Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện Hepatitis a virus (HAV) trong nhuyễn thể bằng kỹ thuật Reverse transcription PCR

HAV trong thực phẩm, xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp nhằm đánh giá khả năng áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm; áp dụng phương pháp đã xây dựng để giám sát sự ô nhiễm HAV t

TỔNG QUAN

Tổng quan về virus viêm gan A

1.1.1/ Lịch sử phát hiện HAV

Dựa theo lịch sử y khoa, bắt đầu từ thế kỷ thứ 5 trước Công Nguyên loài người có những miêu tả về những trận dịch vàng da (jaundice outbreaks) xảy ra tại nhiều nơi khác nhau trên thế giới, nhất là ở những thành phố lớn đông dân cƣ hoặc ở những trại lính chật chội Người bệnh đang sống rất khỏe mạnh, bỗng dưng bị đau bụng, tiêu chảy và biểu hiện vàng da [7]

Trong Thế Chiến thứ 2, một cơn dịch cảm cúm đã lây lan nhanh chóng với khoảng 200.000 người Mỹ và hơn 5 triệu người dân địa phương bỗng dưng ngã bệnh

Lúc bấy giờ người ta chưa hiểu rõ nguyên nhân một cách chính xác, họ cho rằng bệnh nhân bị ngộ nước hoặc trúng độc Vào những năm 1930, với sự phẫu thuật lấy tế bào gan – sinh thiết gan (liver biopsy) để khám nghiệm dưới kính hiển vi, y khoa đã tiến một bước rất dài trong việc xác định bệnh viêm gan

Nhưng tới năm 1973 người ta mới nhận ra được sự có mặt của virus viêm gan A trong cơ thể của người bệnh thông qua việc nuôi cấy tế bào Một trong những nguyên nhân phổ biến của bệnh viêm gan cấp tính là do virus viêm gan A (HAV), đƣợc nghiên cứu bởi Purcell vào năm 1973.Năm 1980, các nhà khoa học khẳng định sự hiện diện của virus này bằng các phản ứng ngƣng kết huyết thanh Từ đó dịch tễ học, lâm sàng, sự phát hiện trong tự nhiên của virus viêm gan A đã trở nên rõ ràng hơn Kết quả nghiên cứu này dẫn đến sự phát triển một phương thức tiếp cận cho những cách phát hiện, kiểm soát, ngăn ngừa sự lây lan cũng nhƣ sự bùng phát thành dịch của virus viêm gan A này [7]

1.1.2/ Đặc điểm sinh học của HAV

Hepatitis A virus (HAV) là loài thuộc chi Hepatovirus, vị trí trong giới phân loại nhƣ sau:

HAV là cá thể duy nhất trong chi Hepatovirus [26,52] Có bảy kiểu gen khác nhau, đánh số từ I đến VII Bốn kiểu gen trong số này là I, II, III, và VII gây bệnh trên người, trong các kiểu gen gây bệnh trên người được phân thành 6 phân nhóm là IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB [17], 80% chủng HAV gây bệnh cho người có kiểu gen I [26] Các kiểu gen IV, V, VI gây bệnh trên các động vật linh trưởng như khỉ, tinh tinh Những phát hiện đầu tiên của HAV là trên loài khỉ cú (owl monkey) [43]

1.1.2.2/ Đặc điểm hình thái và cấu trúc HAV a) Đặc điểm hình thái

Bộ gene HAV là RNA sợi đơn, đƣợc bao bọc trong vỏ capsid HAV có cấu trúc hình khối với 20 mặt tam giác đều, đường kính hạt virus là 27-32 nm [18,23,25,33]

Hình 1.1.HAV được quan sát dưới kính hiển vi điện tử (x 400.000) [71]

Virus chỉ chứa những gì cần thiết để chúng thực hiện sự xâm nhiễm vào tế bào chủ HAV cũng không ngoại lệ, chúng chỉ tồn tại ở dạng nucleocapsid, không có vỏ bao ngoài Capsid là lớp vỏ protein của virus bao bọc nucleic acid và đƣợc cấu thành từ các đơn vị hình thái Capsomere là các đơn vị hình thái quan sát đƣợc trên bề mặt của các hạt virus tương ứng với tập hợp các đơn vị cấu trúc Promoter là các đơn vị cấu trúc nhỏ nhất Capsid của HAV đƣợc tạo thành từ các tiểu đơn vị hình thái gọi là capsomer Mỗi capsomere bao gồm năm protomers Mỗi protomer của HAV đƣợc làm bằng ba protein là VP1, VP2 và VP3 [37]

Hình 1.2 Hình dạng hạt virus và cấu trúc các tiểu đơn vị tạo nên vỏ capsid HAV [67] b) Đặc điểm cấu trúc bộ gen HAV

Hình 1.3 Tổ chức bộ gen của HAV [13,29]

Chú thích vùng gen 2BC và P3

2B: tạo cơ chế ẩm bào 2C: tạo enzyme helicase 3A: tạo protein bám màng tế bào chủ 3B: tạo mồi phiên mã ngƣợc

Bộ gen HAV gồm khoảng 7500 nucleotide Có ba khu vực chính trong bộ gen:

- Vùng 5’ không dịch mã dài 742 nucleotide Vùng này gắn với VPg đƣợc mã hóa từ vùng gen 3B VPg là một protein của virus có điểm đẳng điện thấp hơn các picornavirus khác VPg hỗ trợ cho quá trình bắt đầu sao chép của RNA virus [64]

- Vùng ORF dài 6681 nucleotide, gồm:

+ Vùng ORF gồm 3 phần chính là P1-2A, 2BC, P3 Vùng gen P1-2A đƣợc dịch mã và đồng thời xử lý bởi một protease của virus để tạo bốn loại protein có cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4; và bảy protein không có cấu trúc 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D Bốn protein cấu trúc mã hóa cho các protein tạo vỏ capsid polypeptid và kháng nguyên của HAV Các kháng nguyên của HAV chủ yếu nằm tại vùng VP1, VP3 [26]

Vùng gen 2BC và P3 mã hóa tạo 7 protein không cấu trúc là 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D Trong đó, vùng 3C mã hóa tạo protease và vùng gen 3D mã hóa tạo RNA polymerase Các yếu tố này giúp RNA virus thực hiện quá trình dịch mã tạo các thành phần cho quá trình lắp ráp và nhân lên trong tế bào chủ [26,58]

+ Vỏ capsid của HAV gồm ba protein: VP1 là cấu trúc chính khoảng 33kDa, VP2 khoảng 27kDa và VP3 khoảng 29kDa [65] Dựa trên trình tự nucleotide, một protein capsid thứ tƣ – VP4, khoảng 2,5 kDa đƣợc mã hóa nhƣng chƣa đƣợc xác định trong cấu trúc của virion trưởng thành [65]

- Vùng 3' không mã hoá dài 63 nucleotide, gắn với đuôi poly A, đuôi poly A có chức năng bảo vệ sợi RNA virus tránh sự phân hủy của các RNase

- HAV xuất hiện trong vật chủ, cũng giống nhƣ các loài picornavirus khác

Locarniniet và cộng sự [36] đã phát hiện có khoảng 11 protein của virus trong các tế bào chủng HM175 bị nhiễm HAV Tuy nhiên, một số nghiên cứu khác cho thấy chỉ có các protein cấu trúc của HAV trưởng thành mới được phát hiện trong các tế bào bị nhiễm bệnh [19,53] Điều này đƣợc giải thích có thể là do sự ổn định của VPg hoặc tốc độ tăng trưởng chậm và không đồng đều của HAV

1.1.2.3/ Vị trí kháng nguyên HAV

Các loài trong họ picornavirus đƣợc phân biệt là do sự xuất hiện của các kháng nguyên khác nhau [9] Những khác biệt này dựa trên hình dạng, độ lớn phân tử trên bề mặt của vỏ capsid virus [9,49] Nghiên cứu bằng tia X trên bề mặt lớp vỏ capsid virus đã xác định protein VP1 là protein tiếp xúc lớn [20] Sự sắp xếp trình tự acid amin trong vùng gen VP1 của HAV đã xác định đƣợc ba peptide tạo kháng nguyên [48]

Các nghiên cứu cũng cho thấy rằng, HAV bị đột biến chủ yếu là do quá trình tiếp xúc với kháng thể hoặc bị kháng thể trung hòa Vùng gen VP1, VP3 chứa các acid amin có thể thay đổi trình tự để tạo các epitope hạn chế quá trình nhận diện kháng nguyên của các kháng thể [60] Các nghiên cứu về bộ gen của HAV cho rằng chỉ có 6 trong số 11 axit amin nằm ở vùng gen VP1 và VP3 là tạo các protein kết hợp đƣợc với kháng thể Quá trình tiếp xúc này sẽ làm thay đổi các axit amin có thể giúp HAV tạo ra các biến thể, tránh đƣợc sự trung hòa kháng nguyên Các locus VP1 và VP3 mã hóa các kháng nguyên đƣợc đặt khá xa nhau, nhƣng chúng cũng đã kết hợp lại với nhau để tạo thành một yếu tố quyết định tính kháng nguyên duy nhất [20]

1.1.2.4/ Sự nhân bản trong tế bào nuôi cấy

Hình 1.4 Sự nhân bản HAV trong tế bào chủ [67] Ở mức độ tế bào, HAV đi vào tế bào chủ thông qua sự ẩm bào Tiếp đó, lyzosome của tế bào chủ sẽ ly giải hạt virus, để giải phóng RNA vào bên trong tế bào chất Quá trình phiên mã ngƣợc sẽ diễn ra để tạo cDNA của HAV Tiếp đó, cDNA thực hiện tiếp 2 quá trình:

- Dịch mã tạo polyprotein, các polyprotein này sẽ tạo ra các capsomer của vỏ capsid virus sau này

