Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của các loài thuộc Vibrio spp. được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 2.2: Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp.
TT
Test SH
Vibrio spp.
V.cholerae V.paraheamolyticus V.vulnificus V.fluvialis V.alginolyticus
1 K. lạc Vàng Xanh Vàng Vàng Vàng 2 Oxidase (+) (+) (+) (+) (+) 3 TSI (+) Glucose (+) (+) (+) Lactose (-) (-) (+) (-) (-) Sucrose + (-) (-) (+) (+) 4 LDC (+) (+) (+) (-) (+) 5 Di động (+) (+) (+) (+) (+) 6 ONPG (+) (+) (+) (+) 7 Indole (+) (-) (-) (-) (+) 8 Urease (-) (+) (-) (-) (-) 9 PAD (-) (-) (-) (-) 10 Citrate (-) (-) (-) (-) (+) 11 VP (-) (-) (-) (-) (+) 12 NaCl 0% (+) 2% (+) (+) (+) (+) (+) 6% (+) (+) (+) (+) 8% (+) (+) 10% (+)/(-)
Quan sát đặc tính sinh hóa, nhận thấy một số vi khuẩn Vibrio spp. có thể phát triển trong môi trường thạch muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng/xanh, Vibrio spp. có thể phân biệt bởi một số phản ứng sinh hóa, hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men đường và không sinh hơi; V. cholerae, V. paraheamolyticus, V. fluvialis và V.
alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V. cholerae và V.
alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi khuẩn thành sản phẩm có gốc indole. Tất cả các loài đều âm tính với urease, riêng V. parahaemolyticus
- 26 -
có phản ứng dương tính với urê, đây là phản ứng có giá trị kiểm tra đối với các chủng có khả năng gây bệnh. Vibrio spp. phát triển ở nồng độ muối thích hợp: 0-2%, 2-6%, 2-8% và từ 2-10%, tỉ lệ dương tính phù hợp với các phản ứng sinh hoá của 5 loài từ 90 – 98%. Kết quả sinh hóa trên thực hiện theo tiêu chuẩn quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E).
(a) Khuẩn lạc có màu vàng (b) Khuẩn lạc có màu xanh
Hình 2.2: Khuẩn lạc trên môi trường TCBS
Hình 2.3: Test sinh hoá
(a) Oxidase (+); (b) Các dãy giếng dùng thử nghiệm Indole(+) và ONPG (+) (c) Lên men đường glucose; (d) LDC (+); (e) Di động (+)
- 27 -
a. Nồng độ muối (+) từ 0% - 2% b. Nồng độ muối (+) từ 2% - 8%
Hình 2.4: Nồng độ muối từ 0% - 10%
* Nhuộm Gram: Kết quả xác định hình dạng vi khuẩn V. cholerae dưới kính hiển điện tử với độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần, vi khuẩn có hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn.
Hình 2.5: Chủng vi khuẩn O3.2 (T3) dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần
2.3.2 Kết quả định danh Vibrios bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ).
Kết quả định danh hoàn tất từ 5 – 7 giờ, tỉ lệ dương tính và kết quả chi tiết về sinh hoá của từng loài Vibrios thể hiện qua phụ lục 4. Tỉ lệ dương tính của từng loài Vibrios được tổng hợp như sau:
Vibrio spp.
V.cholerae V.paraheamolyticus V.vulnificus V.fluvialis V.alginolyticus
TB 98% 99% 99% 98% 94%
- 28 -
2.3.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
Hình 2.6: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp tương đương với đoạn gene 16S-27F và 1492R ở tất cả các chủng Vibrio spp.
Trình tự gene 16S rRNA được nhiều tác giả sử dụng trong phương pháp phân tích PCR để xác định bất kỳ vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn thuộc nhóm
Vibrios (Gomez et al., 2004; Haldar et al., 2011b). Đoạn gene 16S rRNA dài 1.500 bp bao gồm các khu vực bảo tồn cao và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ gần, trong khi vùng biến đổi có thể phân biệt các loài trong cùng một giống. Đây là một công cụ để các nhà nghiên cứu sử dụng đoạn gene 16S rRNA xây dựng cây phát sinh loài trong ngành vi sinh vật (William et al., 1991).
Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ PCR, nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrios lần lượt: V. cholerae vạch từ 1-6; V. fluvialis từ 7-11; V. paraheamolyticus từ 12-19; V. vulnificus từ 20-23; V. alginolyticus từ 24-25.
