Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học cao Ethyl Acetate từ lá cây chân chim không cuống quả (Schefflera Sessiliflora DE P.V)

Trang ii TÓM TẮT Từ lá của Schefflera sessiliflora De P.V, chúng tôi đã thu được một mới chất là C20-gibberellin diterpene 2β, 12β-dihydroxygibberellin 12β-hydroxy-GA110 hoặc kaempfer

TỔNG QUAN

Đặc điểm họ nhân sâm Araliaceae

Thường là cây thân gỗ, đôi khi là cây bụi hoặc bụi nhỏ Thân cành thường có gai ít ra ở gốc, vỏ và lá thường có mùi thơm Đặc trưng bởi có lá kèm và khi lá rụng để lại vết sẹo rõ trên cành bởi có rãnh tiết trong các cơ quan dinh dưỡng Lá kép chân vịt hay lông chim nhiều lần, mọc cách gốc cuống lá phình thành bẹ ôm lấy thân.

Cụm hoa gồm những tán đơn vị tạo thành chuỳ hay chùm Hoa đều, lưỡng tính, mẫu

5 Nhị đẳng số (5-10) và xen kẽ với cánh hoa, ít khi số nhị gấp đôi hoặc nhiều bất định Bầu dưới các cánh hoa rụng sớm nên ít nhìn thấy.Quả nang hay quả hạch 1 hạt trong mỗi ô.Thế giới có 70 chi và 900 loài, phân bố ở vùng Nhiệt đới và Cận nhiệt đới, ít khi có ở vùng Ôn đới.

Phân loại: Căn cứ vào đặcđiểmcơ quan dinh dưỡng và sinh sản, người ta đã tách ra các chi quan trọng, ví dụ như: Hedera, Tetrapanax, Brassaiopsis, Trevesia có lá đơn thường chia thuỳ; trong khi đó Aralia, Polyscias, Acanthopanax, Panax,

Schefflera lá kép Họ này có quan hệ với Apiaceae và Cornaceae Điều đó được thể hiện qua cụm hoa hình tán, hoa nhỏ, có một noãn trong mỗi ô, bầu dưới.

Giá trị kinh tế: Dùng làm thuốc, nổi tiếng là Nhân sâm (Panax pseudogíneng), nhiều cây để làm cảnh Polycias fruticosa.Theo thống kê 1985 (Grushvitsky, Hà Thị Dụng) họ Nhân Sâm ( Araliaceae) ở Việt Nam có 110 loài, thuộc 18 chi (không kể chi Polyscias và các loài được trồng) trong đó có 46 loài và 11 thứ là đặc hữu trong hệ thực vật Việt Nam, đã có 40 loài được sử dụng làm thuốc Đến nay sồ loài chưa thống kê và cập nhật đầy đủ nhưng trên thực tế số loài trong họ đã tăng lên trên 130 loài với trên 60 loài đặc hữu.

Chi Schecfflera

Chi Schefflera là chi lớn nhất trong họ sâm, phong phú về loài và phân bố rộng Chi Chân chim Schefflera có trên 400 loài phân bố chủ yếu ở: Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan và một số đảo ở Thái Bình Dương…Ở Việt Nam, chi này có 45 loài, cây phân bố rải rác ở hầu hết các tỉnh miền núi phía bắc (từ Hà Tĩnh trở ra) Ở phía Nam mới gặp ở các tỉnh Gia lai, Kon Tum, Đắc Lắc và Côn

2 Đảo Hiện nay số loài Schefflera được sử dụng chưa nhiều, đặc biệt số loài làm thuốc còn khá ít so với tổng số loài đã định danh và khảo sát về mặt phân bố [2]

Những nghiên cứu về tác dụng sinh học và hóa học trên đối tương Schefflera còn rất hạn chế Chỉ có vài loài được khảo sát tác dụng sinh học và một số cấu trúc hóa học đã được xác định trên những bộ phận d ung được cho là có tác dụng theo kinh nghiệm dân gian Dưới đây là hình ảnh một số loài chân chim thuộc chi Schefflera thường gặp.

Hình 1.1 Schefflera octophylla (Lour.) Harms: Chân chim 8 lá

Hình 1.2 Schefflera glomerulata H.L Li: Chân chim hoa chụm

Hình 1.3 Schefflera elliptica (Blume) Harms: Chân chim bầu dục

Hình 1.4 Schefflera venulosa (Wight & Arn.) Harms: Chân chim mây

Hình 1.5 Schefflera myriocarpa Harms: Chân chim ngàn quả

Bảng 1.1: Triterpen và saponin triterpen nhóm olean và ursan trong một số loài thuộc chi Schefflera [4]

OH OH OH H H H H OH β-OH β-OH β-OH β-O-Ara α-OH α-OH β-O-GlcA 2 -Gal 2 -Glc β-OH

CH 2 OH CH 2 OH CHO CH 2 OH COOH COOH CH 3 CH 3

CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 2 OH

Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha H

Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha

CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3

H H OH OH H H H OH β-O-GlcA 2 -Glc 2 -Rha β-OH β-OH β-OH β-O-Ara α-OH β-O-GlcA 2 -Gal 2 -Glc β-OH

CH 3 CH 3 CH 2 OH CHO CH 2 OH COOH CH 3 CH 3

CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 2 OH

H H Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha Glc 6 -Glc 4 -Rha

CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3

Bảng 1.2: Triterpen và saponin triterpen nhóm olean và lupan trong một số loài thuộc chi Schefflera [4]

Vài nét sơ lược về Schefflera sessiliflora

Năm 2004, Trần Công Luận và cộng sự đã phát hiện Schefflera sp3 là một loài mới và được đặt tên là -chân chim không cuống quả có tên khoa học là Schefflera sessiliflora, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) [1] Đặc điểm của cây là không cuống, thường mọc chùm 3-7 quả hay riêng lẻ, hình cầu (5 x 4 mm), khi chín màu cam có 5 cạnh [3]

Giới : Plantea Bộ : Apiales Họ:Araliaceae Chi : Schefflera Loài: Sessiliflora

6 Theo số liệu thống kê thì hiện nay trên thế giới hầu như chưa có một nghiên cứu đầy đủ về loài Schefflera sessiliflora Ở Việt Nam, loài Schefflera sessiliflora cũng có vài công trình nghiên cứu, tuy nhiên cũng chỉ dừng lại là khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học, Khảo sát hoạt tính androgen, định lượng saponin tổng và cô lập 2 sapogenin là acid oleanolic và hederagenin từ saponin tổng [3]

Tác d ụng chữa bệnh cây chân chim trong dân gian

Trong dân gian cây chân chim còn được gọi là ngũ gia bì Đây là một trong những loại cây kiểng thông dụng, đắt tiền Ở những vùng ẩm thấp, người ta trồng cây chân chim trong vườn nhà, quanh nhà để vừa làm cây cảnh vừa có tác dụng trừ muỗi.

