Kết quả điện di hình trên, cho thấy các sản phẩm PCR dài khoảng 880bp tương ứng với đoạn gene tetA được phát hiện ở 2 chủng V. cholerae. Gene tetA
có trình tự bảo tồn đặc trưng cho V. cholerae nên các sản phẩm PCR quan sát được đều thuộc chủng V. cholerae T1 và T2.
Qua nghiên cứu, chưa phát hiện chủng V. cholerae mang gene kháng kháng sinh blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Chủng V. cholerae (T1) và chủng V. cholerae (T3) đều phân lập từ môi trường nước và chúng đều mang gene kháng tetracycline, thuộc nhóm Aminoglycosid. Như vậy một số chủng trong nghiên cứu không chứa gene kháng tetracycline (tetA), nhưng chúng có khả năng kháng với tetracycline, có thể là do sự hiện diện của các gene khác mã hóa kháng với tetracycline như
blaSHV, aac(3)-IV và dhfrI. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Dang và cộng sự, (2006).
Những kết quả nghiên cứu khác cũng cho thấy nhiều loại thuốc kháng với vi khuẩn Vibrio spp. có trong thức ăn hải sản, thông qua plasmid có thể chuyển gene kháng này qua các yếu tố như integrons, transposons, đây là một
tetA (880bp)
M 1 2
900bp
M: thang chuẩn 100bp, 1: V.cholerae (T1), 2: V.cholerae (T3)
- 40 -
yếu tố quyết định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Vibrio spp. Hơn nữa, vi khuẩn Vibrios có khả năng truyền các gene kháng kháng sinh mã hoá plasmid sang các vi khuẩn khác và có thể nhiễm sang con người một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Raissy, 2012). Thungapathra et al., (2002) đã nghiên cứu cho thấy trong tổng số 94 chủng thuộc Vibrios phân lập được, có 43 chủng chứa R- plasmid đề kháng với ampicillin, neomycin, tetracycline, gentamicin, streptomycin, sulfonamide, furazolidone và chloramphenicol.
Ở Việt Nam, sự bùng phát bệnh dịch tả vào những 1995, 2000 và 2002 bởi những gene khác nhau của V. cholerae O1 gây ra, chúng từng xuất hiện và biến mất. Nhiều giả thiết cho rằng những nhóm vi khuẩn này luôn hiện diện trong hệ vi khuẩn ngoài môi trường, chúng sinh sản rất nhanh; hoặc chúng có thể lan truyền từ các nước khác và từng nhóm sẽ tạo ra sự bùng phát dịch bệnh; mặt khác, trong một nhóm vi khuẩn sẽ trải qua quá trình trao đổi gene, chèn thêm hoặc xoá các gene kháng kháng sinh, từ đó xuất hiện một nhóm vi khuẩn kháng thuốc mới (Ehara et al., 2004).
3.3.3 Kết quả giải trình tự các đoạn gene kháng kháng sinh
Kết quả chuỗi trình tự chủng V. cholerae gene DKKS-T1-TraVinhVN- 2014 có số nucleotide ban đầu là 1100 được trình bày như sau:
>Gene_DKKS_T1_TraVinhVN_2014 (1100 nucleotide)
1 GAA TTA CTT AGC GAT GCA GCA GCG AAG TCA AAA CCT ACG CTG AAA
46 CAT ATT TCT ACC TTC GTG CTT GGA GTG CTC CAG CCG CAC TCC TTA
91 ACT TTG TGC TAT TGG GCT GGT TAC TCG GTA CGC AAA ATG CCC GCG
