Nghiên cứu cố định enzyme cellulose trên gel calcium alginate và khảo sát tính chất enzyme sau cố định

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA W X BK TP HCM TRẦN QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CELLULASE TRÊN GEL CALCIUM ALGINATE VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME SAU CỐ ĐỊNH Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm đồ uống Mã số: 11110225 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Cộng hòa xã hội chủ nghĩaViệt Nam Độc lập – Tự – Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRẦN QUỐC VIỆT MSSV: 11110225 Ngày, tháng, nămsinh: 12/01/1987 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm & Đồ uống Mã số: 605402 I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CELLULASE TRÊN GEL CALCIUM ALGINATE VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME SAU CỐ ĐỊNH II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG − Tổng quan tài liệu enzyme cellulose phương pháp cố định enzyme − Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới trình cố định cellulase − Khảo sát tính chất enzyme sau cố định chất CMC − Thử nghiệm khả thủy phân enzyme cố định chất không tan III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tp HồChí Minh, ngày tháng năm 2013 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO PGS.TS Đống Thị Anh Đào PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC PGS.TS Phan Thanh Sơn Nam CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Cán nhận xét 1:PGS.TS ĐồngThịThanh Thu Cán nhận xét 2:PGS.TS NguyễnThúyHương Luận văn thạc sĩ bảo vệ trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp.HCM ngày29, tháng 07, năm 2013 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Chủ Tịch: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 1: PGS.TS Đồng Thị Thanh Thu Phản biện 2: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Uỷ Viên: PGS.TS Đống Thị Anh Đào Thư ký: TS Võ Đình Lệ Tâm Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn PGS.TS Phan Thanh Sơn Nam LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS.Đống Thị Anh Đào tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho em thực tốt luận văn Kế đến, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tập thể quý thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm – người dẫn dắt, dạy cung cấp kiến thức chuyên ngành, kiến thức xã hội cần thiết suốt năm học vừa qua Đó tảng giúp em hồn thành tốt luận văn hành trang cho em vững tin bước vào sống Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè quan tâm, hỗ trợ, hợp tác với suốt thời gian học tập thực luận văn TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực Trần Quốc Việt i GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tóm tắt luận văn TĨM TẮT LUẬN VĂN Trong nghiên cứu chế phẩm enzyme cellulase cố định gel calcium alginate phương pháp bắt nhốt Nồng độ dung dịch natri alginate sử dụng để tạo hạt 2% Hoạt tính enzyme cố định khảo sát chất carboxymethyl cellulose (CMC) Hiệu suất cố định cao 83,645% với thông số: thời gian ngâm hạt gel calcium alginate chứa enzyme dung dich CaCl2 30 phút vàđường kính hạt alginate 3mm pH tối ưu enzyme cố định 4,5, giá trị không thay đổi so với enzyme tự Nhiệt độ tối ưu enzyme có định 60oC, cao 5oC so với enyme tự có nhiệt độ tối ưu 55oC Enzyme cố định bền so với enzyme tự do, hoạt tính enzyme cố định thay đổi so với thay đổi pH nhiệt độ môi trường Enzyme cố định chịu nhiệt độ phản ứng cao chịu pH cao enzyme tự Chế phẩm Celluclast 1.5L sau cố định gel alginate tái sử dụng nhiều lần Hoạt tính enzyme cố định cịn 69,2% sau lần sử dụng 20,3% lần sử dụng thứ ABSTRACT In this study, enzyme cellulase was immobilized in calcium alginate bead by entrapment method Natri alginate concentration which was use for alginate bead forming is 2% Immobilized enzyme activity was carried on carboxymethyl cellulose (CMC) The maximum productivity of