3.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu
3.1.1. Nguyên liệu trà xén cành
Giống trà Kim Tuyên 27 được sử dụng trong nghiên cứu này. Sau khi thu hoạch dot trà (nguyên liệu chính sản xuất trà Oolong), những bộ phan còn lại của cây trà (lá thứ 3, thứ 4, lá già...) sẽ được cắt tỉa và được gọi là trà xén cành.
"Trước xén cành
Hình 3.1: Cánh đồng trà trước và sau khi thu hoạch
Quy trình sản xuất trà Oolong tại nhà máy trải qua 4 công đoạn chính: làm
héo và lên men; xào diệt men; định hình; đóng gói.
C Trà xén cành/đọt Phơi dưới nắng (có lưới che) / thôi ham Ap
Tra đã được làm héo Đưa vào phòng mát } Đảo 2-3 lần, 2-3 giờ/lần
Trà lên men
V Quay thơm 2 lần, mỗi lần cách nhau 3 giờ
Trà sau lên men
Xào diệt men }
Trà Oolong bán thành phẩm PP Nguyên liệu cho nghiên cứu
v Ep dinh hinh va say
Vién tra Oolong
Say khô b
Viên tra Oolong dat độ am <5%
Ỷ Sàng phân loại
Viên trà Oolong đạt độ âm <5% đông nhất
Đóng gói |
Thành phẩm tra Oolong
Hình 3.2: Quy trình thu nhận nguyên liệu tra Oolong xén cành
(theo quy trình sản xuất trà Oolong chính phẩm tại nhà máy công ty Câu Tre) Trà xén cành Kim Tuyên 27 sau khi thu hoạch sẽ tiến hành chế biến theo đúng như quy trình sản xuất trà Oolong chính phẩm hình 3.2 và kết thúc sau giai
đoạn xào diệt men. Bán thành phẩm trà Oolong này là nguyên liệu sử dụng trong
nghiên cứu.
Trà xén cành tuoi
Hình 3.3: Trà xén cành Kim Tuyên
3.1.2. Enzyme thương mại
Enzyme Viscozyme L của hãng Novozyme do công ty Nam Giang cung
cấp dạng lỏng, màu nâu đậm. Hoạt tính của enzyme này vào khoảng 100 đơn vị Fungal Beta-Glucanase (FBG/ml). Theo thông tin từ nhà sản xuất, Viscozyme L được sản xuất từ chủng Aspergillus aculeatus chứa một loạt các carbohydrase
như cellulase, hemicellulase, xylanase; hoạt động ở pH 3.5-5.5 và nhiệt độ 25-
55°C.
3.1.3. Giống vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật từ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học —
Khoa Công nghệ sinh học - Trường DH Quốc Tế - DH Quốc Gia TP.HCM:
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Candida albicans ATCC 1413.
3.1.4. Hóa chat
Na;HPO,, KH;PO¿, FeSO4, KNaC„HaOs, ethyl acetate, ethylic, natri
hydrocarbonat (NaHCO2), acid oxalic, NaCl, cén, indigocacmin, H,SO, dam đặc,
EGCG, DPPH, methanol, vitamain C.
3.1.5. Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng thiết bị và dụng cụ được trang bị trong hệ thống phòng thí nghiệm công nghệ sinh học Trường ĐH Bách Khoa TP.HCM bao gồm:
Máy cô quay chân không (RE300 Anh) Cân kỹ thuật (CP 22025-Satorius, Đức)
Cân phân tích (CP 2245-Satorius, Đức)
Máy nước cất (Anh) Máy đo độ âm 119DAVS MX-50
Máy vortex (USA) Nồi hap tiệt trùng (HIRAYAMA, HV 110) Tu cay vi sinh
Tủ lạnh SANYO
Tú say (MOV-212F SANYO, Nhật)
Tủ U Shella (Hàn)
May quang pho ké (USA)
Lo vi sóng
Bê điều nhiệt Thiết bị khuấy từ.
