Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khảo sát điều kiện cảm ứng sự tăng trưởng của rễ bất định bông cải xanh (Brassica oleracea L. var.italica)

Rễ bất định hình thành được chuyển sang môi trường nuôi cấy lỏng với thành phần tương tự môi trường cảm ứng rễ trong hai tuần, sau đó cấy chuyền sang môi trường MS với sự thay đổi hàm lư

VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bộ kit định lượng glucosinolate

- Enzyme thioglucosidase (hãng Sigma-Aldrich) (hình 3.1.a) - Bộ kit test glucose tự do (hãng Megazyme) (hình 3.1.b)

Hình 3.1 Bộ kit định lượng glucosinolate a Enzyme thioglucosidase; b Bộ kit định lượng glucose tự do

Vật liệu

Hạt giống bông cải xanh Brassica oleracea L var italica được cung cấp bởi công ty Nguyên Nông, 146/6A Võ Thị Sáu, Quận 3, TP.HCM (hình 3.2)

Hình 3.2 Hạt giống bông cải xanh a b

Chương 3 Vật liệu & phương pháp

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Quy trình nghiên cứu chung

Hạt giống bông cải xanh

Sinh khối rễ (môi trường lỏng)

- Saccharose - Casein hydrolysate - Thành phần khoáng

Cảm ứng tổng hợp glucosinolate Giai đoạn 2

- Sorbitol Môi trường tăng sinh tốt nhất

- Mật độ khởi đầu - Sự tăng sinh và tích lũy glucosinolate

Hình 3.3 Sơ đồ nghiên cứu chung

3.3.2 Phương pháp tạo cây mầm in vitro Được cải tiến dựa trên nghiên cứu của tác giả Huỳnh Thị Kim (2014)

25 Hạt Brassica oleracea L var italica

Ngâm lắc trong dung dịch Javel 7%

Rửa bằng nước cất vô trùng đến khi pH nước rửa trung tính

Gieo hạt trên môi trường MS in vitro Điều kiện vô trùng

Hình 3.4 Quy trình tạo cây mầm bông cải xanh in vitro

- Môi trường gieo hạt: môi trường MS, bổ sung myo-inositol 100 mg/l, saccharose 20 g/l, agar 7,0 g/l

+ Ánh sáng : 2800 lux + Thời gian chiếu sáng : 16/8h (sáng/tối) - Chỉ tiêu theo dõi:

+ Hình dạng cây mầm sau 7 ngày nuôi cấy (chiều dài, đường kính thân, hình dạng tử diệp)

- Tỷ lệ hạt bị nhiễm được tính bằng tỷ lệ giữa số hạt bị nhiễm và tổng số hạt ban đầu sau 5 ngày nuôi cấy.- Tỷ lệ hạt nảy mầm được tính bằng tỷ lệ giữa số hạt nảy mầm và tổng số hạt gieo sau 5 ngày nuôi cấy.

26 Tỷ lệ nhiễm được tính bằng số lượng hạt nhiễm/ tổng số hạt gieo

3.3.3 Phương pháp tạo rễ bất định in vitro 3.3.3.1 Cảm ứng rễ trên môi trường rắn

Tử diệp cây mầm bông cải xanh 7 ngày tuổi được sử dụng cho quá trình cảm ứng rễ Môi trường cảm ứng rễ bất định: MS rắn; saccharose 30 g/l; IBA 1,6 mg/l; agar 7 g/l

+ Ánh sáng : 2800 lux + Thời gian chiếu sáng : 16/8 h (sáng/tối) - Chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỉ lệ mẫu cấy tạo rễ

+ Hình thái rễ sau 7 – 10 ngày tuổi (tính từ khi rễ hình thành) 3.3.3.2 Tăng sinh rễ trong môi trường lỏng

Rễ hình thành sau 7 – 10 ngày tuổi được chuyển sang môi trường nuôi cấy lỏng, lắc trong 2 tuần Môi trường tăng sinh rễ: MS lỏng; saccharose 30 g/l; IBA 1,6 mg/l Sử dụng rễ này cho các thí nghiệm về sau

+ Nhiệt độ : 25 ± 2 0 C + Ánh sáng : 2800 lux + Thời gian chiếu sáng : 16/8 h (sáng/tối) + Thể tích môi trường lỏng : 30 ml

- Chỉ tiêu theo dõi: hình thái rễ sau 2 tuần nuôi cấy

27 3.3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự gia tăng sinh khối rễ bất định

3.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng với IBA 1,6 mg/l; hàm lượng saccharose bổ sung thay đổi 20, 30, 40, 50, 60, 70 và 80 g/l

+ Nhiệt độ : 25 ± 2 0 C + Ánh sáng : 2800 lux + Thời gian chiếu sáng : 16/8h (sáng/tối) + Thể tích môi trường lỏng : 30 ml

+ Tốc độ lắc : 100 rpm + Mật độ rễ khởi đầu : 1,2 g [3]

+ Chỉ số tăng trưởng sau 2 tuần nuôi cấy

+ Hàm lượng glucosinolate sau 2 tuần nuôi cấy

3.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định được nuôi cấy trên môi trường MS lỏng;

IBA 1,6 mg/l; saccharose 40 g/l; và casein hydrolysate hàm lượng thay đổi 200, 400, 600, 800 và 100 mg/l

- Điều kiện nuôi cấy: tương tự như trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

28 3.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định được nuôi trên môi trường MS lỏng; IBA 1,6 mg/l; saccharose 40 g/l; casein hydrolysate 600 mg/l; thành phần khoáng đa lượng thay đổi 1/2, 3/4, 1, 5/4 và 5/2 (pha tương tự môi trường MS, trừ khoáng đa lượng có thể tích thay đổi theo hệ số theo sau tên MS)

Điều kiện nuôi cấy mô rễ bất định với các mẫu vật thử nghiệm trong nghiên cứu này được tiến hành tương tự như phương pháp đã sử dụng trong thí nghiệm khảo sát trước đó nhằm đánh giá tác động của nồng độ saccharose đối với quá trình tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định.

