Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Tối ưu hóa điều kiện lên men thu nhận Acid Glucuronic trên môi trường nước dừa già

Việc tối ưu hóa các điều kiện lên men kết hợp giữa hai chủng vi khuẩn acetic vàlactic trên cơ chất nước dừa giả nhằm mục đích thu nhận acid glucuronic hàm lượng cựcđại với giá thành thấp

TONG QUAN TÀI LIEU

NƯỚC DỪA GIÀ

Cây dừa có tên khoa học là Cocos nucifera L., là một loại cây lâu năm được trồng pho biến trên toàn thé giới, đặc biệt là các nước nhiệt đới Việt Nam có điều kiện khí hậu và tho như ng rất phù hợp cho cây dừa phát triển Hiện nay, cây dừa được trồng rộng rãi các tỉnh Đông bằng sông Cửu Long và khu vực duyên hải miền Trung.

Theo thống kê của các tổ chức khác nhau, điện tích trồng dừa của Việt Nam tuy không lớn nhưng sản lượng lại cao và tăng dần đều theo các năm Theo niên giám Thống kê của Hiệp hội Dừa Châu Á - Thái Bình Dương, đến năm 2012, diện tích trồng dừa của

Việt Nam là 157 nghìn hecta va sản lượng hang năm là 1,015,141 triệu quả tương đương

253,785 tan dừa khô Theo thống kê của ETC Group năm 2013, sản lượng dầu dừa xuất khẩu của Việt Nam đứng thứ tư thế giới và Việt Nam cũng là nước xuất khâu cơm dừa nạo say và chỉ xơ dừa chủ yếu.

Cây dừa là loại cây cho trái quanh năm nên có khả năng cung cấp sản phẩm rất dồi dào và ôn định Các sản phẩm tiêu thụ rất đa dạng như dừa trai, cơm dừa sây khô, bột sữa dừa, dầu dừa, than gáo dua, thạch dừa, chỉ xơ dừa Các sản phẩm trên chủ yếu được chế biến từ quả dừa và có giá trị kinh tế cao đối với cả trong và ngoài nước Quả dừa phục vụ trong quá trình chế biến và đa dạng hóa sản phẩm gồm hai loại: quả dừa non và quả dừa gia Quả dừa non hay dừa trái với giá trị dinh dư ng cao phục vụ nhu cầu thức uống Quả dừa già bao gồm phần cơm dừa là thành phân chủ yếu để sản xuất cơm dừa, sữa dừa, dầu dừa Ngoài ra, phan v dừa hay gáo dừa được tận dụng để sản xuất than gáo dừa và chi xơ dừa Bên cạnh đó, phần c n lại là nước dừa già được ứng dụng dé sản xuất thạch dừa Tuy nhiên, do sản lượng dừa rất lớn và mặt khác, thạch dừa c n được sản xuất từ mật rỉ đường nên lượng nước dừa già không được tận dụng hết và tôn đọng lại Vì thế, trên thị trường hiện nay, nước dừa già được xem là nguồn cơ chất có sản lượng lớn và rất ôn định.

Quả dừa là một hệ kín vô trùng với đây đủ các thành phân dinh dư ng như đường, đạm, chất chống oxi hóa, các vitamin và khoáng chất Quá trình chín quả bao gồm hai giai đoạn Giai đoạn đầu, quả dừa c n non chủ yếu chứa thành phần đường khử là ứlucose và fructose Giai đoạn sau, khi quả dừa đó chớn, thành phần đường của nước dừa gia mới xuất hiện sucrose [15] Một số thành phan dinh dư ng của nước dừa được trình bày trong bảng sau.

Bang | Thành phần dinh dư ng của nước dừa

Chất dinh dưỡng Giá trị (g/100g)

Carbohydrate 3,71 Chat xo 1,10 Đường tông sô 2,61 Lipid tông sô 0,20 Nước 94,99 Protein 0.72 Tro 0.39

Bảng 2.Thành phần vitamin của nước dừa

Vitamin Giá tri (mg/100¢g) Acid pantothenic 0,043

B, (Thiamin) 0,030 Ba (Riboflavin) 0,057 Bs (Pyridoxin) 0,032 C (Acid ascorbic) 2 A400 Niacin 0,080

Bang 3.Thanh phan khoáng chat của nước dừa Chat khoang Giá trị (mg/100¢g)

Ca 24.000 Cu 0.040 Fe 0.290 K 250.000 Mg 25,000 Mn 0,142 Na 105,000 P 20.000 Se 1,000 Zn 0,100

Bảng 4 Thành phần acid amin của nước dừa

Acid amin Giá tri (g/100¢g) Acid aspartic 0,070 Acid glutamic 0,165 Alanine 0.037 Argine 0,118 Cystein 0,014 Glycine 0,034 Histidine 0,017 Isoleucine 0,028 Leucine 0,053 Lysine 0,032 Methionine 0,013 Phenylalanine 0,037 Proline 0.030 Serine 0.037 Threonine 0.026 Tryptophan 0,008 Tyrosine 0,022 Valine 0,044

Tu năm những năm 1960, nước dừa đã được biết đến và sử dụng để làm môi trường nuôi cây vi sinh [17] Đặc biệt, nước dừa gia được xem là môi trường điển hình để nuôi cay vi khuẩn acetic [18,19] Cho đến thời diém hiện nay, rất nhiều nghiên cứu và công bố cũng cho thay nước dừa già là một trong những môi trường thích hợp nhất cho nhóm vi khuẩn acetic phát triển [9] Bên cạnh đó, thành phan đa dạng chất dinh dư ng của nước dừa già cũng phù hợp cho các nhóm vi khuẩn khác phát triển Hiện nay, đã có một số công bố nhóm vi khuẩn lactic có khả năng sống và phát triển trên môi trường này.

Năm 2011, Kuswardani và cộng sự đã công bố vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus và Streptococcus thermophilus có khả năng sống và phát triển trên môi trường nước dừa [20] Ngoài ra, Seesuriyachan (2011) cũng cho thay Lactobacillus bulgaricus TISTR 1498 có thé sử dụng các thành phan nước dừa mà không cần bố sung thêm chất dinh dư ng nào dé tạo thành các exopolysaccharide đơn giản [21] Trong những năm gan đây, một sô nghiên cứu công bô khả năng lên men của nhóm vi khuân lactic trên môi trường nước dừa tạo sản phẩm có lợi cho sức kh e Năm 2010, Yuliana và cộng sự nghiên cứu sản xuất thức uống lên men từ nước dừa bởi tô hợp vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus va Streptococcus thermophilus [22| Năm 2013,

Lee và cộng su lên men hai giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus L10 vaLactobacillus casei L26 trên môi trường nước dừa tao thức uống probiotic [23] Nói t6m lại, nước dừa gia có thể xem là nguồn cơ chất tự nhiên thích hợp cho các nhóm vi khuẩn acetic và lactic sống va phát triển.

NHOM VI KHUÂN ACETIC 1 Tong quan về vi khuẩn acetic

Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm vi khuẩn được ứng dụng rat rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, đặc biệt là trong sản xuất thực phẩm Từ rất lâu, nhóm vi khuẩn acetic đã được ứng dụng dé lên men sản xuất giẫm ăn hằng ngày Chúng cũng là nhóm vi khuẩn điển hình tong hợp cellulose Gan đây, nhóm vi khuẩn acetic c n được quan tâm với khả năng sinh acid glucuronic, một acid có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ giải độc gan dé đào thải các chất độc hại ra ngoài cơ thể Nhóm vi khuẩn acetic là nhóm vi khuẩn hiện diện rất phong phú trong tự nhiên, chúng có thể được phân lập từ trái cây, giảm, rượu, bia; trong đất, nước

Về vi thé, vi khuẩn acetic là những trực khuẩn Gram âm Chúng thường có dang hình que đến elip, đứng tách riêng lẻ hoặc một số xếp thành dạng chuỗi dài Ngoài ra, một số loài e n có tế bảo hình cầu, xoăn, chùy, hình chi hay hình bán nguyệt tùy thuộc loài và điều kiện môi trường nuôi cấy.