136 CCC CGA TGT GGA TGG TGA TCA TCA CCA ACC TCA CCA ATA TTG TGC 181 TCG ATC TAC TAC TCG TAC TCG GAC TAG GGC TAA AAG TCG AAG GAG 226 CCG CCA TTG CGT CGG TTA TCG CCG ATT ATG CTG GTC TCT TGT TTG 271 GTC TGC TGT GCG TGG TGC GTT ACT GGC GGC AGC ATC AGC TCC CAG 316 CGC CCT TCT CTT TCA TCC CCT CTC TCA CCA AAG AGC TTT CCC GTT 361 TAG TGG CGC TCA ATC GTG ATA TCT TCC TGC GCT CAC TCT GTC TGC 406 AAG CCG TAT TTA GCT TTA TGA CCT TTC AAG GCG CAG CGT TGG GAG 451 ATG ACA TCG TCG CCG CTA ATG CGG TGC TGA TGA GCT TTT TGA TGA 496 TGA TTT CCT ACG GTA TGG ATG GAT TTG CCT ACG CGA TGG AAG CCA 541 TGG TCG GTA AAG CAA TGT TGT CCA GGC AGA CTT GCG ACG GAT TCA 586 CCG CAT CAT TTT CAC CTA TCT CCG GCT GGA AAG TGC CGG GGG CAA 631 GAT CTT CCA TAC TGG AGA CAC TCA CGG GAA GAA TCA CAT TCG ATT 676 TAA GAC ACC TCA CCT CCA GAT GGC GGT TGA TTG GGC GAA CCT CTT 721 GAC TAC GAT TCA TGT GGT AAA GCT GAC CAG GGG TAG ACG GAA CAA 766 CCA CCT GCG ATG TTT TGC TCA CTC ACA CAT CTG CAA GAT AGG CTA 811 TAG ACC TGG ATA GGA CTG GTC AGG GCT CTC TGG ACT TCA TAA ATG 856 GTG TGG GCG TTC AGC GAT ACA TCA GGC CAC ATT AGA CTC CCG CGC
- 41 -
901 TTC TGT ACT GCC GAG GGA GTA TAA AGC TGG TGC AAT TAA CCA GCC 946 TGA CGC ACC GTT TAG CAA AAT TCA CCC AAA ACT GTG CTT CCC CAC 991 AAA CGT CAA ACC GCT AAG GCT TCC GGC AGT CGG CCA TAG CCC GTA 1036 TTT CGA ATG CCA TTA CGG CCT TCC TCT GGA ACA ATA CTG AGT TCA 1081 AAG AAC TTT CCA AAA CCG GG- 1100
Kết quả chuỗi trình tự chủng V. cholerae gene DKKS-T3-TraVinhVN- 2014 có số nucleotide ban đầu là 1077 được trình bày như sau:
>Gene_DKKS_T3_TraVinhVN_2014 (1077nucleotide)
1 TGC GTG TAT CTG CGT TTG AAC CTC GGA TAA ACC GCT GCC ACT GGA
46 GCA TAT CGA GCC CGC GAG CGA TCT CTA CAA ACG CTT TGA CTC CGC
91 CGC CAT GTC GAT TGG CGC GTT AAG CCC AGA AGC CCA TGA AGC GTT
136 AGC CAC CGC GAT GAA CCG CCT AGG CGG CTA TTC CAA CTC AGG TGA 181 AGG TGG TGA AGA TCC ACG CCG TTT TGG CAC TGA GCG TAA CTC ACG 226 TAT CAA GCA ATG TTG TCC AGG CAG ACA TGG CCA GCG CCC CAC CCT 271 TTG CCC GAC CGG CTG AGA TGC CGA AGC TTG ACG ACC TGT ACA ATC 316 GTA ATC AAT CTG GCT GGA TCT TGC TGA TAG AAC CAA GAG GGG GGG 361 GGC AAG ATG GTA AAA GGG ATG TGG GCC TCG TAG AGA CAC CAG ACG 406 TAA TCC ACC ACA TTG GTG TAA TTT GCA ATG GCC GCT TGT ACT TCT 451 TCC AAA GGG AAT GGG TAC AAC TGT TCG ATA CTA ACA ATC TCC ACG 496 TCT TGC TGT TCA TTG GCT CGG CGC TGT TCA AGG AGA TCG TAA TAA 541 ACC TTA CCA GAA CAG AAC ACA ACG CGT TTT ACT TGC GAC GGA TTC 586 AGC GCA TCA ATT TCA CCA ATC GCC GGC TGG AAA GTA CCG TGG GCA 631 AGA TCT TCC ATA CTG GAG ACA CAC AGT GGA TGA CGC AGC AGC GAT 676 TTA GGA GAC ATC ACC ACC AGA GGG CGG CGC ATT GGG CGA ACC ACT 721 TGA CGA CGA ATC ATG TGG TAA ACC TGA GCA GGG GTA GAC GGA ACA 766 ACC ACC TGC ATG TTT TGC TCA GCA CAC AGC TGC AAG TAA CGC TCT 811 AAA CGT GCA GAG GAG TGC TCA GGG CCT TGG CCT TCA TAA CCG TGT 856 GGC AGC AAC ATA GTC AGG CCA CAT AGA CGA CCC CAC TTC TGT TCA 901 CCA GAG GAG ATA AAC TGG TCA ATA ACC ACC TGC GCA CCG TTA GCA 946 AAA ATC ACC AAA ACT GTG CTT CCC ACA ACG TCA AAC CGC TAG GCT 991 CCG CTG TCG CAT AGC CCG GTA TTC GAA TGG CCA ATT ACG ACT TCC 1036 TTT CCT GAC CAA TAC CTG AGT CAA GAC TTT CAA AAC GGG GGC 1077