- Phiên mã tạo ra mRNA, mRNA sẽ sử dụng các thành phần có sẵn của tế bào chủ nhƣ polymerase, ribosome… để tạo các yếu tố còn lại của virus mRNA sẽ là vật liệu di truyền cho thế hệ HAV tiếp theo sau khi đƣợc giải phóng khỏi tế bào chủ

Các phương pháp phát hiện HAV

1.2.1/ Phương pháp nuôi cấy tế bào và phát hiện kháng nguyên

Phương pháp nuôi cấy tế bào đã được ứng dụng trong việc nghiên cứu virus gây bệnh trên người và động vật HAV cũng đã được nuôi cấy trong các dòng tế bào người và tế bào động vật, bao gồm:

- Tế bào ở người: tế bào gan Alexander (Alexander hepatoma cells); nguyên bào sợi (Human fibroblasts); tế bào nguyên bào sợi phổi (Human lung fibroblasts- MCR5); tế bào nguyên bào phôi thai (Human embryo fibroblasts - HFS); tế bào thận thai nhi (Fetal rhesus kidney - FRhK-4; FRhK-6) [15,16]

- Tế bào động vật: tế bào thận khỉ xanh châu Phi (African green monkey kidney cells-BSC-1) [15,16]

Tuy nhiên, hầu hết các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy luôn gặp khó khăn trong nghiên cứu là do chủng HAV thường không có dấu hiệu phá hủy tế bào (cytopathic effect – CPE) và rất ổn định trong môi trường [16] Để giải quyết vấn đề không có CPE, các nghiên cứu về miễn dịch và phát hiện kháng nguyên HAV đã đƣợc áp dụng

Một số kỹ thuật đƣợc tiến hành trong các nghiên cứu này là: phát hiện tế bào nhiểm HAV bằng cách nhuộm miễn dịch huỳnh quang và phát hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang [44,45]; ELISA [44]; đồng vị phóng xạ - RIA [45]; đồng vị phóng xạ kết hợp lai huỳnh quang – RIFA; phát hiện HAV bằng kỹ thuật lai tại chỗ – insitu hybridization [44]

Tuy nhiên, các kỹ thuật nuôi cấy virus này tiêu tốn thời gian dài Phương pháp kính hiển vi huỳnh quang chỉ phát hiện đƣợc HAV trong tế bào nuôi cấy sau khi tế bào được lây nhiễm 7 ngày Phương pháp RIFA có thời gian phân tích từ 3 đến 4 tuần mới cho kết quả Mặc khác, các phương pháp này đều yêu cầu các thiết bị phân tích hiện đại, đắt tiền và không có khả năng phân lập HAV trực tiếp từ các mẫu lâm sàng hay mẫu môi trường

Hiện tại, kỹ thuật xét nghiệm bắt kháng thể IgM đã được thương mại hóa để phát hiện anti-HAV IgM [28] Mặc dù kháng thể IgM kháng HAV tồn tại trong thời gian dài, nhưng xét nghiệm chẩn đoán này thường không đạt được kết quả dương tính nếu thời gian nhiễm sau 4 – 6 tháng Sự có mặt của IgM thường có sự xuất hiện kèm theo của kháng thể IgG, cả 2 đều là anti-HAV, loại kháng thể này thường tồn tại suốt đời Tuy nhiên, phương pháp phát hiện HAV dựa trên xét nghiệm bắt kháng thể này yêu cầu một lƣợng HAV đủ để bắt với kháng thể IgM, nhƣ vậy virus viêm gan A này đã nhiễm vào cơ thể bệnh từ trước Do đó, tính hiệu quả khi chữa trị bệnh lúc nguyên phát sẽ giảm đi

1.2.2/ Phương pháp phát hiện bằng khuếch đại nucleic acid

Phương pháp khuếch đại in vitro các đoạn nucleid acid là phương pháp dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử để xác định và chẩn đoán tác nhân gây bệnh

Trong số các phương pháp khuếch đại nucleic acid, PCR là phương pháp đầu tiên và là kỹ thuật đƣợc áp dụng rộng rãi nhất trong cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu và lâm sàng Trong đó, RT-PCR là phương pháp khuếch đại nucleic acid dùng cho các loài có bộ gen là RNA Kỹ thuật này yêu cầu thực hiện 2 bước là phản ứng RT để tổng hợp cDNA và phản ứng PCR sử dụng cặp mồi bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của một đoạn DNA mục tiêu, một DNA polymearase chịu nhiệt có khả năng tổng DNA mạch đôi từ mạch khuôn mục tiêu Quá trình PCR bắt đầu với bước biến tính ở nhiệt độ 94 o C đến 96 o C, nhiệt độ này sẽ phá vỡ cầu nối hydrogen để tách sợi DNA mạch đôi ra thành 2 mạch đơn Tiếp đó là bước bắt cặp giữa mồi và khuôn ở nhiệt độ khoảng từ 45 o C đến 60 o C Tại nhiệt độ này mồi có thể gắn vào sợi DNA mạch đơn theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung Nhiệt độ bước này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính mạch khuôn Cuối cùng là bước kéo dài, thường là khoảng 72 o C Ở nhiệt độ này, DNA polymerase sẽ gắn lên vị trí bắt cặp và sử dụng nguyên liệu là dNTP có trong dung dịch phản ứng để tổng hợp kéo dài DNA primer theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn Toàn bộ quá trình đƣợc lặp đi lặp lại 25-40 lần để một bản sao của mẫu DNA có thể biến thành hàng tỷ bản sao trong vòng 1,5-3 giờ.

Xác nhận hiệu lực phương pháp

Xác nhận hiệu lực phương pháp là quá trình thực nghiệm một quy trình hay một phương pháp phân tích bằng những thí nghiệm kiểm tra và cung cấp những chứng cứ khách quan về tính chính xác và độ tin cậy của phương pháp khi áp dụng tại phòng thí nghiệm

Xác nhận hiệu lực một phương pháp phân tích vi sinh vật mới ( Phương pháp thay thế mới) là quá trình thực nghiệm để so sánh những kết quả thu được từ phương pháp thay thế và kết quả thu được từ phương pháp tiêu chuẩn (Phương pháp tham chiếu) cho cùng mục đích sử dụng [57]

1.3.1.2/ Các bước xác nhận hiệu lực phương pháp Để trở thành một phương pháp chính thức được công nhận rộng rãi và có tính pháp lý, phương pháp phân tích mới được xây dựng phải trải qua 2 bước xác nhận hiệu lực: xác nhận hiệu lực sơ cấp và xác nhận hiệu lực thứ cấp [57]

- Xác nhận hiệu lực sơ cấp (primary validation): Quá trình này do phòng thí nghiệm đề xuất phương pháp mới tiến hành, nhằm đưa ra các thông số kỹ thuật cơ bản của phương pháp, với mục đích chứng minh phương pháp này có tính năng tương đương hay có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp tiêu chuẩn Các thông số được xác định trong bước đánh giá này là giới hạn phát hiện, độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả

- Xác nhận hiệu lực thứ cấp (secondary validation): là sự thẩm tra các thông số kỹ thuật trong bước xác nhận hiệu lực sơ cấp, đồng thời xác nhận độ lặp lại (repeatability), độ tái lặp (reproducibility), độ lệch chuẩn (standard deviation) của phương pháp thay thế khi áp dụng tại các phòng kiểm nghiệm có tiện nghi và điều kiện khác nhau Quá trình này được tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, dưới sự chủ trì của một cơ quan chuyên môn có chức năng Kết quả xác nhận hiệu lực thứ cấp sẽ đƣợc trình lên hội đồng quốc gia hay tổ chức quốc tế có thẩm quyền ban hành phương pháp xem xét, đánh giá và ban hành để trở thành một phương pháp chính thức

1.3.2/ Các thông số kỹ thuật trong xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp định tính

1.3.2.1/ Độ chính xác (Accuracy) Độ chính xác của một phương pháp là thông số đánh giá khả năng cho kết quả chính xác của phương pháp đó Đối với một phương pháp mới được xây dựng, độ chính xác được xác định thông qua tỷ lệ cho kết quả âm tính hay dương tính đối với các mẫu có kết quả dương tính hay âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

1.3.2.2/ Độ nhạy (Sensitivity) Độ nhạy là chỉ số đánh giá khả năng phát hiện vi sinh vật mục tiêu có trong mẫu bằng phương pháp thay thế Chỉ số này là tỷ lệ giữa số kết quả dương tính so với số kết quả dương tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

1.3.2.3/ Độ đặc hiệu (Specificity) Độ đặc hiệu của một phương pháp phân tích vi sinh là khả năng phương pháp đó cho kết quả âm tính trên mẫu phân tích không chứa vi sinh mục tiêu (mẫu thật sự âm tính) Chỉ số này là tỷ lệ giữa số kết quả âm tính của phương pháp thay thế so với số kết quả âm tính khi phân tích bằng phương pháp tham chiếu

1.3.2.4/ Âm tính giả (False negative) Âm tính giả là kết quả khi phân tích một mẫu chắc chắn chứa vi sinh vật mục tiêu của phương pháp nhưng kết quả của phương pháp đó cho âm tính

1.3.2.5/ Dương tính giả (False positive)

Dương tính giả là kết quả dương tính khi phân tích mẫu chắc chắn không chứa vi sinh vật mục tiêu nhưng kết quả của phương pháp đó cho dương tính

1.3.3/ Ý nghĩa của việc xác nhận hiệu lực phương pháp

Một phương pháp mới cần phải được thực hiện đánh giá so sánh với những phương pháp tiêu chuẩn trước khi đưa vào sử dụng Việc đánh giá này giúp cho người sử dụng nhận định được một cách tương đối phương pháp nào là tối ưu hơn Từ đó, tùy vào điều kiện và các yêu cầu cụ thể sẽ lựa chọn phương pháp có tính hiệu quả nhất đáp ứng cho công việc phân tích Do đó, công việc này phải đƣợc thực hiện một cách khách quan và phải được thẩm định bởi các cơ quan, tổ chức có thẩm quyền Một phương pháp tốt mang lại nhiều sự tiện ích cần phải đƣợc phổ biến sử dụng rộng rãi, do đó việc xác nhận hiệu lực phương pháp sẽ có vai trò là cầu nối đưa phương pháp đó đến nơi cần đến Xác nhận hiệu lực phương pháp cũng giúp bổ sung những thiếu sót, hạn chế của phương pháp và giúp phương pháp trở nên đáng tin cậy, được sử dụng rộng rãi.

