Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu tinh sạch Chondroitin Sulfate bằng phương pháp hóa học và hóa lý

NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: ˗ Tổng quan tài liệu về Chondroitin Sulfate, nguyên liệu sụn ức gà; phương pháp siêu âm, enzyme dùng trong việc thủy phân để thu nhận dung dịch Chondroitin Sulfate

Tổng quan

Tổng quan về Chondroitin sulfate

2.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của CS

Chondroitin sulfate (CS) là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide, gồm các monome là các đơn vị disaccharide chứa nhóm: glucuronic acid (GlcA) và N- acetyl-galactosamine (GalNAc) liên kết với nhau bởi liên kết glucoside (GlcA β (1→3) GalNAc) (hình 2.1) tạo thành Chondroitin sulfate glycosaminoglycans (CS-GAGs) không phân nhánh Một chuỗi CS-GAGs có thể chứa từ 20 – 40 đơn vị disaccharide và các disaccharide liên kết với nhau bởi liên kết 1 →4 glycoside[1], [2]

Mỗi nhóm OH của CS-GAGs đƣợc thay thế bởi nhóm sulphate (SO 4 2- ) tại vị trí carbon C4 hoặc C6 của GalNAc và vị trí carbon C2 hoặc C3 của GlcA sẽ tạo ra các đồng phân của CS (hình 2.1) [4],

Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của CS

Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO 4 2- ) gốc đường với các nhóm carboxyl (COO - ) của gốc đường acid làm cho phân tử chondroitin có điện tích âm rất cao, dễ dàng liên kết cộng hóa trị với các protein trong proteoglycan (PG) Trong các nghiên cứu của Kato (1994) và Bernfield (1999) đã cho thấy CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycosid tạo thành một PG, là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [24]

Chuỗi CS đƣợc gắn với nhóm – OH của gốc serine ở một số protein Sự gắn kết chuỗi GAGs bắt đầu với bốn gốc đường đơn theo phương thức cố định bởi liên kết tetra – saccharide: xylose – galactose – galactose – glucuronic acid (Xyl – Gal – Gal – GlcA) (hình 2.2) trong đó xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi.[6],[22]

Hình 2.2: Cấu tạo hóa học của CS

CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm trọng lƣợng phân tử trung bình của sản phẩm thu đƣợc Mỗi phân tử đường có thể bị sulfate hóa 1, 2 lần hoặc không bị sulfate hóa Đa phần nhóm OH ở vị trí cacbon 4 và 6 của GalNac đƣợc sulfate hóa Quá trình này nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu Việc sulfate hóa ở các vị trí carbon khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS [3]

Chondroitin có 3 loại chính A, B và C, chúng đƣợc đặc trƣng bởi số lƣợng và vị trí gắn sulfate trong nhóm dissacharide của chuỗi polysaccharide [5],[9], [32]

- Chondroitin sulfate A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4) có nhiều ở mô sụn, có thể kết hợp với protein tạo nên chondromucoit

- Chondroitin sulfate B: acid iduronic thay thế acid glucuronic, thường có nhiều ở da, gan, vân tim, thành mạch Vị trí bị sulfate hóa ở C-4 của GlcNac và C-5 của glucuronic acid bị epime hóa thành iduronic acid

- Chondroitin sulfate C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6)

Hình 2.3: Các đồng phân của CS

Ngoài ra còn có Chondroitin sulfate D và E Phân loại CS đƣợc tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 2.1: Bảng phân loại CS Tên Vị trí bị sulphate hóa Tên phân loại

Cacbon 4 của đường N- acetyl-D-galactosamine

Cacbon 4 của GalNAc-L- iduronic acid

Chondroitin sulfate C Cacbon 6 của GalNAc Chondroitin-6-sulphate

Chondroitin sulfate D Cacbon 2 của glucuronic acid and 6 của GalNAc

Chondroitin sulfate E Cacbon 4 và 6 của

Số lƣợng đồng phân của CS đƣợc tìm thấy rất nhiều Điều này cho thấy rằng, cấu trúc chuỗi CS không mang tính ngẫu nhiên và những chuỗi CS có thể chứa những thông tin sinh học, cấu trúc phân tử đặc biệt ảnh hưởng đến chu trình sinh học của cơ thể theo Robert M Lauder và các cộng sự (2009) [1]

CS phân bố khắp cơ thể người, động vật có vú, động vật không xương sống và trong một số loài vi khuẩn Tại các mô khớp, CS chiếm khoảng 20%, một số lƣợng tuy không lớn nhƣng đóng vai trò vô cùng quan trọng trong sự bền chắc và đàn hồi của mô sụn Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu cũng cho thấy tại giác mạc CS chiếm khoảng 20% [10]

7 Nguồn gốc của CS trên thị trường hiện tại được chiết xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu như: phụ phẩm của heo (lỗ tai và mõm heo), sụn cá mập (xương sọ, xương sống và vây), ống khí quản bò, sụn bò và có thể dùng CS từ sụn khí quản động vật (khí quản gà, vịt ) để thay thế cho sụn cá mập, giảm giá thành nhƣng vẫn đảm bảo chất lƣợng của sản phẩm

Trong các nghiên cứu khoa học đã đƣa ra hàm lƣợng CS của một số nguyên liệu

Sụn từ xương hàm cá sấu và sụn ức gà là những nguyên liệu chứa nhiều CS, lần lượt là 14,84% và 14,08% tính theo trọng lƣợng sụn khô [10] Theo một nghiên cứu khác của Luo và cộng sự (2002) thì hàm lƣợng CS từ sụn ức gà chiếm 16,8% [23] Hàm lƣợng CS từ các sụn khác như: sụn xương ức cá sấu 11,55%, sụn khí quản cá sấu 9,51%, sụn vây cá mập 9,6%, sụn sườn cá sấu 5,56%, và sụn cá đuối 5,27% (tính theo chất khô) [10]

Hàm lƣợng CS trong khí quản vịt đƣợc nghiên cứu là khoảng từ 9,7% đến 10,6% theo hàm lƣợng chất khô [46]

Hình 2.4: Một số nguồn nguyên liệu thu nhận CS

CS trong mô động vật liên kết chặt chẽ với protein trong dạng phức proteoglycan cho nên việc đầu tiên là phải tách CS ra khỏi protein nhờ việc làm yếu các liên kết giữa CS – Protein và phân hủy protein để giải phóng CS [24]

8 Tùy vào nguồn gốc xuất xứ mà CS có cấu trúc hóa học khác nhau, mỗi cấu trúc hóa học của mạch polyme khác nhau có chức năng sinh học khác nhau Một trong những yếu tố quyết định đến giá trị của CS đó là chất lƣợng và sự công nhận của các cơ quan có thẩm quyền Một số sản phẩm có thể chứa hàm lƣợng CS ít hơn so với quy định đã đăng ký nhƣng không nhỏ hơn 10%, do đó cần phải tiến hành kiểm tra chất lƣợng và nguồn gốc của CS trong các sản phẩm thương mại [4],[7]

