21872-1:2007)
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng để phát hiện hay phân biệt các loài
Vibrios được thực hiện theo quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E).
Chọn khuẩn lạc trên môi trường SNA để thử nghiệm các đặc tính: phản ứng với oxidase; kiểm tra tính lên men đường glucose/lactose; khả năng sinh hơi và sinh H2S; thử phản ứng sinh Indole và sự di động. Thử tính ưa mặn của Vibrio spp. ở các nồng độ muối NaCl khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%), V. cholerae mọc tốt trên môi trường có muối từ 0 – 2%; V. parahaemolyticus và V. Aginolyticus từ 2 – 8 %,
V. vulnificus và V.fluvialis từ 2 – 6%.
* Thử nghiệm oxidase: Nhỏ nước muối sinh lý lên lam sạch và đặt đĩa giấy tẩm oxidase, dùng que cấy đầu tròn lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ đĩa môi trường SNA lên đĩa giấy tẩm oxidase đã được làm ướt và quan sát, đọc kết quả trong vòng 10 giây đến 1 phút. Nếu đĩa giấy chuyển màu xám, tím hoặc xanh tím là kết quả dương tính, không đổi màu là kết quả âm tính.
* Môi trường TSI saline: Mục đích của việc cấy trên môi trường này là kiểm tra tính lên men đường glucose, lactose, tính sinh gas và tính sinh H2S của vi khuẩn.
Môi trường TSI saline được pha chế có màu đỏ cam, hấp khử trùng sau khi đổ vào ống nghiệm, môi trường đặt nghiêng, phần nghiêng cao tương đương phần đứng và chiều dài môi trường đạt không qua 2/3 chiều cao ống nghiệm, tuyệt đối không để thạch chạm nắp ống nghiệm.
Cách cấy vi khuẩn
Trong điều kiện vô trùng, chọn lấy một khuẩn lạc Vibrios riêng rẻ trên môi trường SNA cấy vào môi trường TSI saline. Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn
Vibrios nghi ngờ thẳng xuống phần thạch đứng, phần thạch nghiêng ria cấy ngang đem ủ ở 37 0C trong 24 giờ. Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi của môi trường:
Vi khuẩn sinh H2S giữa vùng thạch đứng và thạch nghiêng sẽ có màu đen.
Vi khuẩn sinh hơi sẽ xuất hiện bọt trên mặt thạch hoặc cột thạch có những đường nứt.
Vi khuẩn lên men đường glucose, không lên men đường lactose thì phần thạch nghiêng có màu đỏ hồng còn phần thạch đứng có màu vàng.
Kết quả: Trên môi trường TSI, Vibrio cholerae làm phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S (Hình 2.3).
- 22 -
* Thử khả năng sinh indole
+ Nguyên tắc: là thử khả năng oxy hóa acid amine tryptophane của vi khuẩn thành những sản phẩm biến dưỡng có gốc indole gồm indole, sketole. Việc phát hiện indole được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với thuốc thử Kovacs (para dimethylaminobenzaldehyde, p-DMABA) tạo nên một phức chất dạng quinone có màu đỏ.
+ Phương pháp tiến hành: nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Kovacs vào ống nghiệm vi khuẩn có Trypton và DL-trytophan đã được ủ ở 37oC trong 24 giờ:
Phản ứng dương tính (+): nếu có vòng đỏ hồng xuất hiện sau 2 – 3 phút. Phản ứng âm tính (-): khi không có vòng đỏ hồng trên mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử. Do vi khuẩn Vibrios có khả năng sinh indole nên phản ứng indole dương tính (+) và có một vòng đỏ trên môi trường ống nghiệm.
* Thử tính ưa mặn
V. cholerae phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối từ 2 – 3%, để xác định sự hiện diện của vi khuẩn, do đó cần cấy vi khuẩn ở các nồng độ muối (NaCl) khác nhau (0%, 2%, 6%, 8% và 10%).
Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Vibrios nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa môi trường peptone có muối ở các nồng độ trên, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Đọc kết quả dựa vào sự thay đổi độ đục của môi trường: ống nghiệm đục cho kết quả dương tính, ống nghiệm trong suốt cho kết quả âm tính. Vi khuẩn mọc tốt ở môi trường có nồng độ muối 2%.