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật Liệu

- Cân kỹ thuật (d = 0,01gram) - Cân phân tích (d = 0,0001gram) - Tủ ấm 37 0 C

- Bể ổn nhiệt - Nồi hấp - Tủ sấy - Tủ bảo quản hóa chất 2 – 8 0 C - Tủ bảo quản chủng -30 o C - Tủ an toàn sinh học Nuve MN120 - Máy vortex

- Máy PCR (Applied Biosystems ABI 2720 Thermal Cycler) - Bộ điện di DNA liền nguồn Mupid-eXU

- Bộ chụp ảnh điện di (ATTO) và Video Graphic Printer

- Pipet, transferpipet cỏc mức 1-10àl; 10-100àl; 100-1000àl

2.1.2.1/ Hóa chất dùng cho tách chiết RNA virus

- Proteinase K có nồng độ ≥ 30U/mg - Bộ kit High Pure Viral RNA dùng để tách chiết RNA

+ Đệm liên kết (Binding Buffer) + Poly (A), lyophilizate

+ Đệm bảo vệ (Inhibitor Removal Buffer) + Đệm rửa (Wash Buffer)

+ Đệm giải hấp (Elution Buffer)

2.1.2.2/ Hóa chất dùng cho phản ứng Reverse Transcription (RT)

- Nuclease-Free Water - Mồi ngẫu nhiên (Random primer) - Buffer phản ứng (GoScript™ 5X Reaction Buffer) - MgCl 2 25mM

- dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix) - Chất ức chế RNase (Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 20units) - Enzyme GoScript™ Reverse Transcriptase

2.1.2.3/ Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- Nuclease-Free Water - Buffer phản ứng (5X Colorless GoTaq Flexi Buffer) - MgCl 2 25mM

- dNTP thành phần (PCR Nucleotide Mix) - Mồi xuôi (Upstream primer)

- Mồi ngƣợc (Downstream primer) - GoTaq G2 Hot Start Polymerase

- Đệm TAE 1X (4,48 g Tris; 2ml Na 2 EDTA 0,5M pH 8; 1,14ml glacial acetic acid, nước cất đủ 1000ml)

- Agarose phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR

- Dung dịch nạp mẫu Blue/Orange Loading Dye 6X, thuốc nhuộm Dynamid Nucleotid Dye 6X

2.1.3.1/ Trình tự các cặp mồi phát hiện HAV

Trình tự dùng cho thiết kế mồi đƣợc lấy từ Genbank, có mã số M14707

Cỏc mồi đƣợc tổng hợp bởi hóng IDT, nồng độ 100àM

Sử dụng công cụ BLAST (www.ncbi.nih.gov) để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi

Kích thước sản phẩm khuếch đại là 248bp Khuếch đại vùng bảo tồn VP3-VP1 trên bộ gen của HAV [8,13,25,42,46]

Bảng 2.1 Trình tự mồi có sẵn được sử dụng trong nghiên cứu

Kích thước đoạn khuếch đại (bp)

F: 5- GTT TTG CTC CTC TTT ATC ATG CTA TG-3′

R: 5- GGA AAT GTC TCA GGT ACT TTC TTG-3′

* Thông tin theo Cetificate of Analysis của nhà sản xuất

2.1.3.2/ Thang DNA Để ước lượng kích thước các đoạn DNA được khuếch đại, thang DNA được sử dụng có kích thước 100bp Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng loại thang 100bp DNA Ladder Plus (Promega), bao gồm 11 vạch với kích thước như Hình 2.1

Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang 100bp DNA Ladder Plus

2.1.3.3/ Nền mẫu NT2MV sử dụng cho nghiên cứu

Các mẫu NT2MV sử dụng trong nghiên cứu là loài nghêu (Meretrix lyrata) Đây là các loại mẫu lấy từ :

- Khu vực biển Cần Giờ và các khu vực ven biển Bình Đại, Ba Tri, Thạnh Phú của tỉnh Bến Tre Các khu vực này thuộc các điểm giám sát Nhà Nước về khai thác cũng nhƣ bảo vệ nguồn lợi của NT2MV đƣợc quốc tế cấp giấy chứng nhận về giá trị thương phẩm

- Lô hàng thành phẩm xuất nhập khẩu của công ty, doanh nghiệp có sử dụng nguồn nguyên liệu là nghêu nằm trong vùng nuôi do Nhà Nước quản lý Các mẫu lô hàng này đƣợc Trung tâm Chất lƣợng Nông lâm thủy sản vùng 4 (NAFIQAD 4) lấy mẫu để kiểm tra và cấp giấy chứng nhận xuất khẩu

2.1.3.4/ Chủng virus, vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu

Chủng virus sử dụng chính cho nghiên cứu và dùng làm đối chứng dương là chủng HAV, Norovirus và các virus gây bệnh trên thủy sản Các vi sinh vật gây bệnh lan truyền qua đường thực phẩm khác cũng được sử dụng trong phần đánh giá hiệu lực sơ cấp của phương pháp và khẳng định độ đặc hiệu, tính chọn lọc của cặp mồi đã chọn

Việc bố trí thí nghiệm xem tại Phụ lục 6

Danh sách chủng, ký hiệu và nguồn gốc đƣợc trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật dùng trong thí nghiệm

Tên chủng Nguồn gốc Số lƣợng Ký hiệu

Chủng chuẩn hepatitis A virus * ATCC VR-1357 01 HAV

4 Virus gây bệnh đốm trắng Kit IQ2000* 01 WSSV

5 Virus gây bệnh đầu vàng Kit IQ2000 01 YHV

Kit IQ2000 là bộ kit dùng để phát hiện các virus gây bệnh trên tôm, cá và đƣợc cung cấp bởi hãng GeneReach Biotecnology Corp (Đài Loan) bao gồm: virus gây bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV); virus gây bệnh đầu vàng (Yellow head virus-YHV)

* Chủng chuẩn hepatitis A virus Đối với chủng HAV Đƣợc cung cấp bởi ATCC có số hiệu ATCC VR-1357 Ống chứa dịch chủng chuẩn có trạng thái tồn tại là hạt virus được giữ trong môi trường chuyờn biệt nhƣ sau: EMEM + 2% FBS + 2,5àg/ml Amphotericin B Ống chứa dịch chủng chuẩn có 1,6 x 10 6 TCID 50 /ml Tiến hành quy đổi TCID 50 thành đơn vị PFU/ml để thuận tiện cho việc tính toán trong quá trình xác nhận hiệu lực phương pháp Công thức quy đổi theo ATCC như sau [69]:

Phương pháp

2.2.1.1/ Cơ sở dữ liệu NCBI

NCBI là một tài nguyên quốc tế về thông tin sinh học phân tử NCBI đƣợc tạo ra để giữ gìn những cơ sở dữ liệu công cộng, quản lý nghiên cứu trong sinh học tính toán, phát triển những công cụ phần mềm thông tin về bộ gen và phổ biến các thông tin về y-sinh học

Trang web NCBI liên tục cập nhật thông tin, tạo ra những cở sở dữ liệu và công cụ mới cho việc khai thác dữ liệu NCBI cung cấp nhiều khả năng tìm kiếm tài liệu, cơ sở dữ liệu và công cụ tin-sinh học

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI để tìm kiếm các trình tự gen của chủng HAV, tạo ra dữ liệu để so sánh độ tương đồng và đánh giá độ đặc hiệu và chuyên biệt của mồi trên lý thuyết

Việc tìm kiếm đƣợc tiến hành trên Nucleotide Database, các mã số truy cập trình tự gene cần tìm hay tên loài HAV là từ khóa tìm kiếm trình tự gen Các trình tự gen được tìm thấy sẽ được lưu dưới định tệp (file) FASTA để sử dụng vào các bước tiếp theo

BLAST là một chương trình tìm kiếm và so sánh độ tương đồng Chương trình này sử dụng để so sánh trình tự RNA, DNA hay protein đang nghiên cứu với những trình tự có trong cơ sở dữ liệu (Genbank, EMBL,…), lựa chọn các trình tự có độ tương đồng từ cao xuống thấp Chương trình BLAST giúp nhanh chóng tìm ra những trình tự sinh học tương đồng (nếu có) với trình tự đang nghiên cứu Ngoài ra, BLAST còn cung cấp cho người dùng những số liệu về tỉ lệ tương đồng, nguồn gốc các trình tự tương đồng

Trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi sử dụng chương trình Nucleotide BLAST để tìm kiếm sự tương đồng hay khác biệt giữa trình tự RNA đang nghiên cứu với trình tự RNA của chủng HAV trong các nghiên cứu khác, thông tin về trình tự tương đồng được thề hiện tương ứng trong từng cột thông số như sau:

- Accession: Mã số truy cập vào các trình tự tương đồng trong Genbank - Description: Mô tả chức năng trình tự

- Max core: Điểm tương đồng được tính toán bởi Nucleotide BLAST (giá trị này càng cao thì độ tương đồng càng cao)

- Query coverage: Mức độ bao phủ của vùng tương đồng với trình tự tương đồng

- E value: Giá trị E xác suất của vùng tương đồng xuất hiện không ngẫu nhiên ( giá trị này càng nhỏ thì mức độ tương đồng càng cao)

- Max ident: Mức độ tương đồng giữa vùng trình tự gốc và trình tự tương đồng.

