phòng bệnh tả
4.3.2.1 Lượng dịch lỏng FA (Fluid accumulation): Sau khi đưa huyền dịch vi khuẩn vào ruột non thỏ với liều 105 – 107, lượng dịch lỏng tiết ra sẽ được thu hồi qua Bảng sau.
Bảng 4.3: Lượng dịch lỏng (ml/cm) thu hồi trong ruột non của thỏ qua các giai đoạn thời gian.
TT Chủng VK 3 giờ 6 giờ 9 giờ 16 giờ Số thỏ
1 T1 0,3 0,35 0,25 0 2 2 T3 0,4 0,25 0,2 0 2 3 O1.2 0,5 0,6 0,3 0,2 2 4 Ng3 0,5 0,6 0,4 0,25 2 5 85V1 0,4 0,5 0,3 0,15 2 6 81V1 0,4 0,4 0,3 0,2 2
Hình 4.7: Biểu đồ FA sau khi tiêm vi khuẩn vào ruột non thỏ
Thời gian (giờ) Dịch lỏng (ml/cm)
- 56 -
Qua kết quả trên, nhận thấy tất cả các chủng V.cholerae T1, T3, O1.2 Ng3, 85V1, và 81V1 khi tiêm vào ruột non đối với thỏ đã uống vaccine (mORCVAX) có tích luỹ dịch lỏng tại thời điểm 3 giờ nhưng sau đó giảm dần đến thời điểm 6 giờ, 9 giờ và đến 16 giờ số lượng dịch lỏng không đáng kể, do niêm mạc ruột có tiết kháng thể đã gắn với thụ thể trên bề mặt vi khuẩn, cản trở vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột của vật chủ, từ đó niêm mạc ruột không thể tiết ra độc tố và tế bào biểu mô ruột non không thể tiết ra chất lỏng (Taylor et al., 1987). Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
4.3.2.2 Hàm lượng V. cholerae bám dính niêm mạc ruột non đối với thỏ đã uống vaccine phòng bệnh tả
Số lượng khuẩn lạc thu được qua các giai đoạn thời gian: 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và 16 giờ được tổng hợp qua Bảng sau:
Bảng 4.4: Hàm lượng V. cholerae bám dính
TT Chủng VK
3 giờ
6 giờ 9 giờ 16 giờ % bám dính Số thỏ 9 giờ 16 giờ 1 T1 0 105 12*103 0 12,4±0,6 0 2 2 T3 0 8*104 20*103 0 7,41±1,9 0 2 3 O1.2 0 138*103 43*103 0 15,19±6,54 0 2 4 Ng3 0 141*103 82*103 0 14,77±3,12 0 2 5 85V1 0 156*103 65*103 0 14,64±4,18 0 2 6 81V1 0 14*104 46*103 0 19±2,9 0 2
Hình 4.8: Biểu đồ vi khuẩn bám dính trong niêm mạc ruột non đối với thỏ đã tiêm phòng
Thời gian (giờ)
- 57 -
Qua kết quả Bảng 4.4, nhận thấy số đơn vị vi khuẩn bám dính trong niêm mạc ruột non tại thời điểm 6 giờ và sau đó giảm dần tại các thời điểm 9 giờ và 16 giờ ở tất cả các chủng vi khuẩn, riêng 2 chủng T1, T3 số lượng vi khuẩn chỉ bám dính tạm thời ở thời điểm 6 giờ từ 8.104 đến 105, sau đó cũng giảm xuống đáng kể ở thời điểm 9 giờ chỉ còn 12.103 đến 20.103, đến thời điểm 16 giờ hầu như tất cả các chủng đều không còn bám dính vào niêm mạc ruột non, chứng tỏ V. cholerae bị ức chế bởi các kháng thể được tiết ra từ niêm mạc ruột non.
