Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Ứng dụng dấu chuẩn phân tử trong chọn giống cà chua cho năng suất cao

NGUYỄN KHÁNH DƯƠNG ỨNG DỤNG DẤU CHUẨN PHÂN TỬ TRONG CHỌN GIỐNG CÀ CHUA CHO NĂNG SUẤT CAO Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ... Bằng 13 chỉ thị phân tử S

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây cà chua

Giống cà chua trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum Mill.) có nguồn gốc từ

Nam Mỹ Những loài cà chua hoang dại gần gũi với loài cà chua trồng trọt ngày nay được mang từ nơi xuất xứ đến Trung Mỹ, rồi đến Mehico Người Tây Ban Nha đem cà chua về châu Âu rồi sau đó đem đến vùng Địa Trung Hải Cà chua có nhiều tên gọi khác nhau và được giới thiệu đi khắp thế giới Đầu tiên, năm 1554 nhà nghiên cứu về thực vật Pier Andrea Mattioli giới thiệu những giống cà chua của Mehico có màu vàng và đỏ nhạt Năm 1650 ở Bắc Âu thời gian đầu cà chua chỉ được dùng để trang trí và thỏa tính tò mò

Thomas Jefferson (1710) đã trồng cà chua trong vườn nhưng không thu được những kết quả mong muốn trong việc cải tiến giống cà chua Năm 1750 cà chua được dùng làm thực phẩm ở nước Anh, nhưng thời bấy giờ cà chua chưa được chấp nhận là thực phẩm Đâu đó vẫn quan niệm cho rằng trong quả cà chua có chất độc bởi vì cà chua là thành viên trong họ cà, có họ hàng với cây cà độc dược Cuối thế kỉ 18, cà chua mới được dùng làm thực phẩm ở Nga và Italia Đến thế kỉ 19 (1830) quả cà chua đã trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn thường ngày Năm 1860, những giống cà chua mới đã được giới thiệu ở Mỹ, cũng trong thời kỳ này cà chua trở thành cây trồng chính của nước Pháp

Quá trình cải tiến giống được các nhà chọn tạo giống cà chua thực hiện liên tục cho đến ngày nay Nhờ vậy, giống cà chua trở nên phong phú, đa dạng đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng ở mọi nơi trên thế giới [4]

1.1.2 Đặc điểm thực vật học Hệ rễ

Hệ rễ cây cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng ăn sâu trong đất Rễ phụ cấp 2 phân bố dày đặc trong đất ở thời kỳ cây sinh trưởng mạnh Khi gieo thẳng rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1,5m, nhưng ở độ sâu dưới 1m rễ ít, khả năng hút nước và chất dinh dưỡng ở tầng đất 0,5 m yếu Khả năng tái sinh của hệ rễ cà chua mạnh, khi rễ chính bị đứt, rễ phụ phát triển mạnh Dựa vào đặc tính này nhà vườn có thể nhổ cây giống ở thời kì 2-3 lá thật trồng "tạm" ra nơi có diện tích dinh dưỡng rộng hơn ở vườn ươm để kích thích hệ rễ phát triển

Cây cà chua còn có khả năng ra rễ bất định, loại rễ này tập trung nhiều nhất ở đoạn thân dưới 2 lá mầm Dựa vào đặc điểm này trong kỹ thuật trồng trọt nhà vườn có thể nhân giống theo phương pháp vô tính Dùng những đoạn thân có tuổi sinh trưởng trung bình cắt từng đoạn ngắn từ 15-18cm trồng vào hàng, khi trồng cần đặt xiên, vùi sâu vào đất từ 5-7cm để rễ có điều kiện sinh trưởng tốt

Trong quá trình sinh trưởng hệ rễ chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện môi trường như nhiệt độ đất và ẩm độ đất v.v Ở nhiệt độ đất từ 18-20 0 C rễ phụ phát triển mạnh, khi nhiệt độ xuống thấp 14-16 0 C sự phát triển của rễ chậm lại 15-20 ngày Nhiệt độ cao trên 35 0 C rễ cà chua phát triển bị trở ngại và có thể chết Rễ cà chua tương đối chịu hạn, nhưng hệ rễ sinh trưởng tốt ở đất có sức giữ ẩm đồng ruộng trong khoảng 70-80% [4]

Thân Đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi Thân cây cà chua thay đổi trong quá trình sinh trưởng phụ thuộc vào giống, điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ) và chất dinh dưỡng v.v Ở thời kì cây con, thân tròn, có màu tím nhạt, có lông tơ phủ dày, thân giòn, dễ gãy, dễ bị tổn thương v.v

Khi trưởng thành cây có màu xanh nhạt hơi tối, thường có tiết diện đa giác, cây cứng, phần gốc hóa gỗ Đặc điểm của thân cà chua phát triển theo kiểu lưỡng phân, các chùm hoa sinh ra trên thân chính và các cành Vì vậy thân chính có vị trí quan trọng đối với sản lượng cây, các chồi phát triển mạnh ở nách lá, đặc biệt trong điều kiện nhiệt độ thích hợp và ẩm độ không khí cao [4]

Lá cà chua là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác Lá cà chua thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá hoàn chỉnh gồm có 3-4 đôi lá chét Tùy theo giống, ngọn lá có một phiến lá riêng biệt gọi là lá đỉnh Ở giữa các đôi lá chét còn có lá giữa, trên gốc lá chét có những phiến lá nhỏ gọi là lá bên Bộ lá có ý nghĩa quan trọng đối với năng suất, số lá trên cây ít, khi lá bị bệnh hại sẽ ảnh hưởng đến năng suất quả