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Bang 3.1: Các bước tiễn hành thí nghiệm Thứ tự Bước thí nghiệm Nội dung tiên hành
Kiểm tra một sô chỉ tiêu của nguyên liệu
trà tươi Kim Tuyên 27 (đọt trà và trà xén
l Khảo sát nguyên liệu cành) và trà Oolong bán thành phẩm được
sản xuât từ hai nguồn nguyên liệu (hình 3.2).
Khảo sát điều kiện trích ly
2 polyphenol từ trà Oolong có bô sung Viscozyme L
Lan lượt khảo sát ảnh hưởng của các đơn yếu tố: ty lệ nước(rà/ nông độ Viscozyme, nhiệt độ, thời gian, tốc độ lắc đến quá trình trích ly
3 Tôi ưu hóa
Những yếu tô ảnh hưởng chính đến quá trình trích ly sẽ được tối ưu hóa với ma tran CCD trong Minitab dé xác định được điều kiện trích ly tối ưu nhất — Kiểm tra băng thực nghiệm tại điều kiện trích ly tối
ưu.
Thu nhận cao trà dạng paste và dạng bột
Đánh giá một số chỉ tiêu đặc trưng
Độ âm, tro
Khao sát nguyên liệu aan PPT. chat tan
CN... TFTR.tamninđườngkhở...
Ỷ Tỷ lệ chiết
Khao sát các yêu tô anh hưởng
Nội dung nghiên cứu } J
Thí nghiệm sang lọc
Tụi ưu húa ơ xố. Thớ nghiệm trung tõm
Thí nghiệm tôi ưu hóa Hàm lượng Viscozyme L Nhiệt độ
Chế độ lắc
Khả năng kháng khuân Khả năng chống oxy hóa
Hình 3.4: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm
3.2.1. Khảo sát thành phần nguyên liệu Tra tươi (dot trà va trà xén cành đã bất hoạt enzyme) và tra Oolong bán thành phẩm (được sản xuất từ dot và tra xén) được xay nhỏ, bố sung tỷ lệ nước 1/20 (w/v), đun sôi 10 phút, lọc thu dịch. Quá trình chiết được tiếp tục như vậy
cho tới khi nào dịch trà không còn phản ứng màu xanh với FeCl, 5%. Hoa chung
các dịch chiết thu được và định mức lên cùng một thể tích dùng dé kiểm tra một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu như: hàm lượng chất tan, TF, TR, polyphenol tong, đường khử...
3.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hoạt động của enzyme
Viscozyme trong quá trình trích ly polyphenol từ tra Oolong
Trà Oolong sản xuất từ trà xén cành được xay nhỏ dùng làm nguyên liệu cho thí nghiệm. Sự phụ thuộc của quá trình trích ly vào điều kiện trích ly được đánh giá dựa vào hàm lượng polyphenol tổng thu nhận được trong dịch chiết.
Cân chính xác một lượng trà Oolong, bô sung nước và enzyme Viscozyme phù
hợp với mỗi nghiệm thức, ủ trong bề 6n nhiệt. Sau thời gian ủ với enzyme, dun
sôi đúng 3 phút và lọc thu dịch. Hiệu quả quá trình trích ly được ghi nhận thông
qua hàm lượng polyphenol tông thu được trong mỗi dịch lọc (theo 3.3.2).
3.2.2.1. Tỷ lệ nguyên hiệu và nước
Thí nghiệm được bồ trí ngẫu nhiên và 3 lần lặp lại với các thành phan nhu sau:
- Yếu tố có định: ham lượng Viscozyme L 0.04ml/g, nhiệt độ ủ 40°C, thời
gian 90 phút.
- Yếu tố khảo sát: tỷ lệ nguyên liệu trả/nước được khảo sát lần lượt 1/5,
1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30 (w/v).
- Yếu tố kiểm tra: ham lượng polyphenol tổng Kết thúc thời gian ủ với enzyme, mẫu trà được đun sôi (khoảng hơn 90°C) 3phút, lọc, làm nguội và tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng thu được trong dịch chiết ở từng nghiệm thức.