2.2.2/ Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật sinh học phân tử

2.2.2.1/ Phương pháp chiết tách và tinh sạch RNA virus

Virus tập trung chủ yếu ở phần nội tạng của NT2MV Khi ly giải nội tạng này bằng Proteinase K, toàn bộ nucleic acid của virus đƣợc phóng thích ra ngoài Với sự hiện diện của guanidine HCl, nucleic acid gắn vào mạng lưới sợi thủy tinh trong cột lọc ly tâm Sử dụng các buffer để rửa kết hợp với ly tâm, sau quá trình này thì muối, protein và các thành phần tế bào khác bị loại bỏ, chỉ còn RNA virus liên kết trên lưới sợi thủy tinh Sau cùng, RNA tinh sạch đƣợc tách rửa vào buffer có nồng độ muối thấp với lượng thể tích nhỏ Trong bước thu nhận RNA virus, được chia thành 2 phần chính: a) Xử lý mẫu nhuyễn thể

Hình 2.2 Vị trí lấy mẫu nội tạng nghêu (A) và mẫu nội tạng sau khi đã tách rời (B)

Hình 2.3 Nội tạng NT2MV sau khi tách được đặt trong ống falcon

Hình 2.4 Mẫu nội tạng tách sạch (A), mẫu nội tạng tách chưa sạch (B) sau khi ly tâm

- Dùng kéo, kẹp tách lấy phần nội tạng của nhuyễn thể trên khay vô trùng (Hình 2.2)

- Cân 2 ± 0,2gam nội tạng vào ống falcon (khoảng 10 nội tạng đối với mẫu nghêu) ( Hình 2.3)

- Đồng nhất nội tạng bằng chày dập mẫu, đồng thời bổ sung 2ml Proteinase K vào falcon chứa mẫu

- Vortex ống falcon chứa mẫu trong 20 giây, đem ủ 37 o C trong tối thiểu 1 giờ

- Ủ falcon ở 60 o C trong 15 phút, để bất hoạt Proteinase K

- Ly tâm falcon thu dịch nổi, hoặc chiết phần dịch trong falcon ra eppendorf 2ml, đem ly tâm, thu dịch nổi Lực ly tâm là 3000 xg trong 5 phút (Hình 2.4)

- Phần dịch nổi này đƣợc sử dụng để tách chiết RNA virus

* Chuẩn bị trước hóa chất dùng cho tách chiết RNA virus:

- Poly A: Bổ sung 0,4ml đệm giải hấp (Elution buffer) vào lọ chứa Poly A đông khô Lắc đều, chia nhỏ ra các eppendorf 0,5ml để bảo quản lâu ở nhiệt độ dưới -15 o C

Thể tớch chia nhỏ là 40àl/eppendorf

- Chuẩn bị Working solution: theo tỷ lệ 0,4ml đệm liên kết (Binding buffer) : 4àl Poly A Tựy thuộc vào số mẫu cần tỏch chiết, chuẩn bị lƣợng thể tớch đủ dựng trong ống falcon Trộn đều hỗn hợp và chia nhỏ ra các eppendorf Mỗi eppendorf chứa 0,4ml hỗn hợp, dùng cho tách chiết một mẫu Hỗn hợp này chỉ sử dụng trong ngày, bảo quản ở nhiệt độ 15-25 o C

- Đệm bảo vệ (Inhibitor removal buffer): Thêm 20ml ethanol tuyệt đối, lắc đều

- Đệm rửa (Wash buffer): Thêm 40ml ethanol tuyệt đối vào mỗi lọ, lắc đều b) Tách và tinh sạch RNA bằng High Pure RNA Viral kit

Hình 2.5 Sơ đồ tóm tắt các bước tinh sạch RNA virus bằng High Pure RNA Viral kit

Bước 1/ Cho 200àl dịch nổi và 400àl Working solution vào eppendorf cú dung tớch 1,5ml:, trộn đều, ủ ở 15-25 o C trong ít nhất 10 phút

Bước 2/ Gắn một cột lọc (High Pure Spin Filter Tube) vào một ống thu dịch (Collection Tube), tạo thành ống lọc Pipette toàn bộ lƣợng mẫu trong eppendorf 1,5ml sau khi ủ vào ống lọc Ly tâm ống lọc ở 8000 xg trong 15 giây Loại bỏ ống thu dịch và chèn cột lọc vào ống thu dịch mới

Bước 3/ Loại chất ức chế: Thờm 500 àl đệm bảo vệ, ly tõm ở 8000 xg trong 1 phỳt Bỏ ống thu dịch và chèn cột lọc vào ống thu dịch mới

Bước 4/ Rửa lần 1: Thờm 450àl đệm rửa, ly tõm ở 8000 xg trong 1 phỳt Bỏ ống thu dịch và chèn cột lọc vào ống thu dịch mới

Bước 5/ Rửa lần 2: Thờm 450àl đệm rửa, ly tõm ở 8000 xg trong 1 phỳt

Bước 6/ Ly tâm ở 13000 xg trong 10 giây Loại bỏ ống thu dịch, chèn cột lọc vào eppendorf 1,5 ml

Bước 7/ Tỏch rửa RNA: Bổ sung 50àl đệm giải hấp Ly tõm ở 8000 xg trong 1 phỳt

Loại bỏ cột lọc, đậy nắp eppendorf

Bước 8/ RNA tinh sạch thu được sau tách rửa có thể đem sử dụng trực tiếp cho phản ứng RT-PCR hoặc bảo quản ở -30 o C c) Khảo sát thời gian ủ mẫu với Working solution

Dung dịch Working solution chứa đệm liên kết và poly A Trong đệm liên kết có chứa Guanidinium isothiocyanate có bản chất là một protein dùng để phá lớp vỏ capsid virus, ức chế hoạt động của RNase Poly A có vai trò nối vào đoạn RNA để bảo vệ cho RNA Do đó, cần xác định rõ thời gian ủ mẫu với Working solution để lƣợng RNA đƣợc gắn với poly A là nhiều nhất và đồng thời các thành phần không mong muốn khác bị ức chế nhiều nhất

Tiến hành khảo sát các khoảng thời gian ủ : 10 – 15 – 20 – 25 – 30 phút

- Chuẩn bị 5 ống chứa dịch chủng HAV đã biết trước nồng độ Mỗi ống tương ứng với một thời gian khảo sát

- Cho vào eppendorf : 200àl gồm 10àl dịch chủng HAV + 190àl Nuclease Free- Water và 400 àl Working solution Trộn đều Ủ tại cỏc khoảng thời gian cần khảo sỏt

Nhiệt độ ủ đồng nhất cho tất cả các eppendorf

- Sau khi ủ, tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo như trong quy trình của bộ kit High Pure RNA Viral ở trên Mỗi thời gian ủ khảo sát lặp lại 3 lần

- Lƣợng RNA thu đƣợc sau khi tinh sạch trong mỗi khảo sát đƣợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 260nm Nồng độ RNA tại mốc thời gian ủ nào cao nhất sẽ đƣợc chọn làm thời gian ủ của mẫu và Working solution cho quy trình

*Kiểm soát chất lƣợng RNA tách chiết Phương pháp

- Đo độ hấp thụ của RNA sau tách chiết bằng máy ScanDrop trong dải bước sóng 180-720nm

- Độ tinh sạch của RNA tách chiết: Tỷ lệ A260/A280 ≥ 2,0

- Không nhiễm muối, phenol: Tỷ lệ A260/A230 ≥ 2,0

- Nồng độ RNA thu đƣợc tối thiểu phải đạt 50ng/àl cho 2g nội tạng nhuyễn thể

2.2.2.2/ Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR a) Thực hiện phản ứng Reverse Transcription (RT)

Các thí nghiệm phân tích HAV bằng phản ứng RT đều đƣợc thực hiện với dung tớch 20àl gồm cỏc thành phần của bộ kit GoScript™ Reverse Transcriptase của hóng Promega Quá trình thực hiện được chia làm 2 bước chính: a1) Ủ mẫu với mồi ngẫu nhiên (Random primer)

- RNA sau khi tinh sạch sẽ hỳt 5àl vào eppendort 200àl, bổ sung tiếp vào 1àl mồi ngẩu nhiờn và 1àl Nucleease Free-Water

- Trộn đều và nhẹ nhàng dung dịch bằng pipet - Ủ dung dịch này ở 70 o C trong 5 phút

- Làm lạnh nhanh dung dịch này ở 4 o C trong 10-15 phút a2) Nạp mastermix RT vào hỗn hợp mẫu RNA sau khi ủ với mồi ngẫu nhiên

Thành phần phản ứng RT chưa tối ưu hóa và các bước thực hiện như Bảng 2.3

Bảng 2.3 Thao tác thực hiện và thành phần phản ứng RT

STT thành phần Thành phần Nồng độ trong 1 phản ứng

4 Chất ức chế RNase 20units 0,5

6 Nuclease Free-Water / Vừa đủ 13àl

Kiểm tra tính chuyên biệt và đặc hiệu của cặp mồi đã chọn bằng công cụ

3.1.1/ Kiểm tra tính chuyên biệt của cặp mồi khuếch đại gen VP3-VP1 của HAV bằng công cụ BLAST

F: 5′- GTT TTG CTC CTC TTT ATC ATG CTA TG-3′ (vị trí nucleotide thứ 2167 đến 2193 trong bộ gen của HAV )

R: 5′- GGA AAT GTC TCA GGT ACT TTC TTG-3′ (vị trí nucleotide thứ 2389 đến 2414 trong bộ gen của HAV)

Theo kết quả nghiên cứu của nhiều công trình đã đƣợc công bố, để phát hiện HAV có thể sử dụng phương pháp PCR với các cặp mồi được thiết kế dựa trên các vùng gen bảo tồn của loài HAV, vùng gen bảo tồn này mã hóa tạo ra các protein capsid của HAV, trong đó 2 vùng gen là VP1/2A và VP3-VP1 đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhất [7,21,25]

Công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) đƣợc tích hợp trên trang web NCBI Chương trình này cho phép tìm kiếm và so sánh trình tự yêu cầu với các trình tự có sẵn trên các ngân hàng gen nhƣ Genebank, EMBL, DDBJ dựa trên sự tương đồng