3.3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ rễ khởi đầu lên sự tăng sinh khối rễ

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định được nuôi trên môi trường MS1/2 lỏng;

IBA 1,6 mg/l; saccharose 40 g/l; casein hydrolysate 600 mg/l; mật độ rễ khởi đầu thay đổi như sau: 0,6 ± 0,1; 0,8 ± 0,1; 1,0 ± 0,1; 1,2 ± 0,1; 1,4 ± 0,1; 1,6 ± 0,1; 1,8 ± 0,1 và 2,0 ± 0,1 g

+ Tốc độ lắc : 100 rpm - Chỉ tiêu theo dõi: chỉ số tăng trưởng sau 2 tuần nuôi cấy

3.3.4.5 Khảo sát sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định theo thời gian

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định từ tử diệp sau 7 – 10 ngày tuổi (chọn các mẫu có khối lượng gần bằng nhau, tiến hành trên 3 nhóm) được cấy chuyền sang môi

29 trường MS1/2 lỏng; IBA 1,6 mg/l; saccharose 40 g/l; casein hydrolysate 600 mg/l Trọng lượng rễ và hàm lượng glucosinolate được ghi nhận sau mỗi 7 ngày

+ Tốc độ lắc : 100 rpm - Chỉ tiêu theo dõi:

+ Chỉ số tăng trưởng sau mỗi tuần nuôi cấy

+ Hàm lượng glucosinolate sau mỗi tuần nuôi cấy

3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự sinh tổng hợp glucosinolate

3.3.5.1 Sự phối hợp giữa glucose và fructose

IBA 1,6 mg/l; casein hydrolysate 600 mg/l; hàm lượng đường thay đổi theo bảng 3.1

+ Tốc độ lắc : 100 rpm - Chỉ tiêu theo dõi:

Bảng 3.1 Nghiệm thức phối hợp giữa glucose và fructose

Nghiệm thức Saccharose (g/l) Glucose (g/l) Fructose (g/l) GF0

GF1 GF2 GF3 GF4 GF5

- Phương pháp nghiên cứu: rễ bất định được nuôi trên môi trường MS1/2 lỏng, IBA 1,6 mg/l, saccharose 40 g/l, casein hydrolysate 600 mg/l, hàm lượng D-manitol thay đổi như sau: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 mg/l

- Điều kiện nuôi cấy tương tự như trong thí nghiệm phối hợp giữa glucose và fructose

IBA 1,6 mg/l; saccharose 40 g/l; casein hydrolysate 600 mg/l; hàm lượng sorbitol thay đổi như sau: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 mg/l

- Điều kiện nuôi cấy tương tự như trong thí nghiệm phối hợp giữa glucose và fructose

31 3.3.6 Phương pháp xác định trọng lượng tươi

Dùng kẹp gắp và thấm khô mẫu trên giấy thấm, cân xác định khối lượng Trọng lượng tươi của mẫu (FW) được xác định như sau [43]:

M1: trọng lượng đĩa petri M2: trọng lượng đĩa petri + trọng lượng mẫu V: thể tích mẫu (ml)

3.3.7 Phương pháp xác định chỉ số tăng trưởng

Mẫu được thấm khô bằng giấy thấm Sau đó, cân mẫu để xác định trọng lượng giữa hai thời điểm t1 và t2 Nếu tiếp tục sử dụng mẫu để nuôi cấy, quá trình phải tiến hành trong điều kiện vô trùng Chỉ số tăng trưởng (GI) được tính theo công thức: GI = (Trọng lượng tại t2 - Trọng lượng tại t1)/Trọng lượng tại t1.

W1: trọng lượng sinh khối (trọng lượng tươi) theo thời gian t1

W2: trọng lượng sinh khối (trọng lượng tươi) theo thời gian t2

3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng D-Glucose tự do

- Nguyên tắc: D-Glucose được phosphoryl hóa bởi enzyme hexokinase và adenosine-5’-triphosphate (ATP) thành glucose-6-phosphate (G-6-P) và adenosine-5’- diphosphate (ADP)

Sự hiện diện của glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6P-DH), G-6-P bị oxi hóa bởi nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADP + ) tạo gluconate-6- phosphate và nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH)

Tổng D-Glucose được xác định qua độ hấp thu của NADPH hình thành ở bước sóng 340nm

- Quy trình: hút mẫu, mẫu trắng vào cuvet với các thành phần tương ứng trong bảng 3.3, cho cá từ nhỏ vào cuvet