* Nhuộm Gram: vi khuẩn sau khi phân lập từ các khuẩn lạc điển hình sẽ tiến hành nhuộm Gram để xác định hình dạng và tính bắt màu và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 40 – 100X, vi khuẩn sẽ bắt màu hồng nhạt và có hình que ngắn, sau đó chụp dưới kính hiển vi điện tử 10.000 X
2.2.2 Xác định Vibrios bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ).
Nguyên lý định danh vi sinh vật là dùng phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh hoá của vi sinh vật thông qua sự thay đổi màu của các giếng môi trường có sẵn trong thẻ (card). Các thẻ định danh được phủ hoá chất tối đa 64 giếng, các giếng có hoá chất đặc biệt phù hợp với tính chất sinh hoá của vi sinh vật khác nhau.
Máy sẽ tự động báo cáo kết quả khi xét nghiệm hoàn tất từ 5 – 7 giờ, bao gồm tỉ lệ dương tính của từng loài Vibrios và kết quả chi tiết về sinh hoá thông qua
- 23 -
việc đo cường độ ánh sáng bị chặn lại (hay sự suy giảm cường độ ánh sáng) khi ánh sáng đi qua giếng với các bước sóng 660 nm, 568 nm, 428 nm.
2.2.3 Xác định vi khuẩn Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc
Chọn 10 khuẩn lạc rời đã được cấy thuần trên môi trường thạch không chọn lọc (SNA: saline nutrient agar), cho vào tube 2,2 ml có viên bi sắt và lắc bằng máy vortex, sau đó cho 1 ml Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần dung dịch (400 μl) chuyển sang tube mới. Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ phần nước trong phía trên. Kết tủa được rửa bằng Ethanol 70% trong 500 μl, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Sấy khô phần tủa (DNA) trong 10 phút ở 450C; sau đó hòa tan DNA thu được trong 100 μl TE 0.1X và trữ ở -200C.
Các gốc vi khuẩn thuần được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR, dựa trên gene 16S rRNA. Trình tự nucleotide của các cặp mồi được trình bày trong Bảng 3.1. Thành phần 01 phản ứng PCR bao gồm: DNA tổng số khoảng 25μl, 2,5 μl buffer 1X (Tris 10 mM, KCl 50 mM, pH 9.0, Triton X-100), 2 μl MgCl2, 4μl cho mỗi dNTP, 1μl mồi xuôi 27F, 1μl mồi ngược 1492R, 0.25μl Taq DNA polymerase. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR như sau: 950C trong 5 phút, sau đó lặp lại 30 chu kỳ với các bước như sau: Biến tính ở 950C trong 1 phút, gắn mồi ở 530C trong 30 giây, tổng hợp DNA ở 720C trong 60 giây. Cuối cùng phản ứng được duy trì 720C trong 5 phút.
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TBE 1X ở 100V trong 90 phút và chụp bằng máy chụp hình gel Biorad UV 2000, thang chuẩn 100 bp (công ty Fermentas).
Bảng 2.1: Trình tự nucleotide các cặp mồi trong phản ứng PCR dựa trên gene 16S rRNA
Xác định Mồi Trình tự nucleotide của mồi (5'Mồi xuôi // Mồi ngược →3') Độ dài (bp) Biến tính 0C/phút Gắn mồi 0C/phút Kéo dài 0C/phút Kết thúc 0C/phút (1) Vibrio spp. 27F 1492R AGAGTTTGATCCTGGCTC’ TACGGTTACCTTGTTACGACT 1500 95/1 53/30,, 72/1 72/5 (2) V. cholerae ctxA-F ctxA-R CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG TCTATCTCTGTAGCCCCTATTACG 302 95/1 53/30,, 72/1 72/5 3) V. cholerae O139 O139rfb-F O139rfb-R AGCCTCTTTATTACGGGTGG GTCAAACCCGATCGTAAAGG 449 95/1 53/30,, 72/1 72/5
- 24 -
Xử lý số liệu: Xử lý kết quả bằng chương trình Excel; phần mềm BioEdit (phân tích kết quả giải trình tự; phần mềm MEGA (Treeview).