Việc kiểm tra tính chuyên biệt của cặp mồi đƣợc thực hiện bằng cách so sánh trình tự vùng gen VP3-VP1 đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi đã chọn với các trình tự bộ gen khác thuộc loài HAV bằng công cụ BLAST Kết quả so sánh đƣợc thể hiện ở Hình 3.1

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra bằng BLAST trình tự gen VP3-VP1 so với trình tự bộ gen của các chủng HAV trên ngân hàng gen của NCBI

Kết quả BLAST Hình 3.1 cho thấy cặp mồi khuếch đại vùng gen VP3-VP1 của HAV có độ tương đồng với 100 trình tự, các trình tự này đều thuộc loài HAV đã được công bố Các chỉ số sau khi BLAST: Max score >200; Query coverage từ 98% đến

100%, E value là 2x10 -125 và Max ident từ 96% đến 100% Điều này chứng tỏ cặp mồi đƣợc lựa chọn có khả năng bắt cặp tốt với các trình tự nucleid acid thuộc chủng HAV

Thông tin trình tự vùng gen VP3-VP1 đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi và kết quả BLAST xem tại Phụ lục 2

3.1.2/ Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại đoạn gen VP3-VP1 với các vi sinh vật khác bằng công cụ BLAST

Khảo sát này nhằm mục đích kiểm tra khả năng bắt cặp không đặc hiệu của mồi đã chọn so với các vi sinh vật khác bằng công cụ BLAST Khảo sát đƣợc thực hiện bằng cách so sánh trình tự đoạn DNA khuếch đại với các trình tự nucleid acid của các vi sinh vật khác loài HAV Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện tại Hình 3.2

Hình 3.2 Kết quả so sánh bằng công cụ BLAST trình tự đoạn DNA khuếch đại của gen

VP3-VP1 với bộ gen các loài vi sinh vật khác

Kết quả BLAST Hình 3.2 cho thấy, trình tự DNA mục tiêu khuếch đại từ gen VP3-VP1 có sự tương đồng cao với 1 trình tự bộ gen, nhưng trình tự này cũng lại cho kết quả hiển thị là HAV Điều này chứng tỏ, cặp mồi đƣợc lựa chọn khuếch đại vùng gen VP3-VP1 không có khả năng bắt cặp không đặc hiệu với các trình tự nucleid acid khác loài HAV đã đƣợc công bố.

3.1.3/ Khảo sát tính chuyên biệt của cặp mồi phát hiện HAV đã chọn

Khảo sát nhằm mục đích khẳng định thêm tính chuyên biệt của cặp mồi đã chọn sau khảo sát in silico bằng các công cụ sinh tin học trên NCBI Khảo sát đƣợc thực hiện bằng thực nghiệm với 11 chủng vi sinh vật, bao gồm:

- 6 chủng virus là: hepatitis A virus, Norovirus GI, Norovirus GII, virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), virus gây bệnh đầu vàng (YHV), Mengovirus

- 5 chủng vi sinh khuẩn là: Salmonella Typhymurium, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes Thông tin chi tiết về các chủng vi sinh vật này đƣợc trình bày trong Bảng 2.2

Tiến hành phản ứng RT-PCR với mẫu là 11 chủng nhƣ Bảng 3.1 Các thông số về điều kiện phản ứng RT-PCR đƣợc trình bày tại mục 2.2.2.2, cụ thể nhƣ sau: nồng độ

MgCl 2 trong phản ứng RT là 2,5mM; nồng độ MgCl 2 và nồng độ các mồi trong phản ứng PCR tương ứng là 2mM và 0,4μM; nhiệt độ bắt cặp giữa mồi và khuôn là 50 o C

Kết quả quả khảo sát thể hiện ở Hình 3.3 và Bảng 3.1

Hình 3.3 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi dùng để phát hiện HAV với các chủng vi sinh vật khác

L: Thang chuẩn 100bp; 1: HAV; 2: E.coli; 3: S.aureus; 4: V.para; 5: L.mono; 6:S.typhi; 7: NoV-GI; 8:

NoV-GII; 9: WSSV; 10: YHV;11: MeV; (-): chứng âm không chứa RNA của HAV

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi phát hiện HAV khi khuếch đại với các chủng vi sinh vật khác

Hình 3.3 và Bảng 3.1 cho thấy cặp mồi khuếch đại vùng gen VP3-VP1 (248bp) của HAV không cho bất kỳ sản phẩm khuếch đại nào với các chủng vi sinh vật khác, chứng tỏ không xảy ra hiện tƣợng bắt cặp không đặc hiệu giữa cặp mồi này với các vi sinh vật thường gặp trong nước và thực phẩm

Từ nghiên cứu khảo sát tính đặc hiệu của cặp mồi trên công cụ BLAST và kết quả từ phản ứng RT-PCR, cho thấy cặp mồi đã chọn dùng để phát hiện HAV có tính chuyên biệt rất cao Và kết quả này cũng thay thế cho thông số độ chọn lọc trong việc xác nhận hiệu lực sơ cấp phương pháp

STT Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu Kết quả

6 Hepatitis A virus ATCC VR-1357 HAV +

7 Norovirus GI Microbiologics HE0013S NoV-GI - 8 Norovirus GII Microbiologics HE0013S NoV-GII -

9 White spot syndrome virus kit IQ2000 WSSV -

10 Yellow head virus kit IQ2000 YHV -

Ghi chú: (+) Dương tính với HAV; (-) Âm tính với HAV

Xây dựng quy trình phân tích HAV bằng phương pháp RT-PCR

3.2.1/ Khảo sát thời gian ủ mẫu với dung dịch làm việc (working solution)

Khảo sát nhằm mục đích tối ưu thời gian tương tác giữa HAV và đệm liên kết chứa poly A Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, thời gian ủ mẫu ít nhất là 10 phút Do vậy cần xác định thời gian ủ mẫu tối đa để tránh khả năng hƣ hỏng RNA hoặc bị nhiễm các tác nhân không mong muốn từ môi trường bên ngoài Khảo sát được thực hiện trong các khoảng thời gian 10, 15, 20, 25, 30 phút Lƣợng RNA thu đƣợc sau quá trình chiết tách đƣợc xác định bằng máy Scandrop, đơn vị tính lƣợng RNA thu đƣợc đƣợc quy đổi thành ng/àl Kết quả khảo sỏt sự ảnh hưởng của thời gian ủ lờn hiệu xuất chiết tách RNA đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả sự ảnh hưởng thời gian ủ mẫu với Working solution

Kết quả từ Bảng 3.2 cho thấy: tại tất cả các mốc thời gian khảo sát, tỉ lệ hấp thụ A260/280 ≥ 2; tỉ lệ A260/230 ≥ 2 Chứng tỏ quá trình tinh sạch RNA đạt hiệu quả cao

Không bị nhiễm các thành phần khác nhƣ muối, phenol, DNA…

Nồng độ RNA sau khi tinh sạch (ng/àl)

10 phút 15 phút 20 phút 25 phút 30 phút

Nồng độ RNA trung bình 210 227 284 291 220

Tỉ lệ A260/280 trung bình 2,21 2,30 2,04 2,17 2,34 Tỉ lệ A260/230 trung bình 2,20 2,05 2,10 2,29 2,36

Nồng độ RNA tăng dần từ 10 phút đến 25 phút ủ với working solution Trong đó, tại các khoảng thời gian ủ 20 phút và 25 phút thu đƣợc lƣợng RNA đƣợc tinh sạch cao nhất tương ứng 284 ng/àl và 291 ng/àl Sau đú giảm xuống 220 ng/àl tại thời điểm

30 phút Lặp lại 3 lần khảo sát đều cho kết quả tương tự

Trên cơ sở kết quả khảo sát chúng tôi chọn khoảng thời gian ủ dịch chiết mẫu với working solution trong khoảng 20-25 phút là thời gian tối ƣu cho việc thực hiện quá trình này

3.2.2/ Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 đến phản ứng RT

Khảo sát này nhằm mục đích xác định nồng độ MgCl 2 tối ƣu trong hỗn hợp phản ứng RT để tạo ra lƣợng cDNA nhiều nhất có thể và có tín hiệu khuếch đại tốt trong phản ứng PCR cho việc phát hiện HAV

Khảo sát đƣợc thực hiện trên dịch chiết RNA từ dịch chủng chuẩn HAV có nồng độ 2 -4 Nồng độ RNA đã đƣợc tinh sạch từ dịch chủng chuẩn HAV có độ pha loãng 2 -4 là 270 ng/μl

Thành phần và chương trình của phản ứng RT như Bảng 2.3, Bảng 2.4 Trong đó, nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp mastermix RT đƣợc thay đổi trong khoảng 1,5 – 5mM

Sản phẩm của quá trình RT đƣợc tiếp tục thực hiện bằng phản ứng PCR để khuếch đại số lƣợng cDNA vừa mới tạo ra Dựa theo những thí nghiệm khảo sát ban đầu chúng tôi đã thực hiện và khuyến cáo của nhà cung cấp bộ kit, nồng độ mồi đƣợc chọn trong thớ nghiệm là 0,5àM, nồng độ MgCl 2 đƣợc chọn là 2,5mM, nhiệt độ bắt cặp mồi được chọn là ̅̅̅̅̅ – 5 o C = 50 o C Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.5, chương trình phản ứng PCR thực hiện nhƣ Bảng 2.7 Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện tại Hình 3.4

Hình 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 lên phản ứng RT

L: Thang chuẩn 100bp; 1: 1,5mM MgCl 2 ; 2: 2mM MgCl 2 ; 3: 2,5mM MgCl 2 ; 4: 3mM MgCl 2 ; 5: 3,5mM MgCl 2 ; (-): Chứng âm là mẫu không có RNA của HAV