Qua nghiên cứu chưa phát hiện chủng thuộc Vibrios mang gene O139rfb và chủng mang gene mã hoá độc tố CTXAtrên những mẫu từ môi trường nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản, chứng tỏ Vibrio O139 xuất hiện chưa phổ biến tại tỉnh Trà Vinh. Ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 – 2010 chỉ phân lập một chủng V. cholerae O139 từ môi trường nước (Dong Tu Nguyen, 2012). Nghiên cứu trên cũng cho thấy V. cholerae đại diện cho một số chủng thuộc Vibrios được phân lập ngoài môi trường nước, trong đó chỉ có một vài chủng có đặc tính gây bệnh và môi trường nước trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản luôn tồn tại cả hai chủng không gây bệnh và gây bệnh (O1/non – O1 và O139/non – O139) những chủng không gây bệnh dễ
- 29 -
dàng thu nhận gene độc lực từ những chủng gây bệnh ngoài môi trường nước và có thể phát sinh thành dịch bệnh (Shah, 2003).
Một nghiên cứu khác cũng cho rằng V. cholerae nằm trong nhóm các vi sinh vật thuộc hệ sinh thái là môi trường nước, các chủng O1 và O139 được phân lập ít so với các chủng non-O1 và non – O139. Hơn nữa, những nơi nằm ngoài vùng dịch và cách xa vùng có dịch bệnh, các chủng V. cholerae phân lập ngoài môi trường thường không mang độc tố tả (CTX) (Faruque et al., 1998)
Năm 2013, Nguyễn Hoàng Vũ và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu nhằm giám sát sự lưu hành của vi khuẩn V. cholerae O1, O139 trên các loại mẫu phân, mẫu nước sông, mẫu thực phẩm tươi sống thu thập từ tháng 9/2012 đến tháng 5/2013 trong cộng đồng và môi trường khu vực phía Nam Việt Nam như Thành phố Hồ Chí Minh, An Giang và Bến Tre, kết quả cũng không phát hiện gene độc tố tả CTXA. Như vậy, vi khuẩn V. cholerae O1, O139 có khả năng tồn tại trong thực phẩm tươi sống và nước sông nhưng không mang độc tố tả. Đây là nguy cơ tiềm ẩn của sự tái bùng phát dịch bệnh.
Nhiều nghiên cứu khác cũng đã chứng minh hầu hết những chủng phân lập từ môi trường không mang gene độc tố bệnh tả, một loại enterotoxin chịu nhiệt ổn định (Nair et al., 1994), hoặc độc tố tiêm mao (Waldor et al., 1994).
Meer et al., (2014) đã nghiên cứu cho thấy những chủng V. cholerae non - O1 phân bố rộng khắp môi trường, bao gồm các vùng sông núi. Mặc dù không thể chắc chắn rằng chủng O1 và non- O1 có liên quan trong cùng điều kiện phát triển, tuy nhiên việc hình thành chủng V. cholerae non-O1 trong môi trường cho thấy đó là điều kiện thích hợp cho sự phát triển của các chủng V. cholerae O1, qua các kết quả nghiên cứu chỉ có (47%) chủng V. cholerae O1 biotype El Tor có chứa gene CTX, những chủng không chứa gene CTX là những chủng V. cholerae non - O1.
2.3.4 Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập
Dựa trên kết quả nuôi cấy, đặc điểm sinh hoá, kết quả định danh bằng máy định danh tự động và qua phân tích PCR, nghiên cứu đã ghi nhận 5 loài thuộc Vibrio spp. và 25 chủng trên các mẫu thức ăn từ nghêu, tôm, nước biển, nước ao nuôi tôm, nước sông, huyết heo, gồm 6 chủng thuộc loài V. cholerae
(24%); 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%); 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%); 5 chủng thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%), trình bày qua Bảng 2.3 và Bảng 2.4
- 30 -
Bảng 2.3: Tỉ lệ Vibrio spp. trên các loại mẫu
Loại mẫu (n = 500)
Loài Vibrios Số mẫu kiểm tra Dương tính Số mẫu Tỉ lệ (%) Nghêu (n = 160) V. cholerae 160 03 1,9 V. paraheamolyticus 160 03 1,9 V. vulniticus 160 04 2,5 V. fluvialis 160 05 3,1 V. alginolyticus 160 01 0,63
Huyết heo (n = 100) V. cholerae 100 02 2,0
V. paraheamolyticus 100 02 2,0
Nước (n = 150)
+ Nước sông V. cholerae 50 01 2,0
+ Nước biển V. alginolyticus 50 01 2,0
+ Nước ao nuôi tôm V. paraheamolyticus 50 02 4,0
Tôm (n = 50) V. paraheamolyticus 50 01 2,0
Phân bệnh nhân (n = 40) 40 0 0,0
Tổng cộng 25
Trên mẫu nghêu, có sự hiện diện rất đa dạng các loài thuộc Vibrio spp., vì đây là loài sinh vật sống ở vùng nước mặn, rất phù hợp cho vi khuẩn Vibrio
spp. ký sinh, trong đó loài V. cholerae là 1,9 %. Trong huyết heo do có sử dụng nguồn nước từ sông để sử dụng trong quá trình giết mổ như rửa thịt, pha vào huyết (lúc chọc tiết), tỉ lệ dương tính với V. cholerae là 2% tương ứng với tỉ lệ phân lập V. cholerae lấy trực tiếp từ nguồn nước ở sông (Bảng 4.2). Kết quả này cũng tương đương với kết quả phân lập tại thành phố Hồ Chí Minh với tỉ lệ 1,1% trên mẫu nước và 2,2% trong mẫu thực phẩm; tại Bến Tre trong mẫu nước là 5,7% (Nguyễn Hoàng Vũ, 2013), do Bến Tre là tỉnh có bệnh dịch tả xãy ra vào năm 2010.