enzyme immobilization is 83,645% with immobilized time is 30 minute and bead diameter is 3mm The optimum pH value of immobilized enzyme and free enzyme is 4,5 The optimum temperature value of immobilized enzyme is higher than free enzyme, 60oC and 55oC respectively Immobilized enzyme are more stable versus the change of pH and temperature of environment than free enzyme Immobilized enzyme can stand higher acidity and temperature than free enzyme Immobilized cellulase could be reused many time Immobilized enzyme activity remain 69,2% after times using and remain 20,3% after times using SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT ii Tóm tắt luận văn GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Đống Thị Anh Đào Các số liệu, kết luận nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác chưa công bố hình thức nào, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2013 Học viên thực hiên TRẦN QUỐC VIỆT SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT iii GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i  TÓM TẮT LUẬN VĂN ii  ABSTRACT ii  MỤC LỤC iv  DANH MỤC BẢNG vi  DANH MỤC HÌNH vii  DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x  Chương GIỚI THIỆU .1  Chương TỔNG QUAN 2  2.1 Enzyme cellulase 2  2.1.1 Cơ chất cellulose 2  2.1.2 Phân loại cellulase (Wolfgang, 2004) 3  2.1.3 Enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma reesei 4  2.1.4 Endoglucanase 9  2.2 Enzyme cố định 14  2.2.1 Định nghĩa 14  2.2.2 Các phương pháp cố định (John M deMan, 1999) .15  2.2.3 Cố định enzyme cellulase 17  2.3 Tính đề tài .23  Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25  3.1 Nguyên liệu 25  3.1.1 Nguồn enzyme .25  3.1.2 Cơ chất cellulose: CMC giấy lọc 25  SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT iv GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Mục lục 3.1.3 Chất mang Calcium alginate 27  3.2 Phương pháp nghiên cứu 27  3.2.1 Mục tiêu nghiên cứu 27  3.2.2 Quy trình cố định 28  3.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 29  3.2.4 Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu 29  3.3 Các phương pháp tính tốn phân tích .32  3.3.1 Xác định hoạt tính cellulase (T K Ghose, 1987) 32  3.3.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan (M M Bradford, 1976) 33  3.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 33  Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35  4.1 Ảnh hưởng kích thước hạt đến hiệu suất cố định 35  4.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme cố định đến hiệu suất cố định 38  4.3 Ảnh hưởng thời gian cố định đến hiệu suất cố định .40  4.4 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme cố định 42  4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cố định .45  4.6 Khảo sát số lần tái sử dụng enzyme cố định 48  4.7 Khảo sát hoạt tính thủy phân chất không tan enzyme cố định 52  Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54  5.1 Kết luận 54  5.2 Kiến nghị .55  TÀI LIỆU THAM KHẢO 56  PHỤ LỤC .63  Xác định hoạt tính cellulase chất CMC .63  Xác định hoạt tính cellulase chất giấy lọc Whatman No.1 66  SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT v GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần cellulase sản xuất Trichodermareesei Bảng 2.2 Một số tính chất enzyme cellulase Trichodermareesei tiết Bảng 2.3.Hoạt tính enzyme cố định theo thời gian (M Dragomirescu cộng sự, 2010) Bảng 3.1.Một vài thông số kỹ thuật CMC giấy lọc Whatman No.1 (Zhang cộng sự, 2006) Bảng 4.1.Khảo sát hiệu suất cố định enzyme hạt có kích thước khác Bảng 4.2.Hiệu suất cố định enzyme nồng độ cố định khác Bảng 4.3 Hiệu suất cố định enzyme thời gian ngâm khác Bảng 4.4 Hoạt tính enzyme cố định CMC điều kiện pH môi trường phản ứng khác Bảng 4.5.Hoạt tính enzyme cố định CMC điều kiện nhiệt độ môi trường phản ứng khác Bảng 4.6.Hoạt tính tương đối enzyme cố định CMC sau lần tái sử dụng Bảng 4.7.Sự