Theo y học hiện đại, thành phần hóa học chính là saponin, tanin, tinh dầu, vỏ thân chứa 0,9-1% tinh dầu; vỏ cành và vỏ rễ chứa saponin triterpen khi thuỷ phân ch o acid oleanic Bộ phận dùng: vỏ thân, vỏ rễ, rễ và lá Theo y học cổ truyền, Ngũ gia bì chân chim có vị đắng, chát, hơi thơm, tính mát, có tác dụng giải nhiệt, làm ra mồ hôi, kháng viêm, tiêu sưng và làm tan máu ứ Dịch chiết vỏ cây có tác dụng tăng lực, kích thích thần kinh rõ rệt, chống lạnh, hạ đường huyết Ngũ gia bì chân chim được dùng chữa đau nhức xương khớp, đau bụng, suy nhược.Trong Đông y, nó là một vị thuốc quý có tác dụng làm mạnh gân cốt, trừ phong, đau nhức xương khớp, đau bụng, trẻ em vận động cơ bắp yếu, hạn chế đi lại, chống suy nhược thần kinh, tăng trí nhớ, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt Ngũ gia bì có tác dụng tốt trong điều trị các bệnh mạn tính ở người cao tuổi, tăng sức đề kháng, bồi dưỡng sức khỏe, trị đau nhức khớp ở phụ nữ tuổi tiền mãn kinh Nó có tác dụng tốt với bệnh nhân suy giảm chức năng gan, rối loạn nhẹ bilirubin máu toàn phần Ngũ gia bì còn có tác dụng hạ đường máu ở những bệnh nhân đái tháo đường tụy, điều trị sau phẫu thuật [4]

Bảng 1.3 : Tác dụng chữa bệnh của một số loài thuộc chi Schefflera

Loài Bộ phận dùng Tác dụng

Harms Vỏ và rễ Bổ, hạ nhiệt

Sch.pes-avis Viguier Lá, vỏ và rễ Bổ, tăng sức khỏe Trị kém ăn, mất ngủ

Sch tonkinensis Viguier Vỏ thân, lá và rễ Bổ, hạ nhiệt

Sch Elliptica (Blume) Harms Vỏ thân, vỏ rễ

Kích thích tiêu hóa, trị phong thấp, đau nhức gân cốt

Sch Glomerulata H.L.Li Vỏ và rễ Chưaphong tháp đau xương

Sch leucantha R.Vig Vỏ, lá Trị ho, cầm máu, đau xương

Sch octophylla (Lour.) Harms Vỏ, rễ, thân, lá Trị cảm, viêm Bổ

Sch petelotii Merr Vỏ, lá Tăng cường sinh lực, trị đau nhức gân cốt

Sch Chapana Harms Vỏ Chữa đau nhức xương

Sch Venulosa (Wight et Arn.)

Harms Thân, lá Trị viêm, phong thấp

Các nghiên c ứu về tác dụng dược lý

Năm 2001, Trần Công Luận và cộng sự đã thử tác dụng tăng lực trên cả 3 bộ phận lá, thân, vỏthân Đối với lá và vỏ thân liều 1 g/kg cho tác dụng rõ, đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cây 99%; đã th ử khả năng chịu đựng stress nóng mạnh ở liều 200 mg/kg đối với mẫu thân [5]

Năm 2004, Trần Công Luận và công sự đã thử khảnăng tăng lực khi phối hợp cao thân với cao hồng sâm tỉ lệ 1 : 1 ở liều 400 mg/kg thời gian sống trung bình của chuột dài hơn cả lô sử dụng hồng sâm [6,7] ; đã thử độ độc tính cấp đường uống cao

8 thân với LD 50 = 1255 g/kg (đối với dược liệu) và LD 50 = 277,92 g/kg (khi phối hợp với hồng sâm) [6]

Năm 2008, Võ Duy Huấn, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Cẩm Hồng đã thử tác dụng chống oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết và các genin bằng phương pháp DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl); đã thử khả năng ức chế peroxy hóa lipid bằng phương pháp MDA (malonyl dialdehyd) [8]

Năm 2012, Trần Mỹ Tiên, Đặng Thị Thanh Nhàn, Trần Công Luận, Nguyễn ThịThu Hương đã thử tác dụng kiểu androgen trên chuột đực giảm năng sinh dục của cao lá và cao thân [9]

M ột số nghiên cứu các loài trong chi Schefflera

Năm 2012, Giang Kim Liên Lần đầu tiên tách được chất 4’,7-di-O-methyl naringgenin, rutin, acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28 dioic và chất 7 α,29- dihydroxy-friedelan-3-on, acid 3-O-cafeoylquinic,acid 3,5-di-O-cafeoylquinic được phân lập từ chi Schefflera đồng thời acid 3α,29-dihydroxy-olean-12-en-23,28 dioic là chất mới [10]

Bảng 1.4: Các hợp chất cô lập được từ chân chim bột

Năm 1996, Orasa Pancharoen, Pittaya Tuniwachwuttikul, Walter C Taylor, Kelvin Picker đã cô lập 3 từ lá: acid betulinic 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D- glucopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosid (1), acid betulinic 3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(12)-β-D-xylopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosid (2), acid oleanolic3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)-β-D-glucopyranosyl-(12)]-β-D- glucuronopyranosid (3) [11]

1.6.3 Chân chim Schefflera octophylla (Lour.) Harms

Năm 1982, Adam G., Lischewski M., H V Phiet, Preiss A., Schmidt J., T V Sung, đã cô lập từ lá acid 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic (4) [12]

Năm 1984, Lischewski M., Schmidt J., Preiss A., H V.Phiet, Adam G., đã cô lập từ lá acid 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic (5) [13]

10 Năm 1984, Schmidt J., V V Nam, Lischewski M., H V.Phiet, Kuhnt C., Adam G., đã cô lập từ vỏ cây 1 số dẫn xuất của acid 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic với acid béo dây dài (6) [14] Năm 1989, Junichi KitaJima, Yasuko Tanaka, đã cô lập 2 triterpenoid glycosid từ lá và cuống lá chân chim là acid 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid (7)và acid 3-epi-betulinic 3-O-β-D-glucopyranosid (8) [15] Năm 1990, Junichi KitaJima, Masami Shindo, Yasuko Tanaka, đã cô lập 2 triterpenoid sulfat từ lá tươi chân chim là acid 3-epi-betulinic 3-O-sulfat (9)và acid betulinic 3-O-sulfat (10) [16] Năm 1991, T V Sung, Adam G., đã cô lập 1 triterpenoid sulfat từ lá acid 3 -epi- betulinic 3-O-sulfat 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl- (16)]-β-D-glucopyranosid (11) [17]

Năm 1991, T V Sung, SteglichW., Adam G., đã cô lập 4 triterpenoid từ lá chân chim: acid 3-epi-betulinic (12), acid 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic 28-O-[α- L-rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid

(13), acid 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid

(14)và acid 3-epi-betulinic 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D- glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid (15) [18]

Năm 1991, T V Sung, Peter-Katalinic J., Adam G., đã cô lập từ lá cây chân chim acid oleanonic (16), acid 3-epi-betulinic 3-O-β-D-glucopyranosid 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl-(16)]-β-D-glucopyranosid

(17)và 1 trisaccharid là α-L-rhamnopyranosyl-(14)-O-β-D-glucopyranosyl- (16)-β-D-glucopyranosid (18) [19]

Năm 1992, T V Sung, Adam G đã cô lập từ lá 1 triterpenoid: acid 3-epi-betulinic

Năm 1992, T V Sung, Lavaud C., Porzel A., Steglich W., Adam G., đã cô lập từ vỏ cây chân chim 2 triterpenoid: asiaticosid (20), acid 3α-hydroxyurs-12-en-23,28-

11 dioic (75), acid 3α-hydroxyurs-12-en-23,28-dioic 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (14)-O-β-D-glucopyranosyl (16)]-β-D-glucopyranosid (21) [21]

Năm 1994, Chizuko Maeda, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Thời Nhâm, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, đã cô lập 12 triterpenoid từ vỏ cây là asiaticosid (22), scheffoleosid A (23), cheffursosid B (24), scheffoleosid B (25), scheffursosid C (26), scheffursosid D (27), scheffoleosid D (28), scheffursosid E (29), scheffoleosid E (30), scheffursosid F (31), scheffoleosid

F (32) [22] Năm 2005, Li Yaolan, But Paul P.H., Ooi Vincent E.C., đã cô lập 3 dẫn xuất acid caffeoylquinic là: acid 3,4-di-O-caffeoylquinic (32), acid 3,5-di-O-caffeoylquinic

(33), acid 3-O-caffeoylquinic (34) từ cuống lá chân chim [23]

Bảng 1.5: Một số hợp chất được phân lập từ Schefflera leucantha và

Từ dịch chiết EtOH rễ và lá Schefflera bodinieri, qua sang lọc tác dụng trên hệ thần kinh trung ương cho thấy có ái lực nối kết với các thụ thể α1 và α2-adrenergic, 5HT-1, 5HT-2, opiate, kênh Ca 2+ , sulphonylerea, dopamine 1 và 2, histamine,

GABA A và GABA B Khảo sát về hóa học cho thấy thành phần cấu trúc chính là các glycoside Người ta đã phân lập được 14 hợp chất gồm: 9 glycoside triterpen 5 vòng, 2 triterpen 5 vòng, 1 glucoside triterpen 4 vòng và 2 oligoosaccharid Nghiên

15 cứu sâu hơn về hoạt tính đối với các thụ thể trên một số hợp chất phân lập được, người ta đã xác định được hoạt tính gắn chuyên biệt trên các thụ thể như sau: [24]

Bảng 1.6 : Một số hợp chất của Schefflera bodinieri gắn với thụ thể

Trisaccharide (Glc-Glc-Rha) Kênh Ca 2+ và 5HT2 Stigmasterol 3-O-β-B-glucoside 5HT2

Bảng 1.7: Một số cấu trúc glycoside triterpen 5 vòng đã phân lập được từ

Bodineno glycoside O= Glc-Glc-Rha COOH CH 3 H

Bodirin A OH Glc-Glc-Rha CH 3 CH 3 CH 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU , THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 16

Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp phân lập các chất

 Phương pháp cô quay áp suất thấp

Nhằm loại dung môi ra khỏi dung dịch, dung dịch được chứa trong bình thủy tinh ở điều kiện áp suất thấp Đun nóng dung dịch để thúc đẩy quá trình bay hơi Hơi dung môi trong điều kiện áp suất thấp sẽ đi qua hệ thống làm lạnh, ngưng tụ Kết quả loại được dung môi Nhờ tiến hành quá trình bay hơi ở áp suất thấp nên nhiệt độ bay hơi của dung môi giảm, là một ưu điểm đối với các mẫu kém bền nhiệt [25]

Sử dụng phương pháp trích ly rắn-lỏng với các loại dung môi có tính phân cực khác nhau để phân nhóm tương đối các hợp chất theo sơ đồ 3.1 Theo đó, các hợp chất không phân cực hòa tan tốt trong dung môi không phân cực, các hợp chất có tính phân cực trung bình hòa tan tốt trong dung môi có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất phân cực Phương pháp này giúp cho quá trình cô lập các hợp chất dễ dàng hơn [25]

Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp chất ra riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại chất đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh)

Phương pháp này được sử dụng để phân lập các hợp chất từ hỗn hợp nhiều chất

Có nhiều loại sắc ký:

 S ắc ký lớp mỏng (TLC)

Hay còn gọi là sắc ký phẳng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silica gel như GF60F254, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó

Dung môi di chuyển lên cao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của mẫu chất

17 sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mức dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào hiện tượng hấp thu của pha tĩnh và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-

5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2 SO 4 / Ethanol 10% [25]

Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là là các hạt silicagel cỡ hạt 40-63 μm Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách nhau ra [25]

Các hợp chất tự nhiên để có thể xác định được cấu trúc hóa học thì phải có độ tinh khiết cao (>95%) Sau khi được cô lập bằng phương pháp sắc ký, dù một số hợp chất khi quan sát ở dạng bột trắng hoặc tinh thể không màu nhưng độ tinh khiết vẩn thấp hơn 95% Một trong những phương pháp để nâng độ tinh khiết là kết tinh lại Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất đối với một loại dung dịch Lập lại việc kết tinh nhiều lần sẽ mang lại độ tinh khiết cao

Tuy nhiên, phương pháp này lại làm hao hụt một lượng lớn sản phẩm [25]

2.1.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

 Phương pháp phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy dựa vào liên kết phổ hồng ngoại , người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng [25]

 Phương pháp khối phổ (MS)

Cho phép xác định khối lượng phân tử của một chất sau khi chuyển chất đó thành trạng thái hơi rồi thành ion bằng phương pháp thích hợp Theo đó, mẫu phân tích sẽ bị phá hủy trong quá trình phân tích [25]

 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng

Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc các hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ ( 1 H và 13 C) dưới tác dụng của từ trường ngoài

Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Ngoài ra , đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau.

Trong phổ 1 H-NMR , độ dịch chuyển hóa học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0 ppm đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng từ ở một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học khác nhau

Hóa ch ất - thi ết bị

Silica gel pha thường 230-240 mesh (Merck) Silica gel pha đảo C18 (Merck)

Thuốc thử 10% H 2 SO 4 /EtOH n-hexane (Trung Quốc) chloroform (Trung Quốc) ethyl acetate (Trung Quốc) methanol (Trung Quốc) DMSO (Trung Quốc).

 Thiết bị dùng để trích ly

Becher 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml

Bình lóng 500ml, 1000ml Ống đong 10ml, 100ml, 500ml, 1000ml.

