PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH CÂY LÚA TRỒNG Ở TỈNH PHÚ YÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Ngành: Sinh học

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH PHÚ YÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC PHÚ YÊN - VĂN THỊ PHƢƠNG NHƢ PHÂN LẬP, NHẬN DIỆN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH VI KHUẨN NỘI SINH CÂY LÚA TRỒNG Ở TỈNH PHÚ YÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Ngành: Sinh học Phú Yên, 8/2014 TÓM TẮT Vi khuẩn nội sinh thực vật tìm thấy hầu hết loài thực vật, chúng cư trú mơ thực vật chúng hình thành mối quan hệ khác cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh …có nhiều lồi vi khuẩn nội sinh thực vật - lúa Pantoea, Azospirillum, Burkholderia, vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng suất đóng vai trị tác nhân điều hịa sinh học Ngồi ra, chúng cịn có tiềm loại bỏ chất gây ô nhiễm đất cách tăng cường khả khử độc thực vật làm cho đất trở nên màu mỡ thơng qua chu trình phospho cố định đạm Một trăm mươi bảy dòng vi khuẩn phân lập từ 20 mẫu lúa cao sản thu huyện Đơng Hịa, Sơng Hinh, Tuy An thành phố Tuy Hòa thuộc tỉnh Phú Yên Đa số dịng vi khuẩn có dạng hình que, gram âm có khả chuyển động Kết khảo sát khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA 115 dòng vi khuẩn cho thấy dịng L22 thuộc huyện Tuy An có khả tổng hợp NH4+ cao (5,61 mg/l) sau ngày nuôi cấy, dịng L136 thuộc huyện Đơng Hịa có hàm lượng lân hòa tan cao (319,51 mg/l) sau 10 ngày ni dịng N11 thuộc huyện Tuy An có hàm lượng IAA cao (25,63 µg/ml) sau ngày ni Từ khóa: Cây lúa, cố định đạm, hịa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Tiếng Việt 16S-rDNA 16S-ribosomal DNA coding gene Blast DNA Basic lical alignmeht search tool Acid deoxyribonucleic FAO IAA Food and Agriculture of Organisation Indole acetic acid ML NCBI Ma Lâm National centre for biotechnology information Nfb PCR RMR SEM Biological nitrogen fixation Polymerase chain reaction Phản ứng với chuỗi polyme Rennie medium supplemented with rice extract and malate Scanning electron microscope Kính hiển vi điện tử quét Tổ chức nông lương giới MỞ ĐẦU * Lí chọn đề tài Lúa gạo nguồn lương thực chủ yếu phần dinh dưỡng cho 40% dân số giới Trong năm 2012, sản lượng lúa giới đạt 729 triệu [4] Năng suất sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm nguồn dinh dưỡng Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu đạm, lân kali để tăng trưởng, phát triển tốt cho suất cao Theo ước tính để sản xuất sinh khối (bao gồm hạt rơm) cần 16 - 19 kg N, 2,5 - 3,5 kg P 19 - 25 kg K [28] Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho lúa người dân phải sử dụng lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu phân đạm, lân kali Ở Việt Nam theo báo cáo Cục Trồng Trọt, năm 2012 tổng diện tích đất trồng lúa nước khoảng 7,76 triệu ha, tỉnh Phú Yên 32.710 Trước sức ép vấn đề an ninh lương thực, người dân đặt mục đích phải thu nhiều sản phẩm Song ý thức trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học xảy phổ biến Điều tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến mơi trường dẫn đến kết sản xuất không mang lại hiệu kinh tế chưa có sản xuất lúa bền vững Để khắc phục tác động bất lợi việc sử dụng phân bón sinh học q trình sản xuất nói chung sản xuất lúa nói riêng thật có ý nghĩa Hiện nay, nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến loài vi khuẩn nội sinh ứng dụng vi khuẩn nội sinh sản xuất phân bón Vi khuẩn nội sinh có vai trị quan trọng