Bảng 3.2 Thành phần trong phản ứng xác định glucose tự do

Dung dịch 1 (đệm pH 7,6) Dung dịch 2 (NADP + /ATP)

Khuấy trộn, đo độ hấp thu (A1) của dung dịch sau 3 phút ở bước 340 nm, thêm 0,02 ml dung dịch 3 (HK/G6P-DH) Khuấy trộn, đo độ hấp thu (A2) của dung dịch sau 5 phút ở bước 340 nm Nếu phản ứng chưa dừng sau 5 phút, tiếp tục đo độ hấp thu của dung dịch sau 2 phút nữa cho đến khi kết thúc phản ứng (độ hấp thu không thay đổi giữa hai lần đo)

Nồng độ D-Glucose được tính theo công thức sau: c V x MW ε x d x v x m x DD-Glucose x 100 trong đó,

V: thể tích cuối (ml) MW: trọng lượng phân tử D-Glucose (g/mol) ε: hệ số tiêu hao của NADPH ở bước sóng 340 nm là 6300 (l x mol -1 x cm -1 ) d: độ dày truyền sang của cuvet (cm) v: thể tích mẫu (ml)

33 m: khối lượng mẫu phân tích (g)

3.3.9 Phương pháp xác định hàm lượng glucosinolate

- Nguyên tắc: Glucosinolate được thủy phân dưới tác dụng của thioglucosidase để giải phóng D-Glucose tự do, hàm lượng D-Glucose được xác định bằng bộ kit của hãng Megazyme

+ Chuẩn bị mẫu: rễ được rửa sạch với nước cất, thấm khô bằng giấy thấm, cắt nhỏ và được nghiền kỹ trong cối sứ

 Mẫu thật: cân 800mg mẫu cho vào ống nghiệm, thêm 20ml thioglucosidase 200 mg/l (cân và hòa tan 20 mg thioglucosidase trong 100ml nước cất), đậy nắp, ủ trong bể cách thủy 39 ± 1 0 C trong 1h30 phút, thỉnh thoảng vortex ống nghiệm

 Mẫu blank: cân 800mg mẫu cho vài ống nghiệm, thêm 20ml nước cất, đậy nắp, ủ trong bể cách thủy 95 0 C trong 5 phút

+ Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50 ml có chứa sẵn 2,5 ml Carez 1 (cân và hòa tan 476 ± 1 g kẽm acetate trong 1000 ml nước cất, thêm 60 ml acetic acid, định mức thành 2 lít với nước cất) và 2,5 ml Carez 2 (cân và hòa tan 212 ± 1 g potassiumferrocyanure 700 ml nước cất, khuấy tan và định mức thành 2 lít với nước cất), tráng rửa ống nghiệm bằng nước cất và chuyển nước rửa vào bình định mức, định mức đến vạch bằng nước cất Lắc đều và lọc qua giấy lọc Dung dịch phân tích trong ngày

Thực hiện phân tích hàm lượng D-Glucose tự do theo 3.3.8

- Tính kết quả: hàm lượng glucosinolate (GLS) có trong mẫu:

[GLS] DAmẫu - DAblank ε x d x V v xVt m trong đó,

[GLS]: hàm lượng glucosinolate (àmol/g) ΔA: hiệu số độ hấp thụ của mẫu chuẩn và mẫu trắng

34 v: thể tích mẫu sử dụng trong phản ứng (ml)

V: thể tích cuối trong cuvet (ml) Vt: tổng thể tích mẫu trích ly (50ml) ε: hệ số tiêu hao NADPH ở bước sóng 340nm (6.3 1.mmol -1 cm -1 ) m: khối lượng mẫu phân tích (g) d: độ dày truyền sang của cuvet (1cm) [Tài liệu nội bộ: Glucenzy 01/03 – Invivo Labs]

3.3.10 Phương pháp xử lý và thông kê số liệu

Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Số liệu được đánh giá thông qua giá trị trung bình Kết quả được xử bằng phần mềm SPSS phiên bản 19 dành cho Windows Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA một chiều (One way ANOVA) và Ducant test với p = 0,05 Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Excel 2013.

KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

Kết quả

Hạt bông cải xanh được cấy trên môi trường MS sau khi khử trùng với javel 7% trong 7 phút Hạt nảy mầm sau 24 giờ nuôi cấy Cây mầm bông cải xanh 7 ngày tuổi có chiều cao 8 – 12 cm, đường kính thân 1,0 – 1,5 mm với 2 tử diệp hình tim (hình 4.1)

Hình 4.1 Cây mầm bông cải xanh in vitro 7 ngày tuổi

4.1.2 Kết quả tạo rễ bất định in vitro 4.1.2.1 Sự cảm ứng rễ trên môi trường rắn

Sự gia tăng kích thước mẫu cấy xảy ra sau 3 – 4 ngày nuôi cấy trên môi trường cảm ứng sự tạo rễ, một số tử diệp có sự xuất hiện của mô sẹo tại vết cắt Rễ bất định hình thành trực tiếp từ mẫu cấy sau 5 – 7 ngày và tăng sinh mạnh sau 14 ngày nuôi cấy Hệ thống rễ phát triển mạnh, sợi rễ dài, rễ bên phát triển và có sự xuất hiện của lông rễ ở các rễ phát triển trên bề mặt môi trường (hình 4.2.a và hình 4.2.b) Rễ tiếp tục phát triển ở những tuần tiếp theo Một số mẫu cấy có sự tăng mạnh kích thước khi vết thương tiếp xúc trực tiếp với môi trường dinh dưỡng, mô sẹo hình thành sau 7 ngày nuôi cấy và tiếp theo là sự xuất hiện của rễ bất định từ những khối mô sẹo này (sau 10 - 14 ngày nuôi

