Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát và ứng dụng kỹ thuật Cleas cố định Enzyme Lipase

MỞ ðẦU Hiện nay, enzyme lipase có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong phản ứng tổng hợp hữu cơ, sản xuất biodiesel, biosensor…ðể ñạt ñược ñiều này, yêu cầu ñầu tiên ñối với enzyme là chúng

TỔNG QUAN

Enzyme lipase

Lipase (EC 3.1.1.3), a serine hydrolase enzyme, belongs to the α/β hydrolase superfamily This enzyme catalyzes the hydrolysis of ester bonds in triacylglycerols, without the need for cofactors.

Enzim lipase có vai trò then chốt vì khả năng xúc tác phản ứng tại bề mặt phân chia giữa pha dầu và nước Lipase có mặt rộng rãi trong tự nhiên, tham gia vào quá trình chuyển hóa lipid Ngoài xúc tác phản ứng trong môi trường nước, lipase còn có khả năng xúc tác phản ứng không cần nước, khiến nó trở nên quan trọng trong công nghiệp thương mại.

Lipase cú thể thu nhận ủược từ nhiều nguồn khỏc nhau như ủộng vật, thực vật và vi sinh vật, ủặc biệt từ vi khuẩn và nấm Tuy nhiờn, lipase từ thực vật khụng ủược sử dụng rộng rói trong thương mại như lipase ủộng vật và vi sinh vật

Nguồn lipase thu từ ủộng vật quan trọng nhất là từ tụy tạng bũ, heo, cừu

Lipase từ tụy tạng là một trong những lipase ủược biết sớm nhất và khỏ thụng dụng

Những enzyme này ủược tiết ra ở tỏ tràng xỳc tỏc cho sự thủy phõn triglyceride

Bản chất của loại lipase này là glycoprotein, phân tử lượng 50 kDa, không có hoặc cú ớt hoạt tớnh ủối với phospholipid và ủược hoạt húa ở bề mặt phõn cỏch pha dầu – nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật

Lipase thu ủược từ thực vật ớt ủược quan tõm Nguồn lipase thu ủược chủ yếu từ những hạt có dầu

Lipase thu được từ vi sinh vật có ứng dụng thương mại và công nghiệp rộng rãi Các nguồn vi sinh vật sản xuất lipase ngoại bào bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Lipase ngoại bào là loại enzyme được tiết ra ngoài tế bào vi sinh vật, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thu nhận và ứng dụng.

Bảng 1.1 Nguồn thu nhận enzyme lipase

Nguồn ðối tượng thu nhận ðộng vật Tụy tạng bò, cừu, lợn

Thực vật Hạt cây thầu dầu

Rhizopus oryzae Aspergillus niger Geotrichium candium Rhizopus delemmar

Candida cylindracea Candida parapsilosis Torulopsis spp

1.1.3 Cấu trúc và khối lượng phân tử

Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ tuến tụy của người ủó ủược xỏc ủịnh vào năm 1990, từ ủú ủến nay cú hơn 11 cấu trỳc lipase nữa ủược xỏc ủịnh Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả cỏc lipase cũn lại ủều từ vi sinh vật Cỏc lipase này cú khối lượng phõn tử (19 – 60) kDa, ủều biểu hiện ủặc tớnh xoắn cuộn như xoắn α/β-hydrolase Lừi trong của lipase ủược cấu thành từ phiến β trung tõm bao gồm 8 chuỗi β khỏc nhau (β1 – β8) nối với 6 xoắn α (A – F) a) b)

Hình 1.1 Cấu trúc enzyme lipase a) Mô hình cấu trúc enzyme lipase b) Cấu trúc 3D của enzyme lipase từ P.aeruginosa

Hiện nay, nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu cấu trúc của lipase Trong đó, cấu trúc ba chiều của lipase được coi là cơ sở để hiểu được phản ứng động học, đặc hiệu cơ chất, dự đoán những đặc điểm sinh học và hoạt động của lipase tại bề mặt phân cách của pha dầu - nước Lipase từ nguồn vi sinh vật có tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm và chăm sóc sức khỏe Tuy nhiên, hiểu biết về cấu trúc của lipase vẫn còn hạn chế, gây khó khăn cho việc thiết kế và cải tiến các ứng dụng của lipase.