Số lá là đặc tính di truyền của giống, nhưng quá trình hình thành cũng chịu ảnh hưởng của nhiệt độ Để hình thành 10 lá đầu sau khi trồng cần nhiệt độ trung bình trên 13 0 C, khi hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm là 24 0 C, nếu nhiệt độ thấp hơn 13 0 C thời gian xuất hiện lá mới sẽ chậm lại [4]

Hoa cà chua thuộc loại hoa hoàn chỉnh (gồm lá đài, cánh hoa, nhị và nhụy) Do đặc điểm cấu tạo của hoa nên cà chua tự thụ phấn là chủ yếu Các bao phấn bao quanh nhụy, thông thường vị trí của nhụy thấp hơn nhị Hoa cà chua nhỏ, màu sắc không sặc sỡ, không có mùi thơm nên không hấp dẫn côn trùng

Hoa cà chua mọc thành chùm, hoa đính vào chùm bởi cuốn ngắn Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuốn hoa, tại đó phình to một chút, khi gặp điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi (nhiệt độ, ẩm độ, chất dinh dưỡng ) sẽ thúc đẩy quá trình hình thành tầng rời ở cuống hoa, lớp tế bào này sẽ khô héo và chết dẫn đến hoa bị rơi rụng khỏi chùm Trong quá trình ra hoa của cây, áp dụng các biện pháp kỹ thuật tiên tiến cũng là nhằm mục đích giảm thấp hiện tượng hình thành tầng rời

Cà chua có 3 loại chùm hoa: chùm đơn giản, chùm trung gian và chùm phức tạp

Loại chùm đơn giản chỉ có một trục chính, hoa mọc so le trên trục Loại chùm trung gian thường có 2 nhánh chính Loại chùm phức tạp phân chia thành nhiều nhánh Số chùm hoa trên cây trong một chu kỳ sống khoảng 20 chùm hoặc nhiều hơn Điều đó phụ thuộc chủ yếu vào đặc tính của giống, điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt [4]

Quả cà chua chín thuộc loại quả mọng bao gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn, giá noãn

Quả cà chua được cấu tạo từ 2 ngăn đến nhiều ngăn Hầu hết các giống trồng trọt, loại quả trung bình trở lên có trên 3 ngăn

Khối lượng quả có sự chênh lệch đáng kể giữa loài và trong loài cà chua trồng trọt từ 2-3g đến 200-300g Căn cứ vào khối lượng quả có thể phân loại thành 3 cấp: quả nhỏ có khối lượng dưới 50g, quả trung bình có khối lượng trên 50-100g, quả to có khối lượng trên 100g

Hình dạng quả rất đa dạng giữa các loài và thậm chí trong phạm vi cùng một loài Các dạng quả chính bao gồm: tròn, tròn bẹt, bầu dục, hình quả lê và hình quả anh đào.

Giá trị dinh dƣỡng và ý nghĩa kinh tế của cà chua

Cà chua là một loại rau dễ chế biến và sử dụng, là nguồn dinh dưỡng quý giá của dân chúng nhiều nơi trên thế giới Mỗi 100g cà chua chín có chứa 94g nước, 0,6g protide, 4,2g gluxid, 12mg canxi, 26mg photpho, 1,4mg sắt, 2mg caroten, 0,06mg B1, 0,04mg B2 và 40mg vitamin C Điểm quý của cà chua là rất giàu caroten và khả năng dễ hấp thu đối với người tiêu dùng ở mọi lứa tuổi và đặc biệt trong quá trình nấu, vitamin C hao hụt rất ít Có thể sử dụng cà chua dưới dạng ăn tươi, nấu chín hay đã qua chế biến công nghiệp [25]

Cà chua là một loại cây trồng đem lại lợi nhuận cao, do đó diện tích trồng trọt của cà chua thường lớn hơn các loại rau khác Vị trí của cà chua trong các loại rau thường dùng xếp theo diện tích trồng trọt từ cao xuống thấp như sau:

Bảng 1.1 Diện tích rau trồng trên thế giới [25]

Rau trồng Diện tích trồng trọt

Cà chua cũng là một trong những mặt hàng nông sản có giá trị xuất nhập khẩu cao, kể cả dạng tươi và chế biến Lượng cà chua tươi trao đổi trên thị trường quốc tế năm 1986 là 21,6-22,7 triệu tấn Khoảng 98-99% lượng cà chua Mỹ nhập trong mùa đông là từ Mehico, 96% cà chua nhập khẩu của Singapore là từ Malaysia Đài Loan hàng năm xuất khẩu trị giá 952.000 USD cà chua tươi và 40.800 USD cà chua chế biến

Thu nhập của nông dân trên mỗi hecta trồng cà chua tại Đài Loan là 4.860 USD, Nigeria là 2.700-3.000 USD, Ethiopia là 5.251 USD, Thái Lan là 672 USD Đặc biệt, sản xuất hạt giống cà chua đem lại cho nông dân Thái Lan khoảng 6.000-10.000 USD/ha [25].