trồng, chúng có đặc tính tốt có khả cố định đạm cho trồng, hịa tan lân khó tan giúp cho trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng, tổng hợp kích thích tố sinh trưởng IAA, tăng hàm lượng chất khoáng, tăng khả kháng bệnh giúp loại bỏ chất gây ô nhiễm môi trường [75] Các vi khuẩn nội sinh tiêu biểu Azosprillum, Herbaspirillum, Burkholderia, Pseudomonas, Gluconacetobacter, Nhiều thử nghiệm chứng minh việc gia tăng suất trồng sử dụng vi khuẩn nội sinh Okon và Labandera -Gonzalez thử nghiệm ngoài đồng ở các trồng được chủng vi kh̉n nợi sinh Azospirillum sản lượng trồng tăng lên 30%, cao nhiều so với việc sử dụng phân hóa học [66] Những thí nghiệm ở Mỹ ch o thấy Azospirillum thay 40 kg N/ha/năm [77], Thái Lan , những thử nghiệm bắp năm 1984-1985 cho thấy sản lượng bắp tăng 15-35% [86] Thử nghiệm lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chủng giúp tăng khả đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt tăng 30%, suất lúa tăng 13 - 22% [83] Việc phân lập, nhận diện khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa sở để tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cung cấp cho sản xuất nơng nghiệp Đặc biệt lúa, đối tượng cần nghiên cứu vi khuẩn nội sinh loại lương thực trồng phổ biến tỉnh Phú Yên Xuất phát từ vấn đề nêu trên, thực đề tài: “Phân lập, nhận diện khảo sát số đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên” * Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, nhận diện khảo sát đặc tính dòng vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên cở sở để tuyển chọn dịng vi khuẩn có đặc tính tốt cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA để ứng dụng sản xuất phân sinh học bón cho lúa trồng đất tỉnh Phú Yên tương lai Mặt khác, việc nghiên cứu nguồn tài liệu hỗ trợ cho sinh viên tiếp cận với phương pháp nghiên cứu khoa học, nghiên cứu vi khuẩn nội sinh, giúp cho sinh viên hiểu biết nhiều đặc tính vi khuẩn nội sinh Đồng thời sản phẩm nghiên cứu chuyển giao khoa Nông Nghiệp trường Đại học Phú Yên để ứng dụng * Nội dung nghiên cứu + Phân lập dòng vi khuẩn từ rễ, thân lúa môi trường LGI, NFb RMR + Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc + Quan sát hình dạng khả chuyển động vi khuẩn + Nhận diện dòng vi khuẩn nội sinh kỹ thuật PCR + Khảo sát đặc tính vi khuẩn nội sinh: cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA + Giải trình tự số dịng vi khuẩn phân lập có đặc tính sinh học cao CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật 1.1.1 Giới thiệu về vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trồng [69] Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật Sau xâm nhập vào chủ, vi khuẩn nội sinh tập trung vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi đến tế bào bên trong, vào khoảng trống gian bào hay vào hệ mạch [89] Mật số quần thể vi khuẩn nội sinh biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn kiểu di truyền chủ, phụ thuộc vào giai đoạn phát triển chủ điều kiện mơi trường [68] Rễ thứ cấp Rễ Biểu bì Nội bì Lơng hút Vùng vỏ Mơ gỗ Mơ libe Nội bì Vùng kéo dài rễ Trung tâm Nội bì Lơng hút Chu ln Chóp rễ Hình 1: Cơ chế xâm nhiễm vi khuẩn nội sinh thực vật (http://www.sciencedirect.com/science) Một số nhóm vi khuẩn nội sinh khơng gây hại hay gây bệnh cho chủ, mà trái lại chúng thúc đẩy phát triển trồng cách sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật cố định đạm từ khơng khí Hơn nữa, số dịng vi khuẩn nội sinh giúp kháng lại mầm bệnh [22] kích thích trồng chống chịu với nhân tớ vô sinh