Rhizomucor miehei là enzyme thủy phõn ủầu tiờn cú cấu trỳc bậc banner ủược xỏc ủịnh bởi phương phỏp tia X

Khi nghiờn cứu về cấu trỳc lipase dựng phương phỏp tia X ủó phỏt hiện cấu trỳc α/β Liờn kết β song song làm cầu nối với cấu trỳc xoắn ốc α ủể hỡnh thành cấu trỳc phức tạp Cỏc cầu nối disulphur ủược tỡm thấy trong phõn tử lipase cú lẽ nhằm làm ổn ủịnh cấu trỳc gấp nếp của enzyme Trong cấu trỳc này protein hỡnh cầu chứa một nhân kị nước tạo nên một chuỗi không cực có ý nghĩa quan trọng cho sự ổn ủịnh phõn tử Bờn cạnh ủú cũn cú vài nhúm cú cực và những phõn tử ủược liờn kết

Sự cú mặt của những phõn tử nước ủó làm tăng lực liờn kết Van der waals và lực phõn tỏn trong trung tõm hoạt ủộng Vỡ vậy sự ổn ủịnh về cấu trỳc khụng gian của phõn tử enzyme ủược tăng lờn

Tõm hoạt ủộng của lipase gồm 3 acid amin: serine, histidine và aspartate/glutamate Phớa trờn trung tõm hoạt ủộng cú vựng kị nước ủược hỡnh thành sau khi lipase ủược hoạt húa Sự hiện diện của serine ở tõm hoạt ủộng ủược xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide Gly (Ala) – Xaa – Ser – Xaa – Gly

Các lipase cóc đều có tính chất chung, nhưng khác nhau về một số tính chất như tính đặc hiệu cơ chất, độ phóng giải cơ chất, khối lượng phân tử, thành phần acid amin và điều kiện hoạt động Sự khác nhau này không chỉ giữa các loài mà ngay cả giữa các chủng trong cùng một loài.

Khối lượng phõn tử của lipase dao ủộng khỏ nhiều giữa cỏc chủng vi sinh vật :

Candida rugosa cú 2 ủồng phõn là LipA (58kDa) và LipB (62kDa), Geotrichum

1.1.4 Khả năng xỳc tỏc và tớnh ủặc hiệu của lipase

1.1.4.1.Khả năng xúc tác của enzyme lipase

Lipase (triacylglycerol acylhyrolase – EC 3.1.1.3) xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết ester trên chất nền lipid không tan trong nước Lipase thực hiện chức năng cần thiết trong việc tiêu hóa, vân chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống

Enzyme này cắt ủứt liờn kết ester giữa glycerol và acid bộo do ủú phõn giải cỏc lipid ủó nhũ tương húa thành acid bộo và glycerol Lipase cú khả năng xỳc tỏc cho nhiều phản ứng khác nhau gồm: phản ứng thủy phân, ester hóa, chuyển hóa ester, acid húa, rượu húa và amin húa Trong số cỏc phản ứng trờn, ủược quan tõm nhiều nhất là phản ứng thủy phân, chuyển hóa ester, acid hóa và rượu hóa ðặc biệt lipase dựng trong việc xỳc tỏc tạo ester mới, những ester ủược tạo bởi chuỗi acid bộo ngắn ủược dựng làm chất tăng hương vị trong cụng nghiệp thực phẩm và những ester ủược tạo bởi chuỗi acid bộo dài với gốc methyl hay ethyl ủược dựng làm nhiờn liệu sinh học

1.1.4.2 Tớnh ủặc hiệu của lipase

Sự ủặc hiệu của lipase ủược kiểm soỏt bởi những ủặc tớnh phõn tử enzyme

Cấu trỳc của cơ chất và những nhõn tố ảnh hưởng ủến việc gắn enzyme với cơ chất

Cỏc loại ủặc hiệu của lipase gồm: cơ chất, vị trớ, acid bộo

Mỗi loại lipase thu nhận từ vi sinh vật sẽ cú cỏc vi trớ cắt ủặc hiệu Một số lipase có ái lực cao với các chuỗi acid ngắn ( acid acetic, acid butyric, acid caproic…) Một số lại có ái lực với các acid béo chưa bão hòa (acid oleic, acid linoleic, acid linolenic…) Ngoài ra, một số khỏc khụng ủặc hiệu về cơ chất và cú vị trớ phõn cắt ngẫu nhiờn Vỡ vậy, dựa vào tớnh ủặc hiờu, người ta chia lipase thành 3 nhóm:

