Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc
Chọn 10 khuẩn lạc rời đã được cấy thuần trên môi trường thạch không chọn lọc (SNA: saline nutrient agar), cho vào tube 2,2 ml có viên bi sắt và lắc bằng máy vortex, sau đó cho 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần dung dịch (400 μl) chuyển sang tube mới. Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ phần nước trong phía trên. Kết tủa được rửa bằng Ethanol 70% trong 500 μl, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Sấy khô phần tủa (DNA) trong 10 phút ở 450C; sau đó hòa tan DNA thu được trong 100 μl TE 0.1X và trữ ở -200C.
Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bày trong Bảng 3.1. Thành phần 01 phản ứng PCR bao gồm: DNA tổng số khoảng 25μl, 2,5 μl buffer 1X (Tris 10 mM, KCl 50 mM, pH 9.0, Triton X-100), 2 μl MgCl2, 4μl cho mỗi dNTP, 1μl mồi xuôi 27F, 1μl mồi ngược 1492R, 0.25μl Taq DNA polymerase. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như sau: 950C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến tính ở 950C trong 1 phút, gắn mồi ở 530C trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 720C trong 60 giây. Cuối cùng phản ứng được duy trì 720C trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas).
Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên gene 16S rRNA
Xác định Mồi Trình tự nucleotide của mồi (5'Mồi xuôi // Mồi ngược →3') Độ dài (bp) Biến tính 0C/phút Gắn mồi 0C/phút Kéo dài 0C/phút Kết thúc 0C/phút (1) Vibrio spp. 27F 1492R AGAGTTTGATCCTGGCTC’ TACGGTTACCTTGTTACGACT 1500 95/1 53/30,, 72/1 72/5 (2) V. cholerae ctxA-F ctxA-R CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG 302 95/1 53/30,, 72/1 72/5 3) V. cholerae O139 O139rfb-F O139rfb-R AGCCTCTTTATTACGGGTGG GTCAAACCCGATCGTAAAGG 449 95/1 53/30,, 72/1 72/5
- 24 -
Xử lý số liệu: Xử lý kết quả bằng chương trình Excel; phần mềm BioEdit (phân tích kết quả giải trình tự; phần mềm MEGA (Treeview).
Quy trình phân lập Vibrio spp. theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-2:2007 được tóm tắt qua sơ đồ sau:
Hình 2.1: Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp.
O1
Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh
O139
Ogawa Inaba
Ủ ở 37oC/6h → 1ml vào ống chứa 10ml ASPW Ủ 410C/18h
Ơ Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển sang môi trường TCBS
Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa
[Xác định vi khuẩn Vibrio spp. và cấy thuần lại trên NA saline
Giữ giống
Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9m nước Peptone kiềm (ASPW)
- 25 -