Erlen 100ml , 250ml, 500ml, 1000ml

Bình cô quay 50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml

Phễu đũa thủy tinh giấy lọc

 Thiết bị dùng để phân lập và tinh chế các chất

Bản nhôm silica gel Merck–GF60F254 tráng sẵn, kích thước 20×20 m, độ dày lớp hấp phụ 0,2 mm (Merck, Germany)

Cõn điện tử (TANITA KD–200 và PRECISA XB 220ê)

Máy cô quay chân không ( BUCHI Rotavapor R–200)

21 Máy siêu âm ( Elma S 100 H, Elmasonic, USA)

 Thiết bị dùng để xác định cấu trúc các chất

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR, Viện Hóa Học

Máy đo khối phổ phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS) được đo trên máy Bruker MicrOTOF-QII spectrometer của Trường Đại học Tự nhiên

THỰC NGHIỆM

Nguyên li ệu

Nguyên liệu được cung cấp bởi Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt, s ố 18 Hoàng Văn Thụ, Tp Đà Lạt vào tháng 7/ 2013 do TS Phan Văn Đệ -Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh định danh Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Các hoạt chất có hoạt tính sinh học - Viện Công Nghệ Hóa Học.

Quy trình trích ly các lo ại cao

Lá cây chân chim rửa sạch rồi sấy khô xay nhuyễn thành bột được tận trích với EtOH 96 0 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc bỏ bã, phần dịch chiết được cô quay và thu hồi dung môi dưới áp suất thấp Thực hiện nhiều lần thu được cao EtOH dạng sệt.

Cao EtOH hòa tan trong một ít nước, sau đó được chiết lần lượt với các dung môi theo thứ tự độ phân cực tăng dần: n-hexane, EtOAc Lọc lấy phần dung dịch tan sau khi chiết với 5L n-hexane đem cô quay thu hồi dung môi áp suất thấp thu được cao n-hexane (300g) Phần không tan trong n-hexane tiếp tục được chiết với 5L EtOAc lọc lấy phần dung dịch tan sau khi chiết Đem cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao EtOAc (15g) Toàn bộ qui trình điều chế các loại cao được tóm tắt ở sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế các loại cao từ lá cây chân chim không cuống quả

- Tận trích bằng EtOH 96 0 - Lọc bỏ bã dịch chiết làm khan với Na2SO 4 - Cô cạn dưới áp suất thấp

- Chiết bằng n-hexane -Dịch chiết làm khan với Na2SO 4 -Cô cạn dưới áp suất thấp

- Chiết bằng EtOAc - Dịch chiết làm khan với Na2SO 4 - Cô cạn dưới áp suất thấp

Bột lá cây chân chim không cuống quả

Bã chiết EtOH Cao EtOH

Phần không tan trong n- hexane Cao n-hexan

Cao EtOAc (15g) Phần không tan trong

EtOAc Lá cây chân chim không cuống quả (5Kg)

Phân l ập tinh chế một số hợp chất từ cao EtOAc

Cao EtOAc được trộn với 120g silica gel, được sấy khô ở 50 o C được nghiền mịn bằng cối sứ Sau đó tiến hành sắc ký cột silica gel trên cao EtOAc với các thông số như sau:

-Khối lượng cao 15g -Khối lượng silica gel nhồi cột 120g -Dung môi ổn định cột :n-hexane

Hệ dung môi giải ly bao gồm n-hexane-EtOAc-MeOH với các tỷ lệ thay đổi dần theo độ phân cực từ (50:50:0, 25:75:0, 0:100:0, 0:90:10, 0:80:20).

Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 250 ml và được theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM (TLC) , hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử 10% H 2 SO 4 /EtOH , hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện Các phân đoạn giống nhau trên TLC được gom chung lại.

Sơ đồ 3.2 :Quy trình tách các phân đoạn từ cao EtOAc

Kết quả : Thu được 5 phân đoạn I (2g); II (3g) và III (6g) IV(2g) và V (1g)

Bảng 3.1:Kết quả sắc ký cột trên cao EtOAc

25 Phân đoạn Hệ dung môi(TLC) Kết quả TLC Khối lượng

IV EtOAc-MeOH (90:10) Nhiều vết kéo dài 2g

V EtOAc-MeOH (80:20) Nhiều vết kéo dài 1 g

3.3.1 Khảo sát phân đoạn III

Tiến hành sắc ký cột hấp phụ silica gel trên cao của phân đoạn III nhiều lần với hệ dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần CHCl 3 :MeOH (95:5  75:25) với các thông số như sau:

-Khối lượng cao 6g -Khối lượng silica gel nhồi cột 75g -Dung môi ổn định cột : chloroform

Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 30 ml và được theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử 10% H 2 SO 4 /EtOH, hơ nóng bản s ắc ký trên bếp điện Các phân đoạn giống nhau trên TLC được gom chung lại.

Bảng 3.2 :Kết quả sắc ký cột phân đoạn III của cao EtOAc

26 Phân đoạn Hệ dung môi(TLC) Kết quả TLC Khối lượng

3.3.2 Khảo sát phân đoạn IIIB Ở phân đoạn IIIB (1,5 g) sắc ký cột lại nhiều lần, thu được SS01 (12 mg).

Tiến hành sắc ký cột trên cao của phân đoạn IIIB nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl 3 :MeOH từ (95:5) và tăng dần độ phân cực cho tới (65:35) sau cùng là 100%

MeOH với các thông số như sau:

- Khối lượng cao 1,5g - Khối lượng silica gel nhồi cột 15g - Dung môi ổn định cột: MeOH

Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 10 ml và được theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM (TLC) , hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H2SO 4 10% trong EtOH, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện.

27 Kết quả: Ta thu được 12mg tinh thể màu vàng nhạt hình kim Kiểm tra lại trên SKLM (TLC) nhiều lần bằng hệ dung môi CHCl 3 :MeOH:H 2 O (80:20:01), hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H2SO 4 10% trong EtOH, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện ta thu được 1 vết màu xanh Chất này được gọi là SSL01.

3.3.3 Khảo sát phân đoạn IIIC Ở phân đoạn IIIC (2,5 g) sắc ký cột lại nhiều lần bằng hệ CHCl 3 :MeOH (90:10), thu được SS02 (30 mg), SS03 (20 mg), SS04 (42 mg)

Tiến hành sắc ký cột hấp phụ silica gel trên cao của phân đoạn IIIC nhiều lần với hệ dung môi giải ly CHCl 3 :MeOH từ (90:10) và tăng dần độ phân cực cho tới sau cùng là 100% MeOH với các thông số như sau:

-Khối lượng cao 2,5g -Khối lượng silica gel nhồi cột 15g -Dung môi ổn định cột :chloroform

Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích 10 ml và được theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H2SO 4 10% trong EtOH, hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện.

