1.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - High Performance Liquid Chromatography 1.2.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng hiệu năng cao H
TỔNG QUAN
Tổng quan về Chondroitin Sulfate (CS)
Từ thập niên 70, một số nghiên cứu của các nhà khoa học xác minh rằng sụn cá mập có chứa các hoạt chất có khả năng ức chế hệ miễn dịch, giúp giảm nhẹ các chứng miễn dịch như thấp khớp, đau nhức xương (phong thấp), vẩy nến, chàm (eczema), luput đỏ, [5]
Từ sụn cá mập người ta đã chiết rút ra Chondroitin sulfate (CS) - một loại glycosaminoglycan (GAG) tạo ra từ cơ thể bằng sự phối hợp giữa glucose với glutamine nhờ enzyme tổng hợp glucose [26] GAG tham gia vào cấu trúc tế bào, có trong thành phần của sợi collagen các mạch máu lớn, chiếm tỷ lệ lớn trong chất căn bản của mô sụn và xương, đảm bảo cho sụn và xương không những có độ chắc mà còn có tính đàn hồi, đồng thời là nguyên liệu quan trọng trong tái tạo mô sụn, xương, cải tạo chức năng xương [12] Thêm vào đó CS còn được tìm thấy trong hoạt dịch, chất lỏng bao quanh khớp, giúp bôi trơn khớp Sụn cá mập bảo vệ xương khớp bằng cơ chế ức chế men phá hủy chất sụn trong khớp [8] Từ đó CS còn được điều chế thành thuốc và sử dụng như chất bổ sung hàng ngày trong điều trị các bệnh về xương khớp [1] Đối với mắt, CS có tác dụng quan trọng trong cấu trúc trong suốt và đàn hồi của giác mạc, duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của mắt Các nhà nghiên cứu đã cho thấy CS có trong thành phần của phim nước mắt, góp phần bảo vệ tế bào biểu mô giác mạc Khi được nhỏ vào mắt, CS có tác dụng tạo nên một lớp chất nhầy giữ cho nước mắt lưu lại trên bề mặt nhãn cầu lâu hơn, chống khô mắt Với phát hiện này, CS được dùng trong thuốc nhỏ mắt để phòng ngừa và điều trị các tình trạng khô mắt Ngoài ra, CS còn được sử dụng để điều chế chất nhầy, một chất thường dùng trong phẫu thuật lấy thủy tinh thể và đặt thủy tinh thể nhân tạo nhằm bảo vệ biểu mô và nội mô của giác mạc [5]
1.1.1 Đặc điểm và cấu trúc của CS
CS được phát hiện và lần đầu tiên được tách chiết từ những năm 60 do Davidson và Meyer CS thuộc nhóm chất heteropolysaccharide gọi là glycosaminoglycan (GAG) ngoại bào được tìm thấy trong tự nhiên như một polyme mạch thẳng gồm các đơn vị cơ bản cấu tạo bởi 2 gốc đường (disaccharide) N- acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và D-glucuronic acid (GlcA) xen kẽ nhau (polymeric D-galactosamine and D-glucuronic acid), các gốc đường này được sulfate hoá hay không bị sulfate hoá [16], một số gốc GlcA bị epime hoá thành L- iduronic acid (IdoA) CS là một polyme có phân tử lớn gồm 15 - 150 đơn vị cấu trúc 2 đường đơn của GlcA và GalNAc Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10 – 100 kD [18]
Bernfield (1999) đã nhận thấy CS thường gắn với các protein bằng liên kết o- glycoside tạo thành một proteoglycan (PG) (glucoprotein), là hợp chất hữu cơ thuộc nhóm mucopolysaccharide [11]
Sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO4) 2- của gốc đường với các nhóm carboxyl (COO - ) của gốc đường acid làm cho phân tử Chondroitin sulfate có mật độ điện tích âm rất cao (anionic polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu tạo của PG Chuỗi CS được gắn với nhóm _OH của gốc serine ở một số protein Các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được làm sáng tỏ GAG được tổng hợp trong mạng nội bào và trong thể Golgi Sự gắn kết của chuỗi GAG bắt đầu với 4 gốc đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-
Gal-GlcA, xylose được gắn với protein trong mạng lưới nội bào, còn các phân tử đường khác được gắn trong hệ Golgi [29]
CS ưa nước vì thế hàm lượng nước trong mô sụn cao Các điều kiện thủy phân cũng có thể làm giảm khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm thu được
Mỗi phân tử đường có thể không bị sulfate hoá hoặc bị sulfate hoá 1 hay 2 lần Đa phần nhóm _OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được sulfate hoá, đối với một số chuỗi GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA Quá trình sulfate hoá là nhờ các enzyme sulfotransferase đặc hiệu Việc sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính sinh học đặc thù của CS
Trong cơ thể sống, các PG và GAG giữ vai trò quan trọng trong nhiều quá trình khác nhau như: điều hòa hoạt động của enzyme và sự bám dính, phát triển và di thực của tế bào [20], [28], [30] GAG còn có chức năng cấu trúc và điều khiển trong cơ thể sống Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mô sụn (như một aggrecan) Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết với protein trong mô tế bào nhờ có điện tích âm, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hoà các hoạt động của tế bào
Phân tử PG của mô sụn (chứa khoảng 80 - 100 mạch CS) cùng với protein gắn kết và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất cần thiết cho sụn để chống lại sự ép nén với sự biến dạng nhỏ nhất [16]
Công thức hoá học của CS (C14H21NO14S)n :
Hình 1 1: Cấu trúc hoá học của một đơn vị trong chuỗi CS
Chondroitin-4-sulfate: R1 = H; R2 = SO3H; R3 = H Chondroitin-6-sulfate: R1 = SO3H; R2 = H, R3 = H
Hình 1 2: Cấu trúc mạch của các CS
CS có 3 loại chính là A, B và C, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm sulfate trong nhóm disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide:
CS A: gốc sulfate gắn ở vị trí C-4 (Chondroitin-4-sulfate, CS4), có nhiều ở mô sụn, CS có thể kết hợp với protein tạo nên Chondromucoid
CS C: gốc sulfate gắn ở vị trí C-6 (Chondroitin-6-sulfate, CS6)
CS B: acid iduronic thay thế acid glucuronic
Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn động vật có vú (bò và lợn), ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các loài cá sụn (cá mập, cá đuối )
Tuy nhiên CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, chúng chứa ở mức độ nhiều hay ít một số lượng các isome của CS, có tới 16 n isome của CS, phụ thuộc vào sự thay đổi vị trí sulfate hoá của các cặp đường đôi tạo nên 16 isome/mỗi cặp [25] Trong đó CS A và CS C là những thành phần chủ yếu hình thành PG [29]
Chondroitin Sulfate A ((GlcA-GalNAc-4S); CS4)
Chondroitin Sulfate B ((IdoA-GalNAc-4S); CS4)
Tên cũ là dermatan sulfate (iduronic acid thay cho glucuronic acid), thường có nhiều ở da, còn thấy có ở van tim, gân, thành mạch Vị trí bị sulfate hoá ở C-4 của GlcNAc và C-5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid
Chondroitin Sulfate-C ((GlcA-GalNAc-6S); CS6)
CS được tách chiết trước khi cấu trúc của nó được xác định Vì vậy tên gọi của CS cũng có sự thay đổi Ngoài ra còn có CS D và E Phân loại các CS được tóm tắt trong bảng 1.1
Bảng 1 1: Phân loại CS Tên Vị trí bị sulfate hoá Tên phân loại
Carbon 4 của đường -N- acety-D-galactosamine (GalNAc)
Chondroitin-4-sulfate (CS4); ở người có trong: sụn khớp, giác mạc, da, thành mạch
Carbon 4 của GalNAc - L-iduronic acid Chondroitin-4-sulfate (CS4)
Chondroitin sulfate C Carbon 6 của GalNAc
Chondroitin-6-sulfate (CS6); trong thành phần của sụn và da
Chondroitin sulfate D Carbon 2 của glucuronic acid and 6 của GalNAc
Chondroitin sulfate E Carbon 4 và 6 của
CS tinh chế là chất bột màu trắng hoặc trắng ngà, hòa tan tốt trong nước, rất dễ hút ẩm; nhưng không hoà tan trong ethanol, methanol, acetone Khối lượng phân tử của CS nguyên liệu thường được sử dụng trong chế phẩm thuốc là thấp hơn, khoảng 15 20kDa [29]
CS là thành phần cơ bản của proteoglycan chứa trong xương sụn Có hai loại sụn là sụn khớp và sụn chêm Thành phần hoá học của cả hai loại sụn nêu trên đều bao gồm hai pha chủ yếu là pha lỏng bao gồm nước và các chất điện phân, pha rắn do các đại phân tử tạo thành gồm sợi collagen (collagen loại II trong sụn chêm và loại I trong sụn khớp), proteoglycan và tế bào sụn (chondrocytes) Tế bào sụn tạo nên chất cơ bản (matrix) của sụn [16]
Bảng 1 2: Thành phần chính của mô sụn
Sụn khớp 68,0 - 85,0 10,0 - 20,0 ( loại I) 5,0 - 10,0 Sụn chêm 60,0 - 70,0 15,0 - 25,0 ( loại II) 1,0 - 2,0
Bảng 1 3: Hàm lượng CS từ các nguồn sụn khác nhau
STT Nguyên liệu C4S (%) C6S (%) Loại CS
1 Vây cá mập 9,60 ± 1,05 8,76 ± 0,96 CS6, CS4
Sụn lưỡi 14,84 ± 0,38 Xương sườn 5,56 ± 0,96 13,54 ± 0,35 CS6, CS4
Xương ức 11,55 ± 0,88 10,54 ± 0,80 CS6, CS4 Cổ họng 9,51 ± 1,99 8,68 ± 1,81 CS6, CS4
4 Xương lưỡi hái của gà 14,08 ± 2,51 3,38 ± 4,74 CS4, CS6
5 Sụn mũi bò 11,50 CS4, CS6
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High
Performance Liquid Chromatography) 1.2.1 Khái niệm về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế : hấp phụ, phân tán, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hóa học trên bề mặt [3], [4]
1.2.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của của quá trình sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thường hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion
Khi đặt chất phân tích lên đầu cột pha tĩnh rồi cho pha động liên tục đi qua cột chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng các tương tác:
- Tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh (F1)
- Tương tác giữa chất phân tích và pha động (F2)
- Tương tác giữa pha tĩnh và pha động (F3)
Trong đó tương tác F1 và F2 đóng vai trò quyết định [3], [4]
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
- Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn - Sắc ký phân bố
- Sắc ký rây phân tử Trong đó, sắc ký phân bố được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (< 3kD) [3], [4]
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường và sắc ký pha đảo
- Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực Sắc ký pha thường dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm
- Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo Dung môi sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, sắc ký pha đảo được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thường
1.2.4 Detector hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV – Vis)
Là loại detector thông dụng nhất trong HPLC Nguyên tắc của detector này là pha động từ cột đi ngang qua tế bào đo được chiếu một chùm tia tử ngoại hay khả kiến Detector này có tính chọn lọc vì chỉ phát hiện được các chất tan hấp thu tia UV hay khả kiến như các alken, alkine, hợp chất thơm và các hợp chất có nối đa giữa C và O, N hay S Dung môi dùng trong trường hợp này phải hấp thu rất ít hay không hấp thu tia bức xạ và chỉ được phép chứa một lượng cực nhỏ các tạp chất hấp thu trong vùng tử ngoại
Sự hấp thu các tia bức xạ bởi các chất tan được mô tả bằng định luật Beer – Lambert:
IO và I: cường độ tia tới và tia ló
: hệ số tắt phân tử C: nồng độ chất tan (mol/l) l: bề dày cốc đo (cm)
Các detector UV – Vis có thể có bước sóng cố định hoặc hoặc biến đổi được
Các detector có bước sóng biến đổi được sử dụng nguồn chiếu xạ là một đèn neon deuteri và/ hoặc một sợi đèn tungsten và có thể vận hành trong vùng sóng 190 –
Các ưu điểm của detector UV – Vis là:
- Độ nhạy khá cao, khoảng 10 -6 g/ml
- Ít phụ thuộc các thay đổi điều kiện (nhiệt độ, tốc độ, dòng )
- Rẻ tiền so với các detector khác
Tuy nhiên, detector này cũng có các nhược điểm như sau:
- Chỉ phát hiện được các chất tan hấp phụ trong vùng tử ngoại gần bước sóng của detector
- Đòi hỏi dung môi phù hợp và tinh khiết
1.2.5 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo
Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:
- Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng - lỏng
- Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết
Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng - lỏng vì một số nguyên nhân sau:
- Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng - lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích
- Do pha tĩnh của sắc ký lỏng - lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi
Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này
Bề mặt cỏc hạt silica SiO2 (cỏc hạt này cú đường kớnh 3, 5 hoặc 10àm) được xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày để tạo ra những nhúm –SiOH như sau (thụng thường chỉ cú khoảng 8àmol –SiOH/m 2 bề mặt):
Hình 1 6: Bề mặt silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các organochlorosilane để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào
Hình 1 7: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích nói chung và thẩm định phương pháp HPLC nói riêng là tiến trình thực hiện các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để chứng tỏ các đặc tính thực hành của phương pháp đạt yêu cầu đối với loại phân tích đã định
Theo bộ hồ sơ kỹ thuật chung Asean Common Technical Requirements (ACTR) là bộ tài liệu hướng dẫn hồ sơ đăng ký thuốc đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật chung của Hiệp hội các nước Đông Nam Á (ASEAN) được quy định tại phụ lục I Bộ hồ sơ kỹ thuật chung ASEAN và các hướng dẫn kỹ thuật ban hành kèm theo thông tư này [10], các đặc tính thực hành tiêu biểu của một phương pháp phân tích gồm có:
- Tính đặc hiệu - Tính tương thích hệ thống - Tính tuyến tính
- Khoảng áp dụng - Giới hạn phát hiện - Giới hạn định lượng - Độ đúng
- Độ chính xác - Độ bền - Độ thô
1.3.1 Tính đặc hiệu (tính chọn lọc)
Tính đặc hiệu là khả năng xác định một cách chắc chắn một chất cần phân tích khi có sự có mặt các thành phần khác, chẳng hạn như tạp chất, các sản phẩm giáng hóa và các thành phần hỗn hợp Ý nghĩa của tính đặc hiệu:
- Định tính: đảm bảo sự nhận danh chất cần phân tích
- Xác định độ tinh khiết: đảm bảo phương pháp phân tích thực hiện cho phép xác định chính xác hàm lượng tạp chất trong mẫu phân tích
- Định lượng: phải cung cấp một kết quả chính xác về hàm lượng hay hiệu lực của chất cần phân tích có trong mẫu thử
1.3.2 Tính tương thích hệ thống
Tính tương thích hệ thống của phương pháp phân tích dùng để xác định chắc chắn rằng độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc ký đủ để tiến hành quá trình phân tích Các thử nghiệm được dựa trên cơ sở theo đó các yếu tố về thiết bị, thành phần cấu tạo điện tử, vận hành phân tích và các mẫu đưa vào phân tích tạo thành một hệ thống tương thích với nhau
1.3.3 Tính tuyến tính – Khoảng xác định
Tính tuyến tính của một phương pháp phân tích là khả năng có thể rút ra các kết quả thực nghiệm bằng phương pháp đo một cách trực tiếp, hoặc bằng một sự chuyển đối toán học cho biết sự tỷ lệ của hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu thử trong vòng một khoảng đã cho Trong cả hai trường hợp, giữa đại lượng đo được và nồng độ phải thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính Tính tuyến tính được thể hiện bằng hệ số tương quan R
Khoảng cách giữa nồng độ trên và dưới của chất phân tích trong mẫu thử
(bao gồm cả các nồng độ này) Trong khoảng nồng độ này, quá trình phân tích đã được chứng minh đáp ứng độ chính xác, độ đúng và tính tuyến tính
Khoảng xác định thường được lấy từ những nghiên cứu tính tuyến tính và phụ thuộc vào việc ứng dụng dự định của quy trình để định lượng mẫu thử chứa chất phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng ở 2 cực (cực đại và cực tiểu) của khoảng xác định của quy trình phân tích
1.3.4 Độ đúng Độ đúng của một phương pháp phân tích là sự sát gần của các kết quả thử nghiệm bằng phương pháp đó với giá trị thật sự Độ đúng của một phương pháp phân tích phải được xác định trong suốt khoảng thời gian áp dụng của phương pháp
1.3.5 Độ chính xác Độ chính xác của một phương pháp phân tích là mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm cá thể khi phương pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu Độ chính xác của phương pháp phân tích được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (standard deviation – SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation – RSD) của một loạt các lần đo đạc Độ chính xác có thể được xác định dựa vào độ sao chép (reproducibility) hay độ lặp lại (repeatability) (tức là hệ số biến thiên – coefficient of variation) của phương pháp phân tích tiến hành trong điều kiện thường Độ sao chép liên hệ đến việc sử dụng cùng phương pháp phân tích tại nhiều phòng thí nghiệm, độ chính xác trung gian (intermediate precision) thể hiện các sai biệt trong một phòng thí nghiệm, như thử nghiệm vào các ngày khác nhau và thiết bị khác nhau trong một phòng thí nghiệm, trong khi độ lặp lại đánh giá việc áp dụng phương pháp phân tích trong cùng một phòng thí nghiệm trong một thời gian ngắn với cùng thiết bị và kiểm nghiệm viên
1.3.6 Giới hạn phát hiện – Giới hạn định lượng
Giới hạn phát hiện (limit of detection – LOD) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết để có thể định lượng được
Giới hạn định lượng (limit of quantitation – LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp LOQ là một thông số của phép định lượng các chất có nồng độ thấp trong mẫu thử, đặc biệt thường được dùng để xác định tạp chất và/hoặc sản phẩm phân hủy
Không có các mức giới hạn bắt buộc phải đạt được đối với các giá trị LOD và LOQ của mỗi phương pháp Phương pháp xác định LOD và LOQ tùy thuộc vào quy trình phân tích là phương pháp phân tích dụng cụ hay không dụng cụ Ngoài các phương pháp nêu ra dưới đây, các phương pháp khác cũng có thể được chấp nhận
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu đường nền
- Dựa vào quan sát thực nghiệm - Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính
+ Dựa vào độ lệch chuẩn của mẫu trắng + Dựa vào đường chuẩn
- Các dữ liệu cần có:
+ Giá trị LOD, LOQ + Cách xác định LOD Nếu dựa vào quan sát hoặc dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu thì cần đưa ra sắc ký đồ có liên quan
+ Nếu ước tính LOD bằng tính toán hoặc bằng ngoại suy thì sau đó những ước tính này cần được đánh giá bằng cách phân tích độc lập một số lượng mẫu thử thích hợp có nồng độ đã biết gần hoặc bằng với LOD
+ Cách xác định LOQ: LOQ sau đó cần được đánh giá bằng cách phân tích một số lượng mẫu thử thích hợp có nồng độ đã biết gần hoặc bằng với LOQ
Xác định LOD và LOQ dựa vào hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính
Giá trị LOD và LOQ của phương pháp được xác định theo công thức sau:
LOD =3,3 x S a LOQ x S a S: Độ lệch chuẩn của đáp ứng a: Hệ số góc của phương trình hồi quy tuyến tính
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị
Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất và thuốc thử dùng trong nghiên cứu được trình bày ở các bảng
Bảng 2 1: Các chất chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Mục đích sử dụng Nơi sản xuất Số kiểm soát
1 Chondroitin sulfate sodium Chất chuẩn Sigma – Aldrich
2 Glucosamin HCl Chất chuẩn Sigma – Aldrich
Bảng 2 2: Các chế phẩm chứa CS sử dụng trong nghiên cứu
STT Mẫu Dạng chế phẩm Xuất xứ Hàm lượng nhãn
1 Chondroitin sulfate Bột Alokik Herbal
2 Healthy Joint Plus Viên nén
3 Tobicom Viên nang Dược phẩm ICA -
Bảng 2 3: Các thuốc thử và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Độ tinh khiết Nơi sản xuất
3 Muối Sodium octane sulfonic acid PA Merck, Đức
4 Triethylamine GR PA Merck, Đức
5 Acid phosphoric PA Merck, Đức
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị chính và cấu hình hệ thống HPLC - Hitachi dùng trong nghiên cứu được trình bày ở các bảng 2.4 và 2.5
Bảng 2 4: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Mục đích sử dụng Nơi sản xuất
1 Cân phân tích 4 số lẻ Cân chuẩn Shimadzu AUW
2 Cân kỹ thuật Cân hóa chất Sartorius - Đức
3 Máy đo pH đo pH Hanna Instruments
4 Máy đo UV Đo độ hấp thu Shimadzu, Đức
5 Máy khuấy từ Khuấy hóa chất Sartorius - Đức
6 Bộ lọc hút chân không Lọc pha động Glassco-Anh
7 Bể siêu âm Siêu âm mẫu Elma S180H - Đức
8 Tủ lạnh Bảo quản mẫu Samsung - Hàn
9 Màng lọc cellulose acetate 0,45m Lọc đệm Sartorius - Đức
10 Màng lọc sartolon polyamid 0,45m Lọc đệm Sartorius - Đức
11 Đầu lọc Nylon Syringe Filter 0,45m Lọc mẫu Sartorius - Đức
12 Đầu lọc PTfe Syringe Filter0,45m Lọc mẫu Sartorius - Đức
13 Bình định mức 20, 25, 50, 100ml Schott Duran, Đức
14 Pipet chính xác 1, 2, 3, 5, 10ml Schott Duran, Đức
Bảng 2 5: Cấu hình hệ thống HPLC Hitachi
STT Bộ phận Model Nơi sản xuất
2 Bơm 4 kênh HITACHI 5110 Nhật Bản
4 Detector UV-Vis HITACHI 5420 Nhật Bản
5 Buồng ổn nhiệt cột HITACHI 5310 Nhật Bản
6 Phần mềm điều khiển và xử lý kết quả EZ Chrom Elite Nhật Bản
Nội dung nghiên cứu
Xây dựng quy trình phân tích định lượng CS trong nguyên liệu dạng bột tinh sạch dùng trong dược phẩm, các chế phẩm dược và thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường Việt Nam bằng phương pháp HPLC
3 Thẩm định phương pháp phân tích
Xác định tính đặc hiệu, độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp theo tiêu chuẩn bộ hồ sơ kỹ thuật chung ACTR (2008) [10]
2 Khảo sát các điều kiện sắc ký
Xác định dung môi hòa tan hoàn toàn mẫu nguyên liệu và các chế phẩm viên nén, viên nang cứng
- Ảnh hưởng của bước sóng phát hiện
- Ảnh hưởng của nồng độ từng thành phần của hệ pha động: Muối Sodium Octane sulfonic acid – TEA –
H3PO4 – H2O; pH pha động, tỷ lệ dung môi – pha động
- Ảnh hưởng của tốc độ dòng
- Ảnh hưởng nhiệt độ lò cột - Ảnh hưởng thể tích tiêm Điều kiện sắc ký tối ưu để peak CS phải tách rời hoàn khỏi các peak tạp với hệ số phân giải RS 1,5, peak nhỏ gọn, hệ số đối xứng (AS) 0,8 AS
1,5 và có thời gian phân tích ngắn
1 Xử lý mẫu nguyên liệu và chế phẩm
4 Ứng dụng Ứng dụng quy trình phân tích xây dựng để định lượng CS trong nguyên liệu tinh sạch, các chế phẩm dược và thực phẩm chức năng.
Quy trình nghiên cứu
Dựa vào đặc tính hóa lý và tham khảo các tài liệu nghiên cứu định lượng CS bằng phương pháp HPLC [14], [15, [17], [24], [31], nhận thấy CS tan hoàn toàn trong nước Vì vậy, tôi lựa chọn quy trình xử lý mẫu như sau:
2.3.1.1 Đối với dung dịch chuẩn
Vì mục tiêu nghiên cứu của đề tài là xây dựng quy trình định lượng CS trong nguyên liệu và các chế phẩm dược, mà hiện nay các chế phẩm có chức năng hỗ trợ xương khớp đều được bào chế gồm hai thành phần chính là CS và Glucosamin HCl
Hai chất này đều tan tốt trong nước và có bước sóng hấp thu gần nhau [24] Trên cơ sở đó, tôi định hướng khảo sát các điều kiện sắc ký sao cho các peak này tách hẳn nhau Vì vậy dung dịch chuẩn tôi sử dụng gồm CS và Glucosamin HCl
Dung dịch chuẩn đơn CS 0,4mg/ml
Cân chính xác lượng chuẩn tương đương với 20mg CS vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 30ml nước, lắc nhẹ Siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng, định mức bằng nước, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45àm trước khi phõn tớch bằng HPLC
Dung dịch chuẩn kép CS (0,4mg/ml) – Glucosamin HCl (0,5mg/ml)
Cân chính xác lượng chuẩn tương đương với 20mg CS và 25mg Glucosamin HCl vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 30ml nước, lắc nhẹ Siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phũng, định mức bằng nước, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45àm trước khi phân tích bằng HPLC
2.3.1.2 Đối với chế phẩm nguyên liệu dạng bột
Cân chính xác lượng bột tương đương với 20mg CS so với hàm lượng trên nhãn vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 30ml nước, lắc nhẹ Siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phũng, định mức bằng nước, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45àm trước khi phân tích bằng HPLC
2.3.1.3 Đối với chế phẩm viên nén, viên nang
Cân khối lượng 20 viên, xác định khối lượng trung bình 1 viên Nghiền mịn bột thuốc, cân lượng bột tương ứng với 20mg CS so với hàm lượng trên nhãn vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 30ml nước, lắc nhẹ Siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phũng, định mức bằng nước, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45àm trước khi phõn tớch bằng HPLC
2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký
Các nghiên cứu gần đây đã sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha đảo ghép cặp ion (Reversed-phase Ion-pair Chromatography – RP-IPC) sử dụng muối
Natri octane sulfonic acid để định lượng CS [24], [31] Trong sắc ký phân bố pha đảo, cột C8 và C18 là hai loại cột thường được sử dụng để phân tích Tuy nhiên, đối với sắc ký phân bố pha đảo ghép cặp ion, quá trình sắc ký lại phụ thuộc nhiều vào loại và nồng độ muối ion nên việc khảo sát lựa chọn cột C8 hoặc C18 không cần thiết [21]
Do đó, tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký phân bố pha đảo ghép cặp ion, sử dụng cột hiện có là cột ODS C18 (Octadecylsilane) (250 x 4,6mm, 5m) ở bước sóng phát hiện có độ hấp thu cực đại để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thõa mãn các yêu cầu sau: peak CS phải tách rời hoàn khỏi các peak tạp với hệ số phân giải
R S 1,5, peak CS nhỏ gọn, hệ số đối xứng (A S ) 0,8 A S 1,5 và có thời gian phân tích ngắn theo tiêu chuẩn kỹ thuật chung ACTR (2008)[10]
Dựa vào các tài liệu tham khảo [24], [31] kết hợp với hệ thống trang thiết bị, nguyên vật liệu, hóa chất hiện có, tôi lựa chọn điều kiện sắc ký ban đầu như sau:
- Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi với detector UV–Vis–5420 - Cột sắc ký: InertSustain ODS C18 (250 x 4,6mm, 5m) - Dung dịch đệm pH 4,0: Muối Sodium octane sulfonic acid (0,6g/l) +
TEA (1,5ppm) chỉnh pH hệ đệm bằng acid phosphoric về pH = 4,0
- Tỷ lệ Đệm – ACN: 85 - 15 - Tốc độ dòng hệ pha động: 0,5ml/phút - Nhiệt độ lò cột: 25 o C - Thể tớch tiờm: 20àl - Thời gian sắc ký: 10 phút
Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký
Bước sóng phát hiện: 200 đến 410nm Chọn bước sóng cho độ hấp thu CS cực đại X (nm)
Hệ pha động: Muối Sodium Octane sulfonic acid + H 2 O + TEA Chỉnh pH hệ pha động bằng H3PO4
Các điều kiện được cố định : Bước sóng: Xnm
Nhiệt độ lò cột: 25 o C Thể tớch tiờm: 20àl Thời gian sắc ký: 10 phút
Bảng 2 6: Các điều kiện khảo sát hệ pha động của quá trình sắc ký
Thông số khảo sát Điều kiện khảo sát Các điều kiện khác
Lựa chọn điều kiện thông số khảo sát tối ưu
Muối Sodium octane sulfonic acid
TEA: 1,5 ppm pH hệ pha động: 4,0 Tỷ lệ pha động: Đệm – ACN = 85 - 15
Nồng độ muối tối ưu: A (g/l)
Nồng độ muối: A (g/l) pH hệ pha động: 4,0
Tỷ lệ pha động: Đệm – ACN = 85 - 15
Nồng độ TEA tối ưu: B (ppm) pH hệ pha động
Nồng độ muối: A (g/l) Nồng độ TEA: B (ppm)
Tỷ lệ pha động: Đệm – ACN = 85 - 15 pH hệ pha động tối ưu: C
Nồng độ muối: A (g/l) Nồng độ TEA: B (ppm) pH hệ pha động: C
Tỷ lệ pha động tối ưu: D
Lựa chọn hệ pha động tối ưu thỏa mãn điều kiện đặt ra: peak CS phải tách rời hoàn khỏi các peak tạp với hệ số phân giải R S 1,5, peak CS nhỏ gọn, hệ số đối xứng (A S ) 0,8 A S 1,5 và có thời gian phân tích ngắn theo tiêu chuẩn bộ hồ sơ kỹ thuật chung ACTR (2008)
Tốc độ dòng hệ pha động: 0,3 – 0,4 – 0,5 – 0,6 ml/phút
2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích định lượng theo bộ hồ sơ kỹ thuật chung ACTR (2008) [10]
2.3.3.1 Tính đặc hiệu chọn lọc
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:
- Mẫu trắng: Dung môi pha động, dung môi hòa tan mẫu, pha loãng mẫu (nếu có),…
- Mẫu chuẩn: chứa chất chuẩn cần phân tích pha trong dung môi pha động
Mẫu chuẩn thường có nồng độ chất cần phân tích ở khoảng nồng độ giữa của đường chuẩn
- Mẫu thử: chứa dược chất cần phân tích Mẫu thử có nồng độ chất cần phân tích tương đương với nồng độ trong mẫu chuẩn
Ghi lại các sắc ký đồ Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; phổ UV của peak hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn
Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn
Sắc ký đồ các mẫu thử cho peak có thời gian lưu tương tự với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất hiện thêm các peak khác (peak tạp) không phải peak của hoạt chất cần phân tích, thì peak của hoạt chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các peak tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được quy định trong dược điển
2.3.3.2 Tính tương thích hệ thống
Tiến hành bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu và diện tích peak
Số đĩa lý thuyết: N ≥ 2000 Hệ số bất đối: 0,8 ≤ AS ≤ 1,5
2.3.3.3 Tính tuyến tính – Khoảng xác định
Chuẩn bị dãy các mẫu chuẩn, có nồng độ phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp (tối thiểu phải tương ứng với từ 80% đến 120% giá trị hàm lượng so nhãn) Mẫu có nồng độ chất cần phân tích của dãy chuẩn phải lớn hơn giá trị LOQ của phương pháp Số lượng các mẫu của dãy chuẩn tối thiểu là 5 mẫu (không bao gồm mẫu giả dược)
Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định độ đáp ứng của peak chính trong các mẫu
Phương pháp xử lý kết quả
3.1 Xây dựng quy trình phân tích định lượng CS bằng phương pháp HPLC 3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký
3.1.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thu
Trong thành phần pha động khảo sát có chứa ACN là dung môi có đỉnh hấp thu ở bước sóng 195nm Nếu chọn bước sóng gần 195nm thì độ hấp thu dung môi hữu cơ cao, các cảm biến phát hiện chất phân tích bị quá tải, dẫn đến sai số trong định lượng [23], [27] Trên cơ sở đó, tối tiến hành quét phổ CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml ở bước sóng từ 200 – 410nm bằng thiết bị UV – Vis Shimadzu PharmaSpec L - 7200 Kết quả phổ hấp thu của CS được trình bày như sau:
Hình 3 1: Phổ hấp thu UV của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml
CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 260nm đạt 0,201 Abs
Tôi tiến hành tiêm sắc ký mẫu chuẩn trên với các điều kiện sắc ký ban đầu như mục 2.3.2, thu được peak CS cho đáp ứng peak cao, nhọn, đối xứng (AS 1,146), đường nền sắc kí đồ phẵng
Hình 3 2: Sắc ký đồ của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Xây dựng quy trình phân tích định lượng CS bằng phương pháp HPLC
3.1.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thu
Trong thành phần pha động khảo sát có chứa ACN là dung môi có đỉnh hấp thu ở bước sóng 195nm Nếu chọn bước sóng gần 195nm thì độ hấp thu dung môi hữu cơ cao, các cảm biến phát hiện chất phân tích bị quá tải, dẫn đến sai số trong định lượng [23], [27] Trên cơ sở đó, tối tiến hành quét phổ CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml ở bước sóng từ 200 – 410nm bằng thiết bị UV – Vis Shimadzu PharmaSpec L - 7200 Kết quả phổ hấp thu của CS được trình bày như sau:
Hình 3 1: Phổ hấp thu UV của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml
CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 260nm đạt 0,201 Abs
Tôi tiến hành tiêm sắc ký mẫu chuẩn trên với các điều kiện sắc ký ban đầu như mục 2.3.2, thu được peak CS cho đáp ứng peak cao, nhọn, đối xứng (AS 1,146), đường nền sắc kí đồ phẵng
Hình 3 2: Sắc ký đồ của CS trong nước có nồng độ 0,4mg/ml
Vì vậy, tôi lựa chọn bước sóng 260nm để tiến hành các bước khảo sát tiếp theo
3.1.1.2 Khảo sát nồng độ từng thành phần pha động a) Nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid
Phân tử CS có chứa nguyên tử N có cặp điện tử tự do và sự kết hợp giữa nhóm sulfate (SO4) 2- của gốc đường với các nhóm carboxyl (COO - ) của gốc đường acid làm cho phân tử CS có tính phân cực mạnh [29] Vì vậy, CS sẽ trôi thẳng trực tiếp khỏi pha tĩnh không phân cực của cột nhồi RPC mà không có xảy ra tương tác giữa chúng với nhau Điện tích âm của ion octane sulfonic acid được thêm vào pha động nhằm tạo thành ion ghép cặp với CS Bằng cách này làm giảm độ phân cực của CS nên nó được lưu lại lâu hơn bởi pha tĩnh Điều đó có nghĩa là, các ion ghép cặp (các đối ion) làm trung gian điều phối giữa pha tĩnh không phân cực và các mẫu cần phân tích phân cực mạnh [21]
Sự lưu mẫu của RP-IPC cũng chịu tác động bởi sự hiện diện của dung môi hữu cơ trong pha động, nồng độ của đệm, và độ pH pha động Nồng độ ion ghép cặp càng cao (lên đến một mức nào đó), thì lực lưu mẫu càng lớn Sự giảm lực lưu chất được theo dõi khi nồng độ của ion ghép cặp đạt tới một giới hạn nhất định [21], [27] a) 0,0g/l b) 0,2g/l c) 0,4g/l d) 0,6g/l e) 0,8g/l f) 1,0g/l
Hình 3 3: Quá trình sắc ký CS tại các nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid khác nhau
Bảng 3 1: Độ đáp ứng peak CS tại các nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid
Nồng độ muối Natri octane sulfonic acid
Nhận xét: Khi tăng dần nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid từ 0,0 – 0,6g/l thì thời gian lưu của CS tăng dần, 2 peak CS và Glucosamin HCl tách dần nhau ra (hệ số phân giải RS tăng), độ hấp thu peak CS tăng về diện tích và chiều cao, peak càng đối xứng (hệ số đối xứng AS tiến gần về 1,0) Chứng tỏ với nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid thích hợp thì CS được lưu giữ lâu hơn trong cột, peak CS tách hoàn toàn với các peak khác Khi tăng nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid từ 0,6 đến 1,0g/l thì độ đáp ứng peak CS thay đổi không đáng kể
Muối Sodium octane sulfonic acid dùng trong phương pháp ghép cặp ion khá đắc tiền, thời gian ổn định hệ pha động chứa muối này và thời gian rửa giải hệ pha động để làm sạch hệ thống sắc ký khá dài [21] Vì vậy, dựa vào kết quả khảo sát ở bảng 3.1 tôi lựa chọn nồng độ muối Sodium octane sulfonic acid là 0,6g/l để đảm bảo tính hiệu quả và kinh tế của quá trình sắc ký và sử dụng kết quả này để tiến hành các bước khảo sát tiếp sau b) Nồng độ Triethylamin (TEA)
Khi tách các chất hữu cơ mang tính chất base trên cột tách pha đảo thường xảy ra hiện tượng kéo đuôi Nguyên nhân chính của hiện tượng này là do tương tác liên kết hydro giữa chất phân tích với nhóm silano tự do trên bề mặt pha tĩnh Để giải quyết hiện tượng kéo đuôi peak, trong kỹ thuật sắc ký sử dụng thêm chất cải biến hữu cơ và thường sử dụng là các base hữu cơ như triethylamin, trimethylamin…[3], [19] Trong nghiên cứu này sử dụng chất cải biến hóa học là triethylamin (TEA) với nồng độ thay đổi từ 0,0ppm – 2,5ppm Kết quả thu được trình bày như sau: a) 0,0ppm b) 0,5ppm c) 1,0ppm d) 1,5ppm e) 2,0ppm f) 2,5ppm
Hình 3 4: Quá trình sắc ký CS tại các nồng độ TEA khác nhau
Bảng 3 2: Độ đáp ứng peak CS tại các nồng độ TEA khác nhau
Nhận xét: Khi trong pha động không có TEA, peak CS bị gờ vai, chân peak xấu, độ đáp ứng peak không đạt yêu cầu Khi tăng dần nồng độ TEA từ 0,5 –
2,5ppm thì thời gian lưu peak chính thay đổi không đáng kể, 2 peak CS và Glucosamin HCl tách dần nhau ra, độ đáp ứng peak chính tăng dần về diện tích và chiều cao, peak càng đối xứng Tại nồng độ TEA 1,5ppm peak chính có hệ số đối xứng tốt nhất AS = 1,105 (gần giá trị 1,0) Tuy nhiên, khi tăng thêm TEA (nồng độ 2,0ppm và 2,5ppm), mặc dù độ phân giải của 2 peak thay đổi không đáng kể nhưng peak chính kém đối xứng hơn và đường nền sắc ký bị nhiễu
TEA tương tác tốt với pha tĩnh không phân cực nên thời gian rửa giải loại bỏ pha động chứa TEA trong hệ thống khá dài TEA rất độc, mùi xốc nặng, nếu không được rửa giải hoàn toàn khỏi cột sẽ khiến cột giảm dần hiệu lực phân tách [21] Vì vậy nên lựa chọn nồng độ TEA nhỏ nhất mà vẫn đáp ứng hiệu quả phân tách peak
Trên cơ sở đó tôi lựa chọn nồng độ TEA là 1,5ppm cho các bước khảo sát tiếp sau c) pH hệ pha động
Tiến hành khảo sát khoảng pH của dung dịch đệm để có được một thành phần pha động ổn định và cho hiệu quả sắc ký cao Các giá trị pH được lựa chọn để khảo sát trong khoảng 2,5 - 4,5 Sau khi chạy sắc ký tiến hành thiết lập mối quan hệ giữa độ đáp ứng peak chính và pH của dung dịch đệm trong pha động [3], [21], [27]
Kết quả thu được trình bày như sau: a) pH 2,5 b) pH 3,0 c) pH 3,5 d) pH 4,0 e) pH 4,5
Hình 3 5: Quá trình sắc ký CS tại các giá trị pH dung dịch đệm khác nhau
Bảng 3 3: Độ đáp ứng peak CS tại các giá trị pH dung dịch đệm khác nhau pH dung dịch đệm
Nhận xét: Khi tăng dần giá trị pH của đệm từ 2,5 – 4,5 thì chân peak CS giảm dần hiện tượng doãng chân, peak dần đối xứng Tại giá trị pH dung dịch đệm 4,0, CS đạt độ đáp ứng peak cao nhất về diện tích, chiều cao, hệ số đối xứng Tại các giá trị pH 2,5, 3,0, 4,5 mặc dù hệ số phân giải peak chính cao hơn tại giá trị pH 4,0 nhưng chân peak xấu, độ đáp ứng peak không đạt yêu cầu Vì vậy tôi chọn giá trị pH dung dịch đệm là 4,0 để tiến hành khảo sát các bước tiếp sau d) Tỷ lệ đệm – ACN
Thành phần pha động ảnh hưởng trực tiếp đến lực rửa giải các chất phân tích, ảnh hưởng đến thời gian lưu và hệ số phân giải của peak chính [3], [5], [21], [27]
Tỷ lệ ACN càng lớn thì độ phân cực của hệ pha động giảm, thời gian lưu peak chính càng ngắn, hệ số phân giải giảm nhưng peak chính giảm hiện tượng doãng chân, cân đối hơn, peak chính phân tách hoàn toàn khỏi các peak tạp Tuy nhiên, khi tỷ lệ ACN quá cao thì hệ số phân giải quá nhỏ, hai peak không tách rời nhau dẫn tới hiện tượng trùng peak [3] a) 100 – 0 b) 95 – 05 c) 90 – 10 d) 85 – 15 e) 80 – 20
Hình 3 6: Quá trình sắc ký CS tại các tỉ lệ Đệm – ACN khác nhau
Bảng 3 4: Độ đáp ứng peak CS tại các tỉ lệ Đệm – ACN khác nhau
Nhận xét: Khi tăng dần ACN từ 0 – 15%, thời gian lưu của CS giảm dần, peak chính giảm hiện tượng doãng chân, cân đối hơn, phân tách hoàn toàn Tuy nhiên, khi tỷ lệ ACN quá cao (20%) thì hệ số phân giải quá nhỏ, hai peak không tách rời nhau Vì vậy, tôi chọn tỉ lệ Đệm – ACN = 85 – 15 để tiến hành các bước khảo sát tiếp sau e) Tổng kết khảo sát điều kiện hệ pha động tối ưu
- Nồng độ muối Natri octane sulfonic acid: 0,6g/l
3.1.1.3 Khảo sát tốc độ dòng hệ pha động
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Tính đặc hiệu chọn lọc
Cách tiến hành: Chuẩn bị các mẫu theo quy trình xử lý mẫu chuẩn và mẫu thử như 2.3.1 theo thứ tự như sau:
(1) Mẫu trắng: dung môi hòa tan (nước) (2) Pha động: pha dung dịch có tỷ lệ Đệm pH 4,0 – ACN = 85 – 15 (3) Mẫu chuẩn CS 0,4mg/ml
(4) Mẫu chuẩn Glucosamin 0,5mg/ml (5) Mẫu chuẩn kép CS (0,4mg/ml) – Glucosamin (0,5mg/ml) (6) Mẫu thử nguyên liệu CS từ sụn bò (0,4mg/ml)
(7) Mẫu thử nguyên liệu CS từ sụn bò (0,4mg/ml) thêm chuẩn CS để nồng độ CS tương đương (0,56mg/ml) (8) Mẫu chế phẩm Tobicom có nồng độ CS (0,4mg/ml)
(9) Mẫu chế phẩm Tobicom có nồng độ CS (0,4mg/ml) thêm chuẩn CS để nồng độ CS tương đương (0,56mg/ml)
(10) Mẫu chế phẩm Healthy Joint Plus có nồng độ tương ứng CS
(0,4mg/ml) – Glucosamin (0,5mg/ml)
(11) Mẫu chế phẩm Healthy Joint Plus có nồng độ tương CS (0,4mg/ml) –
Glucosamin (0,5mg/ml) thêm chuẩn CS để nồng độ CS tương đương (0,56mg/ml)
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn như mục 3.1.1.6, thu được kết quả như sau:
1) Mẫu dung môi hòa tan (Nước) 2) Mẫu pha động
3) Mẫu chuẩn CS 0,4mg/ml 4) Mẫu chuẩn Glucosamin HCl 0,5mg/ml
5) Mẫu hỗn hợp chuẩn CS – Glucosamin HCL 0,4-0,5 mg/ml
6) Mẫu nguyên liệu 7) Mẫu nguyên liệu thêm chuẩn CS
8) Mẫu thử Tobicom 9) Mẫu Tobicom thêm chuẩn CS
10) Mẫu Healthy Joint Plus 11) Mẫu Healthy Joint Plus thêm chuẩn CS
Hình 3 10: Sắc ký đồ các mẫu từ 1 – 11
- Kết quả thực nghiệm cho thấy peak CS (mẫu 3) có thời gian lưu là 3,233 phút Trong sắc ký đồ mẫu dung môi hòa tan (mẫu 1) và pha động (mẫu 2) không xuất hiện peak tương ứng với thời gian lưu của CS tại 3,233 phút
- Trên sắc ký đồ của các dung dịch thử (mẫu 6, 7, 8, 9, 10, 11) xuất hiện peak tương ứng với thời gian lưu của CS trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn (mẫu 3)
- Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn CS và Glucosamin HCl (mẫu 5) có sự tách biệt giữa hai peak với hệ số phân giải là 2,605 Các mẫu thử thêm chuẩn CS (7, 9, 11) đều có độ hấp thu peak cao hơn so với mẫu thử không thêm chuẩn CS (mẫu 6, 8, 10) Chứng tỏ phương pháp phân tích định lượng có sự chọn lọc đặc hiệu với CS
3.2.2 Tính tương thích hệ thống
Bảng 3 8: Kết quả tính tương thích hệ thống
Lần tiêm Diện tích peak
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký là diện tích peak (0,214%) và thời gian lưu (0,370%) nằm trong giới hạn cho phép (RSD < 2%), hệ số đối xứng peak (1,127) nằm trong khoảng 0,8
AS 1,5 Số đĩa lý thuyết trung bình NTB = 2538,5 (> 2000) Điều đó chứng tỏ điều kiện sắc ký lựa chọn là phù hợp và đảm bảo sự ổn định cho phép phân tích định tính và định lượng CS
3.2.3 Tính tuyến tính (khoảng xác định)
Bảng 3 9: Diện tích peak ứng với từng nồng độ của CS trong dãy chuẩn
Lượng cân chuẩn gốc (mg) 86,8 Độ pha loãng dung dịch gốc 50
Nồng độ CS trong dung dịch chuẩn gốc (mg/ml) 1,6
Nồng độ (mg/ml) Diện tích peak TB (mAU.s)
Các giá trị thống kê
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 100470840x - 2827851,4
Khoảng tuyến tính 0,24 – 0,64mg/ml
Hình 3 11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak của chuẩn CS y = 100470840x - 2827851,4
KHOẢNG TUYẾN TÍNH CỦA CS
Hình 3 12: Sắc ký đồ peak CS tại các nồng độ trong khoảng tuyến tính
Nhận xét: Sử dụng trắc nghiệm t và trắc nghiệm F đã xác định được:
- Hệ số a và b có ý nghĩa về thống kê
- Phương trình hồi quy có tính tương thích
- R = 0,9998 > 0,9990 nên có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích peak và nồng độ chất nghiên cứu
- Phương pháp sắc ký đạt tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,24 - 0,64mg/ml hay tuyến tính trong khoảng nồng độ 60 – 160% nồng độ làm việc Kết quả này được sử dụng làm cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng các chất nghiên cứu
3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Dựa vào đường chuẩn ta có
LOD =3,3 x S a LOQ x S a Trong đó: a là hệ số góc của phương trình hồi quy S là độ lệch chuẩn của mẫu trắng, cũng đuợc xác định theo phương trình hồi quy
Như vậy theo phương trình hồi quy ta có:
S = 341115,349 a = 100470840 LOD = 0,011 mg/ml LOQ = 0,034 mg/ml
Bảng 3 10: Độ đáp ứng peak CS tại nồng độ định lượng 0,034mg/ml
Lần tiêm Diện tích peak
Thời gian lưu (phút) Hệ số đối xứng
Nhận xét: Dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính ta xác định được nồng độ của LOD và LOQ Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn có nồng độ LOQ = 0,034 mg/ml thì độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký là diện tích peak (0,170%) và thời gian lưu (0,602) nằm trong giới hạn cho phép (RSD < 2%), hệ số đối xứng peak (1,148) nằm trong khoảng 0,8 AS 1,5
Vậy giới hạn định lượng của CS với điều kiện sắc ký đã chọn là 0,034 mg/ml
3.2.5 Độ đúng của phương pháp
Bảng 3 11: Kết quả phân tích độ đúng mẫu nguyên liệu CS
Lượng cân mẫu thử (mg)
Lượng chuẩn thêm vào (mg) Độ pha loãng
Nồng độ mẫu (mg/ml)
Diện tích peak TB (mAU.s)
Nhận xét: Kết quả thực nghiệm cho thấy độ thu hồi của hoạt chất CS đạt cao, trung bình 99,753% nằm trong giới hạn cho phép là 98,0 – 102,0% Độ lệch chuẩn tương đối của các giá trị độ đúng RSD = 0,999% nằm trong khoảng cho phép (RSD 2%) đã thể hiện độ đúng cao Như vậy phương pháp phân tích xây dựng có tính thu hồi tốt, độ nhạy cao, chính xác đạt yêu cầu để định lượng hoạt chất
3.2.6.1 Độ chính xác – Độ lặp lại Bảng 3 12: Kết quả phân tích độ chính xác – độ lặp lại của mẫu nguyên liệu CS
Mẫu KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak trung bình
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Nhận xét: Kết quả thử độ lặp lại của phương pháp cho thấy với các điều kiện phân tích đã chọn, xác định được % hàm lượng hoạt chất trong mẫu thử nguyên liệu là 79,970% (so với nhãn là 80,68%) có độ chính xác cao 99,115% với độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,637% < 2% Như vậy phương pháp có độ lặp lại cao đáp ứng được yêu cầu cho phép
3.2.6.2 Độ chính xác – Độ chính xác trung gian
Bảng 3 13: Kết quả phân tích định lượng mẫu nguyên liệu của kiểm nghiệm viên 1
KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak trung bình
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Bảng 3 14: Kết quả phân tích định lượng mẫu nguyên liệu của kiểm nghiệm viên 2
KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak trung bình
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Bảng 3 15: Thống kê kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên
Kết quả KNV 1 KNV 2 TB
Nhận xét: Hai kiểm nghiệm viên thực hiện trên cùng một quy trình phân tích định lượng đã xây dựng với cùng một mẫu thử nguyên liệu và vào hai ngày khác nhau cho kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất so với nhãn đạt cao, trung bình tương ứng 98,978% (RSD = 0,679) và 99,356% (RSD = 0,618)
Sử dụng F-Test hai mẫu toán chênh lệch trong phân tích thống kê để kiểm tra sự sai khác kết quả định lượng của hai kiểm nghiệm viên Nhận thấy FTN (1,20) <
F0.95,5,5 (5,05) chứng tỏ 2 kiểm nghiệm viên có tính đồng nhất về thống kê
Bảng 3 16: Tổng kết kết quả thẩm định phương pháp phân tích định lượng CS theo bộ hồ sơ tiêu chuẩn chung ACTR (2008)
Tính đặc hiệu chọn lọc Phương pháp phân tích có tính đặc hiệu chọn lọc với
Tính tương thích hệ thống
Phương pháp phân tích phù hợp và đảm bảo sự ổn định cho phép phân tích định tính và định lượng CS
Tính tuyến tính và khoảng xác định
Phương pháp đạt tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,24 - 0,64mg/ml hay tuyến tính trong khoảng nồng độ 60 – 160% nồng độ làm việc
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
LOD = 0,011 mg/ml LOQ = 0,034 mg/ml Độ đúng của phương pháp phân tích
Phương pháp có tính thu hồi tốt, độ nhạy cao, chính xác đạt yêu cầu để định lượng hoạt chất Độ chính xác của phương pháp phân tích
Phương pháp có độ chính xác cao, độ tái lặp tốt, có thể áp dụng với các phòng thí nghiệm, các cơ sở có trang bị máy sắc ký lỏng hiệu năng cao và nhân lực đủ trình độ
Ứng dụng quy trình phân tích để định lượng các chế phẩm chứa CS
Trên cơ sở quy trình định lượng đã xây dựng, áp dụng để định lượng CS trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường Việt Nam
Các mẫu thử được lựa chọn:
Bảng 3 17: Các mẫu chế phẩm áp dụng quy trình phân tích định lượng bằng
STT Mẫu Dạng chế phẩm Xuất xứ
Hàm lượng ghi trên nhãn
1 Chondroitin sulfate Bột Alokik Herbal Extracts - Ấn Độ ~ 80,68%
2 Healthy Joint Plus Viên nén
3 Tobicom Viên nang Dược phẩm ICA - Việt
Bảng 3 18: Kết quả định lượng mẫu thử nguyên liệu Mẫu thử nguyên liệu
KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak TB (mAU.s)
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Bảng 3 19: Kết quả định lượng mẫu thử Tobicom
KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak TB (mAU.s)
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Bảng 3 20: Kết quả định lượng mẫu thử Healthy Joint Plus Mẫu thử
KL cân thử (mg) Độ pha loãng
Diện tích peak TB (mAU.s)
% Hàm lượng hoạt chất trong mẫu
Nhận xét: Các sản phẩm đều có hàm lượng hoạt chất nằm trong khoảng 98 - 102% so với nhãn tương ứng mẫu nguyên liệu, mẫu Tobicom, mẫu Healthy Joint Plus là 98,926% (RSD = 0,417%); 99,797% (RSD = 0,259%); 101,016%
(RSD = 0,238%) với độ lệch chuẩn tương đối giữa kết quả định lượng 2 mẫu thử RSD < 2% Chứng tỏ có thể áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng để định lượng các sản phẩm chứa CS có dạng bào chế tương tự với các mẫu sản phẩm đã tiến hành định lượng trên.
