô lên, khuẩn lạc có màu vàng nhạt.
Hình cầu, đường kính khoảng 6 µm, sống tập đoàn
M1 Tốc độ mọc trung bình, bề mặt khô,
khuẩn lạc có màu hồng đậm. Hình cầu, đường kính khoảng 8 - 12 µm, sống thành tập đoàn. M6 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt nhẵn, ướt,
khuẩn lạc có màu trắng đục sau đó chuyển sang vàng cam.
Hình cầu, đường kính khoảng 5 - 12 µm, sống riêng lẻ.
M7 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt nhẵn, khô, khi mới phát triển khuẩn lạc có màu hồng nhạt, khi già có màu hồng đậm hơn.
Hình bầu dục, đường kính khoảng 3- 7 µm, sống tập đoàn.
M8 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt bóng, ướt, khuẩn lạc có màu hồng nhạt sau đó chuyển sang màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 3 - 8 µm, sống tập đoàn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M9 Tốc độ mọc chậm, bề mặt bóng ướt, khuẩn lạc có màu trắng đục.
Hình elip, đường kính khoảng 4 - 18 µm, sống tập đoàn.
M10 Tốc độ mọc chậm, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu trắng, khi già có màu hồng đậm.
Hình cầu, đường kính 15 - 20 µm, sống tập đoàn.
Hầu hết các dòng vi tảo này phát triển khá tốt trên môi trường thạch GYPSct, thời gian để khuẩn lạc xuất hiện là từ 2 đến 3 ngày ủ tối ở 28oC±1. Màu sắc khuẩn lạc của các dòng đa số là trắng đục và trắng ngà ngoại trừ một số dòng M10, M1, M6, B8, Đ14 và B3 là khuẩn lạc có màu đặc trưng (hồng, vàng, vàng cam) và có sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc theo tuổi của khuẩn lạc. Điều này là do sự tích lũy carotenoid nội bào của vi tảo. Đây cũng là đặc điểm đặc trưng của khuẩn lạc của nhiều dòng vi tảo dị dưỡng như Thraustochytrium và Schizochytrium đã được phân lập trong những
khi già có màu vàng đậm.
M19 Tốc độ mọc nhanh, bề mặt bóng, khi mới phát triển khuẩn lạc màu vàng nhạt, khi già có màu vàng đậm.
Hình cầu, đường kính khoảng 2 - 14