hữu sinh [39] 1.1.2 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thƣ̣c vật 1.1.2.1 Vi khuẩn Azospirillum Trong năm 1984 - 1985, người ta phát nhiều loài giống Azospirillum vùng rễ cỏ Kallar (Leptochloa fusca) [71]; vi khuẩn xâm nhập vào bên nhu mơ rễ có khả cố định đạm, hịa tan lân dạng khống khó tan chất dinh dưỡng khác [74], sản xuất kích thích tố thực vật [85], hay kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh cho trồng [70] 1.1.2.2 Vi khuẩn Azotobacter Năm 1966, Döbereiner phân lập lồi Azotobacter paspali từ cỏ, chúng có khả cố định đạm cộng sinh tổng hợp IAA 1.1.2.3 Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có nhiều loại hòa khác bắp, lúa hoang, cỏ voi, khóm, cà rốt, củ cải đường, cải bắp cà phê với đặc tính ưu việc có khả cố định đạm, tổng hợp IAA gibberellin, hòa tan kẽm lân khó tan [61] 1.1.2.4 Vi khuẩn Herbaspirillum Vi khuẩn Herbaspirillum vi khuẩn vi hiếu khí, vi khuẩn cố định đạm sống rễ nhiều họ đậu, bao gồm loại họ lúa có giá trị kinh tế Hai loài Herbaspirillum seropedicae Herbaspirillum rubrisubalbicans tìm thấy bắp, mía đường, lúa hoang lúa trồng Phần lớn loài Herbaspirillum thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt buộc mơ thực vật Trong vùng rễ chúng có khả cố định đạm mạnh mẽ [19], chúng phát tán đến vùng thân [20] 1.1.2.5 Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella có loài quan trọng Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Có khoảng 30% dịng lồi cố định đạm điều kiện kỵ khí [43] Vi khuẩn Klebsiella oxytoca dịng SG-11 có khả cố định đạm từ nitơ khơng khí khả tổng hợp IAA Ở Ấn Độ, Kumar nghiên cứu vi khuẩn K oxytoca dịng GR-3 nhận thấy chúng có mật số rễ 6x106 CFUxg-1, khả tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan 30 μg/mg trọng lượng khơ, khả hịa tan lân khó tan 31,5 μg/mg trọng lượng khô mức độ biểu hoạt tính phức hệ nitrogenase qua phản ứng khử acetylene cao [47] 1.1.2.6 Vi khuẩn Enterobacter Một số loài vi khuẩn sống vùng rễ hay nội sinh bên mô thực vật có khả cố định đạm, vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật [42] phân lập loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ số cỏ Triều Tiên, chúng có khả hịa tan phosphate khó tan để cung cấp cho theo chế acid hóa cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid 1.1.2.7 Vi khuẩn Azoarcus Vi khuẩn Azoarcus vi khuẩn cố định đạm, gram âm phân lập từ cỏ Kallar Vi khuẩn có rễ, bề mặt rễ thân cỏ Năm 1987, Bilal Malik phân lập số loại vi khuẩn Azoarcus sống cỏ Kallar Người ta phát lúa mì sống vùng trước có cỏ có suất cao mà khơng cần bón nhiều phân hóa học Vi khuẩn cịn phân lập từ rễ lúa, kích thích sinh trưởng lúa Ở nơi vùng rễ có hàm lượng oxy thấp vi khuẩn có khả cố định đạm tốt [55] 1.1.2.8 Vi khuẩn Pseudomonas Giống Pseudomonas spp có nhiều lồi có khả cố định đạm Pseudomonas diminuta, P fluorescens, P paucimobilis, P pseudoflava, P putida, P stutzeri P vesicularis [26] Một số dòng vi khuẩn Pseudomonas có khả hịa tan lân Pseudomonas fluorescens, P putida, P Chlororaphis [24] Một số chủng Pseudomonas như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae có khả tổng hợp chất kích thích tố tăng trưởng thực vật như: IAA, cytokinin kích thích phát triển rễ làm tăng khả hấp thụ chất dinh dưỡng đất [35], số có khả kháng lại số vi sinh vật gây hại trồng như: Pseudomonas jluorescens HP72 chống nấm Rhizoctionia solani, Pseudomona putida chống lại vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh đậu phộng [79] 1.1.2.9 Vi khuẩn Burkholderia Trong