Tình hình phát triển sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam

Cà chua đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều nước trên 150 năm nay và là cây rau ăn quả được trồng rộng rãi khắp các châu lục Theo dõi tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 5 năm gần đây cho thấy diện tích trồng cà chua trên thế giới biến đổi ổn định, tăng dần từ năm 2007 đến năm 2011 Sản lượng cà chua trên thế giới tăng đáng kể từ năm 2007 (137,29 triệu tấn) đến 2009 (152,96 triệu tấn), sau đó sản lượng tăng dần với số lượng ít (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới trong những năm gần đây [35]

Trên thế giới cà chua được trồng quanh năm, mặc dù là cây trồng được xem là mẫn cảm với sương giá nhưng nó vẫn được trồng thành công trong điều kiện che chắn từ Equador cho đến tận vùng cực Bắc như Alaska Hiện nay, việc sản xuất cà chua trên thế giới đã được chuyên môn hóa cao, ứng dụng được tiến bộ khoa học kỹ thuật vào trong sản xuất [20]

Bảng 1.3 Diện tích trồng cà chua của các nước dẫn đầu thế giới từ năm 2007-2011 (ngàn ha) [35]

Trung Quốc Ấn Độ Italia Mỹ Thổ Nhĩ Kỳ Ai Cập Brazil Mêhico

Số liệu bảng 1.3 cho thấy, mặc dù là nơi phát triển cà chua muộn nhưng Châu Á lại là châu lục có diện tích trồng cà chua lớn nhất thế giới và gấp 4-5 lần châu lục khác Trong các nước có diện tích trồng cà chua lớn thì Trung Quốc là nước có diện tích lớn nhất

Sản lượng cà chua ở các nước dẫn đầu có sự biến đổi liên tục qua các năm Tuy nhiên Trung Quốc vẫn là nước có sản lượng cà chua lớn nhất thế giới, sau đó đến Ấn Độ và một số nước khác (bảng 1.4) Sản lượng cà chua ở Trung Quốc đặc biệt tăng đáng kể từ trên 36,10 triệu tấn năm 2007 lên trên 48,57 triệu tấn năm 2011 Đây là sự đóng góp lớn cho sự tăng trưởng sản lượng cà chua trên toàn thế giới Có được thành quả trên bởi vì Trung Quốc không những có diện tích trồng cà chua rộng lớn mà còn có nền khoa học kỹ thuật tiên tiến, ứng dụng vào trong sản xuất và công tác lai tạo giống mới

Bảng 1.4 Sản lượng cà chua của các nước dẫn đầu thế giới (triệu tấn) [35]

Trung Quốc Ấn Độ Italia Mỹ Thổ Nhĩ Kỳ Ai Cập Brazil Mêhico

Cà chua là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao và được phát triển ở Việt Nam Giai đoạn từ 1996-2001, diện tích trồng cà chua tăng trên 10.000 ha (từ 7.509 ha năm 1996 tăng lên 17 834 ha năm 2001) Đến năm 2008 diện tích đã tăng lên 24.850 ha Sản lượng cà chua cả nước trong những năm gần đây tăng lên đáng kể (từ 118.523 tấn năm 1996 tăng lên 535.438 tấn năm 2008) [12] Những năm gần đây diện tích trồng cà chua ở Việt Nam tương đối ổn định và có xu hướng giảm trên cả nước Trong khoảng 15-20 năm nay đã có những sự thay đổi lớn trong nghề trồng cà chua ở các tỉnh phía Nam đó là:

Diện tích trồng cà chua tại các tỉnh đồng bằng Nam bộ đang giảm dần do hiệu quả kinh tế giảm và khó khăn trong canh tác Thay vào đó, nông dân chuyển sang các loại rau khác có hiệu quả cao hơn như dưa leo, khổ qua và rau ăn lá Diện tích cà chua tại các địa phương như TP Hồ Chí Minh, Long An và Tiền Giang đã giảm đáng kể, hiện chỉ còn vài chục ha so với hàng trăm ha trước đây.

+ Trong khi đó, Lâm Đồng phát triển rất mạnh, không chỉ thay thế phần giảm diện tích của các tỉnh đồng bằng mà Lâm Đồng còn phát triển rộng hơn, diện tích gấp 2 lần trước kia Ví dụ đầu những năm 2000, Lâm Đồng chỉ có khoảng 3.000 - 4.000 ha, cuối những năm 2010 đã có tới 6.000 ha

Sự thay đổi trên có nguyên nhân ban đầu là việc các tỉnh vùng đồng bằng do phải dùng giống chịu nóng ẩm nên năng suất không cao, nhiều rủi ro vì bệnh Về sau này, các cây rau khác như nói trên dễ trồng, ít rủi ro hơn đã dần dần thay thế