thất enzyme mơi trường chất Bảng 4.8.Hoạt tính enzyme cố định enzyme tự giấy lọc Whatman SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT vi GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Chương 5.2 Kiến nghị Chúng đề xuất số hướng nghiên cứu sau: − Nghiên cứu cố định enzyme với nồng độ alginate cao nhằm cải thiện khả thất thoát enzyme môi trường − Kết hợp Ca alginate số cầu nối với enzyme nhằm cải thiện khả thất enzyme mơi trường − Thủy phân cellulose điều kiện nhiệt độ cao, pH thấp nhằm tăng cường hiệu thủy phân − Ứng dụng chất tạo khơng gian bên hạt alginate để cố định nhiều enzyme SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 55 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Anwar, S A Ul Qader, A Raiz, S Iqbal and A Azhar.”Calcium Alginate: A Support Material for Immobilization of Proteasesfrom Newly Isolated Strain of Bacillus subtilis KIBGE-HAS”, World Applied Sciences Journal Vol.7, pp 1281-6, 2009 [2] A Cavaco-Paulo and L Almeida.”Cellulase Hydrolysis of Cotton Cellulose: The Effects of Mechanical Action, Enzyme Concentration and Dyed Substrates”, Biocatalysis.Vol.10, pp 353-60, 1994 [3] M Aliyu andM.J.Hepher.“Effects of ultrasound energy on degradation of cellulose material”,Ultrasonics Sonochemistry Vol.7, pp.265–8, October.2000 [3] A Tanriseven, S Dogan “Immobilization of invertase within calcium alginate gel capsules”, Process Biochemistry Vol.36 (2001), pp 1081–3, February 2001 [3] A Wolfgang Enzyme in Industry – production and applications WILEY-VCH Verlag GmbH &Co.KGaA, Weinheim: 2004 pp 175-7 [4] A.F.F Hsu et al “Immobilization of lipoxygenase in an alginate-silicate sol-gel matrix: formation of fatty acid hydroperoxides”, BiotechnolLetters Vol.19, pp 71-4, January.1997 [5] B Afsahi et al “Immobilization of Cellulase on Non-Porous Ultrafine Silica Particles”, Scientia Iranica.Vol 14,pp 379-83, August.2007 [6] B Nidetzky et al “Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: adsorptions of two cellobiohydrolases, two endocellulases and their core proteins on filter paper and their relation to hydrolysis”,Biochemistry Journal Vol.303 (Pt3), pp 817-823,November 1994 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 56 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tài liệu tham khảo [7] B.H.A Rehm Alginates: Biology and Applications New Zealand: Springer 2009, pp 30-33 [8] C Divne et al “The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei”, Science.Vol.265 (5171), pp 5248, Jul.1994 [9] C P Kubicek “The Cellulase Proteins of Trichoderma reesei: Structure, Multiplicity, Mode of Action and Regulation of Formation”, Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology Vol.45, pp 1-27, 1992 [10] D Andriani et al “Immobilization of cellulase from newly isolated strain Bacillus subtilis TD6 using calcium alginate as a support material”, Bioprocess Biosyst Engineer Vol.35, pp 29-33, Jan.2012 [11] E Demirkan et al “Immobilization of B amyloliquefaciens α-amylase and comparison of some of its enzymatic properties with the free form”, Romanian Biotechnological Letters.Vol 16, No 6, May.2011 [12] G Schmid and C.H Wandrey “Purification and partial characterization of a cellodextrin glucohydrolase (β-glucosidase) from Trichoderma reesei strain QM 9414” Biotechnology and Bioengineering.Vol.30, pp 571-85 September.1987 [13] G Walsh Proteins, Biochemistry and Biotechnology 2002 Chichester, John Wiley and Sons, UK [14] G.L Miller “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Analytical Chemistry.Vol.31, pp 426–428, March.1959 [15] H Kakita and H Kamishima “Some properties of alginate gels derived from algal sodium alginate”, Journal of Applied Phycology vol.20, pp.93-99, 2009 [16] H Lee et al “A comparative structural characterization of two cellobiohydrolases from Trichoderma reesei: a high resolution electron microscopy study”, Journal of Biotechnology