Kết quả :Ta thu được ta lần lượt thu được 30 mg tinh thể màu vàng Kiểm tra lại trên SKLM (TLC) hệ dung môi CHCl 3 :MeOH (90:10), hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H2SO 4 10% trong EtOH , hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện ta thu được 1 vết màu vàng Chất này được gọi là SSL02

 20 mg bột màu vàng Kiểm tra lại trên SKLM (TLC) nhiều lần với hệ dung môi CHCl 3 :MeOH:H 2 O (80:20:0.2) , hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H 2 SO 4 10% trong EtOH , hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện ta thu được 1 vết màu vàng Chất này được gọi là SSL03

 42 mg tinh thể màu trắng hình kim Kiểm tra lại trên SKLM (TLC) nhiều lần với hệ dung môi CHCl 3 :MeOH (85:15) , hiện vết bằng đèn UV và bằng cách phun xịt thuốc thử H 2 SO 4 10% trong EtOH , hơ nóng bản sắc ký trên bếp điện ta thu được 1 vết màu cam lợt Chất này được gọi là SSL04

Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập và tinh chế các hợp chất cao EtOAc từ lá cây chân chim không cuống quả

K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Xác định cấu trúc SS01

Phổ UV, λmax nm: cho hấp thu cực đại ở 204.

Phổ IR (MeOH), νmax, cm -1 : cho các peak hấp thụ của nhóm hydroxyl ở 3434; nhóm C=O ở 1714, 1660; nhóm C-O ở 1025

Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 1.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M-H] - 363.1818 cho phép xác định công thức phân tử là C20H 28 O 6 (so với lý thuyết ).

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD, δ ppm phụ lục 1.3a) kết hợp với DEPT90, DEPT135(phụ lục 1.4a, b) cho thấy SS01 có 20 carbon: 2 carbon carbonyl ở δ C

180,2 (C-19), 179,8 (C-7); 1 carbon bậc bốn mang nối đôi ở δ C 149,4 (C-16); 1 carbon methylene mang nối đôi ở δC 109,5 (C-17); 2 carbon methine mang oxy ở δC

73,4 (C-12), 66,0 (C-2); 4 carbon methine ở δC 59,8 (C-5), 58,8 (C-9), 50,5 (C-6), 49,0 (C-13); 3 carbon bậc bốn ở δ C 52,0 (C-8), 45,(C-10), 45,0 (C-4); 5 carbon methylene ở δC 49,0 (C-1), 48,0 (C-3), 47,0 (C-15), 43,7 (C-14), 27,9 (C-11); 2 carbon methyl ở 28,5 (C-18), 16,3 (C-20)

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD, δ ppm phụ lục 1.2) của SS01 cho các tín hiệu proton: 2 proton methylene mang nối đôi ngoài vòng ở δH 5,04 (1H, s, H-17b) và 5,00 (1H, s, H-17a); 2 proton methine mang oxy ở δH 4,19 (1H, p, J = 5,5 Hz, H-2) và 3,80 (1H, ddd, J = 3,5, 7,5 và 10,5 Hz, H-12); 4 proton methine ở δH 3,43 (1H, d,

J = 11,5 Hz, H-6), 2,60 (1H, br s, H-13); 2,01 (1H, d, J = 12,0 Hz, H-5), 1,61 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-9); proton của 5 nhóm methylene ở δH 2,45 (1H, dd, J = 4,0 và 13,0 Hz, H-3b), 1,04 (1H, t, J = 12,0 Hz, H-3a), 2,24 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-15a), 2,18 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-15a), 1,99 (1H, dd, J = 4,0 và 13,0 Hz, H-1b), 0,87 (1H, t, J = 11,5 Hz, H-1a), 1,77-1,82 (3H, m, H-14, H-11b), 1,50 (1H, m, H-11a); proton của 2 nhóm methyl ở δH 1,20 (3H, s, H-18), 0,91 (1H, s, H-20), từ dữ liệu phổ trên dự đoán SS01 là diterpen C 20 -gibberellin

Phổ HMBC (phụ lục 1.5), cho thấy proton của nhóm methyl ở δH 1,20 (3H, s, H-18) tương tác với carbon carbonyl ở δC 180,2 (C-19), 1 carbon methylene ở δC 48,0,

30 1 carbon methine ở δC 59,8; vậy 2 carbon này lần lượt là C-3 và C-5 Bên cạnh đó, proton của nhóm methyl ở δH 0,91 (1H, s, H-20) tương tác với 2 carbon methine ở δC 59,8 (C-5), 58,8 và 1 carbon methylene ở δC 49,0; nên 2 carbon này lần lượt là C- 9 và C-1 Ngoài ra, 4 proton của 2 nhóm methylen e đều cho tương tác với carbon methine mang oxy ở δ C 66,0; nên nhóm hydroxyl gắn vào khung aglycon ở C-2

Mặt khác, 2 proton methine ở δH 1,61 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-9) và 2,60 (1H, br s, H-13) đều cho tương tác với carbon methine mang oxy ở δ C 73,4; nên nhóm hydroxyl gắn vào khung aglycon ở C-12 Phổ COSY (phụ lục 1.7a) cũng khẳng định lại vị trí nhóm hydroxyl gắn ở C-2 và C-12; bởi sự tương quan của các proton H-1, H-2, H-3 với nhau; H-9, H-11, H-12, H-13, H-14 với nhau Thêm nữa, phổ

ROESY (phụ lục 1.8a) cho thấy sự tương quan giữa proton Hα-20 với H-2 và H-

12; chứng tỏ H-2 và H-12 phải ở vị trí trục axial (α) và OH-2, OH-12 ở vị trí xích đạo

Tóm lại từ các dữ liệu phổ UV, HR-ESI-MS, 1 H, 13 C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, COSY, ROESY, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu [27] ; chúng tôi khẳng định

SS01 là 2 β ,12 β -dihydroxygibberellin (12 β -hydroxy-GA 110 , 2 β -hydroxy-GA 112 )

Bảng 4.1 : Dữ liệu phổ 13 C, 1 H–NMR, COSY, HMBC của SS01 và so sánh với tài liệu:

1 H–NMR δppm (Số H, dạng mũi, J = Hz)

Xác định cấu trúc SS02

Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 2.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+Na] + 617,1289, cho phép xác định công thức phân tử là C 30H 26 O 13 (so với lý thuyết 617,1266) và mũi ion phân tử giả với m/z: [2*M+Na] + = 1211,2549

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm phụ lục 2.2a) của SS02 cho các tín hiệu proton: 8 proton methine vòng thơm (-CH=) ghép cặp ortho với nhau: 1 cặp ở δH 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’) và 6,85 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’); 1 cặp ở δH 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’’, H-6’’’) và 6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’’’, H-5’’’); 2 proton methine vòng thơm (-CH=) ghép cặp meta với nhau ở δH 6,38