CS đã được sử dụng rộng rãi trong các thực phẩm chức năng và thị trường các chế phẩm bổ sung dinh dƣỡng CS và glucosamine rất lớn Chỉ trong vòng một năm (1998 – 1999), doanh thu bán lẻ tại Mỹ đạt đƣợc 500 triệu USD CS có nhiều tác dụng trong điều trị bệnh lý cũng nhƣ trong các lĩnh vực khác

Hình 2.5: Một số sản phẩm chứa bột CS

Khớp là bộ phận liên kết bao bọc làm cầu nối giữa 2 đầu xương, bao gồm bởi nhiều loại mô khác nhau nhƣ sụn khớp, bao khớp, dịch khớp, dây chằng (hình 2.6)

Hình 2.6: Mô phỏng cấu tạo khớp

9 Sụn khớp là lớp mô bao lấy đầu xương để ngăn các xương tiếp xúc trực tiếp với nhau, giúp khớp vận động dễ dàng đóng vai trò như miếng đệm giữa các khớp xương và tái tạo đầu xương kéo dài ở lứa tuổi đang phát triển [13],[33], [35]

Dich khớp: là dịch trong, có độ nhớt cao, có tác dụng bôi trơn, cung cấp các dƣỡng chất cho cấu trúc bên trong khớp

Sụn ức gà

Sụn chứa một lƣợng lớn glycosaminoglycans, chiếm từ 20% đến 30% khối lƣợng chất khô, có thể đƣợc sản xuất thành các sản phẩm có lợi cho sức khỏe [23]

Có nhiều nguồn cung cấp GAGs nhƣ vi cá mập, khí quản cá sấu, hàm cá sấu, khí quản vịt,… trong đó sụn ức gà là một trong những loại nguyên liệu tiềm năng [23], [29], [40], [46]

Hình 2.8: Sụn ức gà: khi còn mô và mỡ (a) và sau khi đƣợc làm sạch (b)

Sụn ức gà là phần sụn được lấy từ phần chóp của bộ xương ức gà, được thu mua tại công ty Phạm Tôn, quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh

Sụn được tách khỏi bộ xương ức, thu mua ngay tại lò giết mổ ở điều kiện nhiệt độ lạnh, đóng vào các bao PE kín khoảng 5kg, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm Tiến

16 hành ngâm rửa sụn gà trong dung dịch muối NaCl 5%, đồng thời loại bỏ lớp lipid, bụi bẩn bám bên ngoài hoặc sụn không đạt chỉ tiêu Để ráo sụn và đóng bao bì PE 1kg, cho vào tủ đông bảo quản ở điều kiện -18 o C.

Chăn nuôi ở Việt Nam

Tình hình chăn nuôi gia cầm ở nước ta ngày càng phát triển mạnh và rộng khắp cả nước với số lượng đàn và tổng số lượng con ngày một gia tăng Các trang trại chăn nuôi gia cầm tập trung chủ yếu ở khu vực Bắc Trung Bộ và Duyên Hải Miền Trung, Đồng Bằng Sông Hồng và Trung Du Miền Núi Phía Bắc (trên 20%), phân bố thấp ở Đông Nam Bộ (5%) và Tây Nguyên (7%) Nguyên nhân là do điều kiện khí hậu và đặc trƣng nền kinh tế mỗi vùng [69]

Theo số liệu thống kê của cục chăn nuôi, năm 2001 tổng đàn gia cầm là 158,03 triệu con, năm 2002 là 180 triệu con, năm 2003 là 185,22 triệu con Do dịch cúm gia cầm, năm 2004, đàn gia cầm giảm 159,23 triệu con bằng 86,2% so với năm 2003 Năm 2005, đàn gia cầm đạt 159,89 triệu con Từ năm 2005 đến 2015, đàn gia cầm tiếp tục tăng nhanh Năm 2015, đàn gia cầm nước ta có 341,96 triệu con trong đó đàn gà có 273,9 triệu con, chiếm 80,1% so với tổng đàn gia cầm Năm 2016, đàn gia cầm cả nước đạt 356,72 triệu con và cuối năm 2017 có 385,46 triệu con Theo nhƣ kế hoạch phát triển của cục chăn nuôi, đến năm 2020, số lƣợng đàn gia cầm ƣớc tính khoảng 397,9 triệu con

Hình 2.9: Biểu đồ ƣớc tính sản lƣợng chăn nuôi gia cầm qua các năm

(Nguồn: http://hoichannuoi.mard.gov.vn)

Qua biểu đồ ƣớc tính sản lƣợng chăn nuôi gia cầm hình 2.9, ta thấy đƣợc tình hình chăn nuôi gia cầm nói chung, đàn gà nói riêng đang phát triển nhanh chóng

Số lượ n g đàn gi a cầm (t ri ệ u c o n )

2.3.2 Tình hình tiêu thụ thịt gà ở Việt Nam

Lượng tiêu thụ thịt gia cầm trong nước cũng tăng mạnh qua các năm Qua đó ta thấy được nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng tăng Năm 2005 lượng tiêu thụ là 322 ngàn tấn đến năm 2015 tiêu thụ 862 ngàn tấn, sau 10 năm lƣợng tiêu thụ tăng đến 267,7% [69]

Hình 2.10: Tình hình tiêu thụ thịt gà (năm 1997 – 2015) Bảng 2.2: Lƣợng thịt gà nhập khẩu vào Việt Nam năm 2012 – 2015 [69]

Lƣợng thịt gà (Đơn vị: Ngàn tấn) 39,5 49,6 80,3 124,4

Từ năm 2005 trở về trước, nguồn thịt gia cầm tiêu thụ ở Việt Nam hầu hết trong nước, lượng nhập khẩu tăng mạnh vào năm 2008, lên khoảng trên 80 ngàn tấn Từ đó đến nay dao động trong khoảng 35 – 50 ngàn tấn/năm

Trong 6 tháng đầu năm 2015, theo bài viết “Nhập khẩu gần 42 ngàn tấn thịt gà từ Mỹ” đăng trên “baohaiquan.vn”, tổng lƣợng thịt gà nhập khẩu là 69,8 ngàn tấn, chủ yếu từ Mỹ, Brazil và Hàn Quốc (gần 100% gà nguyên con đƣợc nhập từ Hàn Quốc, trong khi 98% đùi gà đƣợc nhập từ Mỹ; còn 70% cánh gà đƣợc nhập từ Brazil), ba quốc gia này chiếm trên 80% tổng lượng thịt gà nhập khẩu cả nước [70]

Qua đó ta thấy được xu hướng chọn thịt gà để cung cấp đạm động vật cho bữa ăn hàng ngày vì nhiều chất dinh dƣỡng, giá thành rẻ, tiết kiệm chi phí đã mở ra một thị trường đầy tiềm năng Thêm vào đó, lợi nhuận từ chăn nuôi gà trong những năm qua đã thu hút và tạo sự cạnh tranh gay gắt giữa nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước

2.3.3 Phụ phẩm từ chế biến gà thịt

Trong quá trình giết mổ gà, lƣợng phụ phẩm có thể lên tới 37 – 40% khối lƣợng sống, bao gồm: lông, da, nội tạng và một số phụ phẩm xương Đó là nguồn nguyên liệu dồi dào để tái sử dụng thành những sản phẩm có giá trị hơn nhƣ: mỡ hỗn hợp làm thức ăn chăn nuôi, bột thịt xương, bột lông vũ thủy phân a) b)

Hình 2.11: Bột thịt xương (a) và bột lông vũ (b)

Bên cạnh đó, nguồn phụ phẩm từ gà đặc biệt là ống khí quản hoặc sụn ức gà có chứa những hợp chất hữu cơ bổ sung vào thực phẩm chức năng nhƣ: Chondroitin sulfate, Hyaluronic acid, Glucosaminoglycans tăng cường hỗ trợ và điều trị bệnh khớp, giúp nâng cao giá trị sử dụng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào nguồn phế phẩm sụn ức gà, nguồn nguyên liệu chƣa đƣợc nghiên cứu và ứng dụng nhiều tại Việt Nam mà chỉ đƣợc xem nhƣ là chất độn để tăng giá thành sản phẩm trên thị trường.