Vol.57, pp 127-136, September.1997 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 57 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tài liệu tham khảo [17] J Blackwell “The macromolecular orgamization of cellulose and chitin”, in Cellulose and other natural polymer systems, R M Jr Brown, Ed New York: Plenum Press, 1982, pp 403-28 [18] J M deMan Principles of Food Chemistry Aspen Publisher:1999, pp 423-7 [19] J P Kraulis et al “Determination of the Three-Dimensional Solution Structure of the C-Terminal Domain of Cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei A Study Using Nuclear Magnetic Resonance and Hybrid Distance GeometryDynamical Simulated Annealing”, Biochemistry.Vol.28 (18), pp 7241-57, September.1989 [20] J Zhou “Immobilization of cellulase on a reversibly soluble-insoluble support: properties and application”, Journal of agricultural and food chemistry.Vol.58, pp 6741-6.Jun.2010 [22] J.Y Zou et al “Crystallographic evidence for subtract ring distortion and protein conformational changes during catalysis in Cel6A from Trichoderma reesei” Structure.Vol.7, pp 1035-45,September.1999 [23] K Won et al “Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads”, Process Biochem.Vol.40, pp 2149-2154, May.2005 [24] K.J Gerard et al “The Crystal Structure of the Catalytic Core Domain of Endoglucanase I from Trichoderma reesei at 3.6 A° Resolution, and a Comparison with Related Enzymes”, Journal of Molecular Biology.Col.272, pp 383-397, September.1997 [25] K.K.K Okajima et al “Spectra of Cellulose Solid, An Explanation by Intramolecular Hydrogen Bond Concept”, Polymer Journal Vol.17(5), pp 707714, 1985 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 58 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tài liệu tham khảo [26] M B Fadda et al “Highly efficient solubilization of natural lignocellulosic materials by a commercial cellulase immobilized on various solid supports”, Applied Microbiology and Biotechnology.Vol.19, pp 306-311, May.1984 [27] M Dragomirescu et al “Immobilized Microbial Cellulases in Organic-Inorganic Hybrid Materials”, Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies Vol.44(1), pp.380,June.2011 [28] M Dragomirescu et al “Microbial Cellulases Immobilized in/on Porous Supports”, Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies Vol.43(1), pp.271-247, 2010 [29] M et al (2003) “Introducing functional groups onto the surface of carbon nanotubes helps to immobilize these useful molecules and facilitates their study” Chemistry Europen Journal.pp.4000-08, 2003 [30] M Grassi et al “Structural Characterization of Calcium Alginate Matrices by Means of Mechanical and Release Tests” Molecules Jurnal.Vol.14(8), pp 300317, August.2009 [31] M Linder et al “Identification of functionally important amino acids in the cellulose binding domain of Trichoderma reesei Cellobiohydrolase “, Protein Science.Vol.4, pp 1056-64, Jun.1995 [32] M M Bradford “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical Biochemistry.Vol.72, pp 248-254, May.1976 [33] M Maija-Liisa et al “Solution structure of the cellulose-binding domain of endoglucanase I from Trichoderma reesei and its interaction with cellooligosaccharides”, European journal of biochemistry.Vol.256, pp 279-286, September.1998 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 59 Tài liệu tham khảo GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO [34] M.P Coughlan Enzyme Systems for Lignocellulose Degradation.London: Elsevier Applied Science, 1989, pp 37-49 [35] M Srisodsuk PhD thesis.Mode of Action of Trichoderma Reesei Cellobiohydrolase I on Crystalline Cellulose Espoo, Finland: VTT Publications, 1994, Vol.188 [36] M.E Himmel et al “Cellulase for commodity from cellulosic biomass” ,Current Opinion in Biotechnol.Vol.10(4), pp 358-64, 1999 [37] M.J Taherzadeh and K Karimi “Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lingocellulosic