Nhúm thứ nhất gồm những enzyme khụng ủặc hiệu vị trớ hoặc cấu trỳc gốc acyl trên mạch triglyceric như lipase từ Candida cylindracea và Staphylococcus aureus

Nhúm thứ hai ủược xem là nhúm quan trọng nhất bao gồm những enzyme xỳc tỏc ủặc hiệu vị trớ 1 và 3 trờn phõn tử triglyceride Trong ủú thụng dụng là lipase từ A.niger,A.oryzae, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi

Kỹ thuật CLEAs

CLEAs (Cross-linked enzyme aggregates) là phương phỏp cố ủịnh enzyme ủơn giản, dễ tối ưu húa, chớ phớ thấp và thời gian cố ủịnh ngắn, cú nhiều ưu ủiểm khi ứng dụng trong sản xuất cụng nghiệp Quỏ trỡnh cố ủịnh bao gồm tủa enzyme từ dịch nổi lờn men hay trong dung dịch ủệm bằng dung mụi hữu cơ, muối vụ cơ hay polymer… Sau ủú, cỏc enzyme sẽ ủược liờn kết với nhau bằng tỏc nhõn tạo liờn kết chéo như glutaraldehyde hoặc PEI tạo thành dạng không hòa tan (hình 1.2) Phương phỏp này cú khả năng ứng dụng cố ủịnh nhiều loại enzyme khỏc nhau, CLEAs enzyme cú ủộ ổn ủịnh và khả năng tỏi sử dụng với hoạt tớnh giữ lại cao [4]

Hỡnh 1.2 Nguyờn tắc cố ủịnh enzyme bằng kỹ thuật CLEAs

Trỏi ngược với kỹ thuật CLECs yờu cầu enzyme cố ủịnh phải ở dạng tinh khiết, CLEAs cú thể ủồng cố ủịnh hai hay nhiều enzyme với nhau hoặc cú lẫn cỏc protein tạp Ngoài ra, ủể gia tăng hoạt tớnh hay tớnh chọn lọc lập thể ủối với cơ chất cho enzyme cố ủịnh thỡ trong quỏ trỡnh cố ủịnh ủược bổ sung với cỏc chất bổ trợ, cú

Tạo liên kết chéo Tủa vai trũ bảo vệ hay biến ủổi cấu trỳc enzyme Vớ dụ CLEAs lipase cố ủịnh với cỏc chất bổ trợ thường ủược bổ sung như BSA, Tween 80, Triton X-100…[5]

So với phương pháp bất động hóa enzyme truyền thống, phương pháp CLEAs có ưu điểm là quá trình bất động hóa đơn giản và không yêu cầu enzym có độ tinh khiết cao Trên thực tế, CLEAs là sự kết hợp của quá trình tinh sạch và bất động hóa enzyme, có thể thực hiện bất động hóa trực tiếp từ dịch sau lên men để loại sinh khối Điều này có lợi ích là làm giảm thời gian sản xuất và hạ giá thành enzyme Phương pháp này áp dụng được với nhiều loại enzyme khác nhau, giúp thuận tiện trong khâu thu hồi và tái sử dụng enzyme bất động hóa.

Nhờ vào liờn kết chộo giữa cỏc enzyme sẽ hạn chế ủược sự tự phõn của enzyme và tăng sự ổn ủịnh của enzyme khi tiếp xỳc với nhiệt hay trong dung mụi hữu cơ Với CLEAs khi cố ủịnh khụng chỉ một enzyme mà cú thể là một phức hệ nhiều enzyme ủể xỳc tỏc trong cỏc chuỗi phản ứng [4][5]

Kớch thước là tớnh chất quan trọng của bất kỳ sản phẩm enzyme cố ủịnh khi ứng dụng vào trong sản xuất cụng nghiệp, tỏc ủộng trực tiếp lờn sự linh ủộng và thu hồi chất xỳc tỏc Cỏc enzyme cố ủịnh theo kỹ thuật CLEAs cú kớch thước phổ biến từ 5-50àm, do ủú khi sử dụng và thu hồi CLEAs thỡ phự hợp với quy trỡnh sản xuất theo mẻ Trỏi ngược với cỏc enzyme cố ủịnh trờn chất mang rắn, enzyme cố ủịnh cú thể bị mất hoạt tính hoàn toàn do hiện tượng khuếch tán giới hạn Tuy nhiên, CLEAs cú cấu trỳc siờu lỗ, nờn sẽ trỏnh ủược hiện tượng khuếch tỏn giới hạn khi sử dụng trong các phản ứng chuyển hóa sinh học như tổng hợp hợp chất hữu cơ