- 42 -
3.3.4 So sánh trình tự nucleotide của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng
V. cholerae hoang dại N16961 tìm các dạng đột biến.
Trình tự nucleotid của chủng V. cholerae T1, T3 với chủng V. cholerae
hoang dại N16961 được so sánh qua Hình sau:
- 43 -
Các vị trí nucleotide được chèn vào và mất đi sẽ tương ứng với các vị trí acid amin sẽ thay đổi trong chuỗi trình tự của các chủng V. cholerae, từ đó suy luận về kiểu đột biến của chủng V. cholerae phân lập (Bảng 3.5).
[
Bảng 3.5: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại N16961 với chủng V. cholerae T1
Codon Thay đổi Nucleotide
Thay đổi acid amin
Số nucleotid T1 mất
Kiểu đột biến
14 AGT→CTG Ser→Leu 1 Sai nghĩa
23 GAT→GGA Asp→Gly 2 Sai nghĩa
24 TCA→GTG Ser→Val 1 Sai nghĩa
31 ATC→ACT Ile→Thr 2 Sai nghĩa
32 AAC→TTG Asn→Leu 1 Sai nghĩa
41 GGG→CGC Gly→Arg 2 Sai nghĩa
44 AAC→CCC Asn→Pro 2 Sai nghĩa
45 CTA→GCG Leu→Ala 1 Sai nghĩa
48 ACA→TGT Thr→Cys 1 Sai nghĩa
50 CCA→TGG Pro→Trp 1 Sai nghĩa
51 CCT→TGA Pro →End Vô nghĩa
52 TGG→TCA Trp->Ser 1 Sai nghĩa
53 GAT→TCA Asp→Ser 3 Sai nghĩa
54 CTA→CCA Leu→Pro 3 Sai nghĩa
55 AAA→ACC Lys→Thr 2 Sai nghĩa
56 CTT→TCA Leu→Ser 1 Sai nghĩa
57 GTT→CAA Val→Pro 2 Sai nghĩa
59 TGG→TTG Trp→Leu 1 Sai nghĩa
69 CGT→TAG Arg→End Vô nghĩa
71 GTT→TAA Val→End Vô nghĩa
74 A-T→TCA → Ser Thêm đoạn Dịch khung
105 CA - →CG - → 1 Dịch khung
106 - TG→-TG - → 2 Dịch khung
121 GCT→TAG Ala→End Vô nghĩa
142 GGT→TGA Gly →End Vô nghĩa
160 AAA→TGA Gly →End Vô nghĩa
161 GTA→TGA Val →End Vô nghĩa
164 CTT→TGA Leu →End Vô nghĩa
165 GAA→TGA Glu→End Vô nghĩa
166 TCA→TGA Ser→End Vô nghĩa
Khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae hoang dại N16961 với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T1 phân lập được, nhận thấy chủng V.
cholerae T1 có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở nhiều codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein (Bảng 3.5 và Phụ lục 8). Chủng V. cholerae T1 có codon kết thúc ở 10 vị trí, tương ứng với 10 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai base, dẫn tới 1 stop codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi
- 44 -
polypeptid và các enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007). Năm 2012, Naha đã có báo cáo về đột biến dịch khung trong chuỗi trình tự chủng V. cholerae hoang dại N16961 và O395. Chủng V. cholerae N16961, O395 đều có codon dừng lại sớm tại vị trí 68, 79 và acid amin tương ứng 119. Trong nghiên cứu của Naha cũng cho thấy trình tự acid amin thuộc protein roi sinh độc tố (TCP) của
V.cholerae O1 type sinh học El Tor có liên quan đến sự bùng phát dịch tả ở Nepal (2012) khác với chủng tham khảo El Tor N16961 do một đột biến ở vị trí amino acid 64 (asparagin → Serine), sự thay đổi này có liên quan đến sự chuyển đổi di truyền gene TCP và là nguyên nhân của bệnh dịch tả lưu hành ở Nepal (Grim et al., 2010), sau đó là những báo cáo từ Haiti, cho thấy rằng kiểu gene này đang lan rộng trên toàn cầu (Reimer et al., 2011).