Chương 4 Kết quả - Thảo luận

36 cấy) Hình thái của rễ xuất phát từ mô sẹo tương tự như rễ từ mẫu cấy ở các tuần tiếp theo (hình 4.2.c) Tỉ lệ mẫu cấy tạo rễ trên ở cả hai trường hợp đều trên 95%

Hình 4.2 Sự hình thành và phát triển rễ bất định a Rễ bất định xuất hiện ở ngày thứ 7; b Rễ bất định hình thành trực tiếp từ vết cắt ở ngày thứ 14; c Rễ bất hình thành từ mô sẹo ở ngày thứ 21 4.1.2.2 Sự tăng sinh rễ trong môi trường lỏng

Khi chuyển từ môi trường rắn sang môi trường lỏng có cùng thành phần dinh dưỡng, bộ rễ sinh trưởng chậm ở tuần đầu Đến tuần thứ hai, rễ bên mới bắt đầu hình thành và phát triển, có màu trắng nhưng chưa có lông rễ Quá trình sinh trưởng của bộ rễ tiếp tục mạnh mẽ ở các tuần tiếp theo.

Hình 4.3 Sự phát triển rễ bất định trong môi trường lỏng a Rễ bất định ở ngày thứ 7; b Rễ bất định ở ngày thứ 14 a a 1 cm b 1 cm c 1 cm b

37 4.1.3 Kết quả về tăng sinh khối của rễ bất định

4.1.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

Khi thay đổi hàm lượng saccharose trong môi trường nuôi cấy rễ bất định, chỉ số tăng trưởng và hàm lượng glucosinolate tích lũy cũng thay đổi theo Khi hàm lượng saccharose bổ sung tăng dần từ 20 đến 50 g/l, chỉ số tăng trưởng cũng tăng dần (từ 1,30 lên 2,56), cao nhất ở hàm lượng saccharose 40 g/l (chỉ số tăng trưởng 2,71) (bảng 4.1 và hình 4.4) Rễ có xu hướng chuyển từ trắng sang trắng ngà (hình 4.5) Khi hàm lượng saccharose bổ sung cao hơn 50 g/l thì chỉ số tăng trưởng giảm dần, đến saccharose 80 g/l thì rễ phát triển kém (chỉ số tăng trưởng 0,73), chuyển sang trắng ngà đến nâu, rễ cứng (hình 4.5) Càng tăng hàm lượng saccharose trong môi trường nuôi cấy, màu sắc của rễ cũng đậm dần, một phần có lẽ do ảnh hưởng của màu sắc môi trường (màu sắc của môi trường biến đổi từ trắng đến ngà theo sự tăng dần hàm lượng) Về sự tích lũy glucosinolate, rễ bất định ở nghiệm thức có saccharose 70 g/l có hàm lượng glucosinolate cao nhất (3,886 mol/g trọng lượng tươi, bảng 4.1 và hình 4.4) Ở nghiệm thức có saccharose 40 và 50 g/l, chỉ số tăng trưởng tương tự nhau nên chúng tôi sử dụng sacharose 40 g/l cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose lên sự tăng trưởng và tích lũy glucosinolate

Hàm lượng sacharose (g/l) Chỉ số tăng trưởng GI Hàm lượng glucosinolate

Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy

Hình 4.4 Ảnh hưởng của hàm lượng saccharose lên sự tăng trưởng và tích lũy glucosinolate

Hàm lượng glucosinolate (mol/g FW)

Chì số tăng trưởng GI

Hàm lượng saccharose (g/l)Chỉ số GI Hàm lượng GLS

Hình 4.5 Sự tăng sinh của rễ bất định sau 2 tuần nuôi trên môi trường có hàm lượng sacharose thay đổi

Hình a, b, c, d, e, f, g tương ứng với các hàm lượng sacharose 20, 30, 40, 50, 60, 70 và

4.1.3.2 Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

Việc bổ sung casein hydrolysate vào môi trường nuôi cấy rễ bất định có tác động tích cực đến sự tăng sinh khối ở tất cả các nghiệm thức (bảng 4.2 và hình 4.6) Hàm lượng casein hydrolysate thích hợp nhất là 600 mg/l (chỉ số tăng trưởng là 3,38 so với đối chứng là 2,52) Rễ phát triển mạnh theo chiều dài, hình thành nhiều rễ bên và có màu trắng ở tất cả các nghiệm thức (hình 4.7) Tuy nhiên, hàm lượng glucosinolate lại giảm ở tất cả các nghiệm thức bổ sung casein hydrolysate so với đối chứng (bảng 4.2) Từ kết a b c d e f g

40 quả này, chúng tôi bổ sung casein hydrolysate hàm lượng 600 mg/l vào môi trường nuôi cấy ở các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate ở rễ bất định

Hàm lượng casein hydrolysate (mg/l) Chỉ số tăng trưởng GI Hàm lượng glucosinolate

Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%.