Việc hình thành đáp ứng miễn dịch trên thỏ có thể giải thích theo 2 cơ chế: Thứ nhất, khi kháng thể tiết ra sẽ ngăn chặn vi khuẩn bám vào niêm mạc bằng cách gắn vào bề mặt kháng nguyên (vi khuẩn) (Finkelstein et al., 1982); làm bất động vi khuẩn hoặc kết dính với vi khuẩn, làm chúng không thể di chuyển trên bề mặt biểu mô ruột (Schrank et al., 1976). Trong trường hợp này, tác nhân gây bệnh sẽ bám dính kém và dễ dàng bị cuốn trôi khi nhu động ruột trở lại bình; thứ hai, đáp ứng miễn dịch dịch thể trong bệnh tả làm xuất hiện IgG trong máu và IgA được tiết ra ở niêm mạc ruột, các kháng thể này tiết ra có tác dụng diệt khuẩn, ngăn cản vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột, hoặc vi khuẩn bị ức chế và không nhân lên để bám vào niêm mạc ruột (William et al., 1983), ngoài ra, một yếu tố liên quan cần thiết để gắn vào niêm mạc ruột là khả năng di động của vi khuẩn, nếu vi khuẩn di động ít, yếu ớt hoặc có đột biến gene ảnh hưởng đến sự tổng hợp protein của roi (Jones et al., 1976).
Sự bám dính của V. cholerae có thể không được gắn ngẫu nhiên vào ruột; chứng minh gần đây cho rằng những chất chiết xuất từ niêm mạc ruột có thể can thiệp vào sự bám dính của V. cholerae đến ruột và kháng độc tố đường ruột ngăn cản sự gắn kết của độc tố dịch tả vào thụ thể trên biểu mô ruột. Mặt khác, vi khuẩn này thường di động theo chiều ngang trong niêm mạc ruột nhằm tránh bị rửa trôi do nhu động của ruột gây ra, roi lại là kháng nguyên, và do đó dễ bị tấn công bởi các phân tử kháng thể từ niêm mạc ruột của vật chủ (Freter et al., 1976)
Chỉ số bám dính giảm do sự bảo hòa của các thụ thể, hoặc một lượng lớn của
V. cholerae bám dính không đặc hiệu, hoặc do sự rửa trôi vi khuẩn, tuy nhiên Jones
et al., (1976) đã quan sát thấy rằng vẫn còn 90% V. cholerae bám dính sau khi tách rửa ruột để thực hiện trong quá trình nghiên cứu. Sự bám dính hoặc không bám dính của vi khuẩn V. cholerae vào niêm mạc ruột là một trong những yếu tố thúc đẩy sự hình thành khuẩn lạc và phân tán các enterotoxin đến các vị trí khác, đó cũng là bước quan trọng trong quá trình sinh bệnh học của bệnh do vi khuẩn. Nếu V. cholerae không bám dính là sự thành công về miễn dịch đối với bệnh tả (Bhattacharjee, 1979).
- 58 -
* Kết luận: 2 chủng vi khuẩn V.cholerae T1 và T3 mang gene kháng kháng sinh trong trong nghiên cứu này thuộc nhóm huyết thanh O1, phù hợp với kết quả định danh bằng huyết thanh học (Nguyễn Thị Đấu, 2014).
- 59 -
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận
Số chủng Vibrio spp. phân lập được trên các loại mẫu từ thức ăn có nguồn gốc thuỷ hải sản, môi trường nước sông, nước ao nuôi tôm, nước biển và huyết heo ở các huyện trong Tỉnh Trà Vinh gồm 25 chủng: 6 chủng thuộc V. cholerae chiếm 24%, 8 chủng thuộc V. paraheamolyticus chiếm 32%, 4 chủng thuộc V. vultificus
chiếm 16%, 5 chủng thuộc V. fluvialis chiếm 20% và 2 chủng thuộc V . alginolyticus chiếm 8%.
6 chủng V. cholerae được thử nghiệm về tính nhạy cảm và đề kháng kháng sinh lần lượt: đề kháng với streptomycin 50%, ampicillin 17%, tetracycline 33%, trimethoprim-sulfamethoxazole 33% và vancomycin 67%. Có 2 chủng V. cholerae trong tổng số 6 chủng kiểm tra chứa gene kháng kháng sinh tetA, gene mã hóa cho tetracycline, các nhóm gene kháng kháng sinh
blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI mã hoá cho nhóm kháng sinh β-Lactam, Aminogly- cosid, Trimethoprim chưa được phát hiện trong nghiên cứu này. V. cholerae nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh như norfloxacin 100%, ampicillin 83% và amoxicillin-clavulanic axit 83%.
Trình tự thuộc chủng V. cholerae T1 và T3 có sự biến đổi thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide làm thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein. Chủng
V. cholerae T1 và T3 có codon kết thúc lần lượt ở 10 và 6 vị trí, tương ứng với các vị trí acid amin, đây là loại đột biến vô nghĩa.