Tổng quan về phương pháp thu nhận CS thô

2.4.1 Ứng dụng của sóng siêu âm thu nhận CS thô

2.4.1.1 Tác động sinh học của sóng siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong quá trình trích ly rắn - lỏng có 3 tác động sinh học chính lên nguyên liệu nhƣ sau:

- Tạo rung: Chuyển động của sóng siêu âm tạo ra rất là nhanh, tác động lên các mô tế bào

19 - Sinh nhiệt: Chuyển động của sóng siêu âm là nguyên nhân chính tạo ra tác dụng nhiệt

- Sự tạo và vỡ bọt: Siêu âm được chiếu xạ qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, gây ra áp suất chân không trong môi trường lỏng Hiện tượng tạo và vỡ bọt xảy ra khi áp suất chân không vƣợt quá so với độ bền kéo của chất lỏng Quá trình này thường bắt nguồn từ những chỗ yếu trong chất lỏng như một lỗ hổng chứa khí phân tán lơ lửng trong hệ

Hình 2.12: Nguyên lý tạo và vỡ bọt khí

Hình 2.12 cho thấy cơ chế sự hình thành, lớn lên và nổ vỡ các bong bóng khí trong pha lỏng: Khi sóng âm gặp chất lỏng, sẽ tạo ra những chu kì gồm 2 pha giãn và nén liên tục, làm xuất hiện bong bóng khí trong pha lỏng [67]

- Trong pha giãn: khí bên ngoài bong bóng đƣợc khuếch tán vào bên trong

- Trong pha nén: bong bóng co lại và khí bị hấp thụ ngƣợc trở lại

Mặt khác các phân tử khí lại tiếp tục bị hấp thụ vào chất lỏng nên kích thước của bong bóng lớn dần qua các chu kì giãn và nén Khi đạt kích thước tối đa, bong bóng nổ vỡ, nhiệt độ có thể đạt 5000 o C và áp suất 2000ats

Hiện tƣợng tạo bong bóng làm tăng quá trình truyền nhiệt và truyền khối trong pha lỏng, tăng cường sự tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, đồng thời tăng sự khuếch tán các chất hòa tan từ nguyên liệu vào dung môi, làm gia tăng hiệu quả trích ly Mặt khác ở bề mặt pha lỏng – rắn xuất hiện sủi bọt khí, tạo ra các vi tia chất lỏng; nếu các vi tia này hướng đến bề mặt nguyên liệu rắn, có thể tạo ra vết rạn nứt và vỡ nguyên liệu, gây

20 ra sự khuấy trộn lớn, làm các hạt pha rắn va chạm mạnh với nhau, gây bào mòn bề mặt hạt nguyên liệu [67]

Tóm lại, quá trình siêu âm gây ra hiện tƣợng xâm thực khí, sẽ làm cho nguyên liệu bị rạn nứt hoặc giảm kích thước, gia tăng sự tiếp xúc nguyên liệu với dung môi, tăng khuếch tán các chất hòa tan dẫn đến tăng động lực của quá trình trích ly

2.4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hình thành vỡ bóng

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình và hiệu quả trích ly bằng sóng siêu âm Chúng bao gồm các thông số liên quan đến:

- Âm trường: tần số sóng âm, cường độ âm, mật độ năng lượng âm … - Nguyên liệu thô: cấu trúc, mức phá vỡ, loại và số lƣợng các chất trích ly

- Đặc tính vật lý dung môi cũng nhƣ điều kiện khảo sát các yếu tố: thời gian, nhiệt độ, pH đệm

2.4.2 Ứng dụng của hệ enzyme protease để thu nhận CS thô

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide ( - CO – NH - ) của các peptide hoặc protein Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển amino acid

Các protease có nguồn gốc động vật cũng đã đƣợc nghiên cứu nhiều nhƣ trypsin, chymotrypsin, pepsin và rennin từ tuyến tuỵ, dạ dày Nhiều protease thực vật nhƣ Papain từ nhựa của thân, lá, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain từ quả, đọt và chồi dứa (Ananas sativa); đã đƣợc nghiên cứu và thu nhận So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt, là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lƣợng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất nên chúng thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng [37], [38]

Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzyme

Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase Các endoprotease cắt các liên kết peptide bên trong các chuỗi polypeptide, trong khi các exopeptidase cắt từng amino acid ở cuối mạch [37]

Hình 2.13: Sơ đồ phân loại protease

- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase đƣợc phân chia thành 2 loại:

+ Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide

+ Carboxypeptide: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành 4 nhóm [37]:

+ Serin proteinase: Gồm các loại protease có các acid amin nhƣ acid asparaginic, histidine và serine trong trung tâm hoạt động Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:

Chymotrypsin và subtilisin Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động

Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật nhƣ papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspatic proteinase: Hầu hết thuộc nhóm pepsin, bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

22 + Metallo proteinase: trung tâm hoạt động chứa ion kim loại và trực tiếp tham gia quá trình xúc tác Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

- Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:

+ Protease acid: pH 2,0÷4,0 + Protease trung tính: pH 7.0÷8,0 + Protease kiềm: pH 9,0÷11,0

2.4.2.3 Cơ chế xúc tác của protease

Hình 2.14: Cơ chế xúc tác của protease

Cơ chế xúc tác của enzyme protease có thể chia làm 3 giai đoạn [37]:

- Giai đoạn đầu: enzyme protease sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng (v) phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất

- Giai đoạn 2: Phức hợp ES sẽ đƣợc tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất

- Giai đoạn 3: enzyme sẽ đƣợc giải phóng và hoạt động tự do Hiện tƣợng này đƣợc xem xét trên cơ sở phản ứng chỉ có một cơ chất duy nhất Nếu nồng độ cơ chất vƣợt quá ngƣỡng cực đại của tốc độ phản ứng thì tốc độ phản ứng không có khả năng tăng lên Ở giai đoạn này các enzyme đã bão hòa cơ chất do đó nó không thể có tốc độ phản ứng cao hơn đƣợc nữa

2.4.2.4 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme Protease đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực [37]:

- Công nghiệp thực phẩm: đông tụ sữa làm phomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, nước mắm