3.2.2.2. Ảnh hướng của hàm lượng enzyme Viscozyme L Thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên với các thành phan cô định và khảo
sát như sau:
- Yếu tố cố định: ty lệ nguyên liệu/nước tối ưu (theo 3.2.2.1), nhiệt độ 40°C,
thời gian 90 phút.
- Yếu tố khảo sát: hàm lượng Viscozyme 0.02; 0.04; 0.06; 0.08 và 0.1ml/g.
- Yếu tố kiểm tra: hàm lượng polyphenol tổng.
3.2.2.3. Anh hưởng nhiệt độ đến hoạt động của enzyme Viscozyme trong quá
trình trích ly
Thí nghiệm được tiễn hành tương tự như trên với các thành phân cô định và khảo
sát như sau:
- Yếu tô cô định: ty lệ nguyên liệu/nước tối ưu (theo 3.2.2.1), hàm lượng Viscozyme tối ưu (theo 3.2.2.2), thời gian 90 phút.
- Yếu tố khảo sát: nhiệt độ tăng dần từ 30, 40, 50, 60, 70 đến 80°C - Yếu tố kiểm tra: hàm lượng polyphenol tổng.
3.2.2.4. Anh hưởng thời gian đến hoạt động của enzyme Viscozyme trong quá
trình trích ly
Thí nghiệm được tiễn hành tương tự như trên với các thành phân cô định và khảo
sát như sau:
- Yếu tổ cỗ định: tý lệ nguyên liệu/nước tối ưu (theo 3.2.2.1), hàm lượng Viscozyme tối ưu (theo 3.2.2.2), nhiệt độ tối ưu (theo 3.2.2.3).
- Yếu tố khảo sát: thời gian từ 30, 60, 90. 120, 150 và 180 phút.
- Yếu tố kiểm tra: hàm lượng polyphenol tổng.
3.2.2.5. Ảnh hướng chế độ lắc đến hoạt động của enzyme Viscozyme trong quá
trình trích ly
Thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên với các thành phan cô định và khảo
sát như sau:
- Yếu tô cô định: ty lệ nguyên liệu/nước tối ưu (theo 3.2.2.1), hàm lượng Viscozyme tối ưu (theo 3.2.2.2), nhiệt độ tối ưu (theo 3.2.2.3), thời gian tối ưu
(theo 3.2.2.4).
- Yếu tố khảo sát: ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo được thé hiện khi tăng dan tốc độ lắc trong quá trình chiết từ tĩnh, 40, 60, 80, 100 đến 120rpm.
- Yếu tố kiểm tra: hàm lượng polyphenol tổng.
Tat cả các thí nghiệm được bô trí ngau nhiên với 3 lần lặp lại.
3.2.3. Quy hoạch thực nghiệm quá trình trích ly polyphenol trà Oolong có
bo sung enzyme Viscozyme L Phuong pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dung là thực nghiệm yếu tô toàn phân. Trong đó, mọi tổ hợp các mức của các yếu tố đều được thực hiện để nghiên cứu nhằm mục dich tìm ra sự tương tác ngẫu nhiên giữa các yếu tô theo
hàm mục tiêu khảo sát. Các bước tiên hành như sau:
Bước 1: Chọn các yêu tô dé tôi ưu hóa
Các yêu tô được lựa chọn dé tôi ưu hóa bao gỗôm: tỷ lệ nguyên liệu/nước,
hàm lượng Viscozyme, nhiệt độ, thời gian và chế độ lắc.
Bước 2: Xác định khoảng biến thiên của các yếu tô
Phương pháp cô điển được sử dụng khảo sát khả năng trích ly polyphenol
với các yêu tô như trên đê chọn mức biên thiên của từng yêu tô.