Trong khi đó, Lâm Đồng có một lợi thế tuyệt đối về nền nhiệt độ thấp, có thể sản xuất quanh năm Đặc biệt từ sau năm 2003, nhờ trồng bằng cây ghép, không còn rủi ro vì héo rũ vi khuẩn nữa, Lâm Đồng đã nhanh chóng thay thế gần như hoàn toàn nghề trồng cà chua ở các tỉnh khác Một ha cà chua ở Lâm Đồng cho năng suất và hiệu quả kinh tế gần như gấp đôi các tỉnh đồng bằng Sự thay đổi như vậy là rất đúng và bền vững Các nghiên cứu phát triển cà chua ở các tỉnh phía Nam cần coi Lâm Đồng là thị trường chính với các lý do sau đây: (i) diện tích cà chua Lâm Đồng chiếm trên 70% diện tích cà chua cả miền Nam, (ii) cà chua trồng trong nhà theo công nghệ cao có xu hướng phát triển mạnh và hiệu quả kinh tế cao, (iii) các giống phù hợp với Lâm Đồng đều có thể trồng được gần như quanh năm ở các vùng cao như Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum và cũng có thể trồng tốt trong vụ Đông Xuân ở các tỉnh khác, nhất là các tỉnh miền Trung từ Quảng Nam vào đến Khánh Hòa Các thí nghiệm dùng giống cà chua lấy cây con giống từ Lâm Đồng trồng tại Quảng Ngãi đạt năng suất trên 35tấn/ha, tại Đăk Lắc trên 50tấn/ha, và việc nông dân Gia Lai vẫn thường mua giống ươm sẵn từ Lâm Đồng về trồng đã minh chứng cho nhận định này [14]

Bảng 1.5 Tình hình sản xuất cà chua của Việt Nam những năm gần đây [37]

Tuy nhiên, sản xuất cà chua ở nước ta có một số tồn tại chủ yếu: Chưa có bộ giống tốt cho từng vụ trồng, sản xuất còn manh mún, chưa có sản phẩm hàng hoá lớn cho chế biến công nghiệp Quá trình canh tác, thu hái diễn ra hoàn toàn thủ công

Mặc dù vậy so với các nước trong khu vực, sản xuất cà chua ở Việt Nam có lợi thế rõ rệt về khí hậu, thời tiết và đất đai phù hợp cho sinh trưởng, phát triển của cà chua nếu được đầu tư tốt, năng suất cà chua sẽ rất cao Diện tích cho phát triển cà chua còn rất lớn vì trồng trong vụ Đông, không ảnh hưởng đến 2 vụ lúa nhưng sản phẩm lại là trái vụ so với Trung Quốc, nước có khối lượng cà chua lớn nhất thế giới Các vùng trồng cà chua đều có nguồn lao động lớn, nông dân có kinh nghiệm canh tác nên giá thành có khả năng cạnh tranh cao [11].

Vai trò của dấu chuẩn phân tử trong chọn giống thực vật

Dấu chuẩn phân tử là đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hóa học hay cấu trúc phân tử được di truyền lại cho hậu thế, giống như các nhân tố di truyền Mendel, nhưng lại có thể định lượng được Có hai loại dấu chuẩn phân tử cơ bản là:

Isozyme là những dạng enzyme có cùng một phản ứng hóa học như nhau (hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau Về mặt di truyền, có thể chia isozyme làm hai dạng:

Enzym dạng đồng phân gen là những enzym được kiểm soát bởi một gen duy nhất Những enzym này có đặc điểm là được cấu tạo từ chuỗi polypeptide đơn nhưng có thể có nhiều loại phân tử khác nhau do sự khác biệt về thành phần và trật tự axit amin Sự khác biệt này cho phép các đồng phân enzym được phân tách bằng phương pháp điện di, một kỹ thuật tách các phân tử dựa trên điện tích và kích thước.

Isozyme đa gen: Các isozyme này được mã hóa bởi hai hay nhiều gen và chúng có thể được phân biệt bằng các đặc điểm hóa miễn dịch hoặc bằng đặc tính enzyme

+ Dấu chuẩn phân tử DNA

Khác với dấu chuẩn isozyme, các dấu chuẩn phân tử DNA rất phong phú do sự đa dạng của DNA, tính ổn định và sự không lệ thuộc chúng vào các yếu tố môi trường Các dấu chuẩn di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài (Ahn et al, 1993;

Dunforal et al, 1995) Chúng cũng có thể được dùng để lựa chọn tổ hợp lai Các dấu chuẩn phân tử được chia ra làm hai nhóm lớn:

Dấu chuẩn đồng trội dựa trên cơ sở lai phân tích gen hoặc chỉ thị RFLP Ưu điểm của phương pháp này là dựa trên các băng điện di thu được, có thể phát hiện được cả cá thể dị hợp tử và đồng hợp tử, đồng thời phân biệt được cá thể đồng hợp tử trội với cá thể đồng hợp tử lặn.

Tuy nhiên, phương pháp này cũng tiềm ẩn nhiều hạn chế như: quy trình thực hiện phức tạp và cồng kềnh, khó có thể tự động hóa, tiêu tốn nhiều chi phí, đồng thời phải sử dụng chất đồng vị phóng xạ, gây nguy hiểm cho sức khỏe con người.

Dấu chuẩn dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR Cho đến nay đã có rất nhiều dấu chuẩn phân tử được phát triển dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR, như AFLP, RAPD, SSR [18]

1.4.2 Chọn lọc nhờ dấu chuẩn SSR dựa vào PCR

Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được phát hiện do sự sai khác về chiều dài của đoạn DNA đích được nhân bản nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặp primer Đó là do sự thay thế bazo nito ở các điểm liên kết primer hoặc do sự sắp xếp lại trật tự DNA trong vùng chứa các điểm đó

SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites), là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự nucleotide đơn giản nào đó Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote là khá phổ biến ở động vật và thực vật Phương thức lặp lại cũng rất đa dạng Nhưng tựu trung lại có ba kiểu sau: 1) lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau; 2) lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác; 3) lặp lại phức tạp : sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu tại các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể, như vùng tâm động hoặc các đầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Kỹ thuật SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotide đơn giản Kỹ thuật này tương đối không phức tạp, dựa trên nguyên tắc PCR và phương pháp điện di trên gel Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại mà sự đa hình về độ dài của SSR được nhân bản sẽ được phát hiện sau quá trình điện di trên gel Theo McCouch (1996), kỹ thuật này tỏ ra rất hữu hiệu trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do tính đa dạng giữa các allen thuộc cùng một locus Ở một số cây trồng, nhờ các dấu chuẩn SSR người ta đã xây dựng được những bản đồ di truyền liên kết, như ở cà chua có tới 32 SSR mang các đơn vị lặp lại (GACA) và (GATA) Riêng về tính hiệu quả trong việc sử dụng các dấu chuẩn phân tử để phân biệt sự sai khác giữa các thứ cây trồng thì các dấu chuẩn SSR có phần ưu việt hơn so với các dấu chuẩn RAPD (Havey, 1997) Một ứng dụng quan trọng khác của các dấu chuẩn SSR là việc dùng chúng để xác định giới tính ở thực vật [18].

Giới thiệu về dấu chuẩn SSR

Cơ chế đột biến hình thành microsatellites vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellites là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong giảm phân hoặc quá trình trượt lỗi trong sao mã Và quá trình trượt lỗi trong sao mã được coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellites, nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand) Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đó tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn [5]

Hình 1.2 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân [5]

Hình 1.3 Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã [5]

1.5.2 Vai trò của dấu chuẩn SSR

Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã Mặc dù chức năng của chúng vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng có thể thấy chúng có sự phân bố giữa các vùng exon và có liên quan đến các bệnh di truyền.

Microsatellites được dùng như một dấu chuẩn di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa và lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellites cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa Microsatellites được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hóa Số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellites ở vùng mã hóa có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellites cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor Vị trí của microsatellites gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi

Vùng điều khiển có chứa microsatellites hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellites đã làm giảm chức năng của gen [10]

1.5.3 Ƣu và nhƣợc điểm của dấu chuẩn SSR

Thuận lợi to lớn của sự phân tích microsatellites là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình

Microsatellites là dấu chuẩn đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định Tính đồng trội của microsatellites sẽ gia tăng hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những dấu chuẩn này so với những dấu chuẩn khác

Hạn chế của phương pháp microsatellites là không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau, điều này là do microsatellites có tỷ lệ đột biến quá cao dẫn đến 2 trở ngại Thứ nhất, trình tự vùng flanking ở 2 bên vùng microsatellites thường khác nhau giữa các loài đột biến, vì vậy khó có thể áp dụng primer microsatellites của loài này cho loài khác Thứ hai, do tỷ lệ đột biến cao nên khi 2 loài có cùng kết quả phân tích với 1 trình tự microsatellites, ví dụ như AC 19 , chúng ta cũng không thể kết luận rằng hai loài đó có cùng nguồn gốc tổ tiên ban đầu, vì có thể 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC 18 rồi đột biến thành AC 19 còn 1 loài phân ly từ tổ tiên của chúng là AC 20 rồi đột biến thành AC 19 [7].

Phương pháp ly trích DNA

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng lớn DNA tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là thu nhận các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học [24] Để đảm bảo tách chiết được DNA đáp ứng các yêu cầu trên thì cần gồm các bước cơ bản sau đây:

1.6.1 Phá vỡ màng tế bào và nhân

Nghiền tế bào trong nitơ lỏng hoặc đá lạnh với dung dịch chiết xuất gồm các thành phần sau: muối NaCl, Tris-HCl, EDTA, SDS, protein K để phá vỡ màng tế bào và nhân, giải phóng ra DNA Nhiệt độ lạnh và các hóa chất có tác dụng:

- Nhiệt độ lạnh và EDTA làm giảm hoạt tính của men phân giải DNA (DNAse)

- SDS và protein K khi phối hợp với nhau sẽ có tác dụng phân giải và làm biến tính protein liên kết với DNA Khi SDS bọc lấy protein sẽ làm gãy tất cả các liên kết không cộng hóa trị

- NaCl và Tris-HCl có tác dụng tẩy rửa carbohydrate, lipid và tinh bột

1.6.2 Hòa tan DNA và loại bỏ tạp chất

Thành phần trong mẫu DNA khi chiết xuất thường có chứa protein, RNA, cacbohydrat và lipid, do vậy cần phải loại bỏ các tạp chất này ra khỏi dung dịch

Hiện nay người ta thường dùng một số hợp chất để loại bỏ các tạp chất trên như sau: dùng phenol/chloroform/isoamyl (PIC) với tỷ lệ tương ứng là 25:24:1 để chiết tách DNA và kết tủa các protein, RNA, cacbohydrat và lipid Sau ly tâm sẽ thu được phần dung dịch nước phía trên ống nghiệm chứa DNA hòa tan Phần kết tủa nằm phía dưới đáy ống nghiệm là các tạp chất lẫn

Mục đích của quá trình kết tủa DNA là cô đặc và bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNAse, đồng thời cho phép hòa tan DNA ở nồng độ mong muốn khi cần thiết Có hai hóa chất chính được sử dụng trong quá trình kết tủa DNA, mỗi loại có những ưu điểm và nhược điểm riêng để phù hợp với các ứng dụng cụ thể.