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); chứng tỏ SS02 có 3 vòng thơm, 1 vòng 4 nhóm thế và 2 vòng 2 nhóm thế đối xứng Ngoài ra, SS02 còn có: 2 proton methine ghép trans ở δH 7,34 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7’’’) và 6,10 (1H, d, J 33 16,0 Hz, H-8’’’); 1 proton anomer ở δH 5,44 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1’’) ứng với 1 carbon anomer ở δC 101,0 (C-1’’); 2 proton của nhóm methylene mang oxy (-CH 2 - O) ở δH 4,26 (1H, dd, J = 1,5 và 11,5Hz, H-6”b) và 4,03 (1H, dd, J = 6,5 và 12,0Hz, H-6”a); 4 proton methine mang oxy (-CH-O) ở δH 3,36 (1H, m, H-5’’), 3,17-3,29 (3H, m, H-2’’, H-3’’, H-4’’); 1 proton của nhóm hydroxyl kìm nối ở δH

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm phụ lục 2.3) kết hợp với DEPT90, DEPT135 (phụ lục 2.4) cho thấy SS02 có 30 carbon: 2 carbon carbonyl ở δC 177,4 (C-4), 166,1 (C-9’’’); 7 carbon methine vòng thơm mang oxy ở δC 156,4 (C-2), 133,1 (C-3), 161,3 (C-5), 164,2 (C-7), 156,4 (C-9), 160,0 (C-4’), 159,8 (C-4’’’); 3 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 103,9 (C-10), 120,8 (C-1’), 124,9 (C-1’’’); 10 carbon methine vòng thơm ở δC 98,8 (C-6), 93,7 (C-8), 130,8 (C-2’,C-6’), 115,1 (C-

3’,C-5’), 130,1 (C-2’’’,C-6’’’), 115,7 (C-3’’’, C-5’’’); 2 carbon methine ngoài vòng ở δC 144,6 (C-7’’’), 113,6 (C-8’’’); 1 carbon anomer ở δC 101,0 (C-1’’); 4 carbon methine mang oxy ở δC 74,1 (C-2’’), 76,2 (C-3’’), 70,0 (C-4’’), 74,2 (C-5’’); 1 carbon methylene mang oxy ở δC 63,0 (C-6’’)

Chứng tỏ SS02 là 1 flavonoid glycoside với đơn vị đường là 6 carbon và một dây nhánh là coumaroyl

Phổ COSY và HSQC xác nhận là đường D-glucopyranoside Ngoài ra, HSQC, cho thấy proton anomer ở δH 5,44 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1’’) ứng với 1 carbon anomer ở δC101,0 (C-1’’) chứng tỏ đây là đường O-glycoside, với hằng số J = 7,0 Hz xác nhận đây là đường β

Phổ HMBC (phụ lục 2.5), cho thấy proton của nhóm hydroxyl kìm nối ở δH 12,56 (1H, s, OH-5) tương tác với 1 carbon bậc bốn mang oxy ở δC 161,1; 1 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 103,8; 1 carbon methine vòng thơm ở δC 98,8; nên 3 carbon này lần lượt là C-5, C-10 và C-6 Bên cạnh đó, 2 proton ghép cặp metaở δH 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,14 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) đều cho tương tác với carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở δC 164,2 và 1 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 103,8 nên hai carbon này lần lượt là C -7 và C-10 Hai proton này cũng lần lượt

34 cho tương tác với hai carbon vòng thơm mang oxy ở δC 156,4 và 161,1 nên hai carbon này lần lượt là C-9 và C-5

Lại nữa, 2 proton ghép cặp ortho ở δH 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’) và 6,85 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’) đều cho tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở ở δ C 160,0; vây carbon này C-4’.Hai proton này cũng lần lượt cho tương tác với 1 carbon vòng thơm mang oxy ở δC 156,4 và 1 carbon bậc bốn vòng thơm ởδC 120,8 nên hai carbon này lần lượt là C -2 và C-1’ Vậy SS02 có khung aglycon là kaempferol

Tương tự, 2 proton ghép cặp ortho ở δH 7,36 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’’’, H-6’’’) và 6,78 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’’’, H-5’’’) đều cho tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở ở δ C 159,8; vây carbon này C4’’’.Hai proton này cũng lần lượt cho tương tác với 1 carbon methine ngoài vòng ở δC 144,6 và 1 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 124,9 nên hai carbon này lần lượt là C-7’’’và C-1’’’ Ngoài ra, 2 proton methine ghép trans ở δH 7,34 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7’’’) và 6,10 (1H, d, J 16,0 Hz, H-8’’’) đều cho tương tác với 1 carbon carbonyl ở δC 166,1 (C-9’’’) Vây

SS02 có dây nhánh là coumaroyl

Mặt khác, proton anomer ở δH 5,44 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1’’) tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở δC 133,1 (C-3); chứng tỏ đơn vị đường O-β-

D-glycopyranoside gắn vào khung aglycon ở vị trí C-3

Ngoài ra, 2 proton của nhóm methylen e mang oxy ở δH 4,26 (1H, dd, J = 1,5 và

11,5Hz, H-6”a) và 4,03 (1H, dd, J = 6,5 và 12,0Hz, H-6”b) của đơn vị đường này cho tương tác với 1 carbon carbonyl ở δC 166,1 (C-9’’’); chứng tỏ dây nhánh gắn vào đơn vị đườngở vị trí C-6

Tóm lại từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1 H, 13 C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu [28] ; chúng tôi khẳng định SS02 là Kaempferol 3-O-[6’’-O-(p-trans-coumaroyl)]- β -D-glucopyranoside

Hình 4.2: Kaempferol 3-O-[6’’-O-(p-trans-coumaroyl)]- β -D- glucopyranoside Bảng 4.2 : Dữ liệu phổ 13 C, 1 H–NMR, HMBC của SS02 và so sánh với tài liệu:

SS02 (DMSO-d 6 ) Trans -tiliroside (DMSO-d 6 )

Xác định cấu trúc SS03

Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 3.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+Na] + 485,0697, cho phép xác định công thức phân tử là C21H 18 O 12

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm phụ lục 3.2a) của SS03 cho các tín hiệu proton: 4 proton methine vòng thơm (-CH=) ghép cặp ortho với nhau ở δH 8,03 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, H-6’) và 6,87 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 2 proton methine vòng thơm (-CH=) ghép cặp meta với nhau ở δH 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H- 8) và 6,18 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); chứng tỏ SS03 có 2 vòng thơm, 1 vòng 4 nhóm thế và 1 vòng 2 nhóm thế đối xứng Ngoài ra, SS03 còn có: 1 proton anomer ở δH

5,40 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1’’); 4 proton methine mang oxy (-CH-O) ở δH 3,38-3,42 (1H, m, H-5’’), 3,25-3,30 (1H, m, H-4’’); 3,20-3,26 (2H, m, H-2’’, H-3’’)