- Y học: Protease thủy phân protein thành các acid amin, có lợi cho tiêu hóa, làm chất giảm đau nhanh sau khi phẫu thuật, giảm đau đối với trường hợp viêm khớp, viêm đa khớp, giảm thời gian tan các vết bầm và chống viêm Dung dịch papain cysteine salicilate có công dụng chữa bỏng, giảm độc tố, trị bệnh bạch cầu và viêm họng

Tổng quan phương pháp tinh sạch từ dung dịch CS thô

2.5.1 Ứng dụng phương ph|p lọc m{ng để tinh sạch CS

“Màng” đƣợc hiểu là những đối tƣợng có cấu trúc phẳng, cho phép một phần nào đó (ít nhất là một cấu tử) trong dòng chất lỏng thấm qua Tất nhiên phần còn lại của dòng sẽ không thấm qua

Hình 2.15: Sơ đồ mô tả quá trình phân riêng bằng màng

Thành của tất cả các tế bào thực vật, động vật và tế bào của con người đều là những màng Những màng này giúp bảo vệ tế bào khỏi tác động bên ngoài, trao đổi chất của tế bào Chúng cho phép “chất” này thấm qua và giữ “chất khác” lại Chẳng hạn nhƣ da của con người và động vật cho phép oxy đi xuyên qua, thành ruột cho phép hấp thu các dinh dƣỡng và các tế bào thận có khả năng thải muối và các chất độc khác Quá trình truyền vận vật chất qua thành tế bào là đặc biệt điển hình cho những quá trình truyền vận chọn lọc cao, chúng đƣợc xem nhƣ là màng tự nhiên [55]

Cũng tương tự như các màng tự nhiên, người ta cũng đã tổng hợp ra nhiều loại màng từ nhiều loại vật liệu khác nhau, có cấu trúc khác nhau, sắp xếp và vận hành khác nhau tùy theo yêu cầu sử dụng chúng

Một “module” màng đƣợc đƣa vào 1 (ít nhất là một) dòng nhập liệu là dòng cần phải phân riêng và 2 dòng tháo liệu là dòng thấm qua và dòng còn lại

Khái niệm “module” đƣợc sử dụng trong kỹ thuật màng bởi vì một thiết bị màng thường bao gồm nhiều module giống hệt nhau Trong công nghiệp người ta sản xuất và sử dụng các module màng phẳng, module màng dạng cuộn (bó), trong đó các màng đƣợc xếp cách nhau một khoảng nhất định; module màng dạng ống và module màng dạng sợi rỗng, trong đó gồm hàng ngàn sợi rỗng đƣợc ghép song song với nhau [55], [56] Độ chọn lọc - Độ chọn lọc của màng, nghĩa là khả năng “phân riêng” các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp ví dụ như rượu với nước, ion muối và nước, của màng

25 - Đƣợc định nghĩa nhƣ là thành phần của sản phẩm thu đƣợc Chẳng hạn với hỗn hợp 2 cấu tử:

Với x là nồng độ của dòng nhập liệu và y là nồng độ của dòng thấm qua (tính theo phần mol) Độ chọn lọc tính theo phần khối lƣợng:

Hình 2.16: Định nghĩa các đại lƣợng quan trọng trong đặc trƣng các loại màng

Dòng - Dòng đƣợc tính trên 1 đơn vị bề mặt và 1 đơn vị thời gian có thứ nguyên là (khối lượng/bề mặt.thời gian) người ta phân biệt dòng tổng thể m  t ' ' ;dòng riêng m  i ' '

Khả năng giữ lại - Đƣợc hiểu là một đại lƣợng đặc trƣng cho đặc tính chọn lọc của màng

- Các kết quả thu đƣợc với các cách tính theo các nồng độ khác nhau có thể nội suy cho nhau, nhƣng có trị số khác nhau

2.5.1.2 Động lực và trở lực phân riêng bằng màng Để tiếp cận với các quá trình phân riêng bằng màng, ta bắt đầu từ định nghĩa:

Dòng = Động lực của quá trình / trở lực của quá trình

Tất cả các công nghệ màng đều không phải là dựa trên cơ sở nhiệt động học, mà là dựa trên cơ sở động học, chẳng hạn độ chọn lọc của chúng (trở lực truyền vận khác nhau) đối với cấu tử Ai và A j Điều đó cho thấy nhiệm vụ cần phải hướng tới của sự nghiệp phát triển kỹ thuật màng là đòi hỏi một sự hiểu biết rõ hơn về sự tương tác giữa màng và hỗn hợp phải phân riêng

Người ta cũng đã khẳng định rằng đối với kỹ thuật màng, nhiệm vụ trọng tâm là nghiên cứu trở lực của quá trình và việc tăng năng suất dòng liên quan mật thiết với mất mát độ chọn lọc và giảm trở lực không chọn lọc (hoặc thậm chí là trở lực chống lại độ chọn lọc) Trên cơ sở trở lực khác nhau đối với các cấu tử và do độ chọn lọc đƣợc thống nhất, chênh lệch động lực của quá trình nói chung sẽ tăng lên, làm cho quá trình phân riêng mà ta mong muốn bị hạn chế Điều đó đặc biệt có thể thấy rõ ở quá trình thẩm thấu ngƣợc, nơi mà dọc theo bề mặt màng, độ tập trung muối và áp suất thẩm thấu tăng lên và làm giảm động lực quá trình truyền vận nước [55]

Quan sát các quá trình màng nhận thấy động lực của quá trình đƣợc thể hiện thông qua nhiều đại lƣợng, chẳng hạn khi quá trình tiến hành với chênh lệch áp suất riêng phần là động lực của quá trình thẩm tách khí (Gas permeation), chênh lệch nồng độ là động lực của quá trình thẩm tách (Dialyse), điện trường bên ngoài là động lực của quá trình điện thẩm tách… Tất cả đó đều là những trường hợp riêng của động lực tổng hợp, là thế hóa học

Các loại màng thương mại thường đã được tối ưu về độ chọn lọc, năng suất, … với những mục đích sử dụng khác nhau và ngày càng bền cơ, bền hóa học,… và ổn định nhiệt hơn Các loại màng sử dụng hiện nay đƣợc chuyên môn hóa theo các yêu cầu, mục đích sử dụng Do đó chất lƣợng và năng suất của màng cũng đƣợc khẳng định đối với từng phương pháp riêng biệt của công nghệ màng [56]

Các màng đƣợc sử dụng một mặt là theo độ lớn hoặc khối lƣợng mol lớn nhất của các cấu tử cần phải tách, mặt khác là theo nguyên lý phân riêng và theo trạng thái tổ hợp của dòng mà nó tiếp xúc

Nói chung người ta phân loại màng trước hết là dựa vào vật liệu chế tạo màng, và cách phân loại đầu tiên là phân loại màng từ các vật liệu sinh học tự nhiên và các màng tổng hợp

Hình 2.17: Sơ đồ phân loại cấu tạo màng

Ngoài ra, người ta cũng có thể chia ra hai loại màng là màng xốp và màng không xốp

- Màng xốp: chủ yếu đƣợc dùng cho vi lọc (Microfiltration-MF) và siêu lọc (Ultrafiltration-UF) Màng cú đường kớnh mao quản từ 0,1 đến 10 àm là cho vi lọc và từ 0,001 đến 0,1 àm là cho siờu lọc Cỏc màng vi xốp nhƣ UF cú thể phõn riờng được các cao phân tử hòa tan, chẳng hạn như tách Albumin khỏi sữa tươi

- Màng không xốp: chủ yếu đƣợc sử dụng cho thẩm thấu ngƣợc (Reverse Osmosis- RO), lọc nano (Nanofiltration-NF) và phân riêng phân tử trong pha khí

Siêu lọc là công nghệ màng đƣợc tiến hành nhờ chênh lệch áp suất liên quan đến vùng phân riêng, nghĩa là độ lớn của các phân tử cũng nhƣ các cấu tử phải phân riêng

Hình 2.18: Phân loại các công nghệ màng tiến hành nhờ chênh lệch áp suất

Vùng làm việc của siêu lọc thông thường nằm trong khoảng chênh lệch áp suất giữa 2 phía màng là 0,5 – 10 bar Trong kỹ thuật siêu lọc, người ta sử dụng các màng đặc biệt là các màng xốp Một cấu tử nào đó có thể đƣợc màng giữ lại hay không ngoài phụ thuộc vào điều kiện làm việc còn phụ thuộc chủ yếu vào tương quan giữa độ lớn của chúng và kích thước cũng như cấu trúc mao quản của màng Độ lớn của mao quản và phân bố mao quản sẽ quyết định quá trình truyền vận trong màng.[55]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Sụn được tách khỏi bộ xương ức, được thu mua ngay tại lò giết mổ ở điều kiện nhiệt độ lạnh, đóng vào các bao PE kín khoảng 5kg, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm Tiến hành ngâm rửa sụn gà trong dung dịch muối NaCl 5%, đồng thời loại bỏ lớp lipid, bụi bẩn bám bên ngoài hoặc sụn không đạt chỉ tiêu Để ráo sụn và đóng bao bì PE 1kg, cho vào tủ đông bảo quản ở điều kiện -18 o C

Tiêu chuẩn đầu vào của sụn

- Kích thước: tương đối đồng đều, chiều dài từ 6 – 7 cm, đầu lớn có dạng hình tam giác, dài 1 đến 1,5 cm, sau đó nhỏ dần

- Khối lƣợng: Khối lƣợng của một mô thịt và sụn từ 9 -11g, phần thịt bám bên ngoài không đồng đều, sau khi loại bỏ lớp mô thịt, lipid bám bên ngoài, khối lƣợng sụn khoảng 3,5 – 4,5 g, chiếm 40 – 45%

- Cảm quan: tươi, màu trắng, thịt bám bên ngoài đỏ thẫm, không có mùi hôi, mùi kháng sinh, không lẫn các tạp chất khác Lớp lipid bám bên ngoài thấp, không đáng kể Không có các vết bầm tím hoặc tụ máu

Một đơn vị Anson là lƣợng enzyme tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hấp thu cực đại ở bước sóng 660nm tương ứng với 1mol tyrosine trong đường chuẩn [37]

Enzyme Alcalase 2,4L đƣợc mua bởi công ty BrennTag Việt Nam, thành phố Hồ Chí Minh, từ hãng (Novozymes, Mỹ) đƣợc sản xuất từ vi khuẩn Bacillus Licheniformis

Enzyme alcalase 2,4L là một endo-protease Hoạt tính ghi trên nhãn 2,4 đơn vị Ason/g; nhiệt độ tối ƣu từ 40÷65 0 C; pH tối ƣu từ 6,0÷8,0; tỷ trọng là 1,17 (g/ml) Chế phẩm Enzyme Alcalase để thí nghiệm được xác định lại hoạt độ theo phương pháp Ason cải tiến trước khi sử dụng, có hoạt độ 60,8 U/ml

Hóa chất và thiết bị

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hóa chất của Sigma – Aldrich, Merk (Đức), Trung Quốc

Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng

STT Tên hóa chất Mục đích sử dụng

1 Chondroitin – Sulfate Chất chuẩn để dựng đường chuẩn 2 1,9 – Dimethylmethylene blue Chất chỉ thị màu cho các thí nghiệm

3 Glycine Chất chỉ thị màu cho các thí nghiệm

4 Folin Xác định hàm lƣợng protein hòa tan

Xác định hàm lƣợng protein hòa tan

Pha dung dịch đệm phosphate

7 Trichloroacetic acid (TCA) Tủa protein

8 NaCl, HCl Pha dung dịch chỉ thị màu

10 Chế phẩm enzyme protease Thủy phân sụn gà, phá cấu trúc protein

Quá trình thu nhận bột CS thô bằng phương pháp siêu âm hoặc trích ly bằng enzyme, do đó thiết bị chính sử dụng là: Thiết bị siêu âm VC 750, tần số và công suất tối đa lần lƣợt là 20kHz và 750W và bể điều nhiệt (có cài đặt nhiệt độ, thời gian)

Quá trình tinh sạch CS đƣợc thực hiện trên thiết bị Cross – flow, với các loại màng lọc PS10, PS20, NF và RO thương mại

Ngoài ra để thực hiện đƣợc các thí nghiệm, chúng tôi còn sử dụng các thiết bị khác nhƣ:

- Máy quang phổ UV-VIS

- Cân điện tử 2 và 4 số lẻ

- Bình định mức 50ml, 100ml, 1000ml

Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS

Nội dung nghiên cứu của luận văn đƣợc chia làm 3 phần chính: Khảo sát quá trình xử lý sụn ức gà để loại bỏ lớp thịt bám bên ngoài bằng phương pháp hóa học, hóa sinh và vật lý; Khảo sát quá trình thu nhận bột CS thô có sử dụng sóng siêu âm để trích ly hoặc chế phẩm enzyme protease hỗ trợ thủy phân; Khảo sát quá trình tinh sạch CS bằng phương pháp lọc màng hoặc phương pháp hóa học

Phần 1: Khảo sát quá trình xử lý sụn ức gà để loại bỏ lớp thịt bám bên ngoài

Mục đích: loại bỏ lớp màng thịt, mô máu, mỡ bám bên ngoài bề mặt sụn dễ dàng nhất nhưng không ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng CS thu hồi (%)

Phần 2: Khảo sát quá trình thu nhận bột CS thô có sử dụng sóng siêu âm để trích ly hoặc chế phẩm enzyme protease hỗ trợ thủy phân

Mục đích: cho thấy sự tác động của các thông số công nghệ trong quá trình xử lý siêu âm hoặc chế phẩm enzyme đến hiệu suất thu hồi CS Dựa vào kết quả, chọn phương pháp xử lí hiệu quả nhất để thu nhận bột CS thô

Phần 3: Khảo sát quá trình tinh sạch CS bằng phương pháp lọc màng hoặc phương pháp hóa học