Quy trình phân lập Vibrio spp. theo tiêu chuẩn ISO/TS 21872-2:2007 được tóm tắt qua sơ đồ sau:
Hình 2.1: Quy trình phân lập và định danh Vibrio spp.
O1
Thực hiện phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh
O139
Ogawa Inaba
Ủ ở 37oC/6h → 1ml vào ống chứa 10ml ASPW Ủ 410C/18h
Ơ Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Cấy chuyển sang môi trường TCBS Ủ 24h ở 37oC
Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình, cấy chuyển sang môi trường TCBS
Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Cấy sang môi trường NA saline (SNA) Ủ 24h ở 37oC
Kiểm tra các đặc tính sinh hóa
[Xác định vi khuẩn Vibrio spp. và cấy thuần lại trên NA saline
Giữ giống
Cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9m nước Peptone kiềm (ASPW)
- 25 -
2.3. Kết quả nghiên cứu
2.3.1 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng phản ứng sinh hóa
Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hoá của các loài thuộc Vibrio spp. được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 2.2: Kết quả thử sinh hoá các loài thuộc Vibrio spp.
TT
Test SH
Vibrio spp.
V.cholerae V.paraheamolyticus V.vulnificus V.fluvialis V.alginolyticus
1 K. lạc Vàng Xanh Vàng Vàng Vàng 2 Oxidase (+) (+) (+) (+) (+) 3 TSI (+) Glucose (+) (+) (+) Lactose (-) (-) (+) (-) (-) Sucrose + (-) (-) (+) (+) 4 LDC (+) (+) (+) (-) (+) 5 Di động (+) (+) (+) (+) (+) 6 ONPG (+) (+) (+) (+) 7 Indole (+) (-) (-) (-) (+) 8 Urease (-) (+) (-) (-) (-) 9 PAD (-) (-) (-) (-) 10 Citrate (-) (-) (-) (-) (+) 11 VP (-) (-) (-) (-) (+) 12 NaCl 0% (+) 2% (+) (+) (+) (+) (+) 6% (+) (+) (+) (+) 8% (+) (+) 10% (+)/(-)
Quan sát đặc tính sinh hóa, nhận thấy một số vi khuẩn Vibrio spp. có thể phát triển trong môi trường thạch muối-sucrose thiosulfate citrate-mật (TCBS): khuẩn lạc màu vàng/xanh, Vibrio spp. có thể phân biệt bởi một số phản ứng sinh hóa, hầu hết đều tạo sản phẩm oxidase và catalase, lên men đường và không sinh hơi; V. cholerae, V. paraheamolyticus, V. fluvialis và V.
alginolyticus đều không lên men đường lactose, riêng V. cholerae và V.
alginolyticus có khả năng oxy hóa tryptophan của vi khuẩn thành sản phẩm có gốc indole. Tất cả các loài đều âm tính với urease, riêng V. parahaemolyticus
- 26 -
có phản ứng dương tính với urê, đây là phản ứng có giá trị kiểm tra đối với các chủng có khả năng gây bệnh. Vibrio spp. phát triển ở nồng độ muối thích hợp: 0-2%, 2-6%, 2-8% và từ 2-10%, tỉ lệ dương tính phù hợp với các phản ứng sinh hoá của 5 loài từ 90 – 98%. Kết quả sinh hóa trên thực hiện theo tiêu chuẩn quy trình ISO/TS 21872-1:2007 (E).
(a) Khuẩn lạc có màu vàng (b) Khuẩn lạc có màu xanh
Hình 2.2: Khuẩn lạc trên môi trường TCBS
Hình 2.3: Test sinh hoá
(a) Oxidase (+); (b) Các dãy giếng dùng thử nghiệm Indole(+) và ONPG (+) (c) Lên men đường glucose; (d) LDC (+); (e) Di động (+)
- 27 -
a. Nồng độ muối (+) từ 0% - 2% b. Nồng độ muối (+) từ 2% - 8%
Hình 2.4: Nồng độ muối từ 0% - 10%
* Nhuộm Gram: Kết quả xác định hình dạng vi khuẩn V. cholerae dưới kính hiển điện tử với độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần, vi khuẩn có hình hơi cong, có chiều dài từ 1 µm – 3 µm, có roi ngắn.