- 31 -
Bảng 2.4: Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. theo loài (n=25)
Tên loài vi khuẩn Số mẫu dương tính
Mẫu Tỉ lệ (%)
Vibrio cholerae 06 Nghêu: 03
24 Huyết heo: 02
Nước sông: 01
Vibrio paraheamolyticus 08 Nghêu: 03
32 Huyết heo: 02
Nước ao nuôi tôm: 02 Tôm: 01
Vibrio vulniticus 04 Nghêu: 04 16
Vibrio fluvialis 05 Nghêu: 05 20
Vibrio alginolyticus 02 Nghêu: 01
8 Nước biển: 01
Bảng 2.4 cho thấy tỉ lệ phân lập V. paraheamolyticus là cao nhất (32%), chúng xuất hiện trên nghêu, trong nước sông, đặc biệt ở nước ao nuôi tôm có độ mặn từ 6 - 8% và trên tôm, phù hợp với môi trường sống của chúng. Nghêu cũng là ký chủ thường xuyên của V. vulniticus; V. fluvialis và V. alginolyticus,
riêng đối với môi trường nước biển cũng rất thích hợp cho V. alginolyticus phát triển, và chúng cũng liên quan đến nhiễm trùng vết thương ở người, chiếm 71% các trường hợp nhiễm trùng (Hlady, 1996).
Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho thấy V. paraheamolyticus được phân lập 40% từ hải sản, 20,1% từ môi trường nước biển và cửa sông tại thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và các tỉnh Cà Mau, Bến Tre, An Giang, Bạc Liêu (Nguyễn Hoàng Vũ, 2011).
Ngoài những chủng gây bệnh qua đường tiêu hoá thuộc loài V. cholerae, các loài khác thuộc Vibrios thường gây nhiễm trùng vết thương cũng thường xuất hiện như V. paraheamolyticus; V. vulnificus; V. fluvialis, 28% trường hợp người bị nhiễm V. parahaemolyticus do tiếp xúc với nước biển hoặc nước lợ, V. vulnificus biểu hiện thường gặp nhất là nhiễm trùng vết thương là 64%, nhiễm trùng huyết là 30,1% và viêm dạ dày ruột là 5,9% (Desmarchelier, 1997).
Riêng đối với mẫu phân trên người, chưa phát hiện nhiễm Vibrios, có thể do bệnh nhân chưa có đầy đủ các triệu chứng của bệnh tả tại thời điểm khảo sát. Theo kết quả nghiên cứu ứng dụng một số kỹ thuật chẩn đoán nhanh V. cholerae gây tiêu chảy cấp tại tỉnh Thái Nguyên năm 2009, trên 270 mẫu bệnh nhân tiêu chảy cấp có
- 32 -
triệu chứng lâm sàng nghi mắc bệnh tả cũng chỉ phân lập được 5,93% bệnh nhân dương tính với bệnh tả (Phạm Thế Vũ, 2008). Tuy nhiên môi trường nước sông, nước biển, các loại thức ăn có nguồn gốc hải sản có sự hiện diện của các chủng thuộc Vibrio spp. cũng là nguy cơ lây truyền bệnh cho con người.
* Kết luận
Nghiên cứu đã phát hiện 6 chủng V.cholerae; 8 chủng V. paraheamolyticus; 4 chủng V. vulnificus; 5 chủng V. fluvialis và 2 chủng
- 33 -
CHƯƠNG 3: XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA GENE
KHÁNG KHÁNG SINH Ở VI KHUẨN V. CHOLERAE ĐƯỢC TUYỂN
CHỌN