Bảng 3.6: So sánh vị trí các acid amin của chủng V. cholerae hoang dại N16961 với chủng V. cholerae T3
Codon Thay đổi Nucleotide
Thay đổi acid amin
Số nucleotid T3 mất
Kiểu đột biến
6 TAA→TGA End →End Thêm đoạn Dịch khung
14 AGT→CTG Ser→Leu 1 Sai nghĩa
17 TGA→ATC End→Ile 1 …..nghĩa
19 ACA→CCC Thr→Pro 1 Sai nghĩa
23 GAT→CTC Asp→Leu 3 Sai nghĩa
24 TCA→TAC Ser→Tyr 3 Sai nghĩa
32 AAC→ATC Asn→Met 1 Sai nghĩa
48 ACA→CGC Thr→Ala 1 Sai nghĩa
52 TGG→CTA Trp→Leu 1 Sai nghĩa
53 GAT→GCG Asp→Gly 3 Sai nghĩa
54 CTA→GCG Leu→Gly 3 Sai nghĩa
55 AAA→TAT Lys→Tyr 2 Sai nghĩa
63 GGA→GAA Gly→Glu 1 Sai nghĩa
71 GTT→GAG Val→Glu 2 Sai nghĩa
74 A-T→G- - → 2 Vô nghĩa
95 AAA →TGA Lys →End Thêm đoạn Vô nghĩa
100 ATT→TGA Ile→End ,, Vô nghĩa
106 GAA → TAA Glu→End ,, Vô nghĩa
124 GCA→TAA Ala→End ,, Vô nghĩa
161 GTA→TAA Val→End ,, Vô nghĩa
Tương tự với T1, khi so sánh các vị trí nucleotide chủng V. cholerae hoang dại N16961 với các vị trí nucleotide chủng V. cholerae T3phân lập được, nhận thấy chủng V. cholerae T3 cũng có hiện tượng đột biến là thêm hoặc mất từ 1- 3 nucleotide ở mỗi codon, dẫn đến hiện tượng thay đổi vị trí các acid amin và thay đổi cấu trúc protein (Bảng 3.6 và Phụ lục 9). Chủng V. cholerae T3 có codon kết thúc ở
- 45 -
6 vị trí, tương ứng với 6 vị trí acid amin, đây là một đột biến dịch khung do thêm vào hoặc bớt đi một đến hai base, dẫn tới 1 stop codon (end) điều đó sẽ làm ngừng tổng hợp chuỗi polypeptid và các enzyme này sẽ bị ngừng hoạt tính (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
Ở Thái Lan từ năm 2003 và năm 2004, các chủng phân lập có trình tự acid amin tương đồng 100% với trình tự acid amin của chủng tham khảo N16961. Tuy nhiên, trong năm 2007 và sau đó các chủng phân lập ở Thái Lan đã có một đột biến ở vị trí 64 của acid amin (Faruque et al., 2007), sự thay đổi tương tự ở vị trí 64 cũng được tìm thấy đối với chủng V. cholerae O1(ZJ65) phân lập ở Trung Quốc năm 2006 (GenBank, EU622532) và đối với chủng V. cholerae 2010 EL-1786 (GenBank CP003069) đã gây ra dịch bệnh gây tử vong ở Haiti (Reimer et al., 2011).
Điều đó cho thấy, những đột biến với nhiều hình thức đều là nguyên nhân cho những thay đổi về độc lực gây bệnh cũng như sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn V. cholerae. Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae T1, T3 mang gene kháng kháng sinh đều có các trình tự acid amin tương đồng với chủng tham khảo N16961, 2 chủng trên có những vị trí đột biến như sai nghĩa, đột biến dịch khung hoặc đột biến vô nghĩa, và như vậy sự biến đổi gene về kháng kháng sinh sẽ tiếp tục được truyền gene ngang giữa các loài với nhau và nguy cơ về bùng phát dịch có thể sẽ xảy ra.
3.3.5 Mối liên hệ qua cây phát sinh loài
Dựa vào kết quả giải trình tự các đoạn gene DKKS-T1-TraVinhVN-2014 và DKKS-T3-TraVinhVN-2014 thuộc vi khuẩn V. cholerae, so sánh với các trình tự tương đồng trên Genbank (BLAST), trong nghiên cứu này đã chọn ra những trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T1-TraVinhVN-2014 với các số hiệu: AB213657.1, EU263362.1, EU263363.1, EU263361.1, EU263360.1 và các trình tự tương đồng cao với trình tự đoạn gene DKKS-T3-TraVinhVN-2014 với các số hiệu: CP001235.1, AP014524.1, CP001233.1, CP003330.1, CP003069.1, CP001485.1, DQ772843.1, CP002555.1
- 46 -
Bảng 3.7: Các chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh sử dụng so sánh và phân tích với trình tự các chủng Vibrio cholerae: Gene DKKS-T1-TraVinhVN-2014 và Gene DKKS-T3-TraVinhVN-2014.