Trong môi trường | ng, vi khuẩn acetic có tốc độ sinh trưởng rất nhanh, từ 1 tế bào sau 12 giờ có thé phát triển thành 17 triệu tế bào [24] Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tiết ra acid acetic với nồng độ thấp có tác dụng kích thích sự sinh trưởng Ngoài ra, chúng c n có thé sinh acid glucuronic bang quá trình pentose phosphate [5] Vi khuẩn acetic là loài ưa mát, nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng là 20 - 30°C Tuy nhiên, chúng có thé tồn tại đến 38°C nhưng sinh trưởng rất chậm Vi khuẩn acetic có tính chịu acid cao, pH thích hợp là 3.5 - 6.2, một số loài vẫn có thể phát triển được ở pH 3.2 [24].

Nhóm vi khuẩn này không có khả năng tạo bào tử Một số loài có thể di động nhờ tiên mao ở một đầu - đơn mao, hay chu mao, một số không có khả năng này Đây là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc.

Trên môi trường thạch, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lac tr n, nh , đều đặn, đường kính trung bình là 3 mm Một số loài như Acetobacter aceti, Gluconabacter xylinus có khuan lạc rat nh_ (đường kính khoảng 1 mm), bề mặt trơn bóng, có tâm sam màu Một số loài có khuẩn lạc lớn (đường kính khoảng 4 - 5 mm), bề mặt trơn bóng, không có mau, m ng va trong suốt Một số loài tạo thành khuẩn lac ăn sâu vào môi trường nên khó lay ra bằng que cay.

Trên môi trường | ng, vi khuẩn acetic tập trung trên bề mặt môi trường, nơi tiếp xúc nhiều oxy, tạo thành lớp mang có cau trúc khác nhau tùy theo loài và điều kiện nuôi cấy Khi lắc dao, lớp mang nay chìm xuống và vi khuẩn tiếp tục tập trung vào nơi chứa nhiều Oxy dé hinh thanh lớp màng mới Bên cạnh đó, một số loài lại tạo khối cellulose chìm trong | ng môi trường nuôi cay Khi nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, dung dịch môi trường phía dưới lớp màng cellulose trong suốt Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện dong, cellulose được hình thành biv ra làm van đục môi trường nuôi cấy.

Môi trường nuôi cay vi khuẩn acetic phải đáp ứng day đủ các acid amin như acid pantothenic, valin, alanin, prolin , một số chất kích thích sinh trưởng như p - aminobenzoic, acid nicotinic, folic, biotin và một số chất khoang K, Ca, Mg, Fe, S, P, có thé ở dang muối vô cơ hay hợp chất hữu cơ.

Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại vi khuẩn acetic dựa trên các tính chat sinh hoá cụ thé sau: khả năng tao catalase, khả năng tổng hợp các chat ketol từ những rượu bậc cao như glycerol, mannitol, sorbitol , khả năng oxy hóa acetat thành CO2 và nước, kha năng oxy hóa glucose thành acid gluconic, khả năng sử dụng muối amon làm nguồn nito trong môi trường Hoyer va sử dụng rượu etylic làm nguồn carbon, khả năng tạo sắc tố nâu, khả năng tong hợp cellulose Trên cơ sở nảy, Frateur đã chia vi khuẩn acetic thành 4 nhóm: suboxydan, mesoxydan, oxydan, peroxydan: nhóm suboxydan gồm các loài Acetobacter suboxydaz va Acetobacter melanogennum: nhóm mesoxydan gồm Acetobacter xylinum, Acetobacter aceti va Acetobacter mesoxydans; nhóm oxydan gồm các loài không có khả năng tạo các hợp chất ketol: Acetobacter ascendans, Acetobacter ransens va Acetobacter lovaniens, nhóm peroxydan gồm Acetobacter pezoxydans và Acetobacter paradoxum không chứa catalase va không oxy hoá được glucose [25].

1.2.2.1 Giới thiệu Phân loại Gluconacetobacter

Lớp: Schizomycetes Bộ: Pseudomonadales Bộ phụ: Pseudomonadiace

Họ Acetobacteraceae bao gồm các giống Gluconacetobacter, Acidomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Asaia va Kozakia Trong đó, giỗng Gluconacetobacter và Acetobacter là có khả năng tong hop cellulose hiệu quả nhất Vì thế, đây là hai giống tiêu biểu được ứng dụng rộng rãi nhất trong các chủng vi khuẩn acetic Gan đây, các nhà nghiên cứuc n phát hiện chung đóng vaitr chính trong hệ lên men hình thành acid glucuronic.

Vi khuẩn Gluconacetobacter có thé được tim thay từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên Đặc biệt, vi khuẩn này dễ dàng phân lập từ giảm, thạch dừa, trà kombucha do chúng đóng vaitr chính trong các hệ lên men này.

Pee a eS We ae pe hor AND

Hình 1 Vi khuan Gluconacetobacter xylinus [25]

1.2.2.2 Dic diém hinh thai Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuan Gram âm, có dạng hình que thắng hoặc hơi cong, kích thước khoảng 0.3-0.6 x 1.0-8.0um thay đổi tùy loài Các tế bảo đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường | ng và môi trường khí Khi phát triển trên môi trường nuôi cấy, các tế bào được bao bọc bởi chất nhay tạo thành váng cellulose, váng này có ban chat là hemicellulose nên bắt màu xanh với thudc nhuộm Iod và acid sulfuric.

Khi phát triển trên môi trường khắc nghiệt, Gluconacetobacter bién đôi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh va dan dan sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kẻ.

Nhóm vi khuẩn này sinh trưởng tốt ở nồng độ pH thấp Trong quá trình hoạt động và biến dư ng, chúng sinh ra acid acetic, nồng độ acid aectic sinh ra có thé trên 4.5%.

Tuy nhiên, khi acid acetic sinh ra quá mức giới hạn hạn cho phép sẽ ức chế lại chính hoạt động của chúng.

Gluconacetobacter có khuẩn lac nh_, tròn, bé mặt nhay và trơn bóng, phan giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn va tâm có màu sam hon, ria mép khuẩn lạc nhẫn Sau 5 ngày nuôi cay, đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 — 5 mm Khi nuôi cây trong môi trường thạch, Gluconacetobacter phát triển thành từng tế bào riêng lẻ, nhay và trong suốt Khi già, các tế bào dính với nhau thành từng cum moc theo đường cấy Trong môi trường | ng, sau 24h nuôi cấy sẽ xuất hiện một lớp váng đục trên bề mặt, sau 36 - 48h sẽ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày [26].

1.2.2.3 Đặc điểm sinh lý của Gluconacetobacter Gluconacetobacter oxy hóa ethanol thành acid acetic, acid acetic sẽ tiếp tục bị oxy hóa thành COa và nước Chúng có khả năng tổng hợp cellulose, cho phản ứng catalase dương tính nên tạo bọt khí trong dung dịch lên men Hầu hết Gluconacetobacter không tăng trưởng trên môi trường Hoyer và không tạo sắc tố nâu Chúng có thể chuyển hóa glucose thành acid gluconic và acid glucuronic, chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetol [26].