Hình 4.6 Ảnh hưởng của casein hydrolysate lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate ở rễ bất định

Hàm lượng GLS (mol/g FW)

Chỉ số tăng trưởng GI

Hàm lượng casein hydrolysate (mg/l)Chỉ số GI Hàm lượng GLS

Hình 4.7 Sự tăng sinh của rễ bất định sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có hàm lượng casein hydrolysate thay đổi

Hình a, b, c, d, e, f tương ứng với các hàm lượng casein hydrolysate là 0, 200, 400,

4.1.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

Sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường có nồng độ khoáng đa lượng thay đổi, chúng tôi nhận thấy khi giảm nồng độ khoáng, rễ tăng sinh khá mạnh và ngược lại, sự tăng sinh giảm khi nồng độ khoáng tăng lên Sự gia tăng sinh khối tương ứng với sự giảm tổng hợp glucosinolate và ngược lại Theo kết quả này, có hai nhóm tách biệt về chỉ số tăng trưởng và hàm lượng glucosinolate tích lũy: nhóm 1 (môi trường khoáng MS1/2, MS3/4, MS; chỉ số tăng trưởng tương ứng 3,32; 3,43 và 3,24) có hiệu quả tăng sinh tốt hơn nhóm 2 (môi trường khoáng MS5/4, MS3/2; chỉ số tăng trưởng tương ứng 2,62 và 2,65) nhưng hàm lượng glucosinolate ở nhóm 1 lại thấp hơn nhóm 2 (bảng 4.3 và hình 4.8) Rễ trắng, phát triển mạnh theo chiều dài và hình thành nhiều rễ bên ở cả hai nhóm Có thể quan sát thấy nhiều lông rễ của các rễ nhóm 1 khi chúng phát triển lên trên bề mặt môi trường (hình 4.9) Tổng hợp kết quả từ thí nghiệm này và hai thí nghiệm trước đó, chúng tôi sử a b c d e f

42 dụng môi trường MS1/2, bổ sung IBA 1,6 mg/l, saccharose 40 g/l và casein hydrolysate 600 mg/l cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

Môi trường Chỉ số tăng trưởng GI Hàm lượng glucosinolate

Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%.

Hình 4.8 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định

MS1/2 MS3/4 MS MS5/4 MS3/2

Môi trườngChỉ số GI Hàm lượng GLS

Hình 4.9 Sự tăng sinh của rễ bất định sau 2 tuần nuôi trên môi trường có thành phần khoáng thay đổi

Hình a, b, c, d, e tương ứng với các môi trường MS1/2, MS3/4, MS, MS5/4 và MS3/2

4.1.3.4 Ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi đầu lên sự tăng sinh khối rễ

Sau 2 tuần nuôi cấy với các trọng lượng khởi đầu khác nhau trong môi trường MS1/2 lỏng bổ sung IBA 1,6 mg/l, saccharose 40 g/l và casein hydrolysate 600 mg/l, chúng tôi nhận thấy trọng lượng rễ khởi đầu thích hợp cho sự tăng sinh là dưới 1,2 g trọng lượng tươi trong 30 ml môi trường (bảng 4.4 hình 4.10) Chỉ số tăng trưởng đạt cao nhất 4,00 với trọng lượng khởi đầu là 1,0 g rễ tươi trong 30 ml môi trường (tỉ lệ 1:30) và thấp nhất ở trọng lượng rễ khởi đầu là 2 g (chỉ số tăng trưởng là 1,0) Rễ trắng, phát triển mạnh theo chiều dài và hình thành nhiều rễ bên ở tất cả các nghiệm thức, có thể quan sát thấy nhiều lông rễ ở các nghiệm thức có rễ phát triển lên trên bề mặt môi trường (hình 4.11) Từ kết quả trên, chúng tôi áp dụng tỉ lệ 1,0 g rễ tươi / 30 ml môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo a b c e d

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi đầu lên sự tăng sinh của rễ bất định

Trọng lượng rễ khởi đầu

Tỉ lệ giữa trọng lượng rễ và thể tích môi trường Chỉ số tăng trưởng GI 0,6 ± 0,1

Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy

Hình 4.10 Ảnh hưởng của trọng lượng rễ khởi đầu lên sự tăng sinh của rễ bất định

Trọng lượng rễ khởi đầu (g / 30 ml)

Hình 4.11 Sự tăng sinh của rễ bất định sau 2 tuần nuôi cấy với các mật độ rễ khởi đầu khác nhau

Hình a, b, c, d, e, f, g, h tương ứng với mật độ rễ khởi đầu là 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4;

4.1.3.5 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate của rễ bất định theo thời gian

Diễn biến quá trình tăng sinh và tích lũy glucosinolate của rễ bất định trên môi trường MS1/2 lỏng bổ sung IBA 1,6 mg/l, saccharose 40 g/l, casein hydrolysate 600 mg/l được ghi nhận sau mỗi 7 ngày Kết quả cho thấy, từ lúc khởi đầu nuôi cấy đến trước ngày thứ 14, rễ bất định tăng sinh khá chậm (chỉ số tăng trưởng ở ngày thứ 14 là 0,81); từ ngày thứ 14 đến ngày thứ 28 rễ tăng sinh mạnh (chỉ số tăng trưởng là 0.81 ở ngày thứ 14 và 6.94 ở ngày thứ 28), sau đó rễ vẫn tiếp tục tăng sinh nhưng tốc độ chậm hơn ở những ngày tiếp theo (bảng 4.5 và hình 2.12) Rễ có màu trắng, phát triển mạnh theo a b c d e f g h