Hình 2.5: Chủng vi khuẩn O3.2 (T3) dưới kính hiển vi điện tử, độ phóng đại 5.000 và 10.000 lần
2.3.2 Kết quả định danh Vibrios bằng máy định danh tự động (Vitex 2 compact- Biomerieux - BVĐK Trung ương Cần Thơ).
Kết quả định danh hoàn tất từ 5 – 7 giờ, tỉ lệ dương tính và kết quả chi tiết về sinh hoá của từng loài Vibrios thể hiện qua phụ lục 4. Tỉ lệ dương tính của từng loài Vibrios được tổng hợp như sau:
Vibrio spp.
V.cholerae V.paraheamolyticus V.vulnificus V.fluvialis V.alginolyticus
TB 98% 99% 99% 98% 94%
- 28 -
2.3.3 Kết quả định danh Vibrio spp. bằng kỹ thuật PCR
Hình 2.6: Sản phẩm khuếch đại đoạn gene 16S-27F và 1492Rbp Kết quả điện di hình trên cho thấy các sản phẩm PCR dài 1500 bp tương đương với đoạn gene 16S-27F và 1492R ở tất cả các chủng Vibrio spp.
Trình tự gene 16S rRNA được nhiều tác giả sử dụng trong phương pháp phân tích PCR để xác định bất kỳ vi khuẩn bao gồm cả vi khuẩn thuộc nhóm
Vibrios (Gomez et al., 2004; Haldar et al., 2011b). Đoạn gene 16S rRNA dài 1.500 bp bao gồm các khu vực bảo tồn cao và có mặt ở hầu hết các vi khuẩn có phân nhánh nhưng có mối quan hệ gần, trong khi vùng biến đổi có thể phân biệt các loài trong cùng một giống. Đây là một công cụ để các nhà nghiên cứu sử dụng đoạn gene 16S rRNA xây dựng cây phát sinh loài trong ngành vi sinh vật (William et al., 1991).
Đối chiếu các kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa với các sản phẩm từ PCR, nghiên cứu ghi nhận những loài thuộc Vibrios lần lượt: V. cholerae vạch từ 1-6; V. fluvialis từ 7-11; V. paraheamolyticus từ 12-19; V. vulnificus từ 20-23; V. alginolyticus từ 24-25.
Qua nghiên cứu chưa phát hiện chủng thuộc Vibrios mang gene O139rfb và chủng mang gene mã hoá độc tố CTXAtrên những mẫu từ môi trường nước và thức ăn có nguồn gốc thủy sản, chứng tỏ Vibrio O139 xuất hiện chưa phổ biến tại tỉnh Trà Vinh. Ở miền Bắc Việt Nam từ năm 2006 – 2010 chỉ phân lập một chủng V. cholerae O139 từ môi trường nước (Dong Tu Nguyen, 2012). Nghiên cứu trên cũng cho thấy V. cholerae đại diện cho một số chủng thuộc Vibrios được phân lập ngoài môi trường nước, trong đó chỉ có một vài chủng có đặc tính gây bệnh và môi trường nước trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản luôn tồn tại cả hai chủng không gây bệnh và gây bệnh (O1/non – O1 và O139/non – O139) những chủng không gây bệnh dễ
- 29 -
dàng thu nhận gene độc lực từ những chủng gây bệnh ngoài môi trường nước và có thể phát sinh thành dịch bệnh (Shah, 2003).