1.2.2.4 Đặc điểm sinh trưởng của Gluconacetobacter Đặc điểm nổi bật nhất của vi khuẩn Gluconacetobacter là khả năng sinh cellulose.

NHOM VI KHUAN LACTIC 1 Tong quan về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là một trong những chủng vi khuẩn được biết đến va sử dung rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau.

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương thường không di động, không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm Những vi khuẩn này không có khả năng tổng hợp nhân heme của các porphyrine nên chúng là vi khuẩn vi hiểu khí bắt buộc Chúng lên men theo hai kiểu là homofermentative (lên men đồng hình) và heterofermentative (lên men di hình).

Vi khuẩn lactic yêu cầu hàm lượng chất dinh dư ng cao và phức tạp đối với môi trường sống Chúng có khả năng tự tong hợp được các acid amin và vitamin nhưng rất hạn chế Vì vậy, môi trường sống yêu câu cung cấp một số lượng lớn vitamin (riboflavin, thiamine, acid folic, biotin và những vitamin khác), acid amin, acid pantotemic, acid nicotic, purine va pyridine Ngoài ra, sự sinh trưởng va phát triển của vi khuẩn lactic c n phụ thuộc vào một số yếu tố như pH, nhiệt độ và sự tích lũy các sản phẩm chuyển hóa tích lũy trong môi trường sống [28].

Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng bao gồm nhiều giống, loài Tế bảo dạng hình cầu bao gồm: Streptococcus, Lactococcus, Entercoccus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus Chúng thường sống ở những noi san xuất sữa (Lactobacillus brevis, L bulgaricus, L casei, L fermentum) và trong màng nhay ruột của người và động vật (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium, Enterococcus faecalis,

Streptococcus salivarius, S bovis, S pyogenes, S pneumoniae) Vi khuẩn lactic có hệ thống vận chuyền lớn, phức tạp dé vận chuyén các acid amin, dipeptide, tripeptide va oligopeptide nhăm tích lũy dinh dư ng từ môi trường Những hệ thống nay nam ở màng tế bao chất Quá trình trao đôi chất chính là quá trình đường phân va chu trình pentose phosphate Trong hệ vi khuẩn lactic, NADH được oxy hóa thành NAD* Từ con đường nay chúng chuyển đối pyruvate thành lactate với việc sử dung lactate dehydrogenase.

Ngoài ra, màng tế bào vi khuẩn lactic có enzyme protease có thể phân giải protein thành những peptide nh hơn Trong tế bảo, những peptide nh này được phân hủy thành những acid amin bằng enzyme peptidase [29].

Nhóm vi khuẩn lactic gồm nhiều d ng với các giới hạn nhiệt độ sống khác nhau.

Các dòng ưa 4m có giới hạn nhiệt độ sinh trưởng nam trong khoảng 25 - 35°C, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ sinh trưởng trong khoảng là 40 - 45°C, còn các loài ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ tương đói thấp (5°C hoặc có thé thấp hơn) Khi nhiệt độ lên tới 60 - 80°C thì hau hết chúng không sống sót sau 10 - 30 phút.

Một số loài có khả năng tạo thành màng nhây Một số khác lại có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm Như vậy, ngoài khả năng tạo thành acid lactic thì các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn [30].

Năm 1900, Moro lần dau tiên phân lập Lactobacillus acidophilus từ phân su trẻ em Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đối chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này [29].

Phân loại vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli

Vi khuẩn L acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bat buộc Chúng chủ yếu được ứng dụng lên men các sản phẩm từ sữa như sữa chua, một số loại phô mai và đậu nành lên men Một sô thực phầm lên men như dưa cai, kim chi, kombucha cũng

11 chứa vi khuẩn L acidophilus [29] Hiện nay, cũng có một số nghiên cứu sản phẩm lên men nước trái cây sử dụng vi khuẩn L Acidophilus tạo thức uống probiotic.

1.3.2.2 Đặc điểm hình thái L acidophilus là vì khuẩn Gram dương, có dạng trực khuẩn hình que dai và chịu nhiệt TẾ bào hình que, dau tr n, kích thước 0.6 - 0.9 x 1.5 - 6 um, đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, và không sinh bào tử.

Trên môi trường thạch MRS, khuẩn lạc có mùa trắng đục, dạng tròn, nh , ở giữa dày va đục hơn ở mép ngoai Trong môi trường thạch sâu, khuẩn lạc có hình dạng không 6n định Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc có bề mặt trắng đục và phát triển lan theo vết cấy.

Hình 2 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [3 Ì | 1.3.2.3 Đặc điểm sinh lý

L acidophilus có kha năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol tạo thành acid lactic và một số hop chat thir cap khac L. acidophilus cũng sản xuất ra lactase là enzyme có kha năng phân huỷ đường lactose thành các loại đường đơn giản.

Vi khuẩn L acidophilus là loài ưu am, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37°C Chúng chịu được môi trường acid cao, phat triển tốt ở mức pH dưới 5.5[30].

1.3.2.4 Đặc điểm sinh sản L acidophilus là vi khuẩn sinh sản bang cách chia đôi hay trực phân Mặc dù không có hình thức sinh sản hữu tính (chỉ là sinh sản cận hữu tính), nhưng các biến đối di truyền vẫn xảy ra trong từng tế bào vi khuẩn thông qua các hoạt động tái tổ hợp di truyền [30].

1.3.2.5 Các ứng dụng noi bat của Lactobacillus acidophilusVi khuẩn L Acidophilus là một trong những chủng vi khuẩn probiotic điển hình.

Vi khuẩn L Acidophilus có tác dung cân băng hệ vi sinh đường ruột trong cơ thể người nên ứng dụng noi bật nhất là điều trị rối loạn tiêu hóa và các bệnh đường ruột L. acidophilus sinh acid lactic giúp ức chế và loại trừ các vi khuẩn có hai ra kh i hệ tiêu hóa Vi khuẩn L acidophilus còn có công dụng tăng khả năng hap thu lactose bằng cách tiết ra enzyme lactase Đặc biệt, L acidophilus có kha năng tong hop mot số vitamin nhóm B (niacin, folic acid, biotin, Bs và K) và đóng góp trong quá trình chuyển hóa cholesterol Bên cạnh đó, L acidophilus c n được ứng dung để chữa trị các bệnh viêm nhiễm do vi khuẩn sinh ra như viêm âm đạo, điều trị táo bón, viêm loét đại tràng, tiêu chảy đối với người lớn và trẻ em[32].

Vi khuẩn L acidophilus là vi khuẩn đặc biệt thích nghi trên môi trường sữa Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng đã công bố ứng dụng lên men Vi khuẩn L acidophilus trên một số môi trường khác như trên môi trường các loại nước trái cây nhằm đa dạng hóa các sản phẩm probiotic Đặc biệt trong những năm gan đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung và các phế phẩm nông nghiệp để nâng cao giá trị kinh tế các sản phẩm probiotic

HOAT TINH SINH HOC CUA ACID GLUCURONIC 1 Acid glucuronic va co ché sinh tong hop acid glucuronic

Acid glucuronic là một hợp chất hữu co có nguén gốc carbohydrate có công thức phõn tử CứHĂoO; và cụng thức cõu tạo HCO(CHOH)4COOH Acid glucuronic và acid gluconic cú cựng cụng thức phõn tử (CứHĂzOằ) và là đồng phõn của nhau Cả hai loại acid đều được hình thành từ quá trình oxy hóa của glucose nhưng ở những vi trí carbon khác nhau.