- Kết tủa bằng ethanol lạnh 100% nhằm kết tủa hoàn toàn DNA, lúc này có thể nhìn thấy DNA kết tủa dưới dạng vẩn đục mờ Ethanol còn có tác dụng loại bỏ ra một số muối (trừ NaCl) và nhiều phần tử hữu cơ nhỏ khác

- Kết tủa bằng Isopropanol với lượng cho vào bằng lượng dung dịch mẫu

Phương pháp này có nhược điểm là khó loại trừ được một số muối khó tan trong isopropanol, nên các muối này thường kết tủa cùng DNA, do vậy cần phải rửa thêm nhiều lần để loại bỏ hết các muối còn lẫn tạp

Sau bước kết tủa đến bước ly tâm ta sẽ thu được DNA cô đặc (pellet), sau đó rửa pellet nhiều lần bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên để bay hơi hết ethanol rồi hòa tan DNA pellet bằng dung dịch TE (thành phần gồm 10mM Tris-HCl, pH 8.0;

1mM EDTA) cuối cùng bảo quản trong tủ lạnh -4 0 C hoặc -20 0 C [23].

Phương pháp PCR

Phát minh mang tính cách mạng của phương pháp PCR bởi Kary Mullis vào tháng 10 năm 1985 đã đánh dấu bước đột phá trong sinh học phân tử và kỹ thuật gen Nguyên lý cơ bản của PCR nằm ở tính chất biến tính, hồi tính và nguyên lý tổng hợp DNA Nhờ những tính chất này, PCR cho phép khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu theo cấp số nhân, mở đường cho vô số ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, chẩn đoán bệnh và công nghệ sinh học.

Cơ sở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase DNA polymerase dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với sợi này Các sợi DNA khuôn mạch đơn có thể tạo ra bằng cách đun nóng dung dịch DNA mạch kép đến gần nhiệt độ sôi [17]

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với với một đầu từ mạch khuôn, DNA sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch mới Như vậy, ta sử dụng hai mồi chuyên biệt gồm một mồi xuôi và một mồi ngược (từ “xuôi” và “ngược” được hiểu theo chiều phiên mã của gen) [6]

1.7.2 Nguyên lý chung của phương pháp PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn biến tính (Denaturation) : ở nhiệt độ cao 94 0 C-95 0 C (cao hơn nhiệt độ nóng chảy của DNA khuôn) làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau Đoạn khuôn DNA có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính cao hơn

Giai đoạn gắn mồi (Annealing ) : ở nhiệt độ khoảng 55 0 C – 65 0 C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn Giai đoạn này khoảng 30 – 60 giây

Giai đoạn tổng hợp (Elongation) : nhiệt độ tăng lên đến 72 0 C giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùy thuộc độ dài của DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kỳ, từ mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 2 20 – 2 40 bản sao DNA Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme

DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất [6]

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng PCR [36]

Phương pháp phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc

Với sự phát triển của sinh học phân tử, người ta có xu hướng phân nhóm đa dạng di truyền ở mức độ phân tử Như vậy độ chính xác sẽ cao hơn rất nhiều so với phương pháp truyền thống dựa trên tính trạng hình thái học

Tất cả các phương pháp nghiên cứu sự đa dạng của quần thể đều cho kết quả cuối cùng là các dữ liệu phân tử phức tạp như các band vạch trên bảng điện di hoặc thông tin trình tự DNA, RNA, protein Để lấy được các thông tin sinh học từ dữ liệu thô này, các nhà khoa học cần đến sự hỗ trợ của máy tính với các phần mềm phân tích dữ liệu thực nghiệm

Phần mềm NTSYSpc là ứng dụng hữu ích và phổ biến nhất giải thích sự đa dạng của tập hợp sinh vật thông qua mối quan hệ giữa chúng trong lịch sử tiến hóa, đó là ứng dụng xây dựng cây tiến hóa thông qua dữ liệu mô tả tập hợp sinh vật

Phân tích nhóm (cluster analysis) là phương pháp sắp xếp các giống thành những cụm nhóm trên cơ sở những mức độ giống nhau theo quy ước Quy trình được thực hiện như sau:

- Tìm các cặp (i, j) có giá trị khoảng cách nhỏ nhất (hoặc giống nhau nhất)

- Nhập các cặp này thành một nhóm

- Tạo ra các nhóm lớn hơn ứng với nhóm mới sao cho các cặp (i, j) mới tương thích với mức độ giống nhau

Ứng dụng phương pháp nhóm di truyền UPGMA đơn giản và nhanh chóng, dựa trên tính toán khoảng cách trung bình bằng giá trị số học.

Cách tính phương pháp UPGMA bằng tay: [2]

- Tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất trong ma trận khoảng cách

- Xếp hai nhóm isolate này lại với nhau, theo giá trị khoảng cách cụ thể ghi giữa hai điểm

- Xây dựng ma trận khoảng cách mới phối hợp giữa hai isolate gần nhất trong một nhóm riêng Khoảng cách giữa hai nhóm mới này và một isolate khác sẽ được ghi nhận với giá trị khoảng cách trung bình của isolate mới với những isolate trong nhóm

- Lập lại quy trình cho đến hết

Ví dụ: ma trận khoảng cách có 5 isolate

Trong đó, dij là khoảng cách giữa isolate i và isolate j Ví dụ: khoảng cách giữa isolate 3 và 4 (d 34 ) là ngắn nhất Hai isolate này được xếp vào một nhóm với khoàng cách điểm nhánh là (d 34 /2)