Ngược lại, trong cỏc thớ nghiệm xỏc ủịnh hoạt tớnh enzyme theo phương phỏp quang phổ (OD), thỡ tốc ủộ phản ứng xảy ra nhanh Vỡ vậy, khi xỏc ủịnh hoạt tớnh enzyme cố ủịnh theo kỹ thuật CLEAs cần thận trọng vỡ cú thể kết luận sai lầm về hoạt tớnh của các CLEAs enzyme thấp cho các phản ứng sinh học thực tế [4]

Tốc ủộ khuếch tỏn thỡ bị ảnh hưởng bởi kớch thước CLEAs, quyết ủịnh bằng tỷ số tác nhân tạo liên kết chéo trên enzyme [6] Nhưng kích thước tối ưu của các CLEAs enzymelại thường cú kớch thước nhỏ hơn kớch thước của lỗ lọc Do ủú, khi cố ủịnh cần phải hũa hợp giữa hoạt tớnh và kớch thước khối enzyme cố ủịnh Kớch thước CLEAs bị ảnh hưởng chủ yếu bởi tỷ số tác nhân liên kết với enzyme, có thể ủược tăng lờn Bởi vỡ quỏ trỡnh tạo liờn kết chộo giữa enzyme và tỏc nhõn tạo liờn kết khụng dừng lại khi phản ứng tạo liờn kết kết thỳc Tuy nhiờn, ở ủiều kiện hoạt ủộng liờn tục trong thiết bị dạng thỏp ủệm yờu cầu cần cú kớch thước lớn ủể trỏnh giảm áp suất lớn trên toàn cột Một giải pháp, nhốt CLEAs enzyme trong polyvinyl alcohol (ủược gọi là Lentikats) Mặc dự làm giảm một phần hoạt tớnh CLEAs enzyme nhưng mang lại ủộ bền cơ học và cú kớch thước lớn hơn [4][7] Tuy nhiờn, vấn ủề này ủược khắc phục khi sử dụng thiết bị dạng thỏp tầng sụi, cỏc CLEAs enzyme cú kớch thước nhỏ, hoạt tớnh cao, cần phải cú khối lượng riờng ủủ lớn ủể chỳng khụng bị thổi bay ra khỏi cột phản ứng Gần ủõy, phỏt triển kỹ thuật CLEAs từ tính thích hợp với thiết bị kiểm soát từ tính (magnetically stabilized bed) Bên cạnh cỏc ưu ủiểm như khả năng thu hồi, kiểm soỏt, tỏi sử dụng, cũng như ủộ bền, tỷ trọng , ủộ cứng của khối CLEAs, ngoài ra cú thể thay ủổi kớch thước và tớnh kỵ nước bằng cỏch thay ủổi thành phần silica-CLEAs [4]

Cỏc cấu trỳc CLEAs enzyme ủược nghiờn cứu dưới kớnh hiển vi ủiện tử, cấu trỳc CLEAs chủ yếu ở hai dạng Dạng CLEAs ủược hỡnh thành từ enzyme Candida antarctica lipase B (hỡnh1.3), ớt bị glycosyl húa và tớnh kỵ nước cao, ủường kớnh khối khoảng 1 Khi thực hiện CLEAs với enzyme CaLB (5x5x5nm) thì mỗi khối CLEAs chứa tối ủa 8*106 phõn tử enzyme Với cỏc khối kết tụ từ enzyme dễ bị glycosyl hóa trên bề mặt hay bề mặt ưa nước lớn thì kích thước khối CLEAs sẽ nhỏ hơn với ủường kớnh khoảng 0.1 àm, là dạng thứ 2 (hỡnh 1.4) chứa tối ủa khoảng 8*103 phân tử enzyme Ví dụ như enzyme Candida rugosa lipase và Prunus amygdalus R-oxynitrilase Các enzyme này có dễ glycosyl hóa nên bề mặt enzyme có tính ưa nước cao hơn Mặc dù dạng 1 có số lượng phân tử enzyme lớn hơn hàng ngàn lần so với dạng 2 nhưng khi ở ủiều kiện tối ưu cả 2 dạng CLEAs gúp phần tăng hoạt tớnh tự nhiờn của enzyme Bởi vỡ, mật ủộ phõn tử CLEAs enzyme cao hơn so với protein tự do trong dung dịch và sự khuếch tỏn hạn chế ủặc biệt trong phản ứng xảy ra nhanh [8] Trong quỏ trỡnh thu nhận enzyme cố ủịnh bằng kỹ thuật CLEAs xảy ra hiện tượng kết khối giữa các CLEAs enzyme có thể kết thành các khối lớn (hỡnh 1.5) cú thể tỏc ủộng ủến sự linh ủộng của khối CLEAs Kớch thước của cỏc khối này cú thể ủạt ủến 100àm, cú thể nhỡn thấy bằng mắt thường Số lượng CLEAs trong mỗi khối cũng khụng ủồng ủều từ một vài ủến vài trăm ngàn Khi thu nhận bằng phương phỏp ly tõm ủể tỏch CLEAs làm tăng hiện tượng kết khối CLEAs [8]