Hình 3 Công thức cấu tạo của acid glucuronic [5]

Acid glucuronic không tìm thay ở dạng tự do ngoài môi trường Trong cơ thé người, acid glucuronic được tổng hợp từ chu trình uronic trong gan nhưng với lượng rất ít Ngoài tự nhiên, acid glucuronic ton tại trong một số loại cây dược liệu như cam thảo, có một số nghiên cứu cho thấy chúng tổn tại trong trà Kombucha.

1.4.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp acid glucuronic Đến thời điểm hiện nay, cơ chế sinh tổng hợp acid glucuronic đã được nghiên cứu và biết đến là trong cơ thé sông Ngoài ra, một số nghiên cứu phát hiện vi sinh vật có khả năng tiết ra acid này Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể cơ chế sinh tổng hợp ở tế bào vi sinh vật Các nhà khoa học chỉ công bố chúng được tiết ra bởi sự cộng sinh tương hỗ của một hệ nhiều vi sinh vật như hệ lên men trà nắm Kombucha.

Acid glucuronic là kết quả của sự oxy hóa glucose ở carbon thứ 6 (hình 5) Cơ chế oxy hóa được trình bày ở hình 4.

(CHOH, ~— TẾ (CHOH), zc >ằ (CHOH)

O Giuconic acid Glucose Glucuronic acid

Hình 4 Sự oxy hóa glucose tao thành acid glucuronic [33 |

Glucuronide UDP NADPH NADP L-gulono-y-lactone Ì Ì /— 1

UDP-D-glucuronic acid CC — p-ofucuronic acid &“——— L-gulonic acid

UDP-D-glucose 3-ox0-L-gulonic acid

D-fructose-6-phosphate > Pentose phosphate pathway 5 D-xylulose

Hình 5 Sự tổng hợp acid glucuoronic ở sinh vật [5]

Trong các nghiên cứu đã công bó, khi trình đường phân Embden-Meyerhof-Parnas xảy ra, các glucose-6-phosphate sau khi chuyền hóa thành fructose-6-phosphate sẽ thực hiện các phản ứng tạo thành pyruvate dé vào chu trình Kreb Thay vào đó, nó sẽ đi vào lộ trình pentose phosphate gồm 2 giai đoạn oxy hóa và tái tao hexose phosphate, pentose phosphate gây ra sự oxy hóa và sự khử nhóm carboxyl tại vi tri Cl cua glucose 6- phosphate, khử NADP+ thành NADPH va pentose phosphate, dưới sự xúc tac của UDP sẽ tạo thành acid glucuronic.

1.4.2 Ứng dụng của acid glucuronic trong phòng và điều trị bệnh Acid glucuronic là một acid có ý nghĩa quan trọng đối với sức kh e con người.

Nỗi bật nhất là khả năng liên kết thải độc, găn liền với chức năng gan Nó có khả năng găn với các gốc tự do để hình thành dạng liên hợp giúp tế bào tăng khả năng đào thải hoặc phân giải các độc t6 thành các chất đơn giản hơn và thải ra ngoài cơ thé Ngoài ra, acid glucuronic có kha năng chống các gốc tự do có hại giúp tăng khả năng chống lão hóa và ung thư, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, tiêu đường, Gout [5]

1.4.2.1 Kha năng thai độc va loại bỏ các gốc tự do trong máu klectrophiles ilic R——R R— 5 _——*> R—SG

R Phase I Phase H Ny —> R—SO3H Hydrolysis ~~ ae 3

Reduction ROH R—SH R—NH; >~„R Ac

Hình 6 Mô hình chung về sự dao thải độc tô của acid glucuronic [5]

Hình 6 trình bay khả năng liên hợp với các độc tố và gốc tự do để chuyền hóa thành những chat h a tan và đào thai chúng ra kh i cơ thé Acid glucuronic ở dạng hoạt hóa được tạo ra do sự oxy hóa glucose ở dang UDP glucose Sau đó, nó sẽ liên hợp với độc chất nhờ xúc tac của UDP glucuronyl — transferase nằm ở microsom gan dé tạo thành glucuronid Dạng liên hợp glucuronid tạo thành có tính acid, ion hoá được ở pH sinh lý, rất tan trong nước, nên được thải nhanh qua hệ thống niệu đạo.

Quá trình diễn ra gồm 3 phản ứng:

Glucose | phospat + UTP ———— UDP glucose + PP (1)

UDPslucose UDP glucose + 2NAD* UDPGA + 2NADH, (2) dehvdrogense

UDP slucuronyl UDPGA+ X X- glucuronid + UDP (3) lransferase

UDPGA là acid glucuronic hoạt hoa

X: thuốc hay hoá chất UDP glucose - dehydrogenase: enzym trong tế bào chất

UDP glucuronyl - transferase: enzym trong microsom gan

1.4.2.2 Kha nang loại bó biliburin va cholesterol

Bilirubin là san phẩm thoái hóa của nhân porphyrin của hemoglbin Trong tuần hoàn máu chất, bilirubin được gan với albumin và vận chuyên tới gan nhờ glueuronyl transferase Tai gan, bilirubin liên hợp với hai phân tử acid glucuronic trở thành bilirubin diglucuronic Libirubin liên hop này rất tan trong dịch tế bào và được gọi là bilirubin trực tiếp hoặc bilirubin gan Loại bilirubin chưa liên hợp được gọi là bilirubin tự do, bilirubin gián tiếp hoặc bilirubin trước gan Bilirubin liên hợp cùng với acid mật được tích ở túi mật Trong quá trình tiêu hoá, bilirubin liên hợp tư túi mật được tiết vào ruotj non, vi khuẩn trong ruột non sẽ biến bilirubin liên hợp này thành urobilinogen và stercobilinogen Sau đó được thải ra ngoài theo phân hay nước tiểu.

HúCH yX ` zỉ Q.7 v HOR _ coo [00 — O( coo › đi his hes in

H.C CH H.C CH: R, Rp R, R Ry R, l,: -CH;

Hình 7 Sự chuyên hóa bilirubin [5]

(a) Bilirubin tự do không h a tan trong dung dịch nước (b) Bilirubin-UGT liên kết với acid glucuronic tạo ra bilirubin-diglucuronide làm cho biliburin được đào thải ra ngoài.

Cholesterol gây xơ vữa động mạch, làm cứng thành mạch máu gây hại nghiệm trọng đối với sức kh e nên cần phải được loại b Cũng giống nhưc chế liên kết với bilirubin, cholesterol trong máu được chuyên hóa nhờ acid glucuronic liên kết với các lipoprotein trong máu làm giảm lipoprotein tỷ trọng rất thấp, đồng thời làm tăng sản xuất lipoprotein tỷ trọng cao vac n làm giảm triglycerid máu Do đó, cải thiện đáng kể sự hiện diện cholesterol trong máu [6].

1.4.2.3 Khả năng hỗ trợ điều trị bệnh Gout và khá năng phòng chống ung thư Bệnh Gout là do sự tích tụ quá nhiều acid uric trong cơ thé gây ra Acid uric được sản sinh từ sự phân hủy của các chất gọi là purin và thường h a tan trong máu Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng sự có mặt của acid glucuronic làm ức ché sự tong hop enzyme proteoglycanase va colagenase trong sun va gan vao nhan purine lam giam nông độ acid uric trong mau Từ đó, giảm nguy co bệnh Gout [6].