số 40 lồi Burkholderia, có nhiều lồi có khả cố định đạm như: Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia brasilensis, Burkholderia kururiensis, Burkholderia tuberum, Burkholderia phymatum, Burkholderia unamae, Burkholderia tropicalis Burkholderia terrae [38] Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với trồng có khả cố định đạm, kích thích sinh trưởng trồng, diện vùng rễ rễ nhiều lồi như: bắp, mía, cà phê [73] Burkholderia tropicalis tìm thấy khóm [13] Lồi Burkholderia vietnamiensis tìm thấy rễ lúa trồng miền Nam Việt Nam Thí nghiệm lúa cho thấy loài Burkholderia vietnamiensis sau 14 ngày chủng giúp tăng khả đâm chồi 33%, số lượng rễ tăng 57%, bề mặt tăng 30%, suất lúa tăng 13 - 22% [83] 1.1.2.10 Các nhóm vi khuẩn nội sinh lúa Bảng 1: Vi khuẩn nội sinh phân lập từ lúa Vị trí phân lập Nhóm vi khuẩn Lồi vi khuẩn Alphaproteobacteria Thân Methylobacterium sp Thân Thân Thân Rễ Rễ Azospirillum amazonense Azospirillum lipoferum Azospirillum brasilense Azospirillum irakense Rhizobium leguminosarum Betaproteobacteria Thân Thân Herbaspirillum seropedicae Herbaspirillum rubrisubalbicans Rễ Rễ Azoarcus sp Azoarcus indigens Rễ Rễ Burkholderia sp Burkholderia kururiensis Gamaproteobacteria Rễ Hạt Acinetobacter baumannii Pantoea Hạt Hạt Thân Pantoea agglomerans Pseudomonas boreopolis Pseudomonas cepacia Thân Hạt Rễ Pseudomonas stutzeri Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Thân Enterobacter cancerogenus Rễ Enterobacter cloacae Rễ Enterobacter ludwigii Firmicutes Hạt Hạt Bacillus subtilis Bacillus cereus Lá Thân Bacillus pumilus Bacillus megaterium Rễ Staphylococcus sp Rễ Clostridium sp Actinobacteria Lá Streptomyces Bacteroidetes Hạt Hạt Hạt Lá Rễ Sphingomonas melonis Sphingomonas yabuuchiae Sphingomonas echinoides Sphingomonas adheasiva Sphingomonas paucimobilis Hạt Sphingomonas echinoides (Nguồn: Mano [57]) 1.2 Đặc điểm vi khuẩn nội sinh thực vật 1.2.1 Qúa trì nh xâm nhập và nội sinh mô thƣ̣c vật của vi khuẩn nội sinh * Nguồn gốc vi khuẩn nội sinh 10 Error 70 0.05047 0.00072 Total 104 57.90100 S = 0.02685 R-Sq = 99.91% R-Sq(adj) = 99.87% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping M 139 5.0683 A M4 5.0266 A M10 4.9014 B M 134 3.6495 C M1 3.4877 D M 59 3.4018 E M3 3.3938 EF M7 3.3850 EF M 60 3.3365 FG M6 3.3052 GH M2 3.2686 H M 150 3.1969 I M 149 3.1925 I M 62 3.0365 J M 63 3.0113 JK M 58 2.9861 JK M 144 2.9820 JKL M 61 2.9652 KL M 152 2.9250 LM M 151 2.8987 MN M 148 2.8899 MNO M 142 2.8680 MNO M 136 2.8636 NOP M 140 2.8461 NOP M 137 2.8373 OP M5 2.8056 P M 147 2.7276 Q M 141 2.7145 Q M 135 2.7013 Q M9 2.4320 R M8 2.3438 S M 145 2.2671 T M 146 1.9996 U M 138 1.9864 U M 143 1.5083 V PHỤ LỤC 5: Khả hòa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập từ môi trƣờng LGI One-way ANOVA: P2O5 (mg/l) versus Dòng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 41 199805.6 4873.3 9776.43 0.000 Error 84 41.9 0.5 Total 125 199847.4 61 S = 0.7060 R-Sq = 99.98% R-Sq(adj) = 99.97% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping L 136 319.514 A L 150 189.338 B L 131 136.090 C L 127 130.084 D L 129 126.841 E L 22 126.000 EF L 171 124.534 FG L 169 124.191 G L 130 124.138 G L 132 118.492 H L 20 117.187 HI L 128 116.270 I L 17 111.479 J L 172 109.877 K L 19 108.968 KL L 23 108.466 KL L 21 108.009 L L 170 103.799 M L 147 102.917 M L 164 100.074 N L 16 98.877 NO L 149 98.358 O L 14 93.626 P L 166 93.260 P L 15 92.530 P L 165 92.132 P L 146 89.093 Q L 142 87.802 QR L 13 87.005 RS L 151 86.691 RS