Chỉ số bám dính vi khuẩn vào niêm mạc ruột chủng V. cholerae T1 và T3 đối với thỏ không uống vaccine phòng bệnh tả tại thời điểm 9 giờ là 55.7±13.9 và 59.3±4.2 và đối với thỏ có uống vaccine phòng bệnh tả tại thời điểm 9 giờ là 12.4±0.6 và 7.41±1.9. Tại thời điểm 16 giờ trên tất cả thỏ đều không có hiện tượng bám dính vi khuẩn vào niêm mạc ruột.
2 chủng vi khuẩn V.cholerae T1 và T3 mang gene kháng kháng sinh thuộc nhóm huyết thanh (serogroupe) O1, type huyết thanh (serotype) Ogawa và Inaba.
Đề nghị: Tiếp tục tìm hiểu cơ chế sinh bệnh và sự miễn dịch chéo giữa các loài
Vibrio spp. với nhau.
Hướng phát triển của đề tài: Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu về sự biến đổi di truyền đối với vi khuẩn V. cholerae liên quan đến tính gây bệnh cho con người.
- 60 -
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng nước ngoài
Abera, B., Bezabih, B. & Dessie, A, 2010. Antimicrobial susceptibility of V. cholerae
in north west, Ethiopia. Ethiop Medical Journal, 48: 23–28.
Allen, J. G., Atherton, F. R., Hall, M. J., Hassall, C. H., Holmes, S. W., Lambert, R. W., Nisbet, L. J. & Ringrose, P. S, 1979. Phospho-nopeptides as antibacterial agents: alaphosphin and related phospho-nopeptides. Antimicrob Agents Chemother, 15: 684–695.
Atherton, F. R., Hall, M. J., Hassall, C. H., Lambert, R. W., Lloyd, W. J. & Ringrose, P. S, 1979. Phosphonopeptides as antibacterial agents: mechanism of action of alaphosphin. Antimicrob Agents Chemother, 15: 696–705.
Amita SR, Chowdhury M, Thungapathra T, Ramamurthy G, Nair GB, Ghosh A, 2003. Class I integrons and SXT elements in El Tor strains isolated before and after 1992 Vibrio cholerae O139 outbreak, Calcutta, India. Emerg Infect Dis, 9: 500– 502.
Baranwal, S., Dey, K., Ramamurthy, T., Nair, G. B. & Kundu, M, 2002. Role of active efflux in association with target gene mutations in fluoroquinolone resistance in clinical isolates of Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother, 46: 2676– 2678.
Begum, A., Rahman, M. M., Ogawa, W., Mizushima, T., Kuroda, T. & Tsuchiya, T, 2005. Gene cloning and characterization of four MATE family multidrug efflux pumps from Vibrio cholerae non-O1. Microbiol Immunol, 49: 949–957.
Bhattacharjee, J. W. & S. Brahm Srivastava, 1979. Adherence of wild-type and mutant strains of Vibrio cholerae to normal and immune intestinal tissue. Bulletin of the World Health Organization, 57 (1): 123-128.
Binh Minh Nguyen, Je Hee Lee et al, 2009. Cholera Outbreaks Caused by an Altered
Vibrio cholerae O1 El Tor Biotype Strain Producing Classical Cholera Toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. Journal of Clinical Microbiology, p. 1568–1571.
Bina, J. E., Provenzano, D., Wang, C., Bina, X. R. & Mekalanos, J. J, 2006. Characterization of the Vibrio cholerae vexAB and vexCD efflux systems. Arch Microbiol, 186: 171–181.
Boyd, E.F., Waldor, M.K, 2008. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non- O1/non-O139 serogroup isolates. Microbiology, 1655-1666.
Burrus V, Waldor MK, 2004. Shaping bacterial genomes with integrative and conjugative elements. Res Microbiol, 155: 376–386.
Burrus, V., Marrero, J. & Waldor, M. K, 2006. The current ICE age: biology and evolution of SXT-related integrating conjugative elements. Plasmid, 55: 173–183.
- 61 -
Bywater, R. J, 2004. Veterinary use of antimicrobials and emergence of resistance in zoonotic and sentinel bacteria in the EU. Journal Veterinary Medical. B, 51: 361- 363.
Choi, S. Y., Lee, J. H., Jeon, Y. S., Lee, H. R., Kim, E. J.,Ansaruzzaman, M., Bhuiyan, N. A., Endtz, H. P., Niyogi, S. K. & other authors, 2010. Multilocus variable- number tandem repeat analysis of Vibrio cholerae O1 El Tor strains harbouring classical toxin B. Journal Medical Microbiol, 59: 763–769.