Bang 3.2: Mức khảo sát các yếu tô ty lệ nguyên liệu/nước, ham lượng
Viscozyme, nhiệt độ, thời gian và chê độ lac
Mức khảo sát Trà/nước | Viscozyme Nhiệt độ | Thời gian Lắc
(g/ml) (ml/g) CC) (phut) (rpm)
Mức ] 1/5 0.02 30 30 40 Mức 2 1/10 0.04 40 60 60 Mức 3 1/15 0.06 45 90 30 Mức 4 1/20 0.08 50 120 100 Mức 5 1/25 0.1 55 150 120 Muc 6 1/30 60 180
65 70
Bước 3: Sang loc yếu tô ảnh hưởng chính quá trình trích ly thu nhận polyphenol.
Đề thuận lợi cho quá trình tối hóa, bước sàng lọc mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly được thực hiện. Ma trận Plackett — Burman trong phần mềm Minitab 16 được sử dụng dé chọn lọc những yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình trích ly polyphenol từ trà Oolong bố sung Viscozyme L với hàm mục tiêu là hàm lượng polyphenol tổng. Thí nghiệm được thiết kế với mức thấp (-1) và mức cao (+1) của từng yếu tố
được liệt kê trong bảng 3.2.
Bước 4: Thí nghiệm tại tâm (tai giá tri trung tâm cua mỗi yếu tố khảo sát).
Thực hiện thí nghiệm tai tâm của các yếu tố ảnh hưởng chính nhằm đánh giá mức độ phù hợp của thực nghiệm với mô hình hồi quy. Sau khi thực hiện các nghiệm thức trong bước sàng lọc kết quả sẽ cho thấy những yếu tố ảnh hưởng chính đến quá trình trích ly.
Bước 5: Xây dựng phương trình quy hoạch thực nghiệm.
Bước tối ưu hóa với thiết kế hỗn hợp tâm xoay mặt (biến thé của hỗn hợp
tâm xoay CCD — Central Composite Design) sẽ đơn giản hơn khi loại bỏ
những yếu tô ảnh hưởng không đáng kế đến hàm đáp ứng. Hàm đáp ứng
được lựa chọn là hàm lượng polyphenol (Y, %) được biểu diễn dưới dạng phương trình bậc 2 tổng quát như sau:
Y= bọ + bịXi + bạXa + b3X3 + baXa + Ds5X5 + bịaXIXa + ĐịaXIXa + ÐịaXIXa +
b¡sXIXs + bo3X5X3 + DoaXoX4 + Do5XoX5 + D34X3X44 b35X3X5 + basXaXs +
bXIỈ + box" + 33X37 + baaXa- + bssX5°.
Trong đó bị, bạ, b3, bạ, bs là các hệ số bậc 1
bị, bos, b33, bay, bs5 là các hệ số bậc 2 bịa, Địa, Địa, bị, bạa, boa, bos, b34, „ b3s, bys là các hệ số tương tác của từng cặp yếu tố.
X1, Xa, X3, Xa, X5 là các biến độc lập tương ứng: nguyên liệu/nước, hàm lượng Viscozyme, nhiệt độ, thời gian và chế độ lắc.
Bước 6: Xác định điểm tối ưu Từ kết quả phân tích số liệu bang phan mềm Minitab 16, xác định mức tối ưu của các yếu tô cho hàm lượng polyphenol thu được cực đại.
Bước 7: Lập lại thí nghiệm tại các mức tôi ưu vừa tìm được và so sánh độ tương
đồng với hàm lượng polyphenol cực đại theo lý thuyết.
3.2.4. Trích ly thu nhận cao tra Oolong
Quá trình trích ly được tiễn hành trên khối lượng lớn trà Oolong tại điều kiện đã tối ưu hóa. Dịch chiết thu được phối trộn với chất độn đem say phun thu được dạng bột hòa tan hoặc tiếp tục cô quay đến khối lượng gần như không đổi được dạng paste. Sau đó kiểm tra đánh giá chất lượng sơ bộ cao trà Oolong về khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn.
3.3. Phương pháp phân tích
3.3.1. Các chỉ tiêu cơ bản
Xác định hàm âm theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi bằng máy đo độ âm 119DAVS MX-50.
Xác định độ tro tổng bang phương pháp nung ở nhiệt độ cao tới khối lượng không đổi TCVN 7038: 2002 (Phu lục 1).
Xác định hàm lượng chất tan bằng phương pháp Voronxop [9,55] (Phụ lục).
Định lượng đường khử với thuốc thử DNS theo phương pháp Miller [61]
(Phụ lục 1).
3.3.2. Định lượng polyphenol tổng dựa vào phan ứng màu với muối tartrate Dựa vào phản ứng tạo màu giữa hợp chat polyphenol với dung dịch mudi tartrate, ham lượng polyphenol tổng trong mau trà được xác định [41,54].
Chuẩn bị hóa chat:
Dung dịch muối tartrate: lg FeSO, va 5g KNaC4H,O, dùng nước cất hòa
tan và định mức lên 1000ml.
Dung dịch đệm phosphate: dung dịch đệm phosphate bao gồm 85% (v/v) dung dịch Na;HPO„ và 15% (v/v) dung dịch KH,PO, đã chuẩn bị.
Thực hiện:
Iml dịch chiết trà, 4ml nước cất, 5ml dung dịch muỗi tartrate cho vào bình
định mức 25ml. Dùng đệm phosphate định mức lên đủ 25ml. Đo OD tại bước
sóng 540nm với mau trang thay dich trà băng nước cat.
Kết quả hàm lượng polyphenol tổng có trong mẫu được tính toán như sau:
PPT (%w/w) = (3.914 . E .V.100) / (1000 ..V¡.w)
Trong đó:
E kết quả đo ODs4onm Vị thể tích dịch chiết sử dụng w khối lượng khô của mẫu trà V tổng thể tích dịch chiết
3.3.3. Xác định hàm lượng TF và TR
TE và TR là sản phẩm oxy hóa của các chất catechin. Dựa vào khả năng hòa tan của các chất trong các dung môi khác nhau để tách riêng từng phân và
xác định hàm lượng [19,6141].
Phương pháp thực hiện được tiễn hành theo quy trình hình 3.5
30ml dịch trà + 30ml ethyl acetate
Lac 5 phút Đề yên phân lớp
Lớp trên (ethyl acetate) Lớp đun (nước)
2ml pha loãng với 15ml + 15ml NaHCO; 2ml + 6ml nước 15ml + 15ml n-butanol ethanol 95% đủ 25ml 2.5% (w/v) + 2ml acid oxalic bão hoa Lắc 3 phút
V Lac 30s + ethanol 95% du 25ml Đề yên
|, Để yên phân lớp Ý Ỳ
OD380nm(Fa) ( V OD 380nm (Ed) 2ml lớp nước
Lớp trên: Bỏ lớp dưới 2ml acid oxalic bão hòa 4ml pha loãng với 6ml nước ethanol 95% đủ 25ml ethanol 95% đủ 25ml
OD 380nm (Ec) OD 380nm (Eb)
Hinh 3.5: Quy trinh xac dinh ham luong TF va TR
Hàm lượng TF va TR được tính toán như sau:
TF % = (2.25 . Ec)/(1-M).100 TR% = 7.06 . (2Ea + 2Ed — 2Eb — Ec)/(1-M).100
Trong đó:
Ea, Eb, Ec, Ed là giá trị đo OD 380nm (với mẫu trắng là ethanol 95%)
M là độ âm của nguyên liệu.
3.3.4. Xác định kha năng chống oxy hóa Khả năng chống oxy hóa của mẫu cao trà Oolong được xác định dựa vào khả năng quét gốc tự do DPPH theo phương pháp của Blois và cộng sự [16,57].
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là chất có màu tím có gốc tự do nhờ vào
điện tử chưa ghép đôi.
Chất nghiên cứu (dịch trà) có khả năng bắt gốc tự do của DPPH làm giảm cường độ màu. Vì thế, nồng độ mẫu trà cảng cao thì cường độ màu của DPPH càng giảm, được xác định băng cách đo quang phố ở bước sóng 517nm. Dựa vào đường chuẩn suy ra giá trị ICso.
Chuẩn bị:
Pha dung dịch DPPH 1mM (dùng trong ngày, chứa trong chai thủy tinh tối
mau): DPPH pha trong methanol 80% (hòa tan DPPH trong methanol 100%
trước, sau đó thêm nước định mức du 100ml).
Pha các dung dịch cao trà có nồng độ lần lượt là: 50-500wug/ml trong methanol 80% (hòa mẫu với nước cất đủ 20ml trước và định mức bang methanol
100% dén 100ml).
Chất chuẩn vitamin C duoc pha thành các néng độ từ 10-25 pg/ml trong methanol 80% (cách pha tương tự mẫu trà).
Thực hiện:
Iml dung dịch DPPH ImM, 3ml dung dịch mẫu trà tại mỗi nồng độ khác nhau, lắc đều và để trong tối tại nhiệt độ phòng 30 phút. Do OD tại bước sóng
517nm.
Thực hiện tương tự với các nồng độ vitamin C.
Tính tỷ lệ phần trăm ức chế DPPH:
Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) = (A đói chứng — (Amau ~ Atiant)) * 100/A đối chứng
Trong đó:
A đái chứng: là độ hấp thụ của dung dịch methanol và DPPH Amăau: là độ hấp thụ của dung dịch mẫu và DPPH
Aulan.: là độ hấp thụ của dung dịch không có DPPH (chỉ có methanol và mẫu)
Từ đồ thị biểu thị tương quan giữa tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH và nông độ của chất đang khảo sát ta suy ra được nồng độ của mẫu tương ứng với tỷ lệ bắt gốc
DPPH là 50%.
3.3.5. Xác định khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của mẫu cao trà được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch [2,55,12]. Dịch cao trà trong đĩa giẫy sẽ khuếch tán vào môi trường thạch chứa vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với cao chiết sẽ được thé hiện băng đường kính vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy (mm).
Tién hành:
- Cao tra được pha loãng trong nước cất ở nồng độ 50 mg/ml.
- Vi khuẩn thử nghiệm (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, MRSA, Candida albicans) từ ống sốc trên môi trường LB được tăng sinh trong môi trường LB lỏng đạt mật độ 10-10? CFU/ml (đo độ dục
ở bước sóng 600nm có giá tri trong khoảng 0,8-1).
- Pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần bằng NaCl 0,9%, hút 10041 dich trải đều trên môi trường thạch MH, để yên 15 phút.
- Hút 10ul dich cao chiết thắm vào đĩa giấy đường kính 6 mm đã hap khử trùng đặt vào môi trường thạch MH chứa vi khuẩn.
- Đem ủ ở 37C trong 24 giờ.
- Hoạt tính kháng khuẩn được ghi nhận bằng đường kính vòng vô khuẩn xung quanh đĩa giẫy (mm) trên môi trường MH.
3.3.6. Xác định hàm lượng EGCG
Phân tích hàm lượng EGCG được thực hiện bang phương pháp HPLC [33.47] với pha động methanol:nước, sử dụng cột đảo pha C18, đầu dò DAD (Detector Diod Array), bước sóng 280nm, nhiệt độ 32°C.
Xây dựng đường chuẩn EGCG:
Pha dung dich chat chuan EGCG có nông độ từ 40-320ppm. Sau đó lọc qua màng 0.45um rồi di phân tích HPLC xác định diện tích các peak tương ứng với từng nông độ.
Chuẩn bị mẫu:
Mỗi mẫu cao trà (chiết có bỗ sung Viscozyme L, không có Viscozyme L và chiết bang đun sôi) hòa tan trong methanol, sau đó lọc qua màng rồi đi phân tích
HPLC.
Hàm lượng EGCG trong các mẫu cao tra được tinh như sau:
X%=a*V¿/Vị * V/w * 100 Trong đó:
X: % EGCG có trong mẫu