L 145 85.613 S L 134 83.778 T L 167 83.162 TU L 144 82.672 TU L 163 82.181 U L 168 81.691 UV L 12 80.521 V L 148 80.515 V L 143 77.770 W L 133 76.751 WX L 18 75.406 X L 135 72.727 Y 62 PHỤ LỤC 6: Khả hòa tan lân khó tan dòng vi khuẩn phân lập từ mơi trƣờng Nfb One-way ANOVA: P2O5 (mg/l) versus Dịng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 37 36199.29 978.36 19134.66 0.000 Error 76 3.89 0.05 Total 113 36203.18 S = 0.2261 R-Sq = 99.99% R-Sq(adj) = 99.98% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping N3 84.349 A N6 82.807 B N 164 78.590 C N 171 52.822 D N 176 51.522 E N 83 48.703 F N 158 43.052 G N 165 42.423 H N 163 34.792 I N 159 33.996 J N 79 32.331 K N 175 32.193 K N2 30.365 L N 172 29.300 M N8 27.306 N N 174 26.742 O N 82 25.936 P N9 25.845 P N 78 25.251 Q N 161 24.352 R N 12 23.196 S N 177 23.094 S N 80 22.329 T N 173 21.459 U N 162 21.417 U N7 21.370 U N 10 21.324 U N 77 21.233 U N 170 21.166 U N 168 20.285 V N 81 20.183 V N5 19.315 W N 160 19.111 W N 157 18.608 X N 11 16.804 Y N 169 14.289 Z N1 14.110 Z 63 N4 10.868 AA PHỤ LỤC 7: Khả hòa tan lân khó tan dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trƣờng RMR One-way ANOVA: P2O5 (mg/l) versus Dòng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 34 334446.0 9836.6 183438.30 0.000 Error 70 3.8 0.1 Total 104 334449.8 S = 0.2316 R-Sq = 100.00% R-Sq(adj) = 100.00% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping M 60 317.840 A M4 164.707 B M 134 164.657 B M 139 141.048 C M10 99.694 D M3 89.469 E M7 79.788 F M1 79.043 G M2 72.326 H M 151 71.383 I M 148 70.476 J M 59 63.617 K M 136 49.615 L M 58 47.311 M M 144 44.943 N M6 44.807 N M 62 43.977 O M 142 41.633 P M 141 41.451 P M9 41.365 P M 149 40.590 Q M 146 40.181 Q M 63 38.572 R M 152 38.186 R M5 36.725 S M 150 36.100 T M 135 32.698 U M 138 32.562 U M 143 31.610 V M 145 28.526 W M 61 28.302 WX M 140 27.937 XY M 147 27.755 Y M 137 26.939 Z M8 23.302 AA 64 PHỤ LỤC 8: Khả tổng hợp IAA (µg/ml) dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trƣờng LGI One-way ANOVA: IAA (µg/ml) versus Dịng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 41 1763.894 43.022 3260.25 0.000 Error 84 1.108 0.013 Total 125 1765.003 S = 0.1149 R-Sq = 99.94% R-Sq(adj) = 99.91% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping L 23 22.818 A L 22 22.146 B L 19 13.681 C L 17 13.540 C L 150 12.577 D L 136 12.554 DE L 171 12.433 DEF L 165 12.317 EF L 145 12.272 FG L 127 12.223 FG L 170 12.039 G L 142 12.039 G L 13 11.203 H L 163 11.020 HI L 130 10.911 IJ L 172 10.678 J L 128 10.370 K L 18 10.206 K L 164 9.955 L L 148 9.765 L L 20 9.435 M L 16 9.003 N L 166 8.724 O L 151 8.630 O L 14 8.324 P L 144 8.288 P L 169 8.006 Q L 131 7.958 Q L 167 7.916 QR L 129 7.890 QR L 149 7.690 RS L 133 7.525 S L 132 7.465 S L 135 7.217 T L 134 6.778 U L 146 6.725 U 65 L 143 L 15 L 168 L 21 L 12 L 147 3 3 3 5.859 5.702 5.701 5.477 5.223 4.320 V VW VW W X Y PHỤ LỤC 9: Khả tổng hợp IAA (µg/ml) dịng vi khuẩn phân lập từ môi trƣờng Nfb One-way ANOVA: IAA (µg/ml) versus Dịng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 37 1741.431 47.066 544.64 0.000 Error 76 6.568 0.086 Total 113 1747.998 S = 0.2940 R-Sq = 99.62% R-Sq(adj) = 99.44% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping N 11 25.629 A N7 21.745 B N6 21.611 B N1 20.296 C N8 19.890 CD N 12 19.542 DE N 161 19.297 DEF N 158 19.297 DEF N3 19.250 EF N 160 19.080 EF N2 18.788 FG N 169 18.717 FGH N 163 18.283 GHI N9 18.267 GHI N 10 18.267 GHI N 168 18.138 HIJ N 176 18.065 IJ N 77 17.630 JK N5 17.107 KL N 81 16.906 LM N 157 16.833 LM N 165 16.616 LM N 79 16.403 MN N 172 16.326 MN N 174 15.891 NO N4 15.368 OP N 82 15.094 P N 177 15.022 P N 162 15.022 P N 173 13.862 Q 66 N 170 N 159 N 80 N 171 N 78 N 175 N 83 N 164 3 3 3 3 13.717 13.717 13.500 10.819 10.674 9.877 9.042 4.389 Q Q Q R R S T U PHỤ LỤC 10: Khả tổng hợp IAA (µg/ml) dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trƣờng RMR One-way ANOVA: IAA (µg/ml) versus Dòng Vi khuẩn Source DF SS MS F P C1 34 3396.980 99.911 792.88 0.000 Error 70 8.821 0.126 Total 104 3405.801 S = 0.3550 R-Sq = 99.74% R-Sq(adj) = 99.62% Grouping Information Using Fisher Method C1 N Mean Grouping M 61 24.432 A M 59 24.280 A M6 23.858 A B M4 23.362 BC M2 23.184 BC M1 23.078 C M3 21.624 D M 62 19.583 E M 138 19.294 E M5 19.280 E M 60 19.248 E M 139 16.730 F M 151 15.961 G M 137 15.961 G M 141 15.569 GH M 146 14.980 HI M10 14.887 HI M 140 14.588 I M 136 13.804 J M 134 12.936 K M 149 11.843 L M 145 11.647 L M 152 11.255 LM M 147 11.255 LM M 143 11.255 LM M 58 11.174 LM M 63 11.098 LM M8 10.644 MN 67 M 142 M9 M7 M135 M 144 M 148 M 150 3 3 3 9.882 8.674 8.523 7.255 5.961 5.373 5.373 N O O P Q Q Q PHỤ LỤC 11: Kết giải trình tự DNA so sánh với ngân hàng liệu NCBI * Trình tự đoạn DNA dòng L22 CGGCATGTCACGTTACAGGACAATGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTGCTGTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGC TTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGCAGCGCTGGAGTATGGCAGAGGGGGGTGGAATTCCACGTGTAGCAGTGAA ATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGT GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGGATTCATTTCCT TAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGG GACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTACGGA ACCCTGGTGAGAGCCGGGGGTGCCCGAAAGGGAGCCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCCAGTTGCTACGCAAGAGCACTCCGGGGAGACTGCC GGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAA TGGTCGGAACAGAGGGTTGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCAGTCTG CAACTCGACTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACTCTCCGGGGGGCCAT AAAAAAAAAAAGCCCCCTCGCAAGA * Trình tự đoạn DNA dòng L136 CCGAGTGTAGCCGTTTCCGGAATTATTGGGCGTAAGGGCTTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCC CGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGG TGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAA GCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCC GCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATC CTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAG GTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACAC GTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGAT CGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGATCGTTCCCGG GGGGGATATAAAA 68 * Trình tự đoạn DNA dòng L168 GGGCCTGGCGGCAGGCTACACATGCAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGG TGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAA GACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGC TCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTT CGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGAGGTTAATAACCTCGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGA AGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAG CGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCT AGAGTCTTGTAGAGGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGA AGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACGGATTAACCCCGGGGGGGGACC AAAAAAAAAA * Trình tự đoạn DNA dòng N6 