Ma trận khoảng cách mới trên cở sở nhóm (3, 4) và những isolate khác

Trong ma trận mới, tìm giá trị khoảng cách nhỏ nhất Ví dụ ở đây là d 12 , như vậy có nhóm (1,2) được hình thành

Như vậy có thêm một ma trận khoảng cách mới

Trong đó, d(1,2)5 được tính toán giống như trên, trong khi đó d(1,2)(3,4) được tính toán bằng cách lấy trung bình của d 1(3,4) và d 2(3,4)

Trong khi đọc giá trị khoảng cách của ma trận mới, thí dụ chúng ta ghi nhận d (1,2)(3,4) có khoảng cách ngắn nhất điều này có nghĩa là hai nhóm (1, 2) và (3,4) nằm trong cùng nhóm ((1,2),(3,4)) với khoảng cách:

Ma trận mới được tính toán bằng cách lấy trung bình của d 5(1,2) và d 5(3,4)

Giá trị khoảng cách d5((1,2),(3,4)) =[ d 5(1,2) + d 5(3,4) ] / 2 cuối cùng ta có giản đồ phân 5 nhóm như sau :

Hàm lượng thông tin tính đa hình PIC (Polymorphic Information Content) cho mỗi locus SSR (i) được tính theo công thức (Weir, 1996):

PIC (i) = 1- Σ P ij 2 Trong đó : P ij làtần suất alen thứ j với locus SSR thứ i [8]

1.9 Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở cà chua trên thế giới và Việt Nam

Do số lượng dấu chuẩn SSR được dùng trong chọn giống cà chua còn hạn chế, các nhà nghiên cứu C He cùng cộng sự (2003) đã nghiên cứu để phát triển dấu chuẩn SSR Sau khi tìm kiếm và phân tích 500 trình tự DNA cà chua, 158 cặp mồi SSR đã được thử nghiệm trên 19 giống cà chua Kết quả cho thấy 65 cặp mồi đa hình, với tần suất thông tin đa hình PIC dao động từ 0,09 đến 0,85.

0,67 Các dấu chuẩn phân tử mới này có thể là công cụ hỗ trợ hữu ích trong việc định danh và chọn giống nhờ dấu chuẩn phân tử [27] Để phục vụ tốt cho công tác chọn giống nhằm nâng cao năng suất cà chua, một nhóm nghiên cứu tại trường đại học nông nghiệp Nanjing, Trung Quốc (2007) đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền 39 dòng cà chua được thu tập từ 4 quốc gia khác nhau (Trung Quốc, Nhật, Hàn Quốc và Hoa Kỳ) đại diện cho hai châu lục

Thông tin về khoảng cách di truyền trong nghiên cứu có thể được sử dụng bởi các nhà lai tạo khi xác định mối tương quan giữa các dòng bố mẹ [29]

Pritesh và cộng sự (2008) đã sử dụng 23 cặp mồi SSR trên 25 giống cà chua thì có 13% mồi không biểu hiện khuếch đại PCR, 40 alen được thể hiện, hệ số PIC thấp 0,08 ở mồi SSR304 [20]

Cà chua là một trong những cây trồng quan trọng ở Eritrea Tuy nhiên, năng suất trung bình cà chua ở Eritrea thấp hơn rất nhiều so với năng suất trung bình ở Châu Phi và Ý Do đó, Samuel Asgedom cùng cộng sự (2010) đã phân tích đa dạng di truyền của 25 giống cà chua được trồng ở Eritrea và so sánh chúng với các giống của Châu Phi và Ý 15 dấu chuẩn phân tử đã được sử dụng cho nghiên cứu này Các giống cà chua ở Eritrea kém đồng đều hơn so với các giống ở Châu Phi và Ý

Nguyên nhân dẫn đến tình trạng trên có thể là do các nông dân ở Eritrea đã trộn các hạt giống với nhau để thời gian thu hoạch lệch pha, năng suất ổn định và chống chịu được stress [33]

Năm 2011, nghiên cứu của S Geethanjali và cộng sự đã phát triển các dấu chuẩn SSR từ nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo trên NST 12 của cà chua Các dấu chuẩn SSR này đóng vai trò quan trọng trong phân tích đa dạng di truyền và thiết lập bản đồ gen Đặc biệt, một số gen quan trọng liên quan đến các đặc điểm như bệnh héo rủ vi khuẩn, khảm virus, đầu bạc lá, nấm mốc cũng nằm trên NST 12, làm tăng tính ứng dụng của các dấu chuẩn SSR trong lĩnh vực lai tạo và cải thiện giống cây trồng.

Khả năng kết hợp và phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Mục đích cơ bản trong chương trình tạo giống lai là xác định dòng mới mà khi lai với dòng khác sẽ tạo ra con lai có năng suất vượt trội Ngoài khả năng năng suất bản thân của các dòng tự phối, khả năng kết hợp là một tính trạng quan trọng để chọn dòng làm bố mẹ cho giống lai Khả năng kết hợp là khả năng của một dòng tự phối khi lai với dòng khác (giống khác) tạo ra thế hệ con lai có năng suất cao [15]