Năm 1996, các nha khoa học Nhật Bản đã nhận thấy rang acid glucuronic có thé liên kết với fucose sulfat và mannose sulfat tạo thành cấu trúc U-fueoidan làm thúc đây quá trình Apoptosis (quá trình tự hủy) trong tế bào ung thu dạ dày va ruột nên có tác dụng làm phá hủy các tế bao ung thư Phát hiện nay có ý nghĩa quan trọng đối với việc ph ng ngừa và điều trị bệnh ung thư.

CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIEN QUAN VE HƯỚNG CUA DE TÀI

Acid glucuronic đã được quan tam va nghiên cứu từ kha sớm Những năm 1928 đã bắt đầu xuất hiện những nghiên cứu về acid glucuronic Trong giai đoạn này chủ yếu là các nghiên cứu về nguôn gốc của acid glucuronic và sự sinh tong hợp cũng như tam quan trọng của nó đối với cơ thể người Đến những năm đầu thế kỷ 20, các vấn đề về sản xuất acid glucuronic bat đầu được quan tâm, đặc biệt là sản xuất từ vi sinh vật.

Năm 1970, đã có những nghiên cứu định lượng acid glucuronic băng phổ khối

Mass spectrometry — MS Năm 1999, Hwang va cộng sự đã chứngt su hiện diện cua acid glucuronic khi lên men trong điều kiện ky khí không hoàn toàn bởi vi khuẩn Acetobacter xylinum Từ day, đã dẫn đến tiền dé là vi khuẩn acetic đóng vai tr quan trọng trong hệ lên men hình thành acid glucuronic [34] Bước sang những năm dau thé kỷ 21, các nhà khoa học thiên về nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men acid glucuronic trên hệ vi sinh vật acetic Năm 2008, Khan và cộng sự nghiên cứu về quá trình lên men

17 tăng hàm lượng acid glucuronic dựa trên quá trình lên men tạo cellulose bởi chủng vi khuẩn Gluconacetobacter [1] Nam 2010, Yavari và cộng sự công bồ kết quả toi ưu hóa quá trình lên men nước trái cây sinh acid glucuronic dựa trên quá trình lên men trà

Kombucha [2] Vào năm 2011, Yavari và cộng sự tiếp tục công bố kết quả tối ưu hóa quá trình lên men nước nho sinh acid glucuronic bởi hệ nam tra [3] Năm 2010, Yang và cộng sự lần dau tiên nêu kha năng chống lại các tác động có hai của vi khuẩn của trà Kombucha và Kefir trong việc thúc day tạo ra acid glucuronic Trong điều kiện yếm khí tùy tiện, vi khuẩn acid acetic tổng hợp acid glucuronic thay vi cellulose vi khuẩn va giảm như trong điều kiện hiếu khí Vi khuẩn acid lactic trong trường hợp này làm việc như một tác nhân kích thích dé tạo ra acid glucuronic bởi vi khuẩn acid acetic [7] Nam 2013, Vina và cộng sự đã công bố quá trình tối ưu hóa lên men nấm trà thu nhận acid glucuronic với hàm lượng cao nhất là 178 mg/I [31]. Ở Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về ứng dụng cũng như khả năng thu nhận acid glucuronic c n khá mới mẻ Năm 2010, acid glucuronic được mô tả trong tài liệu dược lý của Võ Thị Anh Trà có tác dụng hỗ trợ liên kết giải độc gan, hỗ trợ chuyền hóa giảm cholesterol, biliburin, điều trị bệnh Gout, [6] Hiện nay, chỉ có một vài nghiên cứu được công bồ xoay quanh van dé nâng cao hàm lượng acid glucuronic thu được khi lên men trên hệ vi sinh vat vi khuẩn acetic và lactic Năm 2014, Nguyen và cộng sự cải thiện việc sản xuất acid glucuronic trong trà nam cộng sinh của các vi khuẩn acid acetic và lactic [8] Cũng trong năm 2014, Ly và cộng sự công bố quá trình tối ưu hóa lên men sữa chua dựa sự cộng sinh của vi khuẩn acetic và lactic Kết quả thu được hàm lượng acid glucuronic sau lên men đạt 59.81mg/I Từ kết quả nghiên cứu này, mở ra định hướng mới về các nghiên cứu sản phẩm probiotic có sự kết hợp của vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng có hoạt tinh sinh học cao

Vé van dé su tac dong cua nhom vi khuẩn lactic đối với nhóm vi khuẩn acetic trong hệ lên men sinh acid glucuronic, đến thời điểm hiện tại vẫn chưa có nghiên cứu cụ thé chứng minh sự tương tác qua lại của hai nhóm vi khuẩn acetic va lactic Tuy nhiên, các nghiên cứu công bố kết quả thực nghiệm xoay quanh van dé nay lại khá phong phú.

Yang và công sự (2008) đã công bố kết quả nghiên cứu về sự tương tác của các nhóm vi khuẩn trong hệ vi sinh lên men trà Kombucha [7] Trong nghiên cứu nay, Yang đã chỉ ra là nhóm vi khuẩn lactic hỗ trợ nhóm vi khuẩn acetic tang khả năng sinh tổng hop d — saccharide acid — 1,4 lactone (DSL) Trong chu trình glucuronate, sự hiện diện cua

DSL có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hop acid glucuronic Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn lactic có khả năng phân giải co chất lên men thành các chất đơn giản hơn như acid acetic, xytolitol, tạo diều kiện thuận lợi cho nhóm vi khuẩn acetic sinh trưởng và phát triển [7] Ngoài ra, kết quả một số nghiên cứu công bố gan đây khang định với sự bồ trợ của nhóm vi khuẩn lactic thì nhóm vi khuẩn acetic tăng khả năng sinh tong hop acid glucuronic Nguyen va cộng sự (2014) đã dẫn chứng trong công bồ rang sự kết hợp giữa vi khuẩn lactic va acetic sẽ làm tăng sự sinh tổng hop DSL va DSL quyết định sự hiện diện của acid glucuronic [8] Năm 2015, Nguyen và cộng sự tiếp tục công bố kết qua thử nghiệm khi bồ sung vi khuẩn lactic vào hệ lên men vi khuẩn acetic trên trà đen Kết quả thé hiện hàm lượng acid glucuronic tăng đáng kể khi bố sung vi khuẩn lactic [35].

Cũng trong năm 2014, Ly và cộng sự cũng có nghiên cứu bố sung vi khuẩn acetic vào hệ lên men sữa chua nhằm tăng hoạt tính sinh học của sữa chua truyền thống bởi sự có mặt cua acid glucuronic trong sản phẩm [14].

Nói tóm lại, acid glucuronic là một có ý nghĩa rat quan trọng đổi với sức khỏe con người Diéu này đã thúc đây các nhà nghiên cứu quan tâm và đã có một vài công bố nghiên cứu sản xuất acid này Tuy nhiên, đến thời điểm hiện nay, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu lên men vi khuẩn acetic hoặc lên men một hệ vi sinh vật khảo sát trên một số môi trường lên men nhằm thu nhận lượng acid glucuronic tích lũy Vi vậy, nghiên cứu kết hợp lên men giữa hai vi khuẩn acetic va lactic trên môi trường nước dừa già là một trong những hướng mới dựa trên cơ sở khoa hoc các nghiên cứu tiên dé của chính nhóm nghiên cứu đã công bo.

