Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu phân lập và xây dựng phương pháp đánh giá các Flavonoid trong cao lá bạch quả

TOM TATDé tài “ Nghiên cứu va xây dung phương pháp đánh giá các flavonoid trong cao bachquả” đã phân lập được hai flavonoid chính trong cao bach qua là isorhamnetin vakaempferol.. Với mo

Cán bộ hướng dẫn khoa học :TS Huỳnh Khánh DuyTS Tống Thanh DanhCán bộ cham nhận xét Ï : - 2c SeSS E23 E98 E93 EEESEESEESEEEEEEEseEesesseee.Cán bộ cham nhận xét 2 : - SG Set Sa S1 E28 E98 E9EE2EE58 5588581811855 5E55 2e.Luan văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Dai học Bách Khoa, DHQG Tp HCMngày tháng năm

Thanh phan Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội đông châm bảo vệ luận văn thạc si)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyênngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRƯỞNG KHOA

NHIEM VU LUAN VAN THAC Si

Ho tên học viên: Phan Huy Vũ MSHV:11050160

Ngày, tháng, năm sinh: 22/10/1986 Nơi sinh: Tp Hồ Chí MinhChuyên ngành: Công nghệ hóa học Mã số : 605275

I TÊN ĐÈ TÀI:« NGHIÊN CUU PHAN LAP VÀ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHAP DANH GIÁ CÁCFLAVONOID TRONG CAO LA BACH QUA »

II NHIỆM VU VA NOI DUNG:- Thiết lập sắc ky đồ vân tay của dược liệu bach quả.- Cô lập chất đánh giá trên cao ethanol

- Xác định cấuu trúc chất đánh giá.- Ung dung chất đánh dấu dé đánh dấu xác định hàm lượng chất trong chế phẩm.II NGÀY GIAO NHIỆM VU : 20/01/2014

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIEM VU: 20/06/2014.V CÁN BỘ HUONG DAN :

TS Huỳnh Khánh Duy

TS Tống Thanh Danh

Tp HCM, ngay thang ndm 20 CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Ho tén va chit ky) (Ho tén va chit ky)

TRUONG KHOA

(Ho tén va chit ky)

LỜI CÁM ƠN

cle

Trong quá trình thực hiện luận văn nay, tôi đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng quý báu củaquý thầy cô trường Đại học Bách khoa Tp.HCM, các anh chi, các bạnVật lý Do lường — Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp HCM gia đình và bạn bè về sự độngviên, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành đến:- TS Huỳnh Khánh Duy, TS Tống Thanh Danh đã tận tình hướng dẫn và giúpđỡ tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

- Quy thay cô trường Dai học Bách khoa Tp.HCM đã tận tình giảng dạy và giúpđỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

— Phong Đào tạo Sau đại học — Dai học Khoa Học Bách khoa Tp.HCM đã taođiều kiện tốt cho tôi trong suốt khóa học va thời gian thực hiện dé tai

- (Cac anh chị, các bạn khoa Vật lý Do lường — Viện Kiếm nghiệm thuốcTp.HCM đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

- Ban lãnh đạo, các anh chị khoa Đông dược - Dược liệu, , khoa Thiết lậpChất chuẩn - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp.HCM đã cộng tác va tạo điều kiện chotôi thực hiện luận văn này.

— Gia đình va bạn bè đã luôn động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trongsuốt quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cam ơn

TOM TAT

Dé tài “ Nghiên cứu va xây dung phương pháp đánh giá các flavonoid trong cao bachquả” đã phân lập được hai flavonoid chính trong cao bach qua là isorhamnetin vakaempferol Từ đó, xây dựng quy trình đánh giá chất lượng cao bạch qua góp phanphục vụ cho công tác kiểm tra chất lượng các chế phẩm có thành phân cao lá bạch quảtrên thị trường.

SUMMARY

Thesis “Study and establishment validation method of flavonoids in Ginkgo bilobaextract” isolated two main flavonoids in ginkgo biloba extract which are isorhamnetinand kaempferol Therefrom, quality validate procedure of ginkgo biloba extract wasestablished for contribution of quality control of ginkgo biloba extract-containingproducts in the market

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan day là công trìnhnghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong luận văn là trung thực vàchưa từng được công bố trong bất kìcông trình nào khác.

-HI-MỤC LỤC

LOL CAM 9 aằẼ i¡900 91 iiLOI CAM DOAN oieecccccscsssssesesesecscscsessecscscsesesescscscscsesscssscsesesesesssescscscscssscssscsesessseecseses iiiMUC LUC 22 ivDANH MỤC CAC CHU VIET TAT o cccccccccccescscscscscsescscscscscscsssesssesssssesssssssessseseeeees viDANH MỤC CAC BẢNG - + c2 211111 211111111 2111111111111 011101010 11010101 ưu viiiDANH MỤC CÁC HÌNH - 2 S222 E2 5E 3 5 5151151111115 11115151111111 1111111 k0 XĐẶT VAN ĐẼ L1 TS 1 111111111 111111011101010101 111111111101 11 1111110101010 010111 1H ràg xiiCHUONG 1: TONG QUAN G2121 12v 11T 1T 1T TT TH reg |1.1 Giới thiệu chung về cao bạch quả - - - - + 3xx E SE SE rvcke |II hNHa((cctc |1.1.2 — Mô tả thực vật c- - CC ST T111 1111 1111101011111 112k |1.2 Thành phần hóa hoc + St S18 E11 1111 1 51 511111 11g ng ri Il1.3 Duroc tinh và công dụng ou ccccceessssseececcceseeeeeeecceeeeeaeeeeeeeceseseseeeeeeeeeeeaaas Vi1.3.1 Dược tính - - c c c c1 S9 2S ĐH HH ng cv ra Vil1.3.2 — Công MUNG eeeecccccccccecesesecceeeeeaseseeeecececceseeeseseescesseeaeeeeeceseeeeaeeegees VII1.4 Những nghiên cứu khoa học gan đây: - - - scE SE vs kg eree IX1.5 Một số chế phẩm sử dung bạch qua làm nguyên liệu thành phần xXxICHƯƠNG 2: DOI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU XXII2.1 Đối tượng nghiên CỨU Gv SE 1S 11T TT ng ng ng ưu XXIl

2.1.2 Dung môi, hóa chất - - 6 SE 1k SE vn ng xXII2.1.3 _ Thiết bị - Dụng cỤ G- G11 1n HT ng HH xXII

-iv-2.2 Phương pháp nghiÊn CỨU - - + <5 1c 3131111111183 11 1111155558515 xx2 XXIV2.2.1 Chiết xuất va phân lập flavonoid trong lá bach qua XXIV2.2.2 Dinh tính, định lượng các flavonoid trong cao bạch qua CP1 XXVIIICHUONG 3: KET QUA - NHAN XET eeccecccsescesececsscecsscesceevsceevsceevsceesaceeeees XXXII3.1 Chiết xuất và phân lập flavonoid trong lá bach qua - 5s XXXII

3.1.1 Định danh dược liệu lá bạch quả - << +<+<<<<<<<<<<+2 XXXIH

3.1.2 _ Chiết xuất cao flavonoid toàn phan từ lá bạch quả - XXXIV3.1.3 Dinh tính cao FLI bang sắc ky lớp mỏng 5 5s 2 csssxe: XXXV3.1.4 Thiết lập sắc ký đồ van tay cao FLIL - se sec secsxsececee XXXVII3.1.5 _ Chiết xuất các flavonoid từ cao FL/]L ¿ ¿2 2 z +s+s+e+s+s+s tre LV3.1.6 Xác định cấu trúc các chất phân lap ccc cceccscessssscrssseseecseneeeeees LXIH3.2 Tham định quy trình định lượng quercetin, kaempferol và isorhamnetin bằngphương pháp HPLC + + << << << 120281301 80113830 111111110 1111111111131 5 1 nhu LXXH3.2.1 Khảo sát tính tuyến tính cty ngu LXXII3.2.2 Giới han phát hiện (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) LXXVI3.2.2 _ Khảo sát tính tương thích hệ thống ¿+ xxx sec csa LXXVII3.2.3 Khao sat tính chọn ÏỌC - - - c {c1 SE S1 cv ca LXXXI3.2.4 Khảo sát độ lặp lại - -c n1 S311 1 1 111111222 xx2 LXXXII3.2.5 Khao sát độ đúng c Q11 HH HH H1 nh nen LXXXIV3.3 Ứng dụng quy trình đã xây dựng để định tính và định lượng quercetin,kaempferol và isorhamnetin trong các chê phâm - - «<< << << +52 LXXXVHCHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ, 5-5: c2c++rzrsrrertsrrrrrrrree XCIP.000)900057).8.4)7 (0n XCIPHU LUC 0 ÕẢÔ dd XCV

dd

DDVN

DSCEtOAcHPLC

IR

klLODLOQ

MeOHMSNMRRSD

S/N

sp

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

AcetonitrileDoublet (mũi đôi)Doublet of doublet (mỗi đôi đôn)Dược điển Việt Nam

Differential scanning calorimetry (Phân tích nhiệt vi sai)Ethyl acetate

High perfomance liquid chromatography (Sac ky long hiéu nang cao)Infrared spectroscopy

Hang s6 ghépKhối lượngLimit of detection (Gidi hạn phát hiện)Limit of quantitation (Giới han định lượng)Khối lượng phân tử

MethanolMass spectrometry (Khối pho)Nuclear magnetic resonance (Cong huong tu hat nhan)Độ lệch chuẩn

Singlet (mũi don)Signal/NoiseSan pham

-vị-SX San xuatTLC Thin layer chromatography (sắc ky bản mỏng)t Triplet (mũi ba)

tí Thể tích

UV Ultraviolet- visible

-Vil-DANH MỤC CAC BANG

Bảng 1.1 Kết quả ngiên cứu của nhóm tác giả Jing Zhang 525cc secsrsrsered XIBang 1.2 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dịch chiết cao bạch quatrong nghiên cứu của tác giả A Chandra - c1 1 1111111111155 11115111155 xx2 XIBang 1.3 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dich chiết cao bạch quatrong nghiên cứu của tác giả Amifablh - << c3 1111110 1131111111 111113 1111111552 xx4 XIIBang 1.4 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dich chiết cao bach quatrong nghiên cứu cua tác giả Jiun-Lung LUO eeecccccccccecceeeecececceceseeeeseecceeeeeeaenees XIVBang 1.5 Khối lượng phân tử của các hợp chất có trong dich chiết bach quả(trước khi thủy phân)) - + + + cc 1000111010113 1111111111110 5 11 11k 00 n1 0 1 kh XVBảng 1.6 Khối lượng phân tử của các hợp chất có trong dịch chiết bach qua(sau khi thủy phân) + + + Ă 1101111110101 0 111111111011 11111111110 1 1 1 1111k 0 kh XVIBang 1.7 Kết quả phân tích định lượng viên nén bach quả của tác gia Qi Ping Li XXBảng 2.1 Các chế phẩm có chứa thành phan cao bạch quả trên thị trường XXIIBảng 3.1 Kết quả khảo sát hệ dung môi phân tích cao FL1 - 5-5 s s5: XXXVIBang 3.2 Kết quả khảo sát cao FLI theo thành phan pha tĩnh 5 2 2 2s s52 XLBảng 3.3 Kết quả khảo sát cao FL1 theo thành phan pha động - - - XLIHBảng 3.4 Kết quả khảo sát cao FL1 theo nồng độ acid phosphorie 5-5-¿ XLVBảng 3.5 Kết quả khảo sát cao FLI theo tỷ lệ pha động - - s+s£sx+xzxz XLVIBảng 3.6 Kết quả khảo sát cao FLI tốc độ dòng pha động - - - 56s xxx £esa LBảng 3.7 Kết quả khảo sát cao FLI theo nhiệt độ buồng cột 2 2 +6 se 52 LHBảng 3.8 Kết quả phân lập flavonnoid - - «sex 3xx SE vn E1 cv ru LVIBảng 3.9 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hop chất I và K bằng phương pháp HPLC¬— A CeCe eee ena GG;;;E EE Eee enneaaE EE Oa: LXIIBang 3.10 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hop chất K và I bang phương pháp DSCeee Ầa LXIHBảng 3.11 Sự phân mảnh của hợp chất Ì c-¿ 6s SE ESE£k£xEsEk ke rke LXVBảng 3.12 Sự phân mảnh của hợp chất KK 6-6 SE sE SE EEeEEvEeEeEeerseeees LXXI

-VIII-Bảng 3.13 Tương quan nông độ và diện tích đỉnh của quercetin 5 LXXIHBảng 3.14 Tương quan nông độ và diện tích đỉnh của kaempferol - LXXIVBảng 3.15 Tương quan nông độ và diện tích đỉnh của isorhamnetin LXXVBang 3.16 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quercetin, kaemferol và isorhamnetin

ẮẲŸiẢÔ.ỎỎÔÔÒ Ã II SEES EEE LXXVII

Bảng 3.17 Tính tương thích hệ thông với quercetin chuẩn 5-5 - se s<¿ LXXIXBảng 3.18 Tính tương thích hệ thông với kaempferol chuẩn - s55 s£s«¿ LXXXBảng 3.19 Tính tương thích hệ thông với isorhamnetin Chuan - 55s: LXXXBảng 3.20 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng quercetin LXXXIIBảng 3.21 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng kaempferol LXXXIIBảng 3.22 Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng isorhamnetin LXXXIVBảng 3.23 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng quercetin LXXXVBang 3.24 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng kaempferol LXXXVIBảng 3.25 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng isorhamnetin¬ EERE E EH LXXXVIIBảng 3.26 Khối lượng cân của các chế phẩm ¿- + sex £eEsecevse LXXXVIHBang 3.27 Hàm lượng (%) quercetin, kaempferol và isorhamnetin trong cao bạch quảquả có trong các chế phẩm 6 E2 E3 1k1 SE St 91c 1g cv LXXXIX

“IX=

DANH MỤC CÁC HINH

Hinh 1.1 Cay bach qua |00/280 áo; vá 0 — HHinh 1.3 Hat no ¡3.007 - a “-:/+1151 HHình 1.4 Các cao và chế phẩm có chứa thành phan bạch quả trên thị trường XXIIHình 3.1 Vi phẫu của lá bạch quả 2+ + xxx E3 tre XXXIIHình 3.2 Quy trình chiết cao flavonoid toàn phan từ lá bach quả XXXIVHình 3.3 Sắc ký bản mỏng dịch chiết cao EL 5-5-2 2 2 se ££eE+E+E+e+erereered XXXVIHình 3.4 Sac ky bản mong dịch chiết cao FLL o.cccceccesecesssesesescessceseesscteeeeees XXXVIIHình 3.5 Sac ký đồ cao FLI triển khai trên các pha tĩnh khác nhau XLIHình 3.6 Sắc ký đồ cao FLI triển khai trên các pha động khác nhau - XLIVHình 3.7 Sắc ký đồ cao FLI được triển khai với các nồng độ acid phosphoric XLVIHình 3.8 Sac ky đồ cao FLI được triển khai với các ty lệ dung môi XLVIIIHình 3.9 Sac ký đồ cao FLI khảo sát theo tốc độ dòng của phương pháp - LIHinh 3.10 Sac ky đồ cao FL1 được khảo sát theo nhiệt độ buông CỘT LIHHình 3.11 Sac ký đồ vân tay của cao lá bach quả sau khi thuỷ phân - LIVHình 3.12 Sac ký đồ của quercetin chuẩn và cao EL] 5-5 5s+s£++££e£+eeeeees LIVHình 3.13 Sac ký đồ khảo sát sự thủy phân cao FL theo thời gian 5-55: LVHình 3.14 Sắc ký đồ các phân đoạn của cao FL] trên cột cô điển cccccessssa LVIHình 3.15 Sơ đồ tinh chế phân đoạn 3 vice cscccscssscssessscsssscescecscsecevscscsvsvscesseceanes LVUIHình 3.16 Sơ đồ tinh chế phân đoạn 4 vce cccccscsecssessscsssscescscscesceseceecsvsvscesseceanes LVUIHình 3.17 Sac ky bản mỏng kiểm tra chất tinh khiết Lecce cseceseecscesceceseecseeeeeeees LIXHình 3.18 Sắc ký bản mỏng kiểm tra chat tinh khiết KK - + 2 2+ +2 s+s+x+s+z+<2 LXHình 3.19 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của K - = + + se reesesees LXIHình 3.20 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của Ì -¿- s- s s +x£sE+EexeEsesereesed LXIHình 3.21 Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp DSC LXII

Hình 3.22 Đường tuyến tính của querCetiT - ¿5-6 sE+x+ESE SE E22 E EErnrrycg |Hình 3.23 Đường tuyến tính của kaempfErol - + - ¿+2 2E + EEEE+E£E+E+EEEEeEeErkrkrererekes |Hình 3.24 Đường tuyến tính của isorhamnetin -¿- 2 2 +8 SzE+E*E£E+E+EE#EeE+Erkekrererseee |Hình 3.25 Sắc ký đồ của chuẩn quercetin (A), kaempferol (B), isorhamnetin (C) ởnơng độ LỌD : k1 111 E111 5 T111 111911011 111g TT ng nang LXXVIHình 3.26 Sắc ký đồ của chuẩn quercetin (A), kaempferol (B), isorhamnetin (C) ởNON GO LOQ 2 LXXVIIHình 3.27 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của quercetin, kaempferol vàisorhamnetin chuẩn - 2-2 - k3 SE 119E 28 8 3 1111111111115 11111111111 EErE LXXIX

Hình 3.29 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc của quercetin trong mẫu chuẩn, mẫu thử vamẫu thử thêm chuẩn ¿- + E522 2E2E2E*E9EE#E£EEEEEEE SE E1 1121111211111 e0 LXXXIHình 3.30 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc của kaempferol trong mẫu chuẩn, mẫu thử vàmẫu thử thêm chuẩn - ¿+ ©++2t22EE9E12E2E221231212111112121111211111111 11.2 LXXXIHình 3.31 Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc của isorhamnetin trong mẫu chuẩn, mẫu thửvà mẫu thử thêm chuẩn - ¿- ¿2+ + SE SE 2E9E9E2E£E#E£E#EEEEEEE 1212151211111 tk LXXXI

-xj-DAT VAN DE

Bach qua được gọi là ngân hạnh hay cong tu, tên khoa học là Ginkgo biloba, có xuất xứtừ Trung Quốc, gan đây được đưa về trông ở Việt Nam Trong sách thuốc cô truyền củaTrung Hoa từ 2.800 năm trước Công nguyên, bạch quả đã được coi là vị thuốc quý.Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra lá bạch quả có chứa flavone glycoside vàterpene lactone - có khả năng tri và ngăn ngừa rat nhiêu loại bệnh.

Với hệ tuân hoàn, bạch quả giúp máu di chuyền trong co thé được dé dàng, làm tiêu mỡ,tiêu những chất độc trong máu, đánh tan cục máu đông, làm giãn các mạch máu nhất làvới người giả, khai thông hệ tuần hoàn máu lên não và tới các chi Khi tuần hoàn máuđược thông suốt, cơ thể con người sẽ khoẻ mạnh trí não cũng nhờ đó mà minh man hơn,chứng nhức mỏi, tê bì cũng được cải thiện Chế phẩm bạch quả hỗ trợ cho bệnh nhân bịbệnh Alzheimer, các rối loan tâm than tập tính của người cao tuôi như: rối loạn trí nhớ,giảm khả năng trí tuệ, lú lẫn và rồi loạn trong hành vi cu xử Mặt hang này được nhiềucông ty dược trong nước sản xuất và bán rộng rãi trên thị trường thuốc đông y Tuy nhiêncho đến nay vẫn chưa có chất đối chiếu để kiểm tra được liệu và các sản phẩm từ dượcliệu này.

Xuất phát từ thực tế, chúng tôi thực hiện việc thiết lập sắc ký đồ vân tay chỉ điểm từ đóhướng đến chiết xuất và phân lập các chất chỉ điểm này Với mong muốn nâng tầm chấtlượng va tính pháp ly cho chất đối chiếu cô lập được phục vụ cho công tác kiểm tra chấtlượng các sản phẩm có chứa bach qua đang lưu hành trên thị trường, trong luận văn naychúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu phân lập và xây dựng phương pháp đánh giá cácflavonoid trong cao lá bạch quả”.

Với mục tiêu nghiên cứu là— Thiết lập sac ký do vân tay của dược liệu bạch quả trên cao.- Cô lập chất đánh dấu trên cao ethanol

-XII _ Xác định cấu trúc chất đánh dấu.- Ung dụng chất đối chiếu đánh dấu để xác định hàm lượng chất trong chế phẩmcao lá bạch quả đang có mặt trên thị trường.

-XIII-CHUONG 1: TONG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về cây bach qual”!1.1.1 Tên gọi

Cây bạch quả thuộc:— Ho: Ginkgoaceae- Chi: GinkgoDanh phap khoa hoc: GinkgobilobaTên thông thường: ngân hạnh, bạch quả.

1.1.2 Mô tả thực vatThan: thân gỗ rất lớn, thông thường đạt chiều cao 20-35 m Cây có tán nhọn và các cànhdai gồ ghê

Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), “Được liéu học”, NXB Y học Hà Nội, tr 413 — 416.

|

Lá: có dạng hình quạt, với các gân lá tỏa ra thành phiến lá Hai gân lá đi vào phiến lá tạigốc lá và chia nhánh lặp lại thành hai, kiểu gân lá phân đôi Các lá thông thường dài 5-10

cm.

Hinh 1.2 La bach quaHat: hình trứng, chắc, vỏ cứng nhãn, màu vàng nhạt hay xám nhạt, một đầu hơi nhọn, đàitừ 1,5 - 2,5 cm, rộng Ï - 2 cm, day 1 cm.

1.1.2.1 Phân bốCây bạch quả có nguồn gốc Đông A (Trung Quốc, Nhật Bản) nay được trồng ở nhiều nơithuộc Châu Au, Châu Mỹ

1.2 Thanh phần hóa họcĐã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học, tiêu chuẩn hóa được liệu và tác dụngđược lý của bạch quả trong 30 năm qua.

e Trong lá

Thành phần chính của lá bạch quả gồm các chất terpen mà quan trọng nhất là cácditerpen lacton và các flavonoid Ngoài ra, lá bach quả còn chứa một sô các hop chatkhác như sterol (1), acid hữu cơ (như -hydroxykynurenic-6-HK A).

HO

(1) SterolLá bạch quả có chứa các dẫn chất diterpen lacton có cau trúc đặc trưng của bach qua Cácchất có hoạt tinh bao gồm ginkgolid (2) A, B, C, JvàM và một sequiterpen là bilobalid(3)

R1 R2 R3Ginkgolid A OH H HGinkgolid B OH OH HGinkgolid C OH OH OHGinkgolid J OH H OHGinkgolid M H OH OH

Il

(3) BilobalidFlavonoid trong bach quả thuộc nhóm flavonol với các chất chính là quercetin (4) ,kaempferol (5) và isoharmnetin (6)

OHOH

IV

OH O OH O

(7) Luteolin (8) TricetinCác biflavon trong đó chủ yếu là bilobetin (9), ginkgetin, isoginkgetin (10) vaseiadopotysin; các dẫn chất catechin (11), proanthocyanidin (12)

(9) Bilobetin

(11) Catechin (12) Proanthocyanidin

Cao khô lá bạch quả được chiết bang hỗn hop acetone — nước với tỉ lệ trung bình 50:1,chứa khoảng 22— 27% flavonol glycosid (quercetin, kaempferol, và isorhamnetin);5 — 7% terpen (trong đó có khoảng 2,8 — 3,4% ginkgolid A, B, C; 2,6 — 3,2% bilobalid )và không quá 5 ppm các ginkgolic.

e Trong hạt

Hạt bạch quả chứa 35 % carbohydrat; 2,4% các acid béo và 6,4% protein Tinh bột làthành phan chủ yếu chủ yếu của ho hợp chất carbohydrate Ginnacin, globumin, albuminlà các protein được tìm thấy trong hạt Ngoài ra, thành phân chất béo trong hạt bạch quảbao gồm 90,6 % lipid trung hòa với thành phan là steryl ester (16), triglycerides (13),diglycerides (14), monoglycerides (15) và 7,5 % lipid phân cực như phosphatady lcholine(19), phosphatidyglycerol (17), phosphatidylethanolamine (18).

RO

|O

(16) Steryl ester

VỊ

Ho _" ec _„COOR:

_ i R,OOC——CH O

TS ^^” ul OK ƯA

OH L(17) Phosphatidylglycerol (18) Phosphatidylethanolamine

He _xC00RRaOOC———CH O CHạ

“+ `

CHạ

(19) Phosphatidylethanolamine

1.3 Dược tính và công dụng1.3.1 Dược tính

a Tac dung trén hé than kinh

- Uc chê sự tiên trién và thúc đây sự hôi phục của phù não do độc chat hay ton on ` A r = 3 ~ 2|, J3

thương, giúp điều hòa chuyền hóa năng lượng của nao.) 0!

- Uc chê sự suy giảm các muscarinergic cholineoceptor và ơ-adrenoceptor liên

quan đến tuôi tác, cũng như kích thích sự thu nhận cholin.?PÌ

— Cai thiện sự dung nạp tinh trang thiếu oxy, đặc biệt ở mô não.!°Ì“M Otani, S.S Chatterjee, B.Gabard, G.W.Kreutzberg (1986),Acta Neuropathol, 69, pp.54-65.ở Le Poncin, M Lafitte, J Rapin, J R Rapin (1980), Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie,24(2), pp 236-244.

* E Huguet, T Tarrade (1992), Journal of Pharmacy and pharmacology, 44(1), pp 24-27.> Oken, Barry S., Daniel M Storzbach, and Jeffrey A Kaye (1998), Archives of Neurology, 55(11), pp 1409-1415.° G Fitzl, K Welt, R Martin, D Dettmer, T Hemsdorf, N Clemens, S Konig (2000), Experimental andToxicologic Pathology, 52(5), pp 419-430.

VI

- Gia tăng hoạt động nhận thức và khả năng hoc hỏi; giảm phù võng mac và các

ton thương tế bao trong võng mạc! ”!Ì,

b Tác dụng lên hệ tuần hoàn máu- Piéu hòa trương lực của mạch, làm giãn mạch trong các trường hợp bị comạch `

Tăng trương lực mach máu trong những trường hợp giãn mạch bất thường PÌ

- Giảm trí nhớ, mất tập trung, tram cảm, ù tai, nhức dau; hội chứng sa sút trí tuệ.— Giúp giảm đau đớn trong di lại trong bệnh nghẽn động mach vi ngoại.

— Chong mặt và ù tai có nguồn gôc mach mau và 6c tai.

7 Winter, Eva (1991), Pharmacology Biochemistry and Behavior, 38(1), pp 109-114.* Hirooka, Kazuyuki, et al (2004), Current eye research, 28(3), pp 153-157.” Satoh, Hiroyasu, S Nishida (2004), Clinica chimica acta, 342(1), pp 13-22.'° Zhang, Li, et al (2002), Acta pharmacologica Sinica, 23(10), pp 919-923.

'! Lin, Shing-Jong, et al (2002), Journal of cellular biochemistry, 85(3), pp 572-582.

'? Saleem, Sofiyan, et al (2008), Stroke, 39(12), pp 3389-3396.'3 Kusmic, Claudia, et al (2004), Journal of cardiovascular pharmacology, 44(3), pp 356-362.'* Ahlemeyer, B., and J Krieglstein (2003), Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 60(9), pp 1779-1792.'° Wagner, Hildebert (2011), Fitoterapia, 82(1), pp 34-37.

VII

— Được dùng trong các bệnh Raynaud, Crocq và hội chứng viêm tĩnh mạch.1.4 Nhirng nghiên cứu khoa học gân đây:

Năm 2009!"°!:; Harvey Babich và các cộng sự đã nghiên cứu hiệu quả kháng sinh của dịchchiết lá bạch quả lên tế bào mô khoang miệng của con người Độc tính đối với tế bào ungthư biểu mô khoang miệng HSC-2 có liên quan đến bản chat prooxidative của dịch chiết.Dịch chiết từ lá G.biloba tạo ra các mảnh oxygen phản ứng (ROS) trong môi trường nuôicay tế bao, sự sản sinh ra ROS trong môi trường đệm thì thấp hơn trong môi trường kiềmvà acid Các số liệu phân tích cho thấy khả năng prooxidative tự nhiên của dịch chiếtG.biloba là nguyên nhân gây ra độc tế bào

Năm 2010": Nhóm nghiên cứu của Jing Zhang đã tiễn hành nghiên cứu phương pháptỉnh chế flavonoid từ dịch chiết lá bạch quả (EGb) bằng phương pháp tạo phức với ionkẽm.

Do khuynh hướng tạo chelat với ion kim loại của flavonoid, nhóm nghiên cứu đã tiễnhành tong hợp phức flavonoid — kẽm Các flavonid trong dịch chiết lá bạch quả sẽ tạophức với ion kẽm tạo kết tua vàng Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) được dùnglà tác nhân giải hấp các flavonoid, dựa trên khả năng tạo phức của EDTA với ion kẽmmạnh hơn flavonid Thành phan các flavonoid sau khi tinh chế được xác định bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), kết quả cho thay phương pháp tinh chếcó độ họn lọc cao đối với flavonoid, trong đó có các aglycone cua quercetin vakaempferol Hoạt tính chống oxy hóa của dịch trước và sau khi tinh chế được đánh giádựa trên gốc tự do 2,2-dimethyl-1-peakryl-hydrazyl (DPPH), kết qua cho thấy hoạt tínhchống oxy hóa của dịch chiết hau như không thay đổi sau khi được tỉnh chế

Nhóm tác giả đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo phứcflavonoid — ion kẽm, bao gôm:

- Ảnh hưởng của pH.'°H Babich, et.al (2009), Toxicology in Vitro, 25(6), pp 992-999.'7 J Zhang, et.al (2010), Separation and Purification Technology, 71(3), pp 273-278.

IX

— Ty lệ kẽm sulfat ( ZnSO¿) : EGb.- Nