Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm sàng lọc khả năng sinh enzyme nattokinase của các chủng Bacillus mới được phân lập trong tự nhiên và thử nghiệm tạo sản phẩm gây tan huyết khối từ chủng chọn lọc.
BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ DOI: 10.15625/vap.2020.000108 SÀNG LỌC VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM GÂY TAN HUYẾT KHỐI TỪ VI KHUẨN Bacillus sp *Trần Ngọc Hùng Tóm tắt: Huyết khối nguyên nhân gây đột quỵ Các loại sản phẩm chứa enzyme nattokinase xem biện pháp hữu hiệu để phòng ngừa bệnh Trong số 11 chủng Bacillus khảo sát, chủng Ba 07 Ba 10 nuôi cấy bán rắn 48 cho hiệu gây tan huyết khối cao nhất, đạt 99,3 98,6% tỉ lệ pha loãng 25 lần, cao đáng kể so với nuôi cấy môi trường lỏng Sản phẩm thử nghiệm từ chủng Bacillus Ba 10 có hiệu suất tan huyết đạt 82% tỉ lệ pha loãng 50 lần, cao sản phẩm loại thị trường có hoạt tính ổn định sau tháng bảo quản nhiệt độ oC Từ khóa: Tan huyết khối lợn, nattokinase, Bacillus sp MỞ ĐẦU Đột quỵ bệnh nguy hiểm, có tỉ lệ tử vong biến chứng cao không cấp cứu kịp thời Một nguyên nhân gây nên đột quỵ huyết khối Huyết khối hình thành mạch máu khơng bị tổn thương, làm gián đoạn dòng chảy cắt đứt nguồn cung cấp oxy cho thể Các yếu tố tổn thương thành mạch, thay đổi tính chất dịng chảy, tính chất máu làm gia tăng nguy hình thành huyết khối (Trương Thị Minh Hạnh nnk., 2016) Vai trò làm tan huyết khối nattokinase nhà khoa học chứng minh nhiều thử nghiệm động vật thực nghiệm người Thêm vào đó, enzyme nattokinase an tồn liều cao không gây tác dụng phụ nghiêm trọng Đây lợi vượt trội so với thuốc hóa dược chống đơng máu khác aspirin warfarin Nguồn enzyme nattokinase thu nhận chủ yếu từ Bacillus subtilis (Haritha & Meena, 2011) Ở Nhật Bản, nhiều nghiên cứu cho đời sản phẩm phục vụ cho việc điều trị bệnh tai biến đột quỵ như: Nattokinase Orihiro, Ginkgo Natto, DHA Natto Q10, NattoEnzyme, NattoKan… Hầu hết sản phẩm dựa việc nuôi cấy từ chủng Bacillus subtilis Sản phẩm công ty dược nước chủ yếu sử dụng nguồn nhiên liệu ngoại nhập, điển Công ty CP Dược Hậu Giang nhập nguyên liệu nattokinase từ Công ty JBSL Nhật để sản xuất sản phẩm Những nghiên cứu nước khoảng gần mười năm trở lại đa dạng nội dung, từ nghiên cứu phân lập, sàng lọc, định danh đề tài tạo dòng thử nghiệm sản xuất Nổi bật kể tới nghiên cứu Lê Thị Bích Phượng (2012); Trần Quốc Tuấn (2014); Trương Thị Minh Hạnh (2016) hay Dương Thị Minh Phụng (2016) với đề tài nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất enzyme nattokinase từ đậu nành sản xuất viên thực phẩm chức nattokinase Nghiên cứu Trường Đại học Thủ Dầu Một Email: hungtngoc@tdmu.edu.vn PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 871 thực nhằm sàng lọc khả sinh enzyme nattokinase chủng Bacillus phân lập tự nhiên thử nghiệm tạo sản phẩm gây tan huyết khối từ chủng chọn lọc VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu Các chủng Bacillus: phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống, Phịng thí nghiệm Bộ mơn sinh học, Trường Đại học Thủ Dầu Một cung cấp Huyết khối: chợ Thủ Dầu Một chợ Đình thành phố Thủ Dầu Một, Bình Dương Chế phẩm NattoKan Cơng ty Sinh học Phương Nam sản suất, hàm lượng enzyme nattokinase đạt 600 FU/g Chế phẩm NattoEnzyme Công ty Cổ phần Traphaco sản xuất, viên chứa nattokinase 500 FU, Coenzym Q10 10 mg, Rutin 20 mg, Magnesoxyd 40 mg 2.2.Phương pháp nghiên cứu Phương pháp xác định khả sinh enzyme protease Dựa khả thủy giải casein cách đặc hiệu protease Trong trình phát triển, protease Bacillus sinh thủy giải casein tạo thành vòng phân giải suốt Các chủng vi khuẩn Bacillus thí nghiệm cấy điểm mơi trường định tính enzyme protease (casein g, glucose 0,05 g, pepton 0,2 g, NaCl g, K2HPO4 1,5 g, agar 15 g, nước vừa cho đủ L) Ủ 37 oC Sau ngày, 10 mL dung dịch TCA 5% thêm vào đĩa cấy để vòng phân giải rõ Phương pháp đánh giá khả tan huyết khối canh trường nuôi cấy lỏng Dịch chiết canh trường ni cấy Bacillus sp có chứa enzyme nattokinase làm tan cục huyết khối Khả làm tan huyết khối đánh giá thông qua lượng máu đông bị tan Trên môi trường lỏng: nuôi cấy chủng Bacillus sp mơi trường có thành phần: bột gạo 5%, bột đậu nành 4%, NH4NO3 0,5%, CaCl2 0,01%, pH 7,0 Sau 72 giờ, dịch chiết thu nhận cách ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút thời gian 10 phút Cho mL dịch chiết canh trường nuôi cấy vào đĩa petri vơ trùng có chứa g huyết lợn đông Ủ 37 oC, cân trọng lượng cục huyết lợn lại Lượng huyết tan cho thấy khả tan huyết khối dịch chiết (Lê Thị Bích Phượng cộng sự, 2012) Trên môi trường bán rắn: Chủng Bacillus sp chọn lọc cấy vào môi trường tăng sinh (giá đậu 100 g, glucose 50 g, pepton 10 g, nước cất vừa đủ L); sau 24 cấy dịch vào môi trường bán rắn (bắp xay 15 g, đậu nành 15 g, ZnSO4 0,000105 M, NaCl 0,108 M, MgSO4 0,015 M, KCl 0,03 M, (NH4)2HPO4 0,06 M, CaCO3 0,18 M, nước 45 mL) Giữ nhiệt độ phòng ngày (Trần Ngọc Hùng, 2010) Môi trường lên men dạng bột mịn pha loãng 50 lần nước cất, ly tâm thu dịch nhiệt độ oC thời gian 10 phút, tốc độ 5.000 vòng/ phút Hút mL dịch ly tâm cho vào đĩa petri vơ trùng có chứa g huyết khối Sau giờ, cân lại huyết khối đĩa petri để xác định hiệu suất làm tan huyết Nghiệm thức (NT) đối chứng tiến BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 872 hành với dịch ly tâm bất hoạt cách đun cách thủy 30 phút Hiệu suất tan huyết đánh giá theo công thức Hiệu suất tan huyết (%) = 𝑚0−𝑚1 𝑚0 × 100 Với, m0: Khối lượng cục huyết lợn ban đầu (2 g); m1: Khối lượng cục huyết lợn sau xử lý Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm tiến hành lặp lại lần Xử lý thống kê ANOVA phần mềm Stargraphic Centurion 15 2.3 Bố trí thí nghiệm Sàng lọc vi khuẩn Bacillus sp sinh protease môi trường thạch đĩa Cấy chủng Bacillus vào đĩa petri có chứa mơi trường định tính Ủ nhiệt độ phịng 30 oC, sau ngày, xác định đường kính vòng phân giải casein chủng Chọn lọc chủng có vịng phân giải casein lớn để tiến hành thử nghiệm khả tan huyết khối Đánh giá khả tan huyết khối canh trường nuôi cấy lỏng Nuôi cấy lắc chủng Bacillus môi trường lỏng Sau 72 giờ, thu nhận dịch chiết cách ly tâm Cho mL dịch chiết chủng vào đĩa petri có chứa g huyết lợn đông Ủ 37 oC, cân trọng lượng cục huyết lợn đơng cịn lại sau ủ Lượng huyết tan cho thấy khả tan huyết khối dịch chiết Chọn lọc chủng Bacillus sp có khả làm tan huyết khối tốt để thử nghiệm nuôi cấy môi trường bán rắn Đánh giá khả phân giải khả tan huyết khối canh trường nuôi bán rắn Các chủng Bacillus tăng sinh 24 Sau hút dịch tăng sinh cho vào môi trường bán rắn Ủ nhiệt độ phòng 30 oC, sau 48 72 giờ, thu nhận mơi trường lên men định tính khả làm tan huyết khối sản phẩm tỉ lệ pha loãng 25 lần Chọn lọc chủng Bacillus sp có khả làm tan huyết khối tốt để so sánh sản phẩm thị trường So sánh khả tan huyết khối chế phẩm bán rắn với số sản phẩm khác Môi trường nuôi cấy bán rắn chủng Bacillus sp chọn lọc pha loãng 25 50 lần, ly tâm thu dịch Cho vào đĩa petri có chứa g huyết khối mL dịch lọc Mỗi NT lặp lại lần Đối với chế phẩm thị trường: chế phẩm Nattoenzym thực độ pha loãng 50 100 lần; chế phẩm NattoKan đĩa petri chứa viên nhộng (0,5 g) hòa tan mL nước cất NT đối chứng thực với chế phẩm enzyme bị bất hoạt cách đun sôi cách thủy 30 phút Sau giờ, cân lại khối lượng huyết khối đánh giá hiệu suất làm tan huyết khối chế phẩm Bảng Hiệu suất làm tan huyết khối sản phẩm sau xử lý PHẦN II NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI Nội dung Sản phẩm Ba 10 bất hoạt Sản phẩm Ba 10 pha loãng 25 lần Sản phẩm Ba 10 pha loãng 50 lần Nattoenzyme pha loãng 50 lần Nattoenzyme pha loãng 100 lần NattoKan pha loãng 10 lần (0,5 g) 873 Nghiệm thức NT đối chứng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Đánh giá hoạt tính gây tan huyết chế phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm giàu nattokinase bảo quản nhiệt độ oC túi PE hàn kín miệng Sau tháng 12 tháng, sản phẩm đánh giá hiệu tan huyết khối sau xử lý so sánh với trước bảo quản KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sàng lọc vi khuẩn Bacillus sp sinh enzyme protease mơi trường thạch đĩa Đường kính vịng phân giải casein (mm) Cấy chủng Bacillus sp vào đĩa petri có chứa mơi trường định tính protease Ủ nhiệt độ phòng 30 oC, sau ngày, xác định đường kính vịng phân giải casein chủng thể Hình 14.0 b b 12.0 b 8.0 6.0 ac a bd bd 10.0 ac a a 4.0 e 2.0 0.0 Ba01 Ba02 Ba03 Ba04 Ba05 Ba06 Ba07 Ba08 Ba09 Ba10 Ba79 Chủng Bacillus Hình Biểu đồ thể đường kính vịng phân giải casein chủng Bacillus sp Các ký tự khác cột biểu thị sai khác độ tin cậy 95% (P ... tan huyết khối sản phẩm tỉ lệ pha loãng 25 lần Chọn lọc chủng Bacillus sp có khả làm tan huyết khối tốt để so sánh sản phẩm thị trường So sánh khả tan huyết khối chế phẩm bán rắn với số sản phẩm. .. tính gây tan huyết chế phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm thử nghiệm bảo quản oC Hiệu gây tan huyết đánh giá sau tháng 12 tháng với nhiều tỉ lệ pha loãng chế phẩm khác Hiệu suất tan huyết khối. .. khả gây tan huyết, sở cho nghiên cứu liên quan đến đặc tính enzyme nattokinase từ chủng So sánh khả tan huyết khối sản phẩm bán rắn với số sản phẩm khác Hiệu suất tan huyết (%) Chế phẩm thử nghiệm