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường 2.1.1 Nguôn giống vi sinh vật

Chung vi khuẩn sử dụng dé thực hiện thí nghiệm là hai d ng vi khuẩn có hoạt tinh sinh học cao được cung cấp bởi Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Đại học Bách Khoa, đại học quốc gia thành phố Hỗ Chí Minh [13].

- Chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus với số đăng ký AB911464.1 có trình tự đoạn gen 16S như sau:

AGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGT TGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTAC GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGC AACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGT GAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAG AAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCA AGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAA GTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTT TTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAAT GCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGC AACTGACGCTGAGGCTCGAAAGC

Ident Accession score score cover value

Lactobacillus acidophilus gene for 16S rRNA, partial sequence strain: JCM 7711 952 952 100% 0.0 99% AB911464.1

- Ching vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola với số đăng ký NR_041012.1 có trinh ty doan gen 16S cua nhu sau:

TGGCTCAGAGCGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCAAGTCGCACGAACCTTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTAGGGATCTGTCCACGGGTGGGGGATAACTTTGGGAAACTGAAGCTAATACCGCATGACACCTGAGGGTCAAAGGCGCAAGTCGCCTGTGGAGGAACCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGATGATCGATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAAT

Ident Accession score score cover value

Gluconacetobacter nataicola strain LMG 1536 185 ribosomal RNA gene, partial sequence 621 821 100% O.0 100% NR 040121

Nước dừa già sử dụng tiến hành thí nghiệm thuộc giống dừa ta (Bến Tre) Nước dừa già dùng dé tiễn hành thí nghiệm phải là nước dừa tinh khiết vừa tach kh i quả dừa.

2.1.3 Hóa chất, thiết bị Trang thiết bị và hóa chất sử dụng gồm các trang thiết bị và hóa chất của bộ môn Công nghệ Sinh học - trường Dai học Bách Khoa — Dai học Quốc gia TPHCM.

Tủ cay Nồi hấp tiệt trùng

Tủ sấy Tủ lạnh trữ mẫu Máy quang phố UV vis

Máy đo pH Máy ly tâm Máy vortex

Kinh hién vi Tủ ủ ổn nhiệt Máy ủ lắc v ng

Acid acetic Acid citric NaOH HCl Naphthoresorcinol

Bảng 5 Môi trường dinh dư ng

Môi trường Công dụng Cách sử dụng

Gif giông vi khuân lactic

Hòa tan 55.15g MRS agar trong

1000ml nước cất, hấp tiệt trùng 121°C/15 phút Sau đó phân phối môi trường vào dia Petri tiệt trùng (10ml/đĩa) Thạch môi trường sau khi đỗ đĩa sẽ để 24h ở nhiệt độ thường nhăm kiểm tra khả năng lây nhiễm rồi mới đem sử dụng.

HS (Heschin- Gif giông vi khuân

H a tan môi trường với nước cất, hấp tiệt trùng 121°C/15 phút Sau đó phân phối môi trường vào đĩa Petri tiệt trùng (10ml/đĩa) Thạch môi Charmn) A gar acetic : : trường sau khi đô đĩa sẽ dé 24h ở nhiệt độ thường nhằm kiểm tra khả năng lây nhiễm rồi mới đem sử dụng.

Bồ sung đường (10 % glucose), hap

Nhân giống vi khuẩn | tiệt trùng 121°C/15 phút Sau đó phân

Nước dừa acetic va lactic phối môi trường bình nhân giống tiệt trùng.

Dựng đường Dựng đường cong sinh cong sinh trưởng trưởng

Giống vi sinh Gi Giống vi sinh vật vật G nataicola itt giống L "TC

—_> thich hop thu nhan acid glucuronic Khao sát điều kiện lên men

Tối uu hóa điều kiện lên men thu nhận acid glucuronic trên cơ chat nước dừa

Vv độ vi khuẩn độ vi khuẩn lượng Xác định pH ff nhiệtđ@len || thời gian lên acetic ban dau lactic ban dau lên menđường bổ men men

Xác định mật Xác định mật | Xac dinh Xác định Xác định

Quy hoạch thực nghiệm băng phương pháp đáp ứng bê mặt RSM theo phương án câu trúc có tâm CCD

Hình 8 Quy trình tong quát

2.2.2 Thiết kế thí nghiệm Muc đích: Xác định tâm thí nghiệm dé đưa vào mô hình tối ưu hóa các điều kiện lên men nước dừa sinh hàm lượng acid glucuronic cao băng phương pháp đáp ứng bề mặt với phương án cấu trúc tâm RSM-CCD.

Tiến hành: các thí nghiệm được tiễn hành tuần tự theo phương pháp cô điển dé lay kết quả của thí nghiệm trước làm tiền đề nghiên cứu cho thí nghiệm sau Trong mỗi thí nghiệm, sẽ có 1 yếu tô được khảo sát với phạm vi khảo sát xác định từ các nghiên cứu đã được công bố, các yếu tố c n lại được giữ cố định.

Các chỉ tiêu theo đối: Hàm lượng acid glucuronic.

Các số liệu thu được sẽ được xử ly bang phân mềm thống kê Excel và Stagraphic

2.2.2.1 Cac thi nghiém tién dé a Dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn lactic trên co chất nước dừa già Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn lactic được dựng dựa trên mật độ tế bao trong mỗi thời điểm thời gian Thí nghiệm được tiến hành giới han trong các mốc thời gian khác nhau, 3 lần lặp lại:

+ Ong Falcon chứa 14ml nước dừa (đã khử trùng) và 1ml giống vi khuẩn lactic (5 log

+ Méc thời gian khảo sát: khảo sát trong vòng 48 gid, mỗi lần lay mau cách nhau 2 gIỜ.

+ Chỉ tiêu khảo sát : sau mỗi lần lay mau, mỗi mẫu thí nghiệm sẽ được tiễn hành do chỉ số OD và đếm mật độ vi khuẩn. b Dựng đường cong sinh trướng của vi khuẩn acetic trên co chất nước dừa già Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn acetic được dựng dựa trên mật độ tế bào trong mỗi thời điểm thời gian Thí nghiệm được tiến hành giới han trong các mốc thời gian khác nhau, 3 lần lặp lại:

+ Ong Falcon chứa 14ml nước dừa (đã khử trùng) và Iml giống vi khuẩn acetic (5 log CFU/ml).

+ Méc thời gian khảo sát: khảo sát trong vòng 96 gid, mỗi lần lay mẫu cách nhau 3 gIỜ.

+ Chỉ tiêu khảo sát: sau mỗi lần lay mau, mỗi mau thí nghiệm sé được tiến hành do chỉ số OD và đếm mật độ vi khuẩn.

2.2.2.2 Khảo sát sự anh hưởng điều kiện lên men ảnh hướng đến khả năng thu acid glucuronic trên co chất nước dừa già

Thí nghiệm được tiễn hành trên môi trường nước dừa được chủng giống vi khuẩn acetic va vi khuẩn lactic đã được nhân giống Thí nghiệm được bồ trí ngẫu nhiên 1 nhân tố với 5 mức độ và 3 lần lặp lại.

- Chế độ lắc đảo: 0, 30, 60, 90, 120 rpm/phút.

Các yếu tô cô định: mật độ vi khuẩn lactic ban đầu: 5 lo g CFU/ml, mật độ vi khuẩn acetic ban đầu: 5 log CFU/mL, sucrose: 10%, nhiệt độ: 35°C, pH: 5, thời gian: 36h.