Hình 1.3 Cấu trúc khối CLEAs Candida Antarctica lipase A/B

Hình 1.4 Cấu trúc khối CLEAs Candida rugosa lipase

Hình 1.5 Khối CLEAs Candida Antarctica lipase A/B trong nước

1.2.4 ðộ ổn ủịnh CLEAs enzyme

Một trong những lý do chớnh ủể cố ủịnh enzyme ủể gúp phần làm tăng ủỏng kể sự ổn ủịnh của enzyme trước tỏc ủộng của nhiệt cũng như dung mụi hữu cơ Bằng cỏch giảm sự biến ủổi cấu trỳc, phõn ly cỏc tiểu ủơn vị hoặc cỏc tương tỏc yếu bị mất, ủể bảo vệ cấu trỳc bậc bốn cần thiết cho hoạt tớnh enzyme Kỹ thuật CLEAs là kỹ thuật cố ủịnh enzyme rất cú hiệu quả trong việc ổn ủịnh cấu trỳc bậc bốn của enzyme ở nhiệt ủộ cao Hỡnh 1.6, thớ nghiệm của Sorgedrager và cộng sự khảo sỏt sự ổn ủịnh nhiệt của enzyme papain (protease từ Carica papaya) Sự ổn ủịnh của enzyme CLEAs papain, trong thủy phân N-Bz-Arg-OEt ở pH 7 và 50°C, có sự ổn ủịnh cao hơn so với enzyme papain tự do [4]

Một ủặc tớnh chung của cỏc enzyme ủa tiểu ủơn vị cú khả năng chịu nhiệt yếu khi ở ngoài tế bào do cỏc tiểu ủơn vị dễ bị phõn ly mà dẫn ủến mất hoạt tớnh Vớ dụ, enzyme Nitrile hydratase (NHase) thuộc nhóm enzyme quan trọng ứng dụng trong cụng nghiệp cú ủặc trưng cú sự ổn ủịnh kộm khi ở ngoài tế bào [9] Do ủú, cỏc sản phẩm chuyển hóa trung gian của enzyme NHase như acrylamide và nicotinamide từ cơ chất nitrile, bị giới hạn trong cỏc chuyển húa nội bào Cố ủịnh enzyme nitrile hydratase thu nhận từ vi khuẩn ưa kiềm Nitriliruptorakaliphilus bằng kỹ thuật

CLEAs ủược minh chứng cú tỏc ủộng tăng sự ổn ủịnh trong quỏ trỡnh bảo quản so với enzyme tự do (hình 1.7) [4][10]

Papain (protease từ C papaya) ủược ủ ở 50 0 C và pH 7 Hoạt tính giữ lại khảo trên phản ứng thủy phân N-Bz-Arg-OEt