46 chiều dài và hình thành nhiều rễ bên, sau ngày thứ 21 rễ phát triển lên trên bề mặt môi trường và có thể quan sát thấy nhiều lông hút ở các phần rễ này; sau ngày thứ 35 rễ chuyển dần sang màu trắng ngà và đến ngày thứ 45 có một vài nhánh bị đen (hình 4.13)

Trong quá trình tích lũy glucosinolate, hàm lượng glucosinolate không có sự biến đổi đáng kể trong 28 ngày đầu tiên nuôi cấy Tuy nhiên, đến ngày thứ 35, hàm lượng này tăng lên và duy trì ổn định cho đến ngày thứ 42.

Bảng 4.5 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate theo thời gian nuôi cấy

Ngày Chỉ số tăng trưởng GI Hàm lượng glucosinolate

0,466 ± 0,037 a 0,459 ± 0,062 a 0,496 ± 0,024 a 0,507 ± 0,014 a 0,505 ± 0,045 a 0,904 ± 0,070 b 0,905 ± 0,000 b Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%

Hình 4.12 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate theo thời gian nuôi cấy

Thời gian (ngày)Chỉ số GI Hàm lượng GLS

Hình 4.13 Sự tăng sinh của rễ bất định trong 42 ngày nuôi cấy

Hình a, b, c, d, e, f, g tương ứng với thời gian nuôi cấy là 0, 7, 14, 21, 28, 35 và 42 ngày

4.1.4 Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự sinh tổng hợp glucosinolate 4.1.4.1 Kết quả của sự phối hợp giữa glucose và fructose

Thay thế saccharose bằng hỗn hợp glucose - fructose, chỉ số tăng trưởng chung của các nghiệm thức đều giảm so với đối chứng, nhưng không chênh lệch đáng kể Chỉ số tăng trưởng cao nhất thuộc về các nghiệm thức có tỷ lệ phối hợp glucose : fructose là 30:10 và 20:20, lần lượt đạt 3,60 và 3,61 so với đối chứng là 4,16 Ngoài ra, màu sắc rễ chịu ảnh hưởng bởi môi trường, cụ thể ở tỷ lệ glucose cao, môi trường mang màu vàng nâu nên rễ cũng chuyển sang sắc thái tương tự.

48 glucose hàm lượng cao có hàm lượng glucosinolate cao hơn các nghiệm thức khác: tỉ lệ phối hợp glucose : fructose là 30:10 và 20:20 cho kết quả tổng hợp glucosinolate cao nhất (0,897 và 0,902 mol/g trọng lượng tươi, so với đối chứng là 0,738)

Bảng 4.6 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate trong sau 3 tuần nuôi cấy với tỉ lệ glucose : fructose thay đổi

Tỉ lệ glucose : frutose (g/l) Chỉ số tăng trưởng GI Hàm lượng glucosinolate

0,738 ± 0,029 a 0,897 ± 0,048 b 0,902 ± 0,060 b 0,870 ± 0,011 b 0,781 ± 0,026 a 0,765 ± 0,043 a Các mẫu tự khác nhau biểu diễn mức độ sai biệt có ý nghĩa (theo cột) ở độ tin cậy 95%

Hình 4.14 Sự tăng sinh và tổng hợp glucosinolate sau 3 tuần nuôi cấy với tỉ lệ glucose : fructose thay đổi

Tỉ lệ glucose : fructoseChỉ số GI Hàm lượng GLS

Hình 4.15 Rễ bất định sau 3 tuần nuôi cấy với tỉ lệ glucose : frutose thay đổi

Hình a, b, c, d, e, f, g tương ứng với tỉ lệ glucose : frutose tương ứng 0:0, 40:0, 30:10,

4.1.4.2 Kết quả của sự cảm ứng với D-manitol

Khi bổ sung D-manitol với hàm lượng thấp hơn 50 mg/l vào môi trường nuôi cấy rễ bất định, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt nhiều giữa chỉ số tăng trưởng cũng như hàm lượng glucosinolate ở các nghiệm thức so với đối chứng Ở nghiệm thức có hàm lượng D-manitol bổ sung 50 – 80 mg/l, chỉ số tăng trưởng của rễ giảm nhưng hàm lượng glucosinolate tăng lên so với đối chứng, cao nhất ở nghiệm thức 70 và 80 mg/l với hàm lượng glucosinolate tương ứng là 1,317 và 1,319 mol/g trọng lượng tươi

Thảo luận

4.2.1 Sự hình thành rễ bất định 4.2.1.1 Sự hình thành rễ bất định in vitro

Sự hình thành rễ bất định gồm hai giai đoạn: giai đoạn hình thành sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe – mộc hay chu luân, và giai đoạn kéo dài sơ khởi rễ