Kết quả thi nghiệm sé được sử dung làm cho các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2.3 Khao sát các yếu tổ ảnh hưởng đến khả năng sinh acid glucuronic trên cơ chất nước dừa già a Xác định anh hướng của mật độ giống vi khuẩn acetic ban đầu đến kha nang sinh acid glucuronic

Thí nghiệm được tiễn hành trên môi trường nước dừa được chủng giống vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic đã được nhân giống Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 5 mức độ và 3 lần lặp lại.

- Yếu tô khảo sát: mật độ vi khuẩn acetic ban đầu: 3, 4, 5, 6, 7 log CFU/ml - Cac yếu tố cô định: mật độ vi khuẩn lactic ban đầu: 5 log CFU/ml, sucrose:

10%, nhiệt độ: 35°C, pH: 5, thời gian: 36h. b Xác định ảnh hướng của mật độ giống vi khuẩn lactic ban đầu đến kha nang sinh acid glucuronic

Thí nghiệm được tiễn hành trên môi trường nước dừa được chủng giống vi khuẩn acetic và vi khuẩn lactic đã được nhân giống Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 5 mức độ và 3 lần lặp lại.

- Yếu tô khảo sát: mật độ vi khuẩn lactic ban dau: đối chứng (0), 3, 4, 5, 6 log

KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Các nghiên cứu tiền đề Đường cong sinh trưởng biểu thị quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong chu kỳ sống qua những thời điểm khác nhau Các mốc thời gian của các pha sinh trưởng giúp nhận biết được thời điểm vi khuẩn tạo sản phẩm trong chu trình sống của tế bào Vì vậy, việc lập được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn đóng vai tr quan trọng đối với mục đích xác nhận mốc thời gian thu nhận sản phẩm từ vi sinh vật này.

3.1.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Quá trình lập đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus trên cơ chất nước dừa già được khảo sát trong v ng 48 giờ Mỗi lần lay mẫu cách nhau 2 giờ.

Kết quả được trình bày ở biểu dé 1. Đường cong sinh trưởng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Mat sé vi khuẩn (log CFU/ml) OrRFN WwW fuDHD Ns CO WO

Biểu đồ 1 Đường cong sinh trưởng vi khuân Lactobacillus acidophilus Đường cong sinh trưởng của vi khuân Lactobacillus acidophilus cho thay các giai đoạn tăng trưởng của vi khuẩn như sau: sau 10h thích nghi, vi khuẩn bat đầu vào pha tăng trưởng Mật độ tế bao thời điểm nay là cao nhất, khoảng 10 logCFU/ml Giai đoạn này, tong lượng vi khuẩn hiện diện trong môi trường cơ chat bắt đầu tăng nhanh đột biến kéo theo sự phân chia các hợp chất trong môi trường rất mạnh Pha tăng trưởng kéo dài từ giai đoạn 10h đến 20h thì bat đầu đi vào pha cân bang Giai đoạn pha cân bang khá ồn định và kéo dài từ giai đoạn 20h đến giai đoạn 40h Sau 40h, lượng tế bao vi khuẩn trong cơ chất khảo sát bắt đầu suy giảm và sau 44h thì giảm rõ rệt.

3.1.2 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola Quá trình lập đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola trên cơ chất nước dừa già được khảo sát trong v ng 96 giờ Mỗi lần lẫy mẫu cách nhau 3 giờ Kết quả được trình bay ở biểu đồ 2. Đường cong sinh trưởng vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola

Mat sé vi khuẩn (log CFU/ml)

Biéu đồ 2 Kết quả đường cong sinh trưởng vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola Kết quả đường cong sinh trưởng vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola cho thay pha thích nghi nhanh hơn so với vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Chỉ sau hơn 4 giờ, vi khuẩn G nataicola đã bat đầu tăng trưởng nhẹ và sau hon 16 giờ bat đầu tăng trưởng nhanh đột biến đến 36 giờ thì đi vào pha cân băng Trong pha tăng trưởng, vi khuẩn sẽ phân cắt, biến dư ng chất dinh dư ng đồng thời đây cũng là giai đoạn tiết các hợp chất sản phẩm bậc 2 phục vụ nhu cầu sinh trưởng và phát triển của chúng Và đây cũng chính là giai đoạn thích hợp nhất dé thu nhận sản phẩm acid vì sau giai đoạn nay, vi khuẩn sẽ tập trung tạo sinh khối Tiếp tục là pha cân bằng diễn ra trong khoảng thời gian 36 giờ đến 76 giờ Sau 76 giờ thì đi vào giai đoạn pha suy vong, lượng tế bào của vi khuẩn trong cơ chất khảo sát giảm rõ rệt.

Muc dich quá trình tương tác giữa hai vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola vàLactobacillus acidophilus trong môi trường nước dừa già là dé thu nhận acid glucuronic, sản phẩm do vi khuẩn G nataicola tiết ra Vì thé, thời gian thu nhận acid glucuronic sẽ là thời gian pha tăng trưởng của vi khuẩn G nataicola là từ 16 đến 36 giờ Đây là giai đoạn vi khuẩn tiết ra các sản phẩm trong đó có enzyme xúc tác và giai đoạn hình thành acid glucuronic sẽ dién ra ngay sau đó Hơn nữa, khoảng thời gian này cũng rơi vào pha tăng trưởng cua vi khuẩn L acidophilus, giai đoạn thích hợp hỗ trợ vi khuẩn G Nataicola sinh tong hợp acid glucuronic.

3.2 Kết qua khảo sát sự ảnh hưởng điều kiện lên men anh hưởng đến kha năng thu acid glucuronic trên co chất nước dừa già Điều kiện lên men được khảo sát ở hai điều kiện, lên men động và lên men tĩnh Ở điều kiện lên men dong, thí nghiệm khảo sát ở 30, 60, 90 và 120 rpm/phút Kết quả thí nghiệm được trình bay ở bảng 5.

Bảng 8.Anh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng hình thành acid glucuronic

Số vòng (rpm/phút) slucuronie (mg/l)

Chú thích: Các ký tự a, b,c cho thấy sự khác biệt với độ tin cậy 95%

Theo kết quả trình bày trên thì lượng acid sinh tổng hợp được ở quá trình lên men tĩnh đạt kết quả cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức c_n lại (72.48 mg/l) Ở các kết quả c n lại, lượng acid glucuronic thấp hơn nhưng không nhiều Kết quả này phủ hợp với kết quả của Tantratian và cộng sự (2005), khi vi khuan Acetobacter lên men trong điều kiện hạn chế lượng oxy hòa tan thi glucose sẽ chuyển hóa thành acid glucuronic và gluconic thay vì hình thành cellulose [35] Hơn nữa, nghiệm thức lên men tĩnh giúp cắt giảm chi phí nên có hiệu quả kinh tế hơn.

Vì vậy, nghiệm thức lên men tĩnh được chọn làm tâm thí nghiệm để tiễn hành các thí nghiệm kế tiếp.

3.3 Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành acid glucuronic trên cơ chất nước dừa già

3.3.1 Kết quả khảo sát các đơn yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành acid glucuronic Đối với quy hoạch thực nghiệm, xác định tâm các yếu tô là việc tiên quyết dé xây dựng mô hình thiết kế tối ưu hóa Mục đích của việc khảo sát các đơn yếu tô là xác định tâm thí nghiệm một cách đơn giản và chính xác nhất Theo tuần tự, các đơn yếu tố sẽ được tiễn hành lần lượt Kết quả tâm của yếu t6 trước sẽ được áp dụng dé thực hiện thí nghiệm xác định tâm yếu t6 sau Cuối cùng, các kết quả tâm thí nghiệm sẽ được đưa vào thực hiện tôi ưu hóa.