Hình 1.6 Sự bền nhiệt của CLEAs papain

Hỡnh 1 7 Sự ổn ủịnh của enzyme NHase khi bảo quản ở 21 0 C

Một trong những ưu ủiểm của enzyme cố ủịnh là dễ dàng thu hồi từ mụi trường phản ứng và tiếp tục tỏi sử dụng, giỳp làm ủơn giản quỏ trỡnh sản xuất và giảm tỏc ủộng chi phớ enzyme ủến giỏ thành sản phẩm Theo cỏc nghiờn cứu trước ủõy, CLEAs cú khả năng tỏi sử dụng cao Vớ dụ, enzyme CLEAs (R)-oxynitrilase, thu nhận từ Prunusamygdalus, sau mười lần tái sử dụng chuyển hóa acid hydrocyanic thành o-chlorobenzaldehyde (hình 1.8) nhưng hoạt tính CLEAs enzyme vẫn khụng suy giảm [4][11] Tương tự, enzyme NHase–CLEAs trờn ủược tỏi sử dụng 36 lần ủể hydrat húa n-hexyl cyanide [9] Nhưng vấn ủề là sự mất tớnh chọn lọc của enzyme do tỏc ủộng cơ học, ủiều này chắc chắn xảy khi bổ sung nhỏ giọt dịch nổi sau khi tách CLEAs enzyme [4]

Hình 1.8 Tái sử dụng CLEAs (R)-hydroxynitrile lyase trong o-chlor-obenzaldehyde hydrocyanic

Số lần tái sử dụng

Một ưu ủiểm khỏc của kỹ thuật CLEAs là dễ dàng thu hồi từ mụi trường phản ứng

Trái ngược với enzyme tự do, CLEAs enzyme dễ dàng thu hồi bằng phương pháp ly tõm hoặc lọc Kớch thước của CLEAs hay khối CLEAs sẽ quyết ủịnh sự thành cụng của quỏ trỡnh lọc Với cỏc khối CLEAs lớn dễ dàng ủược lọc trờn phễu lọc thậm chớ cú thể lọc ủược ngay cả trờn phễu lọc thủy tinh cú lỗ lớn với cỏc CLEAs ủơn cú kớch thước àm cú thể lọc trờn màng MW nhỏ Cỏc khối CLEAs cú kớch thước trung bỡnh thường ủược tỏch bởi cỏc phễu lọc cú ủường kớnh lỗ ở mức àm Khi thực hiện lọc CLEAs với cỏc phễu lọc cú kớch thước từ 0.2 ủến 5àm, Candida antarctica lipase CLEAs cú kớch thước 1àm khụng ủược thu hồi với cỏc phễu lọc cú kớch thước từ 1 ựến 5ộm đáng ngạc nhiên hơn, CLEAs Candida antarctica lipase vẫn khụng thể ủược thu hồi khi lọc với phễu lọc cú kớch thước 0.2 àm ðiều này chứng minh về tớnh co giản của khối enzyme cố ủịnh theo kỹ thuật CLEAs, và mỗi enzyme trong khối CLEAs cú một sự tự do di chuyển nhất ủịnh mà khụng cứng nhắc gúp phần tăng hoạt tớnh enzyme cố ủịnh Thu hồi CLEAs enzyme nhỏ hơn như CLEAs

Candida rugosa lipase chịu tỏc ủộng của hiện tượng kết khối CLEAs Candida rugosa lipase cú kớch thước thụng thường 0.1 àm nhưng lại cú thể ủược lọc bởi cỏc phễu lọc 0.5àm Mặc dự, phễu lọc polypropylene cú thể bị nghẹt hoàn toàn, nhưng phễu lọc cú thể thực hiện ủược với phễu lọc Zeta Plus, giỳp thu hồi và ủúng bỏnh enzyme cố ủịnh tốt hơn Do ủú, kiểm soỏt ủược kớch thước của quỏ trỡnh kết khối sẽ kiểm soỏt ủược quỏ trỡnh lọc của CLEAs [8]