Kết quả điện di trên Hình 3.4 cho thấy khi thay đổi nồng độ MgCl 2 từ 1,5mM đến 3,5mM, phản ứng RT-PCR đều cho tín hiệu khuếch đại dương tính tốt và ổn định qua các lần lặp lại Trong đó, nồng độ MgCl 2 tại mức 1,5mM cho kết quả khuếch đại ít nhất trong dãy khảo sát, 4 nồng độ MgCl 2 còn lại đều cho tín hiệu khuếch đại sáng, rõ nhƣ nhau

Từ kết quả khảo sát trên, nồng độ MgCl 2 2mM trong hỗn hợp phản ứng RT là nồng độ đƣợc chọn để thiết lập quy trình RT dùng để tạo cDNA từ RNA của HAV

Chúng tôi chọn nồng độ này với lý do đây là nồng độ MgCl 2 tối thiểu đạt đƣợc tín hiệu tốt và ổn định, thỏa mãn được tính kinh tế khi áp dụng phương pháp Mặt khác, nếu chọn nồng độ MgCl 2 ở mức cao hơn có thể ảnh hưởng tới phản ứng PCR về sau, do lượng cDNA nạp vào hỗn hợp phản ứng PCR vẫn còn MgCl 2 của phản ứng RT trước đó

3.2.3/ Khảo sát đồng thởi ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi đến phản ứng PCR

Khảo sát nhằm mục đích xác định đồng thời 2 thành phần của phản ứng PCR là MgCl 2 và mồi Hai thành phần này đƣợc khảo sát theo bộ kit GoTaq G2 Hot Start Polymerase Nồng độ MgCl 2 khảo sát tại các mức : 1,5 - 2 – 2,5 – 3 – 3,5mM Nồng độ mồikhảo sỏt tại cỏc mức : 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8àM

Khảo sát đƣợc thực hiện trên dịch chiết RNA từ dịch chủng chuẩn HAV có nồng độ 2 -4 RNA đã được tinh sạch và tiến hành bước phản ứng RT với thành phần phản ứng, chương trình phản ứng và nồng độ MgCl 2 đã tối ưu ở mục 3.2.2

Thành phần phản ứng PCR như Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR như Bảng 2.7 với nhiệt độ bắt cặp mồi đƣợc chọn mặc định là ̅̅̅̅̅ – 5 o C = 50 o C Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện tại Hình 3.5 và Bảng 3.3

Hình 3.5 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 và nồng độ mồi lên phản ứng RT-PCR phát hiện HAV (A và B)

1: MgCl 2 : 1,5mM; primer: 0,2àM 2: MgCl 2 : 2mM; primer: 0,2àM 3: MgCl 2 : 2,5mM; primer: 0,2àM 4: MgCl 2 : 3mM; primer: 0,2àM 5: MgCl 2 : 3,5mM; primer: 0,2àM 6: MgCl 2 : 1,5mM; primer: 0,4àM 7: MgCl 2 : 2mM; primer: 0,4àM 8: MgCl 2 : 2,5mM; primer: 0,4àM 9: MgCl 2 : 3mM; primer: 0,4àM 10: MgCl 2 : 3,5mM; primer: 0,4àM

1: MgCl 2 : 1,5mM; primer: 0,6àM 2: MgCl 2 : 2mM; primer: 0,6àM 3: MgCl 2 : 2,5mM; primer: 0,6àM 4: MgCl 2 : 3mM; primer: 0,6àM 5: MgCl 2 : 3,5mM; primer: 0,6àM 6: MgCl 2 : 1,5mM; primer: 0,8àM 7: MgCl 2 : 2mM; primer: 0,8àM 8: MgCl 2 : 2,5mM; primer: 0,8àM 9: MgCl 2 : 3mM; primer: 0,8àM 10: MgCl 2 : 3,5mM; primer: 0,8àM

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát nồng độ mồi và MgCl 2 lên phản ứng PCR

Thang điểm đánh giá kết quả điện di tham chiếu ở bảng 2.6.

Đề xuất quy trình phát hiện HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR70 3.3.1/ Xử lý nền mẫu nhuyễn thể và tách chiết, tinh sạch RNA virus

Từ các kết quả đƣợc xác định qua quá trình khảo sát nhƣ trên, quy trình phân tích HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-PCR đƣợc đề nghị nhƣ sau:

3.3.1/ Xử lý nền mẫu nhuyễn thể và tách chiết, tinh sạch RNA virus

- Dùng kéo, kẹp tách lấy phần nội tạng của nhuyễn thể trên khay vô trùng

- Cân 2 ± 0,2g nội tạng vào ống falcon, tương đương khoảng 10 nội tạng đối với mẫu nghêu

- Đồng nhất nội tạng bằng chày dập mẫu, đồng thời bổ sung 2ml Proteinase K vào falcon chứa mẫu

- Vortex ống falcon chứa mẫu trong 20 giây, đem ủ 37 o C trong tối thiểu 1 giờ

- Ủ falcon ở 60 o C trong 15 phút, để bất hoạt Proteinase K

- Ly tâm falcon thu dịch nổi, hoặc chiết phần dịch trong falcon ra eppendorf 2ml, đem ly tâm, thu dịch nổi Lực ly tâm là 3000 xg trong 5 phút

- Phần dịch nổi này đƣợc sử dụng để tách chiết RNA virus

- RNA virus đƣợc tinh sạch bằng High Pure RNA Viral kit với thời gian ủ mẫu với dung dịch làm việc từ 20-25 phút tại nhiệt độ phòng

3.3.2.1/ Ủ mẫu với mồi ngẫu nhiên (Random primer)

- Hỳt 5àl RNA sau khi tinh sạch vào eppendort cú thể tớch 200àl, bổ sung vào 1àl mồi ngẫu nhiờn và 1àl Nuclease Free-Water Tổng thể tớch phản ứng là 7àl

- Trộn đều và nhẹ nhàng dung dịch bằng pipet - Ủ dung dịch này ở 70 o C / 5 phút

- Làm lạnh nhanh dung dịch này ở 4 o C / 10-15 phút

Thực hiện phản ứng RT với thành phần hỗn hợp phản ứng nhƣ Bảng 3.4

Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp phản ứng RT đề xuất

STT thành phần Thành phần Nồng độ trong 1 phản ứng

4 Chất ức chế RNase 20units 0,5

6 RNA đã ủ với mồi ngẫu nhiên / 7

7 Nuclease Free-Water / Vừa đủ 20àl

Chương trình phản ứng RT như Bảng 3.5.

Bảng 3.5 Chương trình phản ứng RT đề xuất

Thực hiện phản ứng PCR với thành phần hỗn hợp phản ứng nhƣ Bảng 3.6

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR đề xuất Bảng 3.6 Thành phần hỗn hợp trong phản ứng PCR

Chương trình phản ứng PCR như Bảng 3.7

Bảng 3.7 Chương trình phản ứng PCR đề xuất

Bước Số chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút)

4 1 4 ∞ (giữ lạnh cho tới bước PCR)

STT Húa chất Nồng độ trong 1 phản ứng Thể tớch (àl)

6 GoTaq G2 Hot Start Polymerase 1,25units 0,25

7 cDNA từ phản ứng RT / 5

8 Nuclease-Free Water / Vừa đủ 25àl

Bước Số chu kỳ Nhiệt độ ( o C) Thời gian (giây)

3.3.4/ Phân tích sản phẩm PCR Đặt khuôn gel agarose 2% vào bồn điện di, cho dung dịch TAE 1X vào bồn đến khi ngập gel Dựng pipet vụ trựng trộn đều 10àl sản phẩm PCR và 4àl dung dịch nạp mẫu Loading Dye 6X Nạp hỗn hợp sau khi trộn đều vào giếng trên gel điện di Trong quá trình phân tích, luôn dành cho giếng thang DNA chuẩn, chứng dương và chứng âm Điện di ở 100V trong 40 phút Sản phẩm khuếch đại quan sát bằng thiết bị chụp ảnh điện di

Trên bản gel điện di, nếu có xuất hiện vạch sản phẩm khuếch đại với kích thước

248bp thì kết luận mẫu dương tính với HAV Nếu không có sản phẩm khuếch đại hay kích thước sản phẩm khuếch đại không tương đương 248bp thì kết luận mẫu âm tính

Trong quá trình phân tích mẫu, mẫu đối chứng dương được sử dụng nhằm kiểm soát hiệu quả quá trình tách chiết, tinh sạch RNA virus và phản ứng khuếch đại Mẫu đối chứng âm đƣợc sử dụng nhằm mục đích kiểm soát ngoại nhiễm trong quá trình thao tác Mẫu đối chứng dương và đối chứng âm được chuẩn bị như sau:

+ Mẫu đối chứng dương: chủng HAV + Mẫu đối chứng âm: chủng Mengovirus [30]

Quy trình phân tích nhuyễn thể để phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR đƣợc tóm tắt qua sơ đồ trong Hình 3.7

Hình 3.7 Sơ đồ tóm tắt quy trình phân tích HAV trên nhuyễn thể bằng kỹ thuật RT-

Cân 2g nội tạng nhuyễn thể Đồng nhất mẫu, thêm 2ml Proteinase K

Vortex 5 giây, ủ 70 o C / 15 phút Hút 1ml dịch mẫu cho vào eppendorf Ly tâm 3000xg / 5 phút ở nhiệt độ phòng Vortex 5 giây, ủ 70 o C / 15 phút ở nhiệt độ phòng

Hỳt 200àl dịch nổi vào 400àl Working solution Trộn đều tránh tạo bọt, ủ 20-25 phút ở nhiệt độ phòng

Tinh sạch RNA bằng High Pure RNA Viral kit

Thực hiện phản ứng RT Hỳt 5àl cDNA vào tube phản ứng PCR, thực hiện phản ứng Ủ 5àl RNA sau tinh sạch với mồi ngẫu nhiờn Điện di và diễn giải kết quả

Đánh giá hiệu lực sơ cấp của quy trình phát hiện HAV trên mẫu NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR đã đề xuất

Đánh giá hiệu lực là nhằm xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp đã xây dựng khi đƣa vào áp dụng tại một phòng kiểm nghiệm Thông qua các kết quả nhận đƣợc sau quá trình đánh giá, phòng kiểm nghiệm sẽ xem xét khả năng áp dụng phương pháp đó Phương pháp phát hiện HAV trong NT2MV đã xây dựng trong nghiên cứu này đƣợc đánh giá hiệu lực tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm chất lƣợng Nông lâm thủy sản vùng 4 thuộc Cục Quản lý chất lƣợng Nông lâm sản và Thủy sản Các thông số và quy trình đánh giá tuân thủ theo Thông tƣ 54/2011/TT- BNN&PTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

3.4.1/ Xác định giới hạn phát hiện (LOD 50 )

LOD 50 - giới hạn phát hiện của một phương pháp là nồng độ virus thấp nhất trong mẫu mà phương pháp đã xây dựng có thể phát hiện được với tỉ lệ 50% số mẫu gây nhiễm Quá trình đánh giá đƣợc thực hiện trên 11 mật độ gây nhiễm, tại mỗi mật độ gây nhiễm đƣợc lặp lại 10 lần Mật độ virus HAV và kết quả đánh đƣợc thể hiện ở Bảng 3.8.