3.3.3.1 Anh hưởng của mật độ vi khuẩn Gluconacetobacter nataicola ban dau đến kha nang hinh thanh acid glucuronic

Trong quá trình lên men một co chat, tỷ lệ giống lên men đóng vai tr rat quan trọng vì nó quyết định hiệu suất của mẻ lên men Tỷ lệ giống còn có khả năng quyết định thời gian lên men nhanh hay chậm Vi thế, khảo sát ty lệ giống lên men là một trong những yếu tố quan trọng nhất cần phải thực hiện Trong hệ cộng sinh giữa hai vi khuẩn dé hình thành acid glucuronic, G nataicola đóng vai tr chính trong việc sinh ra acid này Do đó can phải xác định tỷ lệ giống thích hợp dé khởi động quá trình lên men sinh sản phẩm.

Kết qua của quá trình khảo sát được thé hiện ở biểu dé 3.

Mật độ vi khuẩn G nataicola ban đầu (logCFU/ml)

FEF NY WwW Ff UH wD xi GCG© CC CC CC CC CC CC

Hàm lượng acid glucuronic (mg/l)

Chú thích: Các ký tự a, b, c cho thấy sự khác biệt với độ tin cậy 95%

Biểu đồ 3 Ảnh hưởng của mật độ giống G nataicola ban đầu đến khả năng hình thành acid glucuronic

Kết qua trên cho thay ở mật độ giống ban dau là 4 log CFU/ml thi ham lượng acid được hình thành là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức c_n lại ở độ tin cậy LSD 95% Lượng acid hình thành ở mật độ này là 81.28 mg/ml Hàm lượng acid glucuronic tạo ra khi lên men ở các mật độ vi khuẩn c n lại thấp hơn O mật độ vi khuẩn ban dau là 3 log CFU/ml, hàm lượng acid sinh ra là 58.24 mg/I Nguyên nhân hàm lượng acid thấp có thể là do mật độ giống khởi động ban đầu quá ít nên không đủ tế bào vi khuẩn thực hiện lộ trình biến du ng dan dén viéc sinh ra acid thap Ở các nghiệm thức mật độ vi khuẩn ban đầu là 5, 6 và 7 log CFU/ml kết quả cao hơn so với mật độ 3 logCFU/ml nhưng vẫn thấp hơn mật độ 4 log CFU/ml Kết qua này có thé là do mật độ vi khuẩn khởi đầu quá nhiều nên cơ chất lên men không đủ đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển của chúng Sau một khoảng thời gian lên men, chúng sẽ sử dụng chính các sản phẩm của mình tạo ra dé đi vào quá trình dị hóa.

Tóm lại, mật độ giống vi khuẩn G nataicola ban đầu là 4 log CFU/ml là thích hợp nhất Hơn nữa, mật độ này cũng không quá cao nên có ý nghĩa về mặt kinh tế Vậy, mật độ này được chon làm tâm thí nghiệm dé thực hiện các thí nghiệm kế tiếp nhau.

3.3.3.2 Anh hưởng của mật độ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ban dau đến kha năng hình thành acid glucuronic

Theo các nghiên cứu đã công bố thì vi khuẩn L acidophilus không sinh ra acid glucuronic nhưng nó đóng vai tr hỗ trợ vi khuẩn acetic tăng khả năng sinh tong hợp acid glucuronic [7,8] Vì vậy, mục đích của thí nghiệm nay nhằm xác định mật độ vi khuẩn L acidophilus thích hợp để bố sung vào hệ lên men nhăm thu được acid glucuronic hàm lượng cao nhất.

Kết quả thí nghiệm được trình bày ở biểu đồ 4.

Mật độ vi khuẩn L acidophillus ban đầu (log CFU/ml)

Hàm lượng acid glucuronic (mg/l) ơ N Ww {1 œ Ss œâ â â â â â â â

Chú thích: Các ky tự a, b, c cho thay sự khác biệt với độ tin cậy 95%

Biểu đồ 4 Ảnh hưởng của mật độ giống L acidophilus ban đầu đến khả năng hình thành acid glucuronic

Kết quả trình bay trên cho thấy, mật độ vi khuẩn L acidophilus ban đầu có mối tương quan với hoạt động của vi khuẩn G nataicola Mật độ vi khuan L acidophilus ban đầu b6 sung càng tăng thì lượng acid glucuronic sinh ra cảng tăng Nhưng đến một mức thì sự gia tăng mật độ vi khuẩn L acidophilus sẽ ức chế vi khuẩn G nataicola dẫn đến hàm lượng acid giảm Ở mật độ vi khuẩn L acidophilus ban đầu tăng dan từ 3 đến 5 log CFU/ml thì lượng acid cũng tăng từ 62.38 đến 82.84 mg/l Và so với mẫu đối chứng là mẫu không có sự tham gia của vi khuẩn L acidophilus thì hàm lượng acid cao

37 nhất thu được cao hơn han Điều này chtngt vi khuẩn L acidophilus có tac dụng kích thích quá trình biến dư ng của vi khuẩn G nataicola thúc day sự tong hợp acid glucuronic làm tăng hàm lượng acid glucuronic tích lũy Mặt khác, điều nay cũng đã được Yang công bố trong nghiên cứu hệ lên men tra kombucha năm 2008 [7] Việc bổ sung vi khuẩn lactic giúp phân giải cơ chất lên men thành các chất đơn giản hơn tạo điều kiện vi khuẩn acetic phát triển Đồng thời, sự có mặt của vi khuẩn lactic cũng giúp vi khuẩn acetic tổng hợp mạnh DSL Theo Hoffmann (2002), DSL quyết định sự có mặt của acid glucuronic Nhưng đến khi mật độ vi khuẩn L acidophilus tăng đến 6 logCFU/ml thì lượng acid sinh ra giảm c n 57.99 mg/l Nguyên nhân có thể là do mật độ vi khuẩn 7 acidophilus quá nhiều dẫn đến sự cạnh tranh môi trường sống làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng va phát triển G nataicola.

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ

Quá trình tối ưu hóa các điều kiện lên men thu nhận acid glucuronic trên co chat nước dừa già bang phương pháp quy hoạch thực nghiệm đã thu được các kết qua tối ưu như sau :

Mật độ vi khuẩn G nataicola ban đầu 4.79 logCFU/ml, Mật độ vi khuan L acidophilus ban dau 5.34 logCFU/ml, Ham lượng sucrose bồ sung 8.99 %,

Ap dụng theo mô hình nay, ham lượng acid glucuronic thu khi được là 93.24 mg/I với độ tương đồng 96%.

4.2 Kiến nghị Phân tích hàm lượng acid glucuronic thu nhận được bằng phương pháp sắc ky | ng cao áp (HPLC) dé so sánh sự chính xác với kết quả phân tích bang Kit K — Uronic.

Từ kết quả thực nghiệm trên, cho thay việc ứng dụng thực tế theo mô hình lên men trên là vô cùng tiềm năng Hơn nữa, cơ chất nước dừa gia là cơ chất phổ biến và 6n định ở nước ta Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển toàn diện mô hình lên men quy mô công nghiệp là cần thiết Ngoài ra, cần nghiên cứu lên men kết hợp tạo sản phẩm thức uống probioti giàu acid glucuronic có lợi cho sức kh e.

Nghiên cứu ứng dụng lên men thu nhận acid glucuronic trên các cơ chất từ các loại trái cây phố bién ở Việt Nam.