Trong công nghiệp sản xuất dược phẩm và hóa chất tinh khiết có ứng dụng enzyme cố ủịnh quy trỡnh sản xuất thường ỏp dụng theo dạng từng mẻ, sau phản ứng enzyme cố ủịnh ủược thu hồi bằng quỏ trỡnh lọc hoặc ly tõm Cỏc nghành cụng nghiệp khỏc cú quỏ trỡnh chuyển húa dầu và mỡ, thiết bị dạng thỏp ủệm sử dụng enzyme cố ủịnh theo kỹ thuật CLEAs thớch hợp với mụ hỡnh sản xuất liờn tục Vấn ủề thường ủược quan tõm là cõn bằng kớch thước khối CLEAs enzyme ủể trỏnh sự giảm áp suất lớn trên toàn tháp hay xảy ra với khối CLEAs enzyme nhỏ nhưng vẫn ủảm bảo hoạt tớnh cao hơn khi sử dụng khối CLEAs enzyme cú kớch thước lớn bị hiện tượng khuếch tán giới hạn ðối với thiết bị tầng sôi có thể sử dụng CLEAs enzyme cố ủịnh cú kớch thước nhỏ nhưng chỳng phải ủược giữ ở trong “lồng”, một bộ phận của thiết bị Thiết bị dạng này ứng dụng rất thành công khi sử dụng CLEAs penicillin amidase ủể thủy phõn liờn tục penicillin G [10] ðiều ủỏng quan tõm hiện nay phát triển CLEAs từ tính bằng cách bổ sung hạt nano có từ tính vào quá trình cố ủịnh Bằng cỏch này CLEAs enzyme từ tớnh sẽ ủược thu hồi, sử dụng và kiểm soỏt dễ dàng bằng thiết bị kiểm soát từ tính [4]

1.2.6 Ứng dụng của kỹ thuật CLEAs

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu và hóa chất

2.1.1.Vật liệu Giống Bacillus subtillis (Viện kiểm nghiệm Hà Nội ) ( Xem thêm phụ lục 2) Tụy tạng heo mới ủược giết mổ, tại chợ Gũ Xoài

2.1.2.Hóa chất Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng

Glutaraldehyde 25%(w/v) Merck ðệm Tris HCl Merck

Tween 20, Cồn 96 0 , Muối ammoni sulphate, acetone Phòng thí nghiệm CNSH

2.1.3.Thiết bị Máy ly tâm, Máy lắc lạnh , Máy quang phổ , Cân phân tích

Phương pháp

Hoạt tớnh enzyme lipase ủược xỏc ủịnh theo phương phỏp ủo ủộ ủục của Richar và Sheila sử dụng cơ chất là Tween 20 (ester của acid lauric) [54]

Nguyờn tắc: Hỗn hợp 3.6 ml Tween 20 2% (v/v) trong dung dịch ủệm Tris HCl 20mM pH 7, 0.1ml dung dịch CaCl2 120 mM pha trong dung dịch ủệm Tris HCl 20mM pH 7, 0.3ml dung dịch enzyme ủược ủ ở 40 0 C trong bể lắc ổn nhiệt trong 30 phỳt Trong thớ nghiệm này, Tween 20 ủược thủy phõn bởi enzyme lipase, tạo acid béo và rượu Acid béo tạo tủa với Ca 2+ trong dung dịch, thông qua cơ chế này ta sẽ xỏc ủịnh ủược hoạt tớnh enzyme lipase thụng qua ủộ ủục bằng OD 500nm

Hoạt tớnh enzyme (UI/ml) là àg lipase/ml tham gia xỳc tỏc chuyển húa giải phúng phức acid bộo-canxi 1 UI/ml tương ủương với ủộ ủục tăng lờn 0.01 OD 500 nm [55] ðơn vị hoạt tớnh enzyme (UI/ml) = (từ 1ml dung dịch mụi trường ban ủầu) Hiệu suất cố ủịnh 2.2.2.Phương phỏp cố ủịnh Qui trỡnh cố ủịnh:

Hỡnh 2.1 Qui trỡnh cố ủịnh enzyme từ vi sinh vật bằng phương phỏp CLEAs

Tủa Thu dịch Giống vi sinh vật, nhân giống Nuôi cấy trên môi trường thu enzyme

Hỡnh 2.2 Qui trỡnh cố ủịnh enzyme từ tụy tạng heo bằng phương phỏp CLEAs

Dịch enzyme sau khi thu nhận ủược lọc,ly tõm ủể loại bỏ cỏc tạp chất, thu dịch nổi ủể thực hiện CLEAs

Hút 2ml dịch nổi enzyme cho vào ống ly tâm 50ml, tiếp tục bổ sung nhỏ giọt 2ml tác nhân tủa (cồn, acetone,dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa) vào dung dịch enzyme Sau ủú bổ sung tiếp tỏc nhõn tạo liờn kết chộo là Glutaralaldehyde 25%

(w/v) Quỏ trỡnh cố ủịnh ủược thực hiện ở ủiều kiện lắc 160 vũng/phỳt và ở nhiệt ủộ 4 0 C Sau 2 giờ cố ủịnh CLEAs lipase ủược thu nhận bằng cỏch ly tõm 5000 vũng/phỳt trong thời gian 10 phỳt Dịch nổi ủược loại bỏ và tủa CLEAs lipase ủược

Tụy tạng heo Xay nhuyễn, cân

Tủa Cố ủịnh Lọc thu dịch enzyme Lọc thu dịch enzyme thô

Tủa rửa lại 2 lần với 4ml dung dịch ủệm Tris HCl 20mM, pH 7.5 và ly tõm 5000/phỳt

CLEAs lipase ủược bảo quản ở 4 0 C.