materials: a review” Bioresourc Journal Vol.2, pp 707738 2007 [38] M.L Huguet et al “Calcium-alginate beads coated with polycationic polymers: comparison of chitosan and DEAE-Dextran”, Process Biochemistry Vol.31, pp 347-53, May.1996 [39] M.L Mattinen et al “Three-dimensional structures of three engineered cellulosebinding domains of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei”, Protein Science.Vol.6, pp 294-303, February.1997 [40] M.M Campos-Vallette et al “Characterization of sodium alginate and its block fractions by surface-enhanced Raman spectroscopy”, Journal of Raman Spectroscopy Vol.41, pp.758-763,July.2010 [41] R.M Abd and A.H Nour “Optimisation of immobilised cellulase onto carbon nanotubes using response surface methodology”.International Journal of the Physical Sciences.Vol.7(5),pp.841-849,January.2012 [42] S Perez and M William.“Structure and amorphology of cellulose”.Internet: http://www.cermav.cnrs.fr/glyco3d/lessons/cellulose/, Mar 20, 2001 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 60 Tài liệu tham khảo GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO [43] S Singh et al “Calcium alginate as a support material for immobilization of Lamino acid oxidase isolated from aspergillus fumigates”.The IIOA3 Journal.Vol.3, pp 7-11,Oct.2012 [44] S.D Mansfield and J.N Saddler Application of Enzymes to Lignocellulosics The American Chemical Society, Oxford University Press: 2003 855: pp 116-31 [45] S.M Lee et al “β-Glucosidase coating on polymer nanofibers for improved cellulosic ethanol production”, Bioprocess and Biosystem Engineering.Vol.33, pp 141–47, Jan.2010 [46] S.N Pawar and K.J Edgar “Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications” Biomaterials.Vol.33,pp 3279-305,April.2012 [47] S Talekar and S Chavare.“Optimization of immobilization of α-amylase in alginate gel and its comparativebiochemical studies with free α-amylase”, Recent Research in Science and Technology.Vol.4, pp.01-05, 2012 [48] T.K Ghose “Measurement of cellulase activities”, Pure and Applied Chemistry.Vol.59 (2), pp 257-68, 1987 [49] T Takeuchi and K Makino “Cellulase immobilized on poly-L-glutamic acid” Biotechnol Bioengineering Vol.29(2), pp 160-4,February.1987 [50] W.J Chirico et al “Purification and characterization of a β-glucosidase from Trichoderma reesei”, European Journal of Biochemistry.Vol.165 (2), pp 333-41, June.1987 [51] Z Su et al “Cellulase immobilization properties and their catalytic effect on cellulose hydrolysis in ionic liquid”, African Journal of Microbiology Research.Vol 6(1), pp 64-70 Jan.2012 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 61 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Tài liệu tham khảo [52] Zhang Y.-H Percival, Michael E Himmel, Jonathan R Mielenz “Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies”,Biotechnology Advances.Vol.24(5), pp.452-481, September.2006 SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 62 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Phụ lục PHỤ LỤC Phương pháp tính tốn phân tích Xác định hoạt tính cellulase (Ghose,1987) a) Hóa chất chất DNS o Hịa tan 10,6 g 3,5 – Dinitrosalicylic 1416mL nước cất Sau thêm vào 306g Natri Kali Tartrate 19,8 g NaOH, 7,6 mL phenol (tan chảy 500C), 8,3g Natri metabisulfite Đệm citrate o Đối với Trichoderma reesei, thí nghiệm hoạt tính cellulase tiến hành đệm citrate 0,05 M, pH 4,8 o Acid monohydrate citric 210 g o Nước cất loại ion 750 mL o NaOH thêm vào pH = 4,3 o Pha loãng thành 1L kiểm tra pH Nếu cần thiết, thêm NaOH pH = 4,5 Khi 1M đệm citrate pha loãng với nước đến 50mM, pH 4,8 Sau pha loãng đệm citrate, kiểm tra chỉnh pH (nếu cần thiết) đến pH 4,8 b) Cách tiến hành Xác định hoạt tính cellulase chất CMC Ống thí nghiệm với enzyme - Thêm 0,5 mL enzyme pha lỗng thích hợp đệm citrate vào ống nghiệm tích tối thiểu 25 mL Ít việc pha lỗng phải tiến hành SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 63 Phụ lục GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO lần cho mẫu enzyme, mẫu giải phóng nhiều 0,5 mg glucose (số liệu tuyệt đối) mẫu giải phóng 0,5 mg glucose - Gia nhiệt enzyme lên 50°C - Thêm 0,5 mL CMC 2%, lắc kỹ - Ủ 50°C 30 phút - Vào cuối thời gian ủ, lấy ống nghiệm khỏi bể điều nhiệt 50°C ngừng phản ứng enzyme cách thêm 3,0 mL DNS lắc Mẫu trắng mẫu đối chứng o Mẫu trắng: 0,5 mL CMC 2%, ủ 50°C 30 phút, thêm 0,5 mL đệm citrate, thêm 3,0 mL DNS lắc Mẫu dùng để điều chỉnh máy quang phổ độ hấp thu = o Mẫu enzyme đối chứng: 0,5 mL CMC 2%, ủ 50°C 30 phút, thêm 0,5 mL enzyme pha loãng, thêm 3,0 mL DNS lắc (chuẩn bị mẫu đối chứng riêng cho pha loãng khác nhau) Màu đo dựa mẫu trắng trừ giá trị vào ống phản ứng tương ứng Mẫu glucose chuẩn o Chuẩn bị dung dịch glucose mg/mL Dung dịch phải cho vào chai thật kín trữ nhiệt độ đông Sau rã đông, nên sử dụng máy vortex để đảm bảo hỗn hợp đồng o Pha loãng dung dịch glucose theo tỉ lệ đây: ƒ Khơng pha lỗng ƒ 1,0 mL + 0,5 mL đệm = 1:1,5 = 1,33 mg/mL (0,67 mg/0,5 mL) ƒ 1,0 mL + 1,0 mL đệm = 1:2 = mg/mL (0,5 mg/0,5 mL) ƒ 1,0 mL + 3,0 mL đệm = 1:4 = 0,5 mg/mL (0,25 mg/0,5 mL) o Ống glucose chuẩn chuẩn bị: 0,5 mL dung dịch pha loãng + = mg/mL (1 mg/0,5 mL) mL đệm citrate vào ống nghiệm o Mẫu trắng, đối chứng chuẩn ủ 500C tương tự mẫu thí nghiệm với enzyme sau ngừng cách thêm 3,0 mL DNS SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 64 Phụ lục GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Màu đo dựa mẫu trắng 0.3 OD o 0.272 0.25 y = 0.281x ‐ 0.009 R² = 0.991 0.189 0.2 0.121 0.15 0.1 0.051 0.05 ‐0.05 0.4 0.8 1.2 Nồng độ glucose (mg/ 0.5 ml) Hình: Đường chuẩn đường khử CMC So màu o Gia nhiệt tất ống nghiệm phút với nước sôi, bể nước phải đảm bảo đủ nước ngập phần dung dịch ống nghiệm Tất mẫu, đối chứng, mẫu trắng mẫu chuẩn glucose nên cho vào lúc Sau đó, chuyển tất ống nghiệm vào bể nước đá lạnh o Thêm 10 mL nước cất, lắc đảo vài lần để dung dịch tách rời khỏi phần đáy ống nghiệm o Màu tạo thành đo dựa mẫu trắng bước sóng 540nm c) Tính tốn o Xây dựng đường cong tuyến tính glucose chuẩn cách sử dụng hàm lượng glucose tuyệt đối (mg/0,5 mL) A540 o Sử dụng đường chuẩn để xác định hàm lượng glucose giải phóng (dựa theo độ hấp thu) mẫu thí nghiệm enzyme sau trừ giá trị mẫu enzyme đối chứng SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 65 Phụ lục GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Ước tính nồng độ enzyme đủ để giải 0,5 mg glucose cách vẽ hàm o lượng glucose giải phóng theo logarit nồng độ enzyme Tính tốn NCU theo cơng thức o Hoạt tính chất CMC = 0,185 nồng độ enzyme giải phóng 0.5 mg glucose NCU/mL Xác định hoạt tính cellulase chất giấy lọc Whatman No.1 Ống thí nghiệm với enzyme - Xé nhỏ giấy lọc vào ống nghiệm 13 x 100 - Thêm 1,0 mL 0,05M Na-citrate, pH 4.8 vào ống nghiệm, dung dịch đệm nên thấm ướt hết giấy lọc - Cân ống nghiệm với đệm chất đến nhiệt độ 600C - Thêm 0,5 mL enzyme pha lỗng thích hợp đệm citrate Ít việc pha loãng phải tiến hành lần cho mẫu enzyme, mẫu giải phóng nhiều 2,0 mg glucose (số liệu tuyệt đối) mẫu giải phóng 2,0 mg glucose Mục đích tương ứng với 2,1 1,9 mg glucose cho pha loãng - Ủ 50oC 60 phút - Vào cuối thời gian ủ, lấy ống nghiệm khỏi bể điều nhiệt 500C ngừng phản ứng enzyme cách thêm 3,0 mL DNS lắc Mẫu trắng mẫu đối chứng - Mẫu trắng: 1,5 mL đệm citrate Mẫu dùng để điều chỉnh máy quang phổ độ hấp thu = - Mẫu enzyme đối chứng: 1,0 mL đệm citrate + 0,5 mL dung dịch enzyme pha loãng (chuẩn bị mẫu đối chứng riêng cho pha loãng khác nhau) Màu đo dựa mẫu trắng trừ giá trị vào ống phản ứng tương ứng - Mẫu đối chứng chất: 1,5 mL đệm citrate + giấy lọc Mẫu glucose chuẩn SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 66 Phụ lục GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO - Chuẩn bị dung dịch glucose 10mg/mL Dung dịch phải cho vào chai thật kín trữ nhiệt độ đơng Sau rã đông, nên sử dụng máy vortex để đảm bảo hỗn hợp đồng - - Pha loãng dung dịch glucose theo tỉ lệ đây: - 1,0 mL + 0,5 mL đệm = 1:1,5 = 6,7 mg/mL (3,35 mg/0,5 mL) - 1,0 mL + 1,0 mL đệm = 1:2 = 5,0 mg/mL (2,5 mg/0,5 mL) - 1,0 mL + 2,0 mL đệm = 1:3 = 3,3 mg/mL (1,65 mg/0,5 mL) - 1,0 mL + 4,0 mL đệm = 1:5 = mg/mL (1,0 mg/0,5 mL) Ống glucose chuẩn chuẩn bị: 0,5 mL dung dịch pha loãng + mL đệm citrate vào ống nghiệm - Mẫu trắng, đối chứng chuẩn ủ 60oC tương tự mẫu thí nghiệm với enzyme sau ngừng cách thêm 3,0 mL DNS Màu đo dựa mẫu trắng OD - 0.909 0.9 0.721 0.8 0.7 0.553 0.6 y = 0.2777x + 0.0147 R² = 0.9815 0.5 0.4 0.251 0.3 0.2 0.1 0 Nồng độ glucose (mg/0.5ml) Hình: Đường chuẩn đường khử cellulose So màu - Gia nhiệt tất ống nghiệm phút với nước sôi, bể nước phải đảm bảo đủ nước ngập phần dung dịch ống nghiệm Tất mẫu, đối chứng, mẫu trắng mẫu chuẩn glucose nên cho vào lúc Sau đó, chuyển tất ống nghiệm vào bể nước đá lạnh SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 67 Phụ lục GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO - Thêm 20 mL nước cất, lắc đảo vài lần để dung dịch tách rời khỏi phần đáy ống nghiệm - Giữ yên ống nghiệm bã lắng xuống (ít 20 phút) hay dùng ly tâm Màu tạo thành đo dựa mẫu trắng bước sóng 540nm Tính tốn - Xây dựng đường cong tuyến tính glucose chuẩn cách sử dụng hàm lượng glucose tuyệt đối (mg/0,5mL) A540 - Sử dụng đường chuẩn để xác định hàm lượng glucose giải phóng (dựa theo độ hấp thu) mẫu thí nghiệm enzyme sau trừ giá trị mẫu enzyme đối chứng - Ước tính nồng độ enzyme đủ để giải phóng 2,0 mg glucose cách vẽ hàm lượng glucose giải phóng theo logarit nồng độ enzyme - Tính tốn FPU theo cơng thức Hoạt tính chất giấy lọc = 0,37 nồng độ enzyme giải phóng 2,0 mg glucose FPU/mL Xác định hàm lượng protein hòa tan (Bradford, 1976) a) Hóa chất - Thuốc nhuộm Bradford: hịa tan 10 mg thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue vào 50 mL ethanol 96o, thêm 100 mL H3PO4 85% định mức tới 1L nước cất - Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin): 0,1 mg/mL - Dịch mẫu protein: mL cho phản ứng b) Tiến hành thí nghiệm Xây dựng đường chuẩn albumin SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 68 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO - Phụ lục Pha loãng dung dịch BSA chuẩn 0.1mg/mL thành: 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL - Hút 1mL dung dịch protein chuẩn nồng độ từ 10 – 50μg/mL, thêm vào mL thuốc nhuộm Bradford, lắc - Sau 10 phút đem đo OD tạibước sóng 595 nm - Vẽ đồ thị biễu diễn biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/mL) Xác định hàm lượng protein mẫu - Tương tự hút 1mL protein cần phân tích, thêm vào mL thuốc nhuộm Bradford, để yên 10 phút, đem đo OD bước sóng 595nm Từ đường chuẩn suy hàm lượng protein hòa tan mẫu cần phân tích Xác định hiệu suất cố định enzyme: Hiệu suất cố định (%) = - (A/ B *100) Trong đó: A: Lượng protein enzyme dịch lọc dung dịch CaCl2 dịch rửa hạt enzyme B: Lượng protein enzyme sử dụng để cố định Tỉ lệ enzyme thất thoát: Tỉ lệ enzyme thất thoát (%) = (A/ B *100) Trong A: Lượng enzyme môi trường ngâm n hạt enzyme cố định B: Lượng enzyme có n hạt enzyme cố định SVTH: TRẦN QUỐC VIỆT 69 ... TÀI: NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH ENZYME CELLULASE TRÊN GEL CALCIUM ALGINATE VÀ KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ENZYME SAU CỐ ĐỊNH II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG − Tổng quan tài liệu enzyme cellulose phương pháp cố định enzyme. .. đề tài nghiên cứu: ? ?Cố định enzyme cellulase gel calcium alginate khảo sát tính chất enzyme sau cố định? ?? Chúng khảo sát tác động nồng độ enzyme, thời gian ngâm hạt gel dung dịch CaCl 2và kích... suất cố định enzyme cellulase lên gel alginate Trong nghiên cứu này, cellulase chế phẩm cố định trực tiếp lên calcium alginate phương pháp bắt nhốt khuôn gel, enzyme cố định khảo sát tính chất