Người ta phân biệt khả năng kết hợp chung (general combining ability- GCA) và khả năng kết hợp riêng (specific combining ability- SCA) Khả năng kết hợp chung là khả năng cho ưu thế lai của dòng tự phối với các dòng khác, đó là giá trị trung bình về ưu thế lai của tất cả các tổ hợp mà dòng đó tham gia Khả năng kết hợp riêng là khả năng cho ưu thế lai của một dòng đem lai với một dòng cụ thể khác, được biểu hiện bằng độ lệch so với giá trị trung bình về ưu thế lai của một cặp lai cụ thể nào đó [13]

1.11.2 Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp

Thông thường sau một giai đoạn phát triển và thu thập, có thể có một số lượng rất lớn các dòng có vẻ tốt cho công tác lai tạo, nhưng thực tế cho thấy không phải dòng thuần nào quan sát thấy tốt cũng cho khả năng kết hợp cao Các dòng thuần có được từ bất cứ nguồn nào, bất cứ phương pháp nào cũng cần được đánh giá tiềm năng của chúng để phục vụ công việc lai tạo sau này, quá trình này gọi là thử khả năng kết hợp của dòng thuần Qua phép lai thử, phần lớn các dòng thuần sẽ bị loại bỏ do có ít triển vọng trong các cặp lai sau này Hayes (1955) đã tổng phối, chỉ có khoảng 0,06% số dòng tự phối có khả năng kết hợp tốt [15]

Thông qua phép lai thử để đánh giá khả năng kết hợp các tính trạng trên tổ hợp lai của bố mẹ sẽ giúp nhà tạo giống có quyết định chính xác để giữ lại dòng có khả năng kết hợp cao sử dụng vào các mục tiêu tạo giống khác nhau, loại bỏ dòng có khả năng kết hợp thấp kém Có hai phương pháp phổ biến dùng để thử khả năng kết hợp của dòng thuần, đó là: lai đỉnh (top cross) và lai luân giao (diallel cross)

Lai đỉnh là phương pháp lai thử chủ yếu để xác định khả năng kết hợp chung do Devis đề xuất năm 1927, Jenkins và Bruce phát triển năm 1932 [32] Yếu tố thành công của lai đỉnh là chọn đúng cây thử như thế nào để đánh giá dòng vẫn là vấn đề gây tranh luận Dùng dạng cây thử có khả năng kết hợp cao thì khả năng ra được giống sẽ tốt hơn so với trường hợp khả năng kết hợp trung bình hoặc thấp Cây thử có thể có nền di truyền rộng (giống thụ phấn tự do, giống tổng hợp, giống lai kép) hoặc có nền di truyền hẹp (dòng thuần, giống lai đơn) Xuất phát từ mục tiêu kinh doanh, các nhà tạo giống thương mại sử dụng dòng ưu tú (có khả năng kết hợp cao) làm cây thử vì họ muốn phát hiện một lai đỉnh sẽ là một lai đơn phục vụ cho buôn bán Xu thế ngày càng phổ biến là các nhà tạo giống dùng cây có nền di truyền hẹp mà chủ yếu là các dòng thuần có khả năng kết hợp tốt để tìm các cặp lai có tiềm năng cao ngay trong phép thử đó nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian tạo giống mới [22].

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu

3.1 Đánh giá các dòng/giống cà chua về năng suất và phẩm chất quả

Trong công tác chọn tạo giống nói chung và chọn giống cà chua nói riêng, nguồn gen hay còn được gọi là nguồn vật liệu khởi đầu đa dạng là rất quan trọng đối với các nhà chọn giống Kết quả của chọn giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có việc đánh giá và sử dụng nguồn vật liệu khởi đầu

Nguồn gen được sử dụng trong chọn tạo giống cà chua cần có sự đa dạng, phong phú và thay đổi, điều này cho phép việc tạo ra nhiều những giống mới thích hợp với điều kiện môi trường và thị hiếu người tiêu dùng Ở Việt Nam, nghiên cứu đánh giá nguồn gen cây cà chua cũng thường xuyên được tiến hành tại các đơn vị nghiên cứu chọn tạo giống Các tác giả Vũ Tuyên Hoàng, Mai Phương Anh, Trần Khắc Thi từ những năm 1975 đã tiến hành nghiên cứu đánh giá phân loại nguồn gen của 289 giống trồng và 6 giống hoang dại và nửa hoang dại, 17 giống địa phương và 3 dạng hoang dại thu thập trong nước Kết quả đã đánh giá, phân lập được các giống có tính chín sớm, khả năng chống chịu sâu bệnh, tiềm năng năng suất cao Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống nhập nội thường có phẩm chất tốt hơn giống địa phương [19] Các giống nghiên cứu trong đề tài đều là giống nhập từ Đài Loan vào năm 2006 và 2007 Từ nguồn giống nhập nội này, bằng phương pháp chọn lọc phối hợp với công nghệ sinh học sẽ tạo nên nguồn vật liệu phục vụ cho công tác chọn giống

3.1.1 Đánh giá về năng suất các giống cà chua nhập nội

Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất là các yếu tố đầu tiên được các nhà chọn giống và người sản xuất quan tâm Năng suất của cây cà chua được kiểm soát bởi đặc trưng di truyền của giống và chịu tác động của các điều kiện ngoại cảnh, chế độ dinh dưỡng cũng như biện pháp kỹ thuật canh tác Để có năng suất cao, số chùm quả phải nhiều và tỷ lệ đậu quả cao Chúng tôi tiến hành đánh giá số chùm hoa trên thân chính (nhánh bên bị tỉa bỏ) của các cây cà chua sinh trưởng hữu hạn, kết quả như sau: