BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH.ThS NGUYỄN THỊ ĐẤU

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH Chủ nhiệm đề tài : ThS NGUYỄN THỊ ĐẤU Chức vụ : Trưởng Bộ môn Đơn vị : Bộ môn Chăn nuôi Thú y Khoa Nông nghiệp – Thuỷ sản Trà Vinh, ngày tháng năm 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA GENE KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN VIBRIO CHOLERAE PHÂN LẬP TẠI TỈNH TRÀ VINH Xác nhận quan chủ quản Chủ nhiệm đề tài (Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Đấu Trà Vinh, ngày tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Cơng nghệ Sinh học, Phịng Đào tạo, Phòng Quản lý Khoa học, Phòng Quản lý Sau Đại học thuộc Trường Viện tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu khoa học học phần nghiên cứu sinh; Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hồ Thị Việt Thu, PGS.TS Trần Nhân Dũng tạo điều kiện, tận tình giúp đỡ, tìm hướng phù hợp với nghiên cứu thực tế để tơi hồn thành luận án này; Chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Trà Vinh, Phịng Khoa học Cơng nghệ Đào tạo Sau đại học, Khoa Nông nghiệp Thuỷ sản Trường Đại học Trà Vinh em sinh viên lớp DA09BTY hỗ trợ tạo điều kiện cho tơi hồn thành nghiên cứu đề tài này; Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Chi cục Thú y tỉnh Trà Vinh tạo điều kiện cho tham gia lấy mẫu sở giết mổ địa bàn Tỉnh; Chân thành cảm ơn anh chị em Bộ môn Vi sinh Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ; Trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Khoa xét nghiệm bệnh viện Đa khoa Trung ương Cần Thơ; Chân thành cảm ơn gia đình đồng nghiệp tạo điều kiện động viên tơi hồn thành nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! NGUYỄN THỊ ĐẤU i TÓM TẮT Nghiên cứu từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2014, có 25 chủng vi khuẩn thuộc Vibrio spp phân lập từ 500 mẫu gồm nghêu, tôm, nước sông, nước biển, nước ao nuôi tôm, huyết heo huyện tỉnh phân bệnh nhân mắc bệnh tiêu chảy bệnh viện đa khoa tỉnh Trà Vinh Kết cho thấy có chủng thuộc lồi Vibrio cholerae (24%), chủng thuộc loài Vibrio paraheamolyticus (32%), chủng thuộc loài Vibrio vulnificus (16%), chủng thuộc loài Vibrio fluvialis (20%) chủng thuộc loài Vibrio alginolyticus (8%) Sáu chủng Vibrio cholerae xác định tính nhạy cảm kháng kháng sinh loại kháng sinh, phương pháp Kirby-Bauer (CLSI, 2010), kết chủng kháng kháng sinh bao gồm: streptomycin 50%, tetracycline 33%, trimethoprim-sulfamethoxazole 33% vancomycin 67% Kết PCR cho thấy có chủng Vibrio cholerae tổng số chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA, gen mã hóa cho tetracycline, riêng nhóm gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV dhfrI mã hố cho nhóm kháng sinh β-Lactam, Aminoglycosid, Trimethoprim chưa phát nghiên cứu So sánh tỉ lệ tương đồng trình tự nucleotide chủng Vibrio cholerae (T1, T3) mang gene kháng kháng sinh nghiên cứu với chủng Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Indonesia, Brazil, Ấn Độ Haiti, tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng 94% với 02 chủng Trình tự thuộc chủng V cholerae T1 T3 có tượng thêm từ 1- nucleotide nhiều vị trí codon, dẫn đến thay đổi vị trí acid amin thay đổi cấu trúc protein Chủng V cholerae T1 T3 có codon kết thúc 10 vị trí, loại đột biến vô nghĩa, làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid vi khuẩn Kết thử nghiệm thỏ chứng minh số bám dính V cholerae T1 T3 vào niêm mạc ruột thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả thời điểm 55,7±13,9 59,3±4,2 thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả 12,4±0,6 7,41±1,9 Tại thời điểm 16 khơng có tượng bám dính vi khuẩn vào niêm mạc ruột tất thỏ thí nghiệm Từ khoá: Vibrio choleae; gene kháng kháng sinh; vaccine ii MỤC LỤC TT 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.4 1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4 1.5.5 1.5.6 TÓM TẮT ……………………………………………………… ABSTRACT …………………………………………………… MỞ ĐẦU ………………………………… Tính cấp thiết đề tài ……………………………………… Giới hạn đề tài nghiên cứu ………………………………… Mục tiêu đề tài …………………………………………… Nội dung thực ………………………………………… Phương pháp nghiên cứu …………………………………… NỘI DUNG Chương 1: Tổng quan tài liệu …………………… Lịch sử bệnh vi khuẩn tả …………………………………… Phân loại - Đặc điểm vi khuẩn Vibrio cholerae ……………… Phân loại vi khuẩn Vibrio cholerae …………………………… Đặc điểm hình dạng Vibrio cholerae ……………………… Độc tố………………………………………………………… Cơ chế kháng kháng sinh Vibrio cholerae …………… Cơ chế bơm kháng sinh ………………………………………… Đột biến tự phát………………………………………………… Yếu tố SXT integrons ……………………………………… Đề kháng kháng sinh Plasmid……………………………… Đặc điểm di truyền kháng kháng sinh Vibrio cholerae số nước…………………………………………………… Tình hình dịch tễ kháng kháng sinh Vibrio cholerae Việt Nam ……………………………………………………… Tình hình dịch tễ bệnh Vibrio cholerae Việt Nam ……… Sự kháng kháng sinh V cholerae …………………… Nguyên nhân kháng kháng sinh Vibrio cholerae ……… Các yếu tố độc lực đa dạng di truyền …………………… Triệu chứng bệnh vi khuẩn Vibrio cholerae ……………… Phòng điều trị bệnh ………………………………………… iii Trang ii v 1 2 3 4 5 6 7 9 10 12 12 14 15 16 18 18 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 4.1 4.2 4.3 4.3.1 4.3.2 Chương 2: Phân lập vi khuẩn V cholerae kháng kháng sinh tỉnh Trà Vinh……………………………………………… Mục đích nghiên cứu ………………………………………… Đối tượng phương pháp nghiên cứu …………………… Xác định V cholerae phản ứng sinh hóa………………… Xác định V cholerae máy định danh tự động…………… Xác định vi khuẩn Vibrio spp kỹ thuật PCR …………… Kết nghiên cứu ……………………………………… Kết định danh Vibrio spp phản ứng sinh hóa ……… Kết định danh Vibrio spp máy định danh tự động … Kết định danh Vibrio spp kỹ thuật PCR …………… Tỉ lệ phát Vibrio spp loại mẫu phân lập ………… Chương 3: Xác định đặc tính di truyền gene kháng kháng sinh vi khuẩn V cholerae tuyển chọn……… Mục đích nghiên cứu ………………………………………… Đối tượng phương pháp nghiên cứu ……………………… Kết nghiên cứu ……………………………………… Kết kháng kháng sinh V cholerae phương pháp Kirby Bauer ……………………………………………… Kết kháng kháng sinh V cholerae PCR……… Kết giải trình tự đoạn gen kháng kháng sinh……… So sánh trình tự nucleotide chủng V cholerae T1, T3 với chủng V cholerae hoang dại N16961 tìm dạng đột biến … Mối liên hệ qua phát sinh loài …………………………… Chương 4: Thử nghiệm chủng V cholerae tuyển chọn thỏ nhằm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch vaccine hành …………………………………………… Mục đích nghiên cứu ………………………………………… Đối tượng phương pháp nghiên cứu……………………… Kết nghiên cứu ……………………………………… Kết đánh giá chủng đột biến V cholerae thỏ khơng uống vaccine phịng bệnh tả …………………………… Kết đánh giá tính đáp ứng miễn dịch thỏ uống vaccine phòng bệnh tả ………………………………………… iv 20 20 20 21 22 23 25 25 27 28 29 33 33 33 36 36 39 40 42 45 50 50 50 52 52 55 10 11 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………… Kết luận ……………………………………………………… Đề nghị ………………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………… PHỤ LỤC……………………………………………………… Thành phần mơi trường, hóa chất dùng thí nghiệm ……… Bộ môi trường thuốc thử dùng định danh vi khuẩn Gram âm Vaccine tả dùng thí nghiệm ……………………………… Kết phản ứng sinh hoá …………………… Tổng hợp KQ thử kháng sinh đồ V cholerae………… Chủng V cholerae kháng thuốc chủ yếu từ năm 2003 – 2009 số nước giới ……………………………………… Sắc phổ chuỗi trình tự chủng T1 gen kháng KS TetA …… Các acid amin chủng T1 ……………………………………… Các acid amin chủng T3 ……………………………… Các acid amin chủng hoang dại……………………… Kết xử lý thống kê ………………………………………… v 50 59 59 60 68 72 72 73 78 79 82 83 84 85 86 Bảng Tên bảng Trang 1.1 2.1 Tình hình dịch tễ bệnh V cholerae Việt Nam …………… Trình tự nucleotide cặp mồi phản ứng PCR dựa gen 16S rDNA ………………………………………………… Kết thử sinh hố lồi thuộc Vibrio spp…………… 13 30 31 4.1 Tỉ lệ Vibrio spp loại mẫu ………………………… Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp theo lồi …………………… Trình tự nucleotide cặp mồi phản ứng PCR xác định gene đề kháng kháng