Chủng vi khuẩn Vibrio
cholerae
Nơi phân lập Năm phân lập Mẫu phân lập Mã số Genbank
Vibrio cholerae Gene
DKKS-T1-TraVinhVN
Trà Vinh VN 2012- 2014 Nước
Vibrio cholerae Gene
DKKS-T3-TraVinhVN
Trà Vinh VN 2012- 2014 Nghêu
Vibrio cholerae non-O1
vcmD
Japan 2005 AB213657.1
Vibrio cholerae O395
chromosome I
China 2008 Nước CP001235.1
Vibrio cholerae LMA3894-
4 (chr I)
Brazil 2011 Nước CP002555.1
Vibrio cholerae MS6 DNA Thailand-
Myanmar
2014 Phân bệnh nhân AP014524.1
Vibrio cholerae M66-2 chromosome I Indonesia: Makassar 2008 CP001233.1
Vibrio cholerae IEC224
chromosome I, "Brazil: Belem" 2012 CP003330.1 Vibrio cholerae O1 str. 2010EL-1786 Haiti 2010 Nước CP003069.1 Vibrio cholerae MJ-1236 chromosome 1 Bangladesh 2009 CP001485.1
Vibrio fluvialis MATE-
AshVFD69
India 2007 Phân bệnh nhân EU263361.1
Vibrio fluvialis MATE -
AshVFD53
India 2007 Phân bệnh nhân EU263360.1
Vibrio cholerae clone
FLH214558
USA 2006 DQ772843.1
Vibrio cholerae strain
N16961 MATE-VCD43
India 2007 Phân bệnh nhân EU263362.1
Vibrio cholerae strain
N16961 MATE-
India 2007 Phân bệnh nhân EU263363.1
Trong nghiên cứu này, 2 chủng V. cholerae phân lập tại Trà Vinh có mang gene mã hoá gene kháng tetracycline phân lập trên mẫu nước và mẫu nghêu có tỉ lệ tương đồng về trình tự nucleotide với các chủng khác ở Thái Lan, Nhật Bản, Trung quốc, Indonesia, Brazil và Ấn Độ, tương đồng 97% với 10 chủng; tương đồng 96% với 01 chủng và tương đồng 94% với 04 chủng (Bảng 3.8).
- 47 -
Bảng 3.8: Mức độ tương đồng đoạn gene kháng kháng sinh của V. cholerae (T1 và T3) với các trình tự trên Genbank bằng công cụ BLAST
Số hiệu gen Chủng Tổng số điểm Tỉ lệ che phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng
AB213657.1 Vibrio cholerae non-O1 vcmD 909 95% 0.0 97%
CP001235.1 Vibrio cholerae O395 (I) 1534 84% 0.0 97%
AP014524.1 Vibrio cholerae MS6 DNA, (I) 1534 84% 0.0 97%
CP001233.1 Vibrio cholerae M66-2 (I) 1534 84% 0.0 97%
CP003330.1 Vibrio cholerae IEC224 (I) 1534 84% 0.0 97%
CP003069.1 Vibrio cholerae O1 str. 2010EL-1786 1534 84% 0.0 97%
CP001485.1 Vibrio cholerae MJ-1236 (I) 1534 84% 0.0 97%
DQ772843.1 Vibrio cholerae clone FLH214558-USA- 1134 83% 0.0 97% CP002555.1 Vibrio cholerae LMA3894-4 chromosome I 1516 85% 0.0 96% EU263362.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE-
AshVCD43
832 95% 0.0 94%
EU263363.1 Vibrio cholerae strain N16961 MATE- AshVCD44
826 95% 0.0 94%
EU263361.1 Vibrio fluvialis MATE-AshVFD69 837 95% 0.0 94% EU263360.1 Vibrio fluvialis MATE -AshVFD53 837 95% 0.0 94%
- 48 -
Từ cây phát sinh loài đã thể hiện rõ về cơ chế tiến hóa liên quan đến các chủng kháng kháng sinh phân lập ngoài môi trường và từ thức ăn hải sản.
Kết quả cây phát sinh loài cũng chỉ ra rằng 2 chủng V. cholerae T1 và T3 phân lập từ nước sông tại Trà Vinh mang gene kháng kháng sinh có mối liên hệ gần về trình tự nucleotid (97%) với nhiều chủng V. cholerae khác như V. cholerae
M66 phân lập tại Indonesia năm 2008; chủng V. cholerae IEC224 phân lập tại