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6 , δ ppm phụ lục 3.3) kết hợp với DEPT90, DEPT135 (phụ lục 3.4) cho thấy SS03 có 21 carbon: 2 carbon carbonyl ở δC 177,4 (C-4), 171,0 (C-6’’); 6 carbon methine vòng thơm mang oxy ở δC 156,3 (C-2), 133,2 (C-3), 161,1 (C-5), 164,4 (C-7), 156,4 (C-9), 160,1 (C-4’); 2 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 103,8 (C-10), 120,6 (C-1’); 6 carbon methine vòng thơm ở δC 98,8 (C-6), 93,7 (C-8), 131,0 (C-2’, C-6’), 115,1 (C-3’, C-5’); 1 carbon anomer ở δC

Chứng tỏ SS03 là 1 flavonoid glycoside với đơn vị đường là 6 carbon Ngoài ra, carbon anomer ở δC 101,2 (C-1’’) tương ứng với carbon carbonyl ở δC 171,0 (C-6’’); chứng tỏ đơn vị đường là O-D-glucuronat

Phổ HMBC (phụ lục 3.5), cho thấy proton anomer ở δH 5,40 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- 1’’) tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở δC 133,2 (C-3); chứng tỏ đơn vị đường O-β-D-glycuronopyranoside gắn vào khung aglycon ở vị trí C-3

Tóm lại từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1 H, 13 C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu [29] ; chúng tôi khẳng định SS03 là Kaempferol 3-O- β -D-glucuronopyranoside

Bảng 4.3 : Dữ liệu phổ 13 C, 1 H–NMR, HMBC của SS03 và so sánh với tài liệu:

SS03 (DMSO-d 6 ) Kaempferol 3-O- β -D- glucuronopyranoside (DMSO-d 6 )

1 H–NMR δppm (Số H, dạng mũi, J = Hz)

1 H–NMR δppm (Số H, dạng mũi, J = Hz)

Xác định cấu trúc SS04

Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 4.1) cho mũi ion phân tử giả với m/z: [M+Na] + 361,0891 phép xác định công thức phân tử là C16H 18 O 8 (so với lý thuyết 361,8094).

Phổ 1 H-NMR (500 MHz, CD 3 OD, δ ppm phụ lục 4.2a) của SS04 cho các tín hiệu proton: 4 proton methine vòng thơm (-CH=) ghép cặp ortho với nhau ở δH 7,48 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’, H-6’) và 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’); 2 proton methine ghép trans ở δH 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7’) và 6,33 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8’);

3 proton methine mang oxy (-CH-O) ở δH 5,36 (1H, td, J = 4,5 và 9,5 Hz, H-5),

4,19 (1H, td, J = 3,0 và 5,5 Hz, H-3), 3,75 (1H, dd, J = 3,5 và 8,5 Hz, H-4); 4 proton của 2 nhóm methylene (-CH 2 -) ở δH 2,25 (1H, ddd, J = 2,0, 4,5 và 13,5Hz, H-2b), 2,22 (1H, dd, J = 3,5 và 14,0 Hz, H-6b) và 2,05-2,13 (1H, m, H-2a, H-6a)

Phổ 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD, δ ppm phụ lục 4.3a) kết hợp với DEPT90, DEPT135 (phụ lục 4.4) cho thấy SS04 có 16 carbon: 2 carbon carbonyl ở δC 177,0 (C-7), 168,6 (C-9’); 1 carbon methine vòng thơm mang oxy ở δC 161,3 (C-4’); 1 carbon bậc bốn vòng thơm ở δC 127,3 (C-1’); 4 carbon methine vòng thơm ở δC

131,2 (C-2’,C-6’), 116,8 (C-3’,C-5’); 2 carbon methine ngoài vòng ở δC 146,7 (C- 7’), 115,4 (C-8’); 1 carbon methine bậc bốn mang oxy ở δC 76,1 (C-1); 3 carbon methine mang oxy ở δC 73,5 (C-4), 72,0 (C-5), 71,3 (C-3); 2 carbon methylene ở δC

Chứng tỏ SS04 là phenolic gắn với acid quinic.

Phổ COSY và HSQC xác nhận lại 1 đơn vị acid quinic Bên cạnh đó, dựa vào hằng số ghép cặp J có thể thấy proton ở δH 4,19 (1H, td, J = 3,0 và 5,5 Hz, H-3) phải ở vị trí xích đạo (equatorial), proton ở δH 3,75 (1H, dd, J = 3,5 và 8,5 Hz, H-4) và 5,36 (1H, td, J = 3,5 và 9,5 Hz, H-5) phải ở vị trí trục (

Phổ HMBC (phụ lục 4.6), cho thấy 2 proton ghép cặp ortho ở δH 7,48 (2H, d, J 8,5 Hz, H-2’, H-6’) và 6,83 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’, H-5’) đều cho tương tác với 1 carbon bậc bốn vòng thơm mang oxy ở ở δC 161,3; vây carbon này C-4’.Hai proton axial)

42 này cũng lần lượt cho tương tác với 1 carbon methine ngoài vòng ở δC 146,7 và 1 carbon bậc bốn vòng thơm ởδC 127,3 nên hai carbon này lần lượt là C-7’ và C-1’

Ngoài ra, 2 proton methine ghép trans ở δH 7,64 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7’) và 6,33 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8’) đều cho tương tác với 1 carbon carbonyl ở δC 168,6 (C- 9’) Vây SS04 có dây nhánh là coumaroyl

Ngoài ra, proton methine mang oxy ở δH 5,36 (1H, td, J = 4,5 và 9,5 Hz, H-5) tương tác với 1 carbon carbonyl ở δC 168,6 (C-9’); chứng tỏ dây nhánh coumaroyl gắn vào acid quinic ở vị trí C-5

Tóm lại từ các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, 1 H, 13 C-NMR, kết hợp với phổ DEPT, COSY, HSQC, HMBC, và so sánh với tài liệu [30] ; chúng tôi khẳng định SS04 là acid 5-p-trans-coumaroylquinic

Hình 4.4: Acid 5-p-trans-coumaroylquinic Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 13 C, 1 H–NMR, COSY, HMBC của SS04 và so sánh với tài liệu:

SS04 (CD 3 OD) 5-p-trans-coumaroylquinic acid (CD 3 OD)

1 H–NMR δppm (Số H, dạng mũi, J = Hz)

1 H–NMR δppm(Số H, dạng mũi, J = Hz)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Qua quá trình nghiên cứu thành phần hóa học cao EtOAc từ lá cây chân chim không cuống quả thu hái tại trung tâm dược liệu Đà Lạt chúng tôi đã thu được kết quả sau.