Bố trí thí nghiệm

Tiến hành thớ nghiệm trờn enzyme lipase thu ủược từ dịch nuối cấy vi sinh vật và dịch thu ủược từ tụy tạng heo

2.3.1 Khảo sát tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs Mục tiờu: Xỏc ủịnh tỏc nhõn tủa dựng trong kỹ thuật CLEAs cố ủịnh enzyme lipase với hoạt tính giữ lại của enzyme là cao nhất

Bố trí thí nghiệm Khảo sát với ba tác nhân tủa cơ bản: acetone, cồn, muối amoni sulphate bão hòa Thí nghiệm thực hiện theo quy trình trên với các thông số thí nghiệm Venzyme/V tác nhân tủa :1/1/2; 1/1; 1/2; 1/3; 1/4

2.3.2 Khảo sát tỉ lệ tác nhân tủa trong kỹ thuật CLEAs Mục tiờu: xỏc ủịnh tỷ lệ tỏc nhõn tủa tối ưu từ thớ nghiệm 1 với hoạt tớnh giữ lại cao nhất

Bố trí thí nghiệm Quy trình thí nghiệm như trên nhưng khảo sát các tỷ lệ thể tích tác nhân tủa Venzyme/V tác nhân tủa : 1/1/2; 1/1; 1/2; 1/3;1/4

2.3.3 Khảo sát tỉ lệ glutaraldehyde Mục tiờu: tỡm tỷ lệ nồng ủộ tối ưu glutaraldehyde tạo liờn kết chộo cho hoạt tính giữ lại của enzyme là cao nhất

Quy trỡnh cố ủịnh Quy trỡnh thớ nghiệm như trờn nhưng khảo sỏt ở nồng ủộ 25%(w/v) ở các tỷ lệ Venzyme/V glutaraldehyde: 1/1/2; 1/1; 1/2; 1/3;1/4

2.3.4 Khảo sỏt thời gian cố ủịnh Mục tiờu: xỏc ủịnh thời gian cố ủịnh ủể hoạt tớnh enzyme cố ủịnh giữ lại là cao nhất

Quy trỡnh thớ nghiệm :Quỏ trỡnh cố ủịnh ủược thực hiện như trờn nhưng sẽ thực hiện ở các thời gian: 30 phút, 60 phút, 90 phút,120 phút, 150 phút và 180 phút

2.3.5 Khảo sỏt khả năng hoạt ủộng của CLEAs lipase Mục tiờu: kiểm tra khả năng ổn ủịnh trước nhiệt của CLEAs lipase vừa cố ủịnh

Quy trình thực nghiệm được thiết lập để đánh giá hoạt tính của enzyme cố định và enzyme tự do Các mẫu CLEAs được ủ ở nhiệt độ 40°C trong thời gian khác nhau (15, 30, 45, 60, 90, 120 phút) Song song, các mẫu đối chứng được sử dụng để xác định hoạt tính của enzyme tự do Sau khi ủ, hoạt tính giữ lại của enzyme cố định và enzyme tự do được xác định để so sánh sự ổn định của các loại enzyme trong điều kiện phản ứng cụ thể.

2.3.6 Khảo sát khả năng tái sử dụng của CLEAs lipase Mục tiờu: khảo xỏc khả năng tỏi sử dụng của enzyme cố ủịnh bằng kỹ thuật

Quy trình thí nghiệm CLEA: Khảo sát trên cơ chất Tween 20, sau 30 phút thủy phân Tween 20, CLEA lipase được thu hồi bằng cách ly tâm 5000 vòng/phút Dịch nổi sau ly tâm đem xác định hoạt tính enzyme cố định, tủa CLEA tiếp tục tiếp tục được sử dụng thủy phân Tween 20 Lặp lại thí nghiệm đến khi hoạt tính CLEA lipase không còn giữ được cấu trúc hoặc hoạt tính giảm 50%.