Sự tạo sơ khởi rễ được khởi phát bởi auxin nồng độ cao và sự kéo dài sơ khởi rễ được kích thích bởi auxin nồng độ thấp Sự hình thành sơ khởi rễ bao gồm sự phản phân hóa của một nhóm tế bào nằm tương đối sâu bên trong (tế bào chu bì hay các tế bào bao quanh tầng phát sinh nếu rễ già hơn), kế đó là sự tái lập hoạt tính phân chia tế bào Cuối cùng sơ khởi rễ tiêu hủy nhu mô vỏ và kéo dài ra ngoài Sự kéo dài sơ khởi rễ được thực hiện nhờ mô phân sinh ngọn rễ và sự tăng trưởng rễ theo đường kính được thực hiện nhờ các tầng phát sinh libe – mộc và sube – nhu bì [1]

Trong cảm ứng và nuôi cấy rễ bất định in vitro, IBA là auxin được sử dụng khá phổ biến Trong thí nghiệm cảm ứng rễ bất định từ các bộ phận khác nhau của cây mầm bông cải xanh, Huỳnh Thị Kim (2014) nhận thấy với sự hiện diện của IBA nồng độ 1,8 và 2,0 mg/l trong môi trường nuôi cấy, cả 3 loại mẫu cấy (tử diệp, cuống tử diệp và trụ hạ diệp) đều có xu hướng tạo sẹo ở vị trí vết thương, rễ bất định hình thành từ mô sẹo với số lượng thấp và phát triển kém Ngược lại, trên môi trường có IBA 1,4 và 1,6 mg/l tỉ lệ mẫu cấy từ tử diệp tạo rễ cao lần lượt 91,67 và 98,40%, rễ hình thành trực tiếp từ mẫu cấy, kéo dài và tạo rễ bên nhanh chóng Có thể do ở mức IBA ngoại sinh bổ sung 1,4 và 1,6 mg/l kết hợp với auxin và cytokinin nội sinh ở tử diệp tạo ra một tỉ lệ auxin : cytokinin thích hợp cho quá trình cảm ứng và phát triển của rễ bất định bông cải xanh [3] Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn nồng độ IBA 1,6 mg/l để thực hiện với tất cả các thí nghiệm vì chúng tôi sử dụng cùng một nguồn nguyên liệu với thí nghiệm của Huỳnh Thị Kim

57 4.2.1.2 Sự tăng sinh của rễ bất định trong môi trường lỏng

Việc sử dụng môi trường lỏng trong nuôi cấy tế bào thực vật có một số thuận lợi: môi trường lỏng có thể tạo điều kiện nuôi cấy đồng nhất, tốc độ tăng trưởng của mẫu cấy nhanh hơn, dễ thanh trùng và có thể dễ dàng mở rộng quy mô nuôi cấy Động tác lắc tròn của máy lắc giúp rễ tiếp xúc tốt với thành phần dinh dưỡng và oxy hòa tan trong môi trường nuôi cấy, giúp phân tán độc tố tích lũy trong môi trường nuôi cấy, làm tăng khả năng trao đổi chất từ đó thúc đẩy sự tăng sinh của rễ [79]

Kết quả thực nghiệm cho thấy sau hai tuần đầu, rễ bất định bông cải xanh tăng trưởng chậm trong môi trường lỏng Sang hai tuần tiếp theo, rễ phát triển mạnh, rồi chậm dần và đạt trạng thái ổn định Song song với quá trình tăng sinh rễ là sự tích lũy glucosinolate Tuy nhiên, sự chênh lệch về hàm lượng glucosinolate rõ nhất vào ngày thứ 35 Do đó, việc nuôi cấy rễ bất định bông cải xanh trên môi trường lỏng có thể dừng ở ngày thứ 28 để thu sinh khối, hoặc cấy chuyển cho chu kỳ nuôi tiếp theo rồi dừng ở ngày thứ 35 để thu glucosinolate.

Sự tăng sinh khối chậm từ ngày 28 đến 42 có lẽ do sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy thông qua việc hấp thu dinh dưỡng khoáng của rễ Rễ cây luôn có sự hấp thu tích cực và chọn lọc các chất dinh dưỡng thông qua quá trình trao đổi chất của tế bào Để hấp thu các chất dinh dưỡng dưới dạng cation, rễ cây phải tiết ra các ion H + để trao đổi với môi trường xung quanh Ion H + tích lũy dần trong vùng rễ, làm cho pH của môi trường giảm dần Mặt khác sự hấp thu tích cực cũng dẫn đến tiêu hao nhiều năng lượng của tế bào, vì vậy rễ hô hấp mạnh và thải ra nhiều khí CO2 vào môi trường của hệ rễ

Lượng khí CO2 này kết hợp với nước tạo ra một lượng acid carbonic, tích lũy ngày càng nhiều dẫn đến việc làm giảm pH của môi trường

4.2.2 Sự tăng sinh của rễ bất định dưới tác động của các yếu tố khác nhau 4.2.2.1 Ảnh hưởng của mật độ khởi đầu lên sự tăng sinh của rễ bất định

Trong nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng, mật độ tế bào khởi đầu đóng vai trò rất quan trọng Mật độ khởi đầu thấp làm giảm sự phân chia tế bào Điều

58 này được chứng minh là do sự phân chia của tế bào này được kích thích bởi một số chất được tiết ra từ những tế bào khác Ngược lại, mật độ tế bào khởi đầu quá cao sẽ làm giảm sự phát triển của tế bào do sự canh tranh về dinh dưỡng và nguồn oxy từ môi trường nuôi cấy [55]

Dựa trên các kết quả thí nghiệm, có thể thấy mật độ khởi đầu là 1,0 ± 0,1 g rễ tươi / 30 ml môi trường nuôi cấy là thích hợp nhất cho sự tăng sinh của rễ bất định bông cải xanh (tỉ lệ 1:30, trọng lượng : thể tích) Tỉ lệ này thấp hơn so với hai nghiên cứu trước đây của hai tác giả Huỳnh Thị Kim (2014) và Nguyễn Ngọc Huỳnh Trang (2013) trên cùng đối tượng khảo sát, tương ứng là 1,2 và 1,5 g / 30 ml môi trường nuôi cấy Sự khác nhau này có thể là do nguồn giống cũng như môi trường sử dụng trong nuôi cấy và một số yếu tố khác

Mật độ khởi đầu tối ưu thay đổi tùy theo từng loài thực vật Trong nuôi cấy rễ bất định Hypericum perforatum nhằm thu được hợp chất phenolic và flavonoid, mật độ thích hợp nhất là 6 g trọng lượng tươi/1 lít môi trường nuôi cấy (tỷ lệ 3:500) Ngược lại, đối với Echinacea purpurea, mật độ khởi đầu thích hợp nhất là 10 g trọng lượng tươi/1 lít môi trường nuôi cấy (1%) để thu được hợp chất phenolic và sinh khối.

4.2.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ khoáng lên sự tăng sinh của rễ bất định

Khoáng (đa lượng) được tế bào thực vật sử dụng để chuyển hóa các chất hữu cơ, tạo thế thẩm thấu Các cation hóa trị 2 như Ca 2+ hay Mg 2+ có khả năng làm biến đổi tính thấm của màng Một vài khoáng đa lượng cũng có vai trò hoạt hóa các enzyme trong tế bào Nhu cầu về thành phần khoáng thay đổi tùy theo loài, cơ quan, tuổi thực vật và các yếu tố bên ngoài Sự thiếu khoáng làm tế bào thực vật giảm tăng trưởng và bộc lộ các triệu chứng thiếu Ngược lại, mọi nguyên tố, kể cả các nguyên tố thiết yếu, sẽ độc cho tế bào nếu liều dùng quá cao Việc thay đổi thành phần khoáng giúp ta có cơ sở xác định vùng tối hảo cho sự phát triển của rễ bất định trong quá trình nuôi cấy [1]

59 Trong thí nghiệm nuôi cấy rễ bất định bông cải xanh với hàm lượng khoáng đa lượng thay đổi, chỳng tụi nhận thấy trong cỏc nghiệm thức sử dụng mụi trường MS ẵ đến MS, rễ bất định tăng sinh khá mạnh, khi nồng độ khoáng tăng cao hơn thì rễ vẫn tăng sinh nhưng chậm hơn Điều đó cho thấy phổ thích ứng với nồng độ khoáng của rễ bất định bông cải xanh khá rộng Về sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất định, chúng tôi nhận thấy không có sự khác nhau nhiều giữa các nghiệm thức

Môi trường MS1/2 và MS3/4 cũng thích hợp cho việc nuôi cấy rễ ở nhiều đối tượng khác, ví dụ như nuôi cấy rễ tơ nhân sâm (G Sivakumar và cộng sự, 2005) và rễ bất định nhân sâm (Huang và cộng sự, 2010) thu nhận ginsenoside [30, 36]; nuôi cấy rễ bất định Hypericum perforatum thu nhận hợp chất thứ cấp ở quy mô bioreactor (Xi-Hua Cui và cộng sự (2010) [22, 75] Môi trường MS1/2 và MS3/4 cũng rất thích hợp cho nuôi cấy dịch treo tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp, chẳng hạn như nghiên cứu của Chun Hua Wu và cộng sự (2007) khi nuôi cấy dịch treo tế bào Echinacea purpurea để thu nhận các dẫn xuất của acid caffeic [21]

4.2.2.3 Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng sinh của rễ bất định Đường đóng vai trò quan trọng trong đời sống thực vật: chúng được tạo ra trong quá trình quang hợp, được chuyển đến các mô, là cơ chất chính trong hô hấp, là chất trung gian để tổng hợp các đại phân tử và các thành phần khác của tế bào Đường ribo và deoxyribo là một phần của cấu trúc DNA và RNA, các polysaccharide là thành phần cấu trúc chính của vách tế bào thực vật Sự điều hòa các quá trình biến dưỡng phụ thuộc nhiều vào hàm lượng đường, vì thế tế bào thực vật khá nhạy cảm với loại đường hiện diện trong nó [27] Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn carbon sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy tế bào thực vật là saccharose, glucose, fructose, mannose, lactose Trong đó, saccharose là nguồn carbon tốt nhất và phổ biến nhất, giúp đẩy nhanh tốc độ gia tăng

Tiêu đề	Khảo sát điều kiện cảm ứng sự tăng trưởng của rễ bất định bông cải xanh (Brassica oleracea L. var. italica)
Tác giả	Nguyễn Minh Nhựt
Người hướng dẫn	PGS. TS. Lê Thị Thủy Tiên
Trường học	Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2015
Thành phố	TP. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	100
Dung lượng	13,47 MB