Một nghiên cứu khác cũng cho rằng V. cholerae nằm trong nhóm các vi sinh vật thuộc hệ sinh thái là môi trường nước, các chủng O1 và O139 được phân lập ít so với các chủng non-O1 và non – O139. Hơn nữa, những nơi nằm ngoài vùng dịch và cách xa vùng có dịch bệnh, các chủng V. cholerae phân lập ngoài môi trường thường không mang độc tố tả (CTX) (Faruque et al., 1998)
Năm 2013, Nguyễn Hoàng Vũ và cộng sự đã thực hiện những nghiên cứu nhằm giám sát sự lưu hành của vi khuẩn V. cholerae O1, O139 trên các loại mẫu phân, mẫu nước sông, mẫu thực phẩm tươi sống thu thập từ tháng 9/2012 đến tháng 5/2013 trong cộng đồng và môi trường khu vực phía Nam Việt Nam như Thành phố Hồ Chí Minh, An Giang và Bến Tre, kết quả cũng không phát hiện gene độc tố tả CTXA. Như vậy, vi khuẩn V. cholerae O1, O139 có khả năng tồn tại trong thực phẩm tươi sống và nước sông nhưng không mang độc tố tả. Đây là nguy cơ tiềm ẩn của sự tái bùng phát dịch bệnh.
Nhiều nghiên cứu khác cũng đã chứng minh hầu hết những chủng phân lập từ môi trường không mang gene độc tố bệnh tả, một loại enterotoxin chịu nhiệt ổn định (Nair et al., 1994), hoặc độc tố tiêm mao (Waldor et al., 1994).
Meer et al., (2014) đã nghiên cứu cho thấy những chủng V. cholerae non - O1 phân bố rộng khắp môi trường, bao gồm các vùng sông núi. Mặc dù không thể chắc chắn rằng chủng O1 và non- O1 có liên quan trong cùng điều kiện phát triển, tuy nhiên việc hình thành chủng V. cholerae non-O1 trong môi trường cho thấy đó là điều kiện thích hợp cho sự phát triển của các chủng V. cholerae O1, qua các kết quả nghiên cứu chỉ có (47%) chủng V. cholerae O1 biotype El Tor có chứa gene CTX, những chủng không chứa gene CTX là những chủng V. cholerae non - O1.
2.3.4 Tỉ lệ phát hiện Vibrio spp. trên các loại mẫu phân lập
Dựa trên kết quả nuôi cấy, đặc điểm sinh hoá, kết quả định danh bằng máy định danh tự động và qua phân tích PCR, nghiên cứu đã ghi nhận 5 loài thuộc Vibrio spp. và 25 chủng trên các mẫu thức ăn từ nghêu, tôm, nước biển, nước ao nuôi tôm, nước sông, huyết heo, gồm 6 chủng thuộc loài V. cholerae
(24%); 8 chủng thuộc loài V. paraheamolyticus (32%); 4 chủng thuộc loài V. vulnificus (16%); 5 chủng thuộc loài V. fluvialis (20%) và 2 chủng thuộc loài V. alginolyticus (8%), trình bày qua Bảng 2.3 và Bảng 2.4
- 30 -
Bảng 2.3: Tỉ lệ Vibrio spp. trên các loại mẫu
Loại mẫu (n = 500)
Loài Vibrios Số mẫu kiểm tra Dương tính Số mẫu Tỉ lệ (%) Nghêu (n = 160) V. cholerae 160 03 1,9 V. paraheamolyticus 160 03 1,9 V. vulniticus 160 04 2,5 V. fluvialis 160 05 3,1 V. alginolyticus 160 01 0,63
Huyết heo (n = 100) V. cholerae 100 02 2,0
V. paraheamolyticus 100 02 2,0
Nước (n = 150)
+ Nước sông V. cholerae 50 01 2,0
+ Nước biển V. alginolyticus 50 01 2,0
+ Nước ao nuôi tôm V. paraheamolyticus 50 02 4,0
Tôm (n = 50) V. paraheamolyticus 50 01 2,0
Phân bệnh nhân (n = 40) 40 0 0,0
Tổng cộng 25
Trên mẫu nghêu, có sự hiện diện rất đa dạng các loài thuộc Vibrio spp., vì đây là loài sinh vật sống ở vùng nước mặn, rất phù hợp cho vi khuẩn Vibrio
spp. ký sinh, trong đó loài V. cholerae là 1,9 %. Trong huyết heo do có sử dụng nguồn nước từ sông để sử dụng trong quá trình giết mổ như rửa thịt, pha vào