Dalsgaard A, Forslund A, Tam NV, Vinh DX, Cam PD, 1999. Cholera in Vietnam: changes in genotypes and emergence of class I integrons containing aminoglycoside resistance gene cassettes in Vibrio cholerae O1 strains isolated from 1979 to 1996. Journal Clinical Microbiol, 37: 734–741.
Dang, H., Zhang, X., Song, L., Chang, Y. and Yang, G, 2006. Molecular characterizations of oxytetracycline resistant bacteria and their resistance genes from mariculture waters of China. Marine Pollution Bulletin, 52 (11): 1494-1503. Desmarchelier, P.M, 1997. Pathogenic Vibrios. In A.D. Hocking, G. Arnold, I. Jenson, K. Newton and P. Sutherland, eds. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance 5th Edition, p. 285 -312.
Dong Tu Nguyen, Tuan Cuong Ngo, Huy Hoang Tran, Thanh Huong Le, Hoai Thu Nguyen, 2012, Characterization of Vibrio cholerae O139 of an Aquatic Isolate in Northern Vietnam.Open Microbiol Journal, 6: 14 - 21
De Saussure, P. P, 2009. Management of the returning traveler with diarrhea. Therap Adv Gastroenterol, 2: 367–375.
De, S. H., and D. N. Chatterjee, 1953. An experimental study of the mechanisms of action of Vibrio cholerae on the intestinal mucous membrane. Journal. Pathol. Bacteriol, 46:559-562.
Ehara, M. B.M.Nguyen, D.T.Nguyen, C.Toma, N.Higa and M.Iwanaga, 2004. Drug susceptibility and its genetic basis in epidemic Vibrio cholerae O1 in Vietnam. Epidemiol. Infect, 132: 595-600.
Ewen Cameron. D, 2008. A defined transposon mutant library and its use in identifying motility genes in Vibrio cholerae. PNAS;105:8736-8741
Faruque, S. M., Tam, V. C., Chowdhury, N., Diraphat, P., Dziejman, M., Heidelberg, J. F., Clemens, J. D., Mekalanos, J. J. & Nair, G. B, 2007. Genomic analysis of the Mozambique strain of Vibrio cholerae O1 reveals the origin of El Tor strains carrying classical CTX prophage. Proc Natl Acad Sci U S A, 104: 5151-5156. Faruque SM, Albert MJ, Mekalanos JJ, 1998. Epidemiology, genetics, and ecology of
- 62 -
Finkelstein, R. A., and L. F. Hanne, 1982. Purification and characterization of the soluble hemagglutinin (cholera lectin) produced by Vibrio cholerae. Infect. Immun, 36:1199-1208.
Fluit, A. C., Florijn, A., Verhoef, J. & Milatovic, D, 2005. Presence of tetracycline resistance determinants and susceptibility to tetraycline and amoxicline.
Antimicrob Agents Chemother, 49: 1636-1638.
Freter, R. & Jones, G. W, 1976. Infection and immunity, 14: 247-256.
Ghosh A, Ramamurthy T, 2011. Antimicrobials & cholera: are we stranded? Indian Journal Med Res 133: 225-231.
Glass, R. I., Huq, I., Alim, A. R. M. A. & Yunus, M, 1980. Emergence of multiply antibiotic-resistant Vibrio cholerae in Bangladesh. Journal Infect Dis, 142: 939- 942.
Glass, R. I., M. I. Huq, J. V. Lee, E. J. Threlfall, M. R. Khan, A. R. M. A. Alim, B. Rowe, and R. J. Gross. 1983. Plasmid-borne multiple drug resistance in Vibrio cholerae serogroup O1, biotype El Tor: evidence of a point source outbreak in Bangladesh. Journal. Infect. Dis. 147:204–209.
Goel, A. K., Jain, M., Kumar, P. & Jiang, S. C, 2010. Molecular characterization of
Vibrio cholerae outbreak strains with altered El Tor biotype from southern India.World Journal Microbiol Biotechnol, 26: 281-287.
Gomez-Gil B, Soto-Rodrı´guez S, Garcı´a-Gasca A, Roque A, VazquezJuarez R, et al, 2004. Molecular identification of Vibrio harveyi-related isolates associated with diseased aquatic organisms. Microbiology, 150: 1769-1777.