sinh …………………………………… Các chủng vi khuẩn sử dụng so sánh phân tích với trình tự chủng Vibrio cholerae………………………………………… Sự nhạy cảm kháng kháng sinh V cholerae …… Sự đa kháng kháng sinh V cholerae ……………… So sánh vị trí acid amin chủng V cholerae hoang dại N16961 với chủng V cholerae T1 …………………………… So sánh vị trí acid amin chủng V cholerae hoang dại N16961 với chủng V cholerae T3 …………………………… Các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh sử dụng so sánh phân tích với trình tự chủng Vibrio cholerae……………… Mức độ tương đồng đoạn gen đề kháng kháng sinh V cholerae (T1 T3) ……………………………………… Lượng dịch lỏng (FA) thu hồi ruột non thỏ ……… 4.2 Hàm lượng V cholerae bám dính …………… 54 4.3 Lượng dịch lỏng (FA) thu hồi ruột non thỏ ……… 55 4.4 Hàm lượng V cholerae bám dính ruột non thỏ … 56 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 vi 23 25 34 35 36 38 43 44 46 47 52 DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 Phân loại type huyết V cholerae ………………………… Cấu tạo vi khuẩn V cholerae ……………………………… Sự hình thành chủng V cholerae có độc tố ………………… Cơ chế tác động kháng sinh ………………………………… Cơ chế ĐK kháng sinh VK ………………………………… Sự di truyền Plasmid từ vi khuẩn sang vi khuẩn ………………… Vi khuẩn đột biến roi …………………………………………… Quy trình phân lập định danh Vibrio spp ………………… Khuẩn lạc môi trường TCBS……………………………… Test sinh hoá…………………………………………………… Nồng độ muối từ 0% - 10% Chủng vi khuẩn O3.2 (T3) kính hiển vi điện tử ………… Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16S-27F 1492R …………… Kết thực kháng sinh đồ ……………………………… Tỷ lệ nhạy cảm đề kháng kháng sinh V cholerae…… Sản phẩm khuếch đại đoạn gen tetAF testAR ………………… So sánh vị trí nucleotide chèn vào ………… Cây phát sinh loài V cholerae kháng kháng sinh………… Thỏ thí nghiệm ………………………………………………… Thỏ gây mê ………………………………………………… Dịch thu từ niêm mạc ruột non thỏ……………………………… Pha loãng mẫu theo dãy thập phân ……………………………… Biểu đồ FA sau tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ …………… Biểu đồ CFU V cholerae bám dính niêm mạc ruột thỏ …… Biểu đồ FA sau tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ……………… Biểu đồ CFU sau tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ …………… 8 12 16 24 26 26 27 27 28 37 37 39 42 48 50 51 51 52 53 54 55 56 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ Chữ tắt Nghĩa tiếng Việt APW Alkaline peptone water Nước peptone kiềm ASPW Alkaline saline peptone water Nước peptone muối kiềm ADH Arginine Dihydrolase CFU Colony forming unit Đơn vị tính số lượng vi khuẩn/ml CTX Cholerae toxin Độc tố bệnh tả CTXΦ Cholerae toxin XΦ Thực khuẩn thể Vibrio cholerae mang gen có độc tố tả CTXP Cholerae toxin Độc tố bệnh tả (pili) CTXA Cholera toxin A Gen mã hoá độc tố tả tiểu đơn vị A CTXB Cholera toxin B Gen mã hoá độc tố tả tiểu đơn vị B CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute Viện tiêu chuẩn lâm sàng phịng thí nghiệm CDC Centers for Disease Control Trung tâm kiểm soát dịch bệnh cAMP Cycle Adenosin monophosphat DNA Deoxyribo nucleic acid Phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền MDR Multidrug resistance Đa đề kháng MHA Mueller Hinton NA Nutrient agar Thạch dinh dưỡng NIHE National Institute of Hygiene and Epidemiology Viện Vệ sinh Dịch tễ Quốc gia RND Resistance-nodulation-division ToxR ToxR Gen quy định mã hóa Protein màng viii ... tả tiểu đơn vị A CTXB Cholera toxin B Gen mã hoá độc tố tả tiểu đơn vị B CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute Viện tiêu chuẩn lâm sàng phịng thí nghiệm CDC Centers for Disease Control... Hinton NA Nutrient agar Thạch dinh dưỡng NIHE National Institute of Hygiene and Epidemiology Viện Vệ sinh Dịch tễ Quốc gia RND Resistance-nodulation-division ToxR ToxR Gen quy định mã hóa Protein... cholerae (T1, T3) mang gene kháng kháng sinh nghiên cứu với chủng Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Indonesia, Brazil, Ấn Độ Haiti, tương đồng 97% với 10 chủng; 96% với 01 chủng 94% với 02 chủng Trình