Thu được 4 chất: Kaempferol 3-O-[6’’-O-(p-coumaroyl)]-β-D-glucopyranoside ; acid5-p-trans-coumaroylquinic, 2β,12β-dihydroxygibberellin (12β-hydroxy- GA 110 ,2β-hydroxy-GA 112 ), Kaempferol 3-O-β-D-glucuronopyranoside

Trong đó 2 β ,12 β -dihydroxygibberellin (12 β -hydroxy-GA 110 ,2 β -hydroxy-GA 112 ) là chất mới

2 β ,12 β -dihydroxygibberellin (12 β -hydroxy-GA 110 , 2 β -hydroxy-GA 112 )

Vì điều kiện thời gian và vật chất không cho phép nên trong phạm vi nghiên cứu của luận văn này Chúng tôi chỉ tách chiết phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất Trong thời gian tới nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn, cũng như độc tính trên các dòng tế bào ung thư ở một số hợp chất đã phân lập được

[1] Trần Công Luận, Phan Văn Đệ, Đỗ Thanh Phú, Nguyễn Phương Dung 2004 Nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc từ 3 loài (Schefflera elliptica, Schefflera corymbiformis, Schefflera sp3) thuộc họ nhân sâm

(Araliaceae) có tác dụng chống stress và tăng lực Đề tài cấp Bộ, Trung tâm

Sâm và Dược liệu Tp HCM

[2] Nguyễn Vũ Trường 2011 Nghiên cứu và thăm dò hoạt tính sinh học của cây Schefflera Petelotti và Schefflera Hypoleuca ở Việt Nam Luận văn thạc sỹ hóa học trường Đại Học Đà Nẵng tr 1

[3] Võ Duy Huấn, Trần Công Luận, Dương Hồng Tố Quyên 2003 Khảo sát đặc điểm vi học và sơ bộ thành phần hóa học của lá, thân và rễ cây Chân chim không cuống quả (Schefflera sp3) Tạp chí Dược liệu 8(1): tr 17-21

[4] Đỗ Thanh Phú 2003 Sàng Lọc tác dụng tăng lực và chống stress kết hợp với khảo sát hóa học một số loài Schefflera, họ Araliaceae Luận văn thạc sỹ khoa học ngành hóa sinh Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM tr.5-9 [5] Trần Công Luận 2001 Nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc họ Nhân sâm

(Araliaceae) có tác dụng chống stress và tăng lực Đề tài cấp Bộ KHYD.0224.R, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp HCM

[6] Nguyễn Thị Thúy Hạnh, Nguyễn Trần Châu, Đỗ Mai Anh, Trần Công Luận, Nguyễn Phương Dung 2004 Nghiên cứu khảnăng hiệp lực của 3 loài Schefflera với Hồng sâm thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) trên tác dụng tăng lực và chịu đựng stress nóng Y học Tp HCM, chuyên đề Y học cổ truyền 8(2): tr 151-155

[7] Huỳnh Ngọc Thi, Phan Kim Lan, Nguyễn Phương Dung, Trần Công Luận 2005

[8] Võ Duy Huấn, Nguyễn ThịThu Hương, Trần Công Luận, Huỳnh Thị Cẩm Hồng 2008 Nghiên cứu hóa học và tác dụng chống oxy hóa in vitro của hợp chất saponin trong thân cây chân chim không cuống quả (Schefflera sp3) Tạp chí Dược liệu 13(1): tr 17-21

Nghiên cứu tác dụng tăng lực và chịu đựng stress nóng của 3 loài

Schefflera và khảnăng hiệp lực với Hồng sâm trên chuột nhắt trắng Y học Tp HCM 9(2): tr 91-95

[9] Trần MỹTiên, Đặng Thị Thanh Nhàn, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương 2012 Nghiên cứu tác dụng hướng sinh dục nam của cây chân chim không cuống quả Tạp chí Dược liệu 17(1): tr 17-23

[10] Giang Thị Kim Liên, Nguyễn Thanh Tâm, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trần Văn Sung, Đào Hùng Cường (2011) 3α,29-dihydroxy-12-oleanen-23,28- dioic acid một triterpen mới từ cây Schefflera farinosa Merr

[11] Orasa Pancharoen, Pittaya Tuniwachwuttikul, Walter C Taylor, Kelvin

Picker 1994 Triterpenoid glycosides from Schefflera lucantha

Tạp chí Hóa học, Hà Nội 49 (6): tr 738-742

[12] Adam G., Lischewski M., H V Phiet, Preiss A., Schmidt J., T V Sung 1982 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic acid from Schefflera octophylla.Phytochemistry 21(6): 1385-1387

[13] Lischewski M., Schmidt J., Preiss A., H V.Phiet, Adam G .1984 3α,11α- dihydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic acid from Schefflera octophylla

[14] Schmidt J., V V Nam, Lischewski M., H V.Phiet, Kuhnt C., Adam G

1984 Long-chain fatty acid esters of 3α-hydroxylup-20(29)-en-23,28-dioic acid acid and other triterpenoid constituents from the bark of Schefflera octaphylla Phytochemistry 23(9): 2081-2082

[15] Junichi KitaJima, Yasuko Tanaka 1989 Two new triterpenoid glycosides from the leaves of Schefflera octophylla Chem Pharm Bull 37(10): 2727- 2730

[16] Junichi KitaJima, Masami Shindo, Yasuko Tanaka 1990 Two new triterpenoid sulfates from the leaves of Schefflera octophylla Chem Pharm

[17] T V Sung, Adam G 1991 A sulphated triterpenoid saponin from

[18] T V Sung, Steglich W., Adam G 1991 Triterpenoid glycosides from

[19] T V Sung, Peter-Katalinic J., Adam G 1991 A bidesmosidic triterpenoid saponin from Schefflera octaphylla Phytochemistry 30(11): 3717-3720

[20] T V Sung, Adam G 1992 An acetylated bidesmosidic saponin from

Schefflera octaphylla Journal of natural products 55(4): 503-505

[21] T V Sung, Lavaud C., Porzel A., Steglich W., Adam G 1992 Triterpenoid and theirs glycosides from the bark of Schefflera octaphylla

[22] Chizuko Maeda, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Kazuo Yamasaki 1994

Oleanane and ursane glycosides from Schefflera octophylla

[23] Li Yaolan, But Paul P.H., Ooi Vincent E.C 2005 Antiviral activity and mode of action of caffeoylquinic acids from Schefflera heptaphylla (L.) Frodin Antiviral research 68: 1-9

[24] [Min Z.& Ronald C.L 1999 Planta Medica 65: 99-103 [25] Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ,

NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Tr 80-147, 151-153, 213-223

[26] Nguyễn Kim Phi Phụng 2005 Phổ MNR sử dụng trong phân tích hữu cơ , NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Tr 204-209, 340-347

[27] Lewis N Mander, David J Owen, Stephen J Croker 1996 Identification of three C20 – Gibberellins : GA97 (2β-Hydroxy-GA53), GA98 (2β- Hydroxy-GA44) and GA99 (2β-Hydroxy-GA19) Phytochemistry 7(3): 23- 28

[28] Micheal Timmers and Sylvia Urban 2011 On- line (HPLC-NMR) And Off-line Phytochemical Profiling of the Australian Plant, Lasiopetalun macrophyllum Natural product communications 7 (5): 551-560