Bảng 3.8 Kết quả LOD 50 của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR

Nồng độ HAV gây nhiễm trên 2g

PFU/g nội tạng NT2MV

Số lần cho kết quả dương tính

* Mỗi nồng độ HAV hỳt 10àl gõy nhiễm vào 2g nội tạng NT2MV

Từ kết quả nhận được trên Bảng 3.8, áp dụng phương pháp tính LOD 50 theo công thức của Speaman-Karber tại mục 2.2.3.1, kết quả quá trình xác định LOD 50 của phương pháp phát hiện HAV trong NT2MV như sau:

Log(LOD 50 ) = m = L – d(P i – 0,5) = log17,8 – log2[(1+0,8+0,5) – 0,5] = 0,71 LOD 50 = 10 m = 10 0,71 = 5,12 PFU/g

Um = d 2 [P i (1- P i )/(n-1)] = (log2) 2 [(1(1-1)+0,8(1-0,8)+0,5(1-0,5)]/9 = 0,0041 Với độ tin cậy 95%, LOD 50 nằm trong khoảng :

Kết quả tính toán cho thấy, LOD 50 của phương pháp phát hiện HAV trên NT2MV bằng kỹ thuật RT-PCR đã xây dựng là 5 PFU/g nội tạng NT2MV Với độ tin cậy 95%, phương pháp này cho phép phát hiện từ 3,8 đến 6,8 PFU/g nội tạng NT2MV

3.4.2/ Xác định các thông số kỹ thuật khác của phương pháp RT-PCR đã được thiết lập

Khảo sát này nhằm mục đích đánh giá các thông số kỹ thuật nhƣ: độ chính xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của phương pháp RT-PCR phát hiện HAV trong mẫu NT2MV đã xây dựng khi áp dụng tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lƣợng Nông lâm thủy sản vùng 4

Khảo sát thực hiện trên 4 nhóm mẫu đã chuẩn bị trước, bao gồm : 20 mẫu âm tớnh là mẫu khụng gõy nhiễm virus; 60 mẫu gõy nhiễm HAV với mật độ 100PFU/àl;

20 mẫu gây nhiễm Norovirus GI; 10 mẫu gây nhiễm WSSV; 10 mẫu gây nhiễm E.coli

Tổng số lƣợng mẫu chuẩn bị là 120 mẫu Kết quả thực hiện thí nghiệm trên 120 mẫu đƣợc hiển thị tại Phụ lục 3

Từ kết quả phân tích 120 mẫu, tổng hợp sự tương quan giữa kết quả nhận được so với tình trạng mẫu nhƣ trên Bảng 3.9

Bảng 3.9 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR

Căn cứ kết quả được tồng hợp trên Bảng 3.9, các thông số kỹ thuật của phương pháp đƣợc tính toán nhƣ sau:

3.4.2.4/ Tỷ lệ dương tính giả, âm tính giả

Tỷ lệ dương tính giả - False possitive (FP)

FP = (1 – SP) x 100% = (1 – 0,984) x 100% = 1,6 % Tỷ lệ âm tính giả - False Negative (FN)

Bảng 3.10 So sánh các thông số đánh giá phương pháp với các tiêu chuẩn công bố

Kết quả chuẩn bị mẫu

Phương pháp cần thẩm duyệt

Dương tính Âm tính Kết quả dương tính a = 59 b = 1 a + b = 60

Với các thông số kỹ thuật thu đƣợc từ kết quả khảo sát, đối chiếu với các tiêu chí được đưa ra bởi Ủy ban phương pháp Vi sinh vật của Canada ( Microbiologycal Methods Committee – MMC) và Viện kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia Việt Nam (VKNVSATTPQG) thấy rằng: các thông số của phương pháp PCR đã đáp ứng các yêu cầu của cả Viện kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia và MMC Canada [57].

Đánh giá hiệu lực thứ cấp của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR thông qua tham gia thử nghiệm liên phòng quốc tế

Phương phát phát hiện HAV xây dựng như trên cũng đã được áp dụng phân tích mẫu thử nghiệm liên phòng quốc tế nhằm đánh giá mức độ tương đồng về quả phân tích HAV trong mẫu khi áp dụng phương pháp này tại Phòng kiểm nghiệm Sinh học của Trung tâm Chất lƣợng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 so với kết quả phân tích HAV của các phòng thí nghiệm khác trên thế giới Chương trình thử nghiệm liên phòng đã tham gia có mã số PT61, tên chương trình: Norovirus (genogroup I and II) and hepatitis A virus proficiency testing Do Trung tâm môi trường thủy sản và khoa học thủy sản Anh Quốc ( Center for Environmet Fisheries and Aquaculture Science –

Thông số Phương pháp RT-PCR (%)

VKNVSATTPQG Việt Nam (%) Độ chính xác 99,2 ≥ 94 ≥ 90 Độ nhạy 100 ≥ 98 ≥ 90 Độ đặc hiệu 98,4 ≥ 90,4 ≥ 90

Dương tính giả 1,6 ≤ 9,6 ≤ 10 Âm tính giả 0 < 2 ≤ 10

CEFAS) Mã số tham gia thử nghiệm của Phòng kiểm nghiệm Sinh học - Trung tâm Chất lƣợng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 là 225

Mẫu thử nghiệm đã nhận được trong chương trình thử nghiệm liên phòng quốc tế cho phương pháp này bao gồm 6 mẫu Thông tin kỹ thuật chi tiết từng mẫu nhận đƣợc nhƣ sau:

- Mẫu SF1: 10 con hàu - Mẫu SF2: 10 con hàu - Mẫu SF3: nội tạng hàu đã nghiền nhuyễn chứa trong ống falcon 50ml - Mẫu SF4: nội tạng hàu đã nghiền nhuyễn chứa trong ống falcon 50ml - Mẫu L1: 25àl mẫu trong đĩa Lenticule

- Mẫu L2: 25àl mẫu trong đĩa Lenticule

Tất cả 6 mẫu đều đƣợc xử lý riêng biệt để cho kết quả nền mẫu cuối cùng là RNA đó đƣợc tinh sạch Mỗi mẫu RNA đƣợc chứa trong eppendorf 200àl Lƣợng RNA này sẽ tiếp tục được thực hiện các bước tiếp theo để xác định mẫu có sự hiện diện của HAV Đối với các mẫu SF1, SF2, SF3, SF4: tiến hành quy trình phân tích như phương pháp đã mô tả tại mục 3.3 Đối với các mẫu L1, L2: tiến hành tinh sạch RNA và thực hiện các bước phân tích như trình bày tại các mục 3.3 nhưng chỉ thực hiện từ bước tinh sạch RNA

Kết quả đƣợc hiển thị tại Hình 3.8 và Bảng 3.11, Bảng 3.12, Bảng 3.13

Hình 3.8 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế về phát hiện HAV trong các mẫu thử nghiệm

L: thang 100bp DNA chuẩn; SF1 : mẫu SF1 ; SF2: mẫu SF2 ; SF3: mẫu SF3 ; SF4: mẫu SF4 ; L1: mẫu L1 ; L2: mẫu L2 ; (-): Chứng âm là mẫu không có RNA của HAV; (+): Chứng dương là mẫu chứa RNA của HAV nồng độ 2 -4

Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật RT-PCR giữa phòng kiểm nghiệm Sinh học và CEFAS

Kết quả phòng kiểm nghiệm

Kết quả CEFAS chuẩn bị Kết luận

Chú thích (+): Có phát hiện; (-): Không phát hiện

Kết quả thử nghiệm thành thạo quốc tế đƣợc thể hiện trên Bảng 3.12 và 3.13

Các số liệu trên bảng này đƣợc chiết xuất từ báo cáo thử nghiệm liên phòng thuộc chương trình PT 61 của đơn vị tổ chức CEFAS Mã số (Lab ID No.) của phòng kiểm nghiệm Sinh học – Trung tâm Chất lƣợng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 là 225

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của các phòng thí nghiệm trên thế giới đối với mẫu SF1, SF2, SF3, SF4

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của các phòng thí nghiệm trên thế giới đối với mẫu L1, L2

A : Phù hợp (chính xác 100%) B : Nghi vấn (có 1 mẫu cho kết quả không phù hợp) C : Không phù hợp (có từ 2 kết quả trở lên không phù hợp) NE – non examined : Không làm thí nghiệm

NR – Results not returned : Không phản hồi kết quả

* : Phòng thí nghiệm tham chiếu của Vương quốc Anh

Kết quả phát hiện HAV khi áp dụng phương pháp đã xây dựng ban đầu được đánh giá hạng A, có nghĩa là kết quả phân tích HAV phù hợp với phòng thí nghiệm tham chiếu của CEFAS và phù hợp với các phòng thí nghiệm khác trên thế giới đã tham gia thử nghiệm trong chương trình này

Báo cáo kết quả thử nghiệm liên phòng quốc tế của CEFAS, kết quả đánh giá của đơn vị tổ chức đƣợc trình bày chi tiết tại Phụ lục 5.

Phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR

Khảo sát nhằm mục đích thử nghiệm việc phát hiện gen mục tiêu VP3-VP1 trên HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR Nằm trong hướng phát triển của đề tài, kỹ thuật này giúp hạn chế đƣợc việc thao tác với pipet quá nhiều, giảm khả năng lây nhiễm và giảm thời gian thực hiện để cho ra kết quả phân tích

Khảo sát đƣợc thực hiện trên mẫu là dịch chiết RNA của HAV có nồng độ 2 -4 đã đƣợc tinh sạch Tiến hành phản ứng RT và phản ứng PCR kết hợp, thành phần phản ứng như Bảng 2.11 Chương trình phản ứng như Bảng 2.12 Khảo sát được lặp lại 3 lần Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện ở Hình 3.9 và Bảng 3.14 Thang điểm đánh giá kết quả hình ảnh gel điện di tham chiếu tại Bảng 2.6

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát 2 thành phần buffer trong phản ứng One-step RT-PCR

Khảo sát tối ƣu 2 mục tiêu

Nồng độ GoScript™ 5X Reaction Buffer

Nồng độ 5X Colorless GoTaq Flexi Buffer

Hình 3.9 Kết quả gel điện di khảo sát 2 thành phần buffer trong phương pháp phát hiện HAV bằng kỹ thuật One-step RT-PCR

L: Thang chuẩn 100bp; 1: PCR buffer 0,8X – RT buffer 0,8X; 2: PCR buffer 0,8X – RT buffer 1X; 3:

PCR buffer 0,8X – RT buffer 1,2X; 4: PCR buffer 1X – RT buffer 0,8X; 5: PCR buffer 1X – RT buffer 1X; 6: PCR buffer 1X – RT buffer 1,2X; 7: PCR buffer 1,2X – RT buffer 0,8X; 8: PCR buffer 1,2X – RT buffer 1X; 9: PCR buffer 1,2X – RT buffer 1,2X

Từ kết quả trên gel điện di Hình 3.9 và Bảng 3.14, nhận thấy nồng độ PCR buffer 1X cho kết quả tín hiệu khuếch đại tốt khi kết hợp với các nồng độ RT buffer 0,8X; 1X; 1,2X Trong đó, PCR buffer 1X và RT buffer 1X cho tín hiệu khuếch đại gen muc tiêu tốt nhất Trên cơ sở đó chúng tôi chọn nồng độ phối hợp trong phản ứng One-step RT-PCR nhƣ sau: GoScript™ Reaction Buffer (RT buffer) 1X; Colorless GoTaq Flexi Buffer (PCR buffer) 1X là nồng độ tối ƣu trong thành phần phản ứng One-step RT-PCR

Khảo sát tỷ lệ lưu hành HAV trong mẫu NT2MV tại Cần Giờ và Bến Tre 85 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

Khảo sát nhằm mục đích đánh giá mức độ hiện diện của HAV tại 2 khu vực nuôi nghêu thuộc huyện Cần Giờ - thành phố Hồ Chí Minh và các khu vực Thạnh Phú;

Ba Tri; Bình Đại 1; Bình Đại 2 thuộc tỉnh Bến Tre, đây là các vùng nuôi, vùng thu hoạch NT2MV thuộc chương trình giám sát quốc gia Mẫu khảo sát là loài nghêu trắng (Meretrix lyrata)

Tổng số mẫu vùng nuôi đƣợc thu thập từ tháng 3 đến tháng 12 năm 2016 trong nghiên cứu này là 100 mẫu

Tổng số lƣợng mẫu lô hàng thành phẩm đƣợc thu thập trong nghiên cứu này từ tháng 5 đến tháng 12 năm 2016 là 80 mẫu

Kết quả khảo sát thể hiện ở Bảng 3.15

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát mẫu nghêu thực tế bằng phương pháp phát hiện HAV trên nhuyễn thể áp dụng kỹ thuật RT-PCR đã xây dựng

Thông tin mẫu Số mẫu khảo sát Số mẫu dương tính

Nhuyễn thể thu từ vùng nuôi

Kết quả trên Bảng 3.15 cho thấy, trong số 5 vùng nuôi đƣợc khảo sát thì Cần Giờ có tỉ lệ hiện diện HAV cao nhất 3/20 mẫu dương tính HAV, chiếm tỷ lệ 15%, Thạnh Phú có tỉ lệ hiện diện HAV thấp nhất 1/20 mẫu dương tính HAV, chiếm tỷ lệ 5% Mức độ hiện diện HAV trung bình trong cả 5 vùng nuôi là 10% Thông tin chi tiết kết quả khảo sát mẫu vùng nuôi và lô hàng xem tại Phụ lục 4 Đối với lô hàng thành phẩm, có 10/80 mẫu cho kết quả dương tính với HAV, chiếm tỷ lệ 12,5% Tỷ lệ này cao hơn tỷ lệ phát hiện HAV ở các vùng nuôi (10%) Sau quá trình tiếp nhận, xử lý, chế biến nghêu thì mức độ hiện diện HAV trong các mẫu lô hàng thành phẩm sẽ ít hơn các mẫu nghêu còn tươi sống Nguyên nhân của việc chênh lệch tỷ lệ này có thể do trong quá trình tiếp nhận nghêu nguyên liệu của công ty đƣợc lấy từ nhiều nguồn, bao gồm các khu vực nuôi trồng và khai thác NT2MV do Trung tâm Chất Lƣợng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 quản lý (Thạnh Phú, Ba Tri, Bình Đại 1, Bình Đại 2) và các khu vực lấy nghêu khác không có sự quản lý, kiểm soát của cơ quan Do đó làm tỷ lệ phát hiện HAV trong lô hàng lại cao hơn ngoài vùng nuôi

Kết luận

Trong khuôn khổ đề tài thực hiện, chúng tôi đã thu đƣợc các kết quả nhƣ sau:

- Khẳng định đƣợc cặp mồi chuyên biệt dùng để khuếch đại gen VP3-VP1, là vùng trình tự bảo tồn của HAV, vùng gen này mã hóa tạo ra vỏ capsid của HAV Tính chuyên biệt và độ đặc hiệu của cặp mồi đƣợc chứng minh trên máy tính và trên cả mẫu thực tế, qua nhiều lần lặp lại cho thấy cặp mồi đã chọn là chuyên biệt cho việc phát hiện HAV

- Xây dựng và hoàn thiện thành công quy trình RT-PCR phát hiện HAV trong NT2MV với các bước chính như sau:

+ Thời gian ủ dịch chiết mẫu với dung dịch làm việc, bảo vệ RNA mẫu là 20-25 phút

+ Thực hiện kỹ thuật RT với nồng độ MgCl 2 tối ƣu là 2mM

+ Thực hiện kỹ thuật PCR với nồng độ MgCl 2 là 2,5mM; nồng độ mồi là 0,4àM;

+ Nhiệt độ bắt cặp mồi và khuôn cDNA trong chương trình khuếch đại là 50 o C

- Kết quả đánh giá hiệu lực sơ cấp của quy trình đề xuất theo tiêu chuẩn ISO 16140-2003 đã xác định được các thông số kỹ thuật của phương pháp như sau: giới hạn phát hiện (LOD 50 ) là 5 PFU/g nội tạng nhuyễn thể; độ chính xác là 99,2%; độ nhạy là 100%; độ đặc hiệu là 98,4%; tỷ lệ dương tính giả là 1,6%; tỷ lệ âm tính giả là 0% Các thông số nhận được cho thấy phương pháp phù hợp để áp dụng tại phòng kiểm nghiệm

- Đã thực hiện đánh giá hiệu lực thứ cấp của phương pháp đề xuất thông qua thử nghiệm liên phòng quốc tế (PT- Proficiency test): Kết quả đánh giá đƣợc xếp loại A, 100% kết quả phân tích HAV từ các mẫu nhận đƣợc hoàn toàn trùng khớp kết quả tham chiếu của đơn vị tổ chức và các phòng thí nghiệm khác

- Bước đầu khảo sát được kỹ thuật RT-PCR một bước (One-step RT-PCR) với 2 đệm thành phần là GoScript™ Reaction Buffer và Colorless GoTaq Flexi Buffer Kết quả khảo sát cho thấy khi phối hợp giữa 2 đệm này theo tỉ lệ 1X : 1X cho tín hiệu khuếch đại rõ và tốt nhất

- Đánh giá mức độ hiện diện HAV trên các mẫu vùng nuôi, vùng thu hoạch và mẫu lô hàng xuất khẩu tại 2 khu vực Cần Giờ và Bến Tre với đối tƣợng khảo sát là nghêu Kết quả mức độ phát hiện HAV là:

+ Vùng nuôi: Thạnh Phú (5%); Ba Tri (10%); Bình Đại 1 (10%); Bình Đại 2 (10%); Cần Giờ (15%)

+ Mẫu lô hàng: 10/80 mẫu cho kết quả dương tính HAV Chiếm tỷ lệ 12,5%.

Kiến nghị

Do giới hạn của đề tài nên còn một số điểm chƣa đƣợc nghiên cứu Mặt khác, để kết quả nghiên cứu đƣợc áp dụng nhiều hơn vào thực tế, chúng tôi xin có một số ý kiến nhƣ sau:

- Thay đổi cụm từ “QUY TRÌNH” trong tên đề tài thành cụm từ “PHƯƠNG PHÁP” để phù hợp hơn với nội dung của đề tài đã xây dựng

- Khảo sát sự ổn định của phương pháp trên một số nền mẫu chưa được khảo sát trong đề tài

- Phát triển kỹ thuật One-step RT-PCR, Realtime RT-PCR dùng cho phát hiện nhanh và định lƣợng HAV

- Thiết kế chứng nội tại để kiểm soát việc âm tính giả do không xảy ra phản ứng khuếch đại trong ống mẫu thử nghiệm.