Mục đích: làm sáng tỏ quy luật ảnh hưởng của các thông số và giải pháp công nghệ đến hiệu quả tinh sạch Chondroitin Sulfate Từ các kết quả thí nghiệm, lựa chọn phương pháp tinh sạch

36 Ngoài ra, chúng tôi còn đánh giá, so sánh một số tính chất của sản phẩm CS tinh sạch so với CS chuẩn và các kết quả của các nhà nghiên cứu khác

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS thô

Phân tích thành phần của sụn ức gà

- Độ ẩm - Protein - Lipid - Tro - Carbohydrat tổng Xác định hoạt tính của enzyme Acalase 2.4L

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệt suất thu hồi CS thô

Quá trình xử lí sụn: NaOH, chế phẩm enzyme Alcalase, chần

Nhiệt độ, pH, tỉ lệ dung dịch/đệm, thời gian siêu âm

Phương pháp thủy phân bằng enzyme Alcalase

- Tỉ lệ sụn: đệm - pH

- Nhiệt độ - Hàm lƣợng enzyme - Thời gian

Tối ƣu hóa các điều kiện thu nhận CS thô

Mode 5, mô hình tối ƣu hóa 4 yếu tố

Lựa chọn phương pháp thu nhận CS thô cao nhất

3.3.2 Sơ đồ nghiên cứu thu nhận CS tinh sạch

Dung dịch CS thô sau khi lọc chân không

Khảo sát phương pháp lọc màng

- Siêu lọc (PS10; PS20) - Lọc nano (NF)

Khảo sát phương pháp hóa học

Tối ƣu hóa điều kiện thu nhận

- Tỉ lệ bột CS thô/ nước - Nồng độ CPC/CTAB - Nồng độ NaCl

Tối ƣu hóa các điều kiện tinh sạch CS

Mode 5, mô hình tối ƣu hóa 4 yếu tố

Lựa chọn phương pháp tinh sạch và thu nhận CS cao nhất

Quy trình thu nhận CS

Hình 3.1: Quy trình thu nhận bột CS thô

 Lựa chọn nguyên liệu sụn ức gà

- Mục đích: Đảm bảo nguyên liệu mang tính đồng nhất để dùng trong nghiên cứu

- Thực hiện: Sụn ức gà đƣợc mua tại công ty Phạm Tôn, cùng một giống gà của một trại chăn nuôi và cùng một lứa (thường từ 38 – 42 ngày tuổi)

- Điều kiện khảo sát: thời gian bảo quản nguyên liệu

- Mục đích: Loại bỏ đi những mẫu thịt vụn còn sót lại trên sụn ức gà

- Thực hiện: Sau khi mua nguyên liệu, sụn đƣợc loại bỏ các mạch máu, mỡ bám bên ngoài và rửa nhanh với dung dịch muối 5%, để ráo và đem bảo quản lạnh đông ở - 18 0 C cho đến khi sử dụng

Khảo sát quá trình xử lý sụn: chần, dung dịch NaOH và chế phẩm enyme Alcalase

- Mục đích: Làm cho cấu trúc của sụn gà mềm để chuẩn bị cho quá trình tiếp theo

Bên cạnh đó vô hoạt hoặc ức chế một số vi sinh vật, vi khuẩn bám bên ngoài

- Thực hiện: Gia nhiệt nước, cho nguyên liệu vào với tỉ lệ cố định tiến hành chần

Sau đó lấy ra làm nguội chuẩn bị cho bước tiếp theo

- Các điều kiện khảo sát: Thời gian quá trình chần

- Mục đích: Bản chất dung dịch NaOH là kiềm, phá hủy lớp màng protein bám bên ngoài

- Các điều kiện khảo sát: nồng độ và nhiệt độ sử dụng

- Mục đích: Sử dụng enzyme Alcalase phá vỡ các liên kết protein bám bên ngoài sụn

- Các điều kiện khảo sát: nồng độ và thời gian thực hiện

Sau đó nguyên liệu sụn ức gà được xử lí các bước sau:

- Mục đích: Lột bỏ màng protein, chất béo bọc bên ngoài sụn

40 - Thực hiện: Thủ công, dùng dao lột màng thịt bám bên ngoài

- Mục đích: giảm kích thước của sụn, tăng diện tích tiếp xúc của sụn với dung dịch đệm, quá trình tiếp theo xảy ra dễ dàng và hiệu quả hơn

- Thực hiện: sử dụng cối xay thịt, nghiền nhỏ nguyên liệu

Khảo sát 2 phương pháp thu nhận CS thô bằng song siêu âm hoặc thủy phân bằng enzyme Alcalase

- Mục đích: Khai thác CS có trong sụn ức gà - Thực hiện: Sử dụng thiết bị siêu âm, tạo sóng siêu âm, hình thành nên hệ bọt và sủi bọt tăng khả năng trích ly CS ra khỏi nguyên liệu

- Điều kiện khảo sát: pH dung dịch, tỉ lệ nguyên liệu : đệm, nhiệt độ và thời gian siêu âm

- Mục đích: Khai thác CS có trong sụn ức gà

- Thực hiện: Quá trình thủy phân đƣợc thực hiện trong bể điều nhiệt có kết hợp lắc đảo 120 vòng/phút nhằm tăng khả năng tương tác giữa enzyme và cơ chất cho quá trình thủy phân hiệu quả hơn

- Các điều kiện khảo sát: Tỷ lệ sụn:đệm, pH, nhiệt độ, hàm lƣợng enzyme/cơ chất, thời gian quá trình thủy phân

- Mục đích: Kiềm hãm sự hoạt động của enzyme nhằm tránh các biến đổi diễn ra sau thủy phân

- Thực hiện: Đun cách thủy các mẫu thủy phân ở nhiệt độ 85 0 C trong vòng 10 phút

Dung dịch sau khi thu được tiếp tục qua các bước xử lí:

- Mục đích: Loại bỏ lƣợng protein không tan trong mẫu nguyên liệu, tinh sạch hàm lƣợng CS hơn

- Thực hiện: Dùng TCA tủa protein hòa tan trong cốc thủy tinh, để qua đêm ở 4 o C

41 - Điều kiện khảo sát: Hàm lƣợng TCA

- Mục đích: Loại bỏ bã sau quá trình tủa protein

- Thực hiện: Dựng giấy lọc kớch thước 15 – 20 àm, thiết bị lọc chõn khụng

- Mục đích: Tăng độ tinh sạch cho chế phẩm CS, loại bỏ các chất có khối lƣợng phân tử nhỏ hơn 14kDa nhƣ acid amin, chất khoáng, muối, TCA có trong mẫu ra ngoài

- Thực hiện: Sử dụng màng thẩm tích làm bằng cellophane, kích thước 100 x 44 mm Cho mẫu vào túi cellophane, đặt vào trong cốc nước cất để 4 tiếng, mỗi tiếng thay nước một lần

- Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình sấy tiếp theo

- Thực hiện: Dùng ethanol (99%) cho vào mẫu theo tỉ lệ khảo sát, để qua đêm ở 5 o C, gạn dung dịch và ethanol thu đƣợc dịch keo

- Mục đích: ly tâm để tạo phân lớp dung dịch hệ keo, thu tủa CS và loại bỏ dung dịch