GGGGCAGCGTTACTCGAGATTACTGGGCGTAAGCGTGCGTAGGTGGTCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAGCCCTGGGCT CAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAATGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTAGCAGTGAAA TGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACATTGACACTGAGGCACGAAAGCGTG GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCAATTTGGCAC GCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAG AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAG ACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGT 69 ACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCAGTCCGGATTG GAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGATCGTCCCCGGC GGAAAAAATAAAAAAAAAGGAGGCGCAGGGGGGGAAGGAGGG * Trình tự đoạn DNA dòng N83 CGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGAATGTGAAATCCCCGGGCTTAACC TGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAG CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTT CCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCACAGAATTCG GCAGAGATGCCTTAGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCG GTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAGTCTTCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAA TGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCTCGAGAGCAAGCGGACCTCTAAAAGTGGGGGTTTATTCCCTGATCGATAGT CTGCCGCCTCGCACTCCGGTGTTATTCGCGAA 70 * Trình tự đoạn DNA dòng N164 GATCGTCACTCGGGAACAAGGGGGTTCAAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTTAGTGGTGAAATCTCACAGCTTA ACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTGTTATTGAAGTAGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAATG CATAGATATTACTTAGAACACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTAAGCAACAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTGGG GAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTTGGGACGTAAGTTTCAGAG ACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGGGAAATGACAGG TTTAGAAATAGACTTTTCTTCGGACATTTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTAGG TTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTACGC AAGTAGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCCACACACGTAATACAATGGCC GGTACAGAGGGCAGCTACACTGCGAAGTGATGCAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCACTCGA CTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGTGATCTCCCCCGCGCACACACAAATATAAA AAAATTGGG 71 * Trình tự đoạn DNA dòng M4 AGCGTTACCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAAC CGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCG TAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAG TGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAA CCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGGTGTCATCAGCTCGTGTCGTGAGATG TTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCGGCCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCC GGTGACAAACCGGATGAAGGTGGGGGATGACCTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCCTAGAGAATATTGCA TTTATGCGTCTGGTGC * Trình tự đoạn DNA dòng M10 GGGCCCGGGCGGCAGCATACACATGNCAGTCGAGCGGAGAGAGGTAGCTTGCTACTGATCTTAGCGGCGGACGGGTG AGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGG AGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCT ACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTAT GGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTTTAGATAATACCTAGAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAA GCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGC GCGCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTA GAGTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAG GCAGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGGTAAGCATGGGGAGCAACAGGATTAGATACCTGGTACTCCATCT A 72 * Trình tự đoạn DNA dòng M60 AGTGACGTTTGTCGGATTATTGGGCGTAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAA CCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGC GTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGG AGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTA GTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACA ATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT GTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACA ATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCT GCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACTTCCCCCGGGGCCT 73 * Trình tự đoạn DNA dòng M134 CGGGAGTAGCGTTTCCGGATTATTGGGTTTAAGGGTCCGTAGGCGGATCTGTAAGTCAGTGGTGAAATCTCACAGCT TAACTGTGAAACTGCCATTGATACTGCAGGTCTTGAGTGTTATTGAAGTAGCTGGAATAAGTAGTGTAGCGGTGAAA TGCATAGATATTACTTAAAACACCAATTGCGAAGGCAGGTTACTAAGCAACAACTGACGCTGATGGACGAAAGCGTG GGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGCTAACTCGTTTTTGGGACGTAAGTTTCAG AGACTAAGCGAAAGTGATAAGTTAGCCACCTGGGGAGTACGAACGCAAGTTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGATTATGTGGTTTAATTCGATGATACGCGAGGAACCTTACCAAGGCTTAAATGGGAAATGACA GGTTTAGAAATAGACTTTTCTTCGGACATTTTTCAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGCCGTGAGGTGTTA GGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCACTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGGACTCTAGTGAGACTGCCTAC GCAAGTAGAGAGGAAGGTGGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGCCTTGGGCCACACACGTAATACAATG GCCGGTACAGAGGGCAGCTACACTGCGAAGTGATGCAAATCTCGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGAGTCTGCAA CTCGACTCTATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGCATCAGCCATGGCGCGGTGATCTCCCCCCGGCACACAAAAA AAA 74 * Trình tự đoạn DNA dòng M139 AGAGGTCATCGTCCTTCAGAAGACTTGGGCGTAAAGCCGTTGCCGTTAGGTTGGTCCGTTTAAGTCCGTTGTGAAAG CTCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCAGTGGATACTGGGCGACTAGAATGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCTGGTGTA GCAGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAGGAACATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACATTGACACTGAGGCAC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGTGCA ATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGG AATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGA CATGTCGAGAACTTTCCAGAGATGGATCGGTGCCTTCGGGAACTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTC GTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAAC TCTAAGGAGACCGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGGTGGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGG CTACACACGTACTACAATGGTAGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGCGACGGTAAGCCAATCCCAGAAACCCTATCTCA GTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGTG TCCCCCCGGCGCACGATCATATATTAAAA 75 ... vi khuẩn nội sinh loại lương thực trồng phổ biến tỉnh Phú Yên Xuất phát từ vấn đề nêu trên, thực đề tài: ? ?Phân lập, nhận diện khảo sát số đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên? ??... tiêu nghiên cứu Phân lập, nhận diện khảo sát đặc tính dịng vi khuẩn nội sinh lúa trồng đất tỉnh Phú Yên cở sở để tuyển chọn dịng vi khuẩn có đặc tính tốt cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp... đặc tính vi khuẩn nội sinh lúa sở để tuyển chọn vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt ứng dụng sản xuất phân bón vi sinh cung cấp cho sản xuất nông nghiệp Đặc biệt lúa, đối tượng cần nghiên cứu vi