Greenough, W. B., III, Gordon, R. S., Jr, Rosenberg, I. S., Davies, B. I. & Benenson, A. S, 1964. Tetracycline in the treatment of cholera. Lancet, 1: 355-357.
Haldar S, Mody KH, Jha B, 2011b. Abundance, diversity and antibiotic resistance pattern of Vibrio spp. In coral ecosystem of Kurusadai island. Journal Basic Microbiol, 51: 153-162.
Hedges, R. W. & Jacob, A. E, 1975. A 98 megadalton R factor of compatibility group C in a Vibrio cholerae El Tor isolate from southern U.S.S.R. Journal Gen Microbiol, 89: 383–386.
Hlady WG, Klontz KC, 1996. The epidemiology of Vibrio infections in Florida, 1981- 1993. Journal Infect Dis,173:1176-1183.
Hưu Dat Tran, Munirul Alam, Nguyen Vu Trung, Hubert P. Endtz, and Heiman F. L. Wertheim, 2012. Multi-drug resistant Vibrio cholerae O1 variant El Tor isolated in northern Vietnam between 2007 and 2010. Journal of Medical Microbiology, 61: 431- 437.
Jain, M., Goel, A. K., Bhattacharya, P., Ghatole, M. & Kamboj, D. V, 2011. Multidrug resistant Vibrio cholerae O1 El Tor carrying classical ctxB allele involved in a cholera outbreak in South Western India. Acta Trop, 117: 152-156.
- 63 -
Jones, G. W. et al, 1976. Infection and immunity, 1232-239.
Kaper, J.B., Morris, J. G., Jr & Levine, M. M, 1995. Cholera. Clin Microbiol Rev, 8: 48-86.
Karki, R., Bhatta, D. R., Malla, S. & Dumre, S. P, 2010. Cholera incidence among patients with diarrhea visiting National Public Health Laboratory, Nepal. Jpn JournalInfect Dis, 63: 185-187.
Kazuhisa Okada, Mathukorn Na-Ubol, Ichiro Nakagawa, Siriporn Chantaroj, et al, 2014. Comparative Genomic Characterization of a Thailand–Myanmar Isolate, MS6, of Vibrio cholerae O1 El Tor, which Is Phylogenetically Related to a ‘US Gulf Coast’’Clone . Volume 9, Issue 6.
Kim, H. B., Wang, M., Ahmed, S., Park, C. H., LaRocque, R. C., Faruque, A. S., Salam, M. A., Khan, W. A., Qadri, F. & other authors, 2010. Transferable quinolone resistance in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother, 54: 799- 803.
Kenneth Todar, 2013. Bacterial AntibioticsResistance: www.textbookofbacteriology.net Korinfo, 2000. Vibrio cholerae. http://www.mokkka.hu/drupal/node/2874.
Levine, M.M. 1991. South America: the nature of cholera. Lancet, 338:45-46.
Maya Kitaoka, Sarah T. Miyata, Daniel Unterweger and Stefan Pukatzki, 2011. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. Journal of Medical Microbiology, 60, 397 - 407.
Meer T. Alam, Thomas A. Weppelmann, Chad D. Weber, Judith A. Johnson, Mohammad H. Rashid, Catherine S. Birch, Babette A. Brumback, Valery E. Madsen Beau de Rochars, J. Glenn Morris, Jr., and Afsar Ali, 2014. Monitoring Water Sources for Environmental Reservoirs of Toxigenic Vibrio cholerae O1, Haiti. Vol.20, No.3
Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K. & Sack, D. A, 2002. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. Journal Clinical Microbiol, 40: 3296-3299.
Nair, G. B., T. Ramamurthy, S. K. Bhattacharya, A. K. Mukhopadhyay, S. Garg, M. K. Bhattacharya, T. Takeda, T. Shimada, Y. Takeda, and B. C. Deb, 1994. Spread of
Vibrio cholerae O139 Bengal in India. Journal. Infect. Dis, 169:1029–1034. Nguyen BM, Higa N, Kakinohana S, Iwanaga M, 2002. Characterization of Vibrio
cholerae O1 isolated in Vietnam. Jpn J Trop Med Hyg, 30: 103-107.
Nguyen, B. M., Lee, J. H., Cuong, N. T., Choi, S. Y., Hien, N. T., Anh, D. D., Lee, H.