- Thực hiện: Sử dụng thiết bị ly tâm, thời gian ly tâm 20 phút

- Mục đích: Loại bỏ nước và ethanol đã bổ sung vào trong quá trình trước, thu nhận chế phẩm CS dạng bột thô

- Thực hiện: Tủa đƣợc cho vào tủ sấy ở 55 0 C và thu bột CS thô

3.4.2 Quy trình thu nhận CS tinh sạch

Sấy chân không CS tinh sạch

Hình 3.2: Quy trình thu nhận CS tinh sạch

DD CS thô sau lọc chân không

Thuyết minh quy trình Tinh sạch dung dịch CS thô thu được bằng phương pháp: lọc màng hoặc hóa học

- Mục đích: Loại bỏ phân tử nước, các ion muối khoáng và các hợp chất có KLPT nhỏ hơn kích thước lỗ màng

- Thực hiện: Sử dụng thiết bị lọc màng Cross – Flow, khảo sát 3 màng lọc: siêu lọc, lọc nano và lọc thẩm thấu – RO

- Các thông số kỹ thuật: Xác định chỉ số độ phân riêng của hàm lƣợng carbohydrate, protein và thông lƣợng qua màng, trở lực màng, tỉ lệ loại bỏ protein

- Mục đích: Dùng hóa chất CPC để tạo tủa với GAGs, loại bỏ dung dịch muối, protein, khoáng…

- Thực hiện: Cho lƣợng CPC vào dung dịch CS thô hòa tan, khuấy đều Xuất hiện các kết tủa trắng Tiến hành quá trình ly tâm để thu tủa

- Các thông số kỹ thuật: Khảo sát nồng độ CPC sử dụng

- Mục đích: Rửa tủa lần 1, nồng độ muối sử dụng thấp nên loại đƣợc các thành phần có chứa gốc sulfate có KLPT thấp nhƣ HA

- Cách thực hiện: Pha dung dịch NaCl 0.4 M, cho vào tủa CPC-GAGs, hòa tan hoàn toàn tủa, sau đó tiến hành ly tâm để thu tủa

- Mục đích: Hòa tan tủa thành dung dịch, chuẩn bị cho quá trình tiếp theo

- Cách thực hiện: Cho dung dịch NaCl nồng độ cao vào, tủa tan dần

- Các thông số kỹ thuật: Khảo sát nồng độ của muối NaCl sử dụng

- Mục đích: Loại bỏ phức tủa CPC – KSCN, thu đƣợc dung dịch CS

44 - Cách thực hiện: Cho dung dịch KSCN vào dung dịch sau khi rửa tủa lần 2 Xuất hiện kết tủa CPC-KSCN Tiến hành ly tâm để loại bỏ tủa Thu đƣợc dung dịch CS

- Thông số: Khảo sát nồng độ KSCN sử dụng

- Mục đích: Loại bỏ các ion muối, khoáng còn sót lại - Cách thực hiện: Sử dụng màng thẩm tích 14kDa, cho phép loại bỏ hết các hợp chất có KLPT nhỏ hơn 14kDa Dung môi quá trình thẩm tích sử dụng là nước cất

- Mục đích: Thu bột CS tinh sạch, dễ dàng bảo quản

- Thực hiện: Tiến hành sấy chân không dung dịch sau quá trình thẩm tích

3.4.3 Phương ph|p bố trí thí nghiệm

3.4.3.1 Xử lý nguyên liệu sụn ức gà

Thí nghiệm 1: Xử lý sụn ức gà bằng dung dịch NaOH [13],[23]

Các yếu tố cố định:

- Tỉ lệ nguyên liệu sụn và dung dịch NaOH: 1:10 (w/w dd ) Các yếu tố thay đổi:

- Nồng độ dung dịch NaOH: 0.05M; 0.1M - Nhiệt độ xử lí: 4 o C; 30 o C

- Thời gian xử lí: 1; 2; 3; 4; 5; 6 (giờ) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thất thoát GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 2: Xử lý sụn ức gà bằng chế phẩm enzyme Alcalase [23]

- Tỉ lệ nguyên liệu sụn và dung dịch đệm: 1:10 (w/w dd ) - pH đệm: 7.5

- Nhiệt độ thủy phân: 55 o C Các yếu tố thay đổi:

- Nồng độ enzyme Alcalase: 2; 3; 4 %w/w pro - Thời gian xử lí: 1; 2; 3; 4; 5; 6 (giờ)

45 Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thất thoát GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 3: Xử lý sụn ức gà bằng quá trình nhiệt [10], [23]

- Tỉ lệ nguyên liệu sụn và dung dịch: 1:10 ((w/w dd ) - Nhiệt độ: 100 o C

Các yếu tố thay đổi:

- Thời gian xử lí: 3; 5; 10; 30; 60; 120 (phút) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thất thoát GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Kết luận: Chọn phương pháp có hiệu suất thất thoát GAGs (%) thấp nhất và ứng dụng đƣợc trong sản xuất công nghiệp

3.4.3.2 Thu nhận CS thô bằng phương pháp sử dụng sóng siêu âm

Thí nghiệm 4: Xác định tỷ lệ sụn:đệm thích hợp của quá trình siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs

- pH đệm: 7 - Nhiệt độ siêu âm: 40 o C - Thời gian siêu âm: 10 phút

- Tỷ lệ nguyên liệu sụn : đệm: 1:06; 1:08; 1:10; 1:12; 1:14 (w/w dd ) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 5: Xác định pH dung dịch đệm của quá trình siêu âm đến hiệu suất thu hồi

- Tỷ lệ sụn: đệm: thí nghiệm 4 - Nhiệt độ siêu âm: 40 o C - Thời gian siêu âm: 10 phút

46 Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 6: Xác định nhiệt độ của quá trình siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs thô

- Tỷ lệ nguyên liệu sụn:đệm : Thí nghiệm 4 - pH đệm: Thí nghiệm 5

- Thời gian siêu âm: 10 phút Các yếu tố thay đổi:

- Nhiệt độ siêu âm: 20; 30; 40; 50; 60 ( o C) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 7: Xác định thời gian của quá trình siêu âm đến hiệu suất thu hồi GAGs thô

- Tỷ lệ nguyên liệu sụn : đệm: Thí nghiệm 4 - pH đệm: Thí nghiệm 5

- Nhiệt độ siêu âm: Thí nghiệm 6 Các yếu tố thay đổi:

- Thời gian siêu âm: 0; 5; 10; 15; 20 (phút) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

3.4.3.3 Thu nhận CS thô bằng phương pháp sử dụng protease enzyme

Thí nghiệm 8: Xác định tỷ lệ sụn:đệm thích hợp của quá trình sử dụng enzyme đến hiệu suất thu hồi GAGs thô [23], [41], [42]

- pH đệm: 7 - Nhiệt độ thủy phân: 50 o C - Hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất (%w/w pro ): 3%

- Thời gian thủy phân: 3 giờ Các yếu tố thay đổi:

- Tỷ lệ nguyên liệu sụn : đệm: 1: 04; 1:06; 1:08; 1:10; 1:12; 1:14 (w/w dd ) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 9: Xác định pH dung dịch đệm thích hợp của quá trình sử dụng enzyme đến hiệu suất thu hồi GAGs thô [23], [41], [42]

- Tỷ lệ nguyên liệu sụn : đệm: Thí nghiệm 8 - Nhiệt độ thủy phân: 50 o C

- Hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất (%w/wpro): 3%

- pH dung dịch đệm: 5; 5.5; 6; 6.5; 7; 7.5; 8 Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 10: Xác định nhiệt độ thích hợp của quá trình sử dụng enzyme đến hiệu suất thu hồi GAGs thô [23], [41], [42]

- Hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất (%w/wpro): 3%

- Nhiệt độ thủy phân: 40; 45; 50; 55; 60; 65 ( o C) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 11: Xác định hàm lƣợng enzyme/cơ chất thích hợp của quá trình sử dụng enzyme đến hiệu suất thu hồi GAGs thô [23], [41], [42]

- Nhiệt độ thủy phân: Thí nghiệm 10 - Thời gian thủy phân: 3 giờ

48 - Hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất (%w/w pro ): 2; 3; 4; 5; 6

Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Thí nghiệm 12: Xác định thời gian thủy phân của quá trình sử dụng enzyme đến hiệu suất thu hồi CS thô [23], [41], [42]

- Nhiệt độ thủy phân: Thí nghiệm 10 - Hàm lƣợng enzyme Alcalase/cơ chất (%w/wpro): Thí nghiệm 11

- Thời gian thủy phân: 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6 (giờ) Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất thu hồi GAGs (% chất khô nguyên liệu)

Kết luận: Chọn phương pháp thu nhận CS thô có hiệu suất thu hồi cao nhất

Thí nghiệm 13: Tối ƣu hóa điều kiện thu nhận CS thô cao nhất Để xác định được các kết quả tối ưu từ các thí nghiệm tương tác của các yếu tố đến hàm mục tiêu, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology – RSM) và phần mềm Modde 5.0 để xử lý kết quả [52]

Phương pháp bề mặt đáp ứng là tập hợp các mô hình toán học và thống kê, liên quan giữa việc xử lý số liệu và thành lập phương trình hồi quy để mô tả các thông số đầu vào tới tính chất của sản phẩm Đây là phương pháp hữu hiệu trong việc tối ưu các quá trình chế biến thực phẩm.[49], [52]

Kế hoạch hỗn hợp bậc hai tâm xoay đƣợc sử dụng khi xác định các hệ số của phương trình hồi quy Để kế hoạch hỗn hợp là xoay tâm, giá trị cánh tay đòn α chọn từ điều kiện: α = 2 k/4

Số điểm ở tâm theo kế hoạch n 0 đƣợc tăng lên 7 để ma trận không suy biến, do vậy nên kế hoạch này sẽ tránh đƣợc sai số khi xác định hàm mục tiêu Y ở các điểm thí nghiệm của bề mặt biểu diễn Mô hình thí nghiệm đƣợc thực hiện theo mô hình toán của phần mềm Modde 5.0

49 Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm với 4 yếu tố khảo sát nhƣ bảng 3.2 Trong đó, các giá trị 0; –1 và +1 lần lƣợt là các giá trị ở tâm và biên của các biến đƣợc xét trong thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm Giá trị –α và +α đƣợc xác định dựa vào quy tắc đòn bẩy Các giá trị x 1 ; x 2 ; x 3 ; x 4 là các biến số cần tối ƣu Trong quá trình thực hiện cần chú ý Q 2 và R 2 , chúng sẽ cho biết mức độ tin cậy của mô hình thí nghiệm R 2 là độ biến thiên của biến thật, Q 2 là độ biến thiên của biến ảo Trong đó, R 2 > 0,8 và Q 2 > 0,5 và độ sai lệch của chúng là [0,2÷0,3] cho thấy giá trị hồi quy là có ý nghĩa và mô hình đáng tin cậy [52]

Bảng 3.2: Bảng quy hoạch cấu trúc có tâm xoay cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng

Theo phương pháp trực giao cấp hai, bốn yếu tố ảnh hưởng thì phương trình hồi quy đƣợc biểu diễn nhƣ sau:

Các kết quả của phương trình hồi quy được tìm ra từ việc giải phương trình trong Modde 5.0 chỉ là các biến mã hóa (nhận khi giá trị p < 0,05), do đó cần chuyển sang biến số thực nhƣ sau:

Z j : giá trị thật của yếu tố gọi là biến thực x j : giá trị mã hóa của yếu tố gọi là biến mã hóa x 0 : giá trị mức cơ sở

Kết quả và bàn luận

Thành phần cơ bản của sụn ức gà

Hình 4.1: Sụn gà chƣa xử lí (a) và xử lí màng thịt bên ngoài (b)

Sụn ức gà đƣợc làm sạch lớp mô thịt, mỡ, màng liên kết giữa mô và sụn rồi đem phân tích về thành phần hóa học cơ bản (Bảng 4.1)

Bảng 4.1: Các thành phần hóa học trong sụn ức gà

Tên chỉ tiêu Hàm lƣợng (%) Ẩm 79,1 ± 1,35 1

Kết quả của bảng 4.1 cho thấy nguyên liệu nghiên cứu có hàm lƣợng ẩm chiếm 79,1% và hàm lƣợng chất khô chiếm 20,9% gồm 11,8% protein; 1,42% tro; 7,68% carbohydrate; không phát hiện lipid Qua đó ta có hàm lƣợng protein và carbohydrate tính theo chất khô trong nguyên liệu chiếm khoảng 56,46% và 36,75%

Kết quả này cho thấy điểm tương đồng với kết quả phân tích của S C Shin và cộng sự (2006) về hàm lƣợng protein là 11,78%; hàm lƣợng béo là 0,29%; hàm lƣợng tro là 1,21% Kết quả có sự khác biệt về hàm lƣợng ẩm là 82,85% và hàm lƣợng carbohydrate là 3,87%, có thể xem nhƣ là nguồn nguyên liệu khác nhau [27]

Khảo sát các quá trình xử lý sụn ức gà

4.2.1 Xử lí sụn ức gà bằng dung dịch NaOH

Mục đích: Loại bỏ lớp thịt bám bên ngoài sụn Các yếu tố cố định:

- Tỉ lệ nguyên liệu sụn:dung dịch NaOH: 1 : 10 (w/v dd )

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hiệu suất thất thoát GAGs Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý NaOH đến hiệu suất thất thoát GAGs

Quá trình xử lí nguyên liệu tươi

Thời gian xử lí (giờ)

Hiệu suất thất thoát GAGs (%)

Hiệu suất th ất t h o át G A G s (% )

NaOH 0.05M, T=4oCNaOH 0.1M, T = 4oCNaOH 0.1M, T = 30oCNaOH 0.05M, T0oC

Ghi chú: Giá trị biểu diễn là trung bình lặp lại 3 lần, lấy 2 chữ số thập phân ± độ lệch chuẩn Những giá trị nghiệm thức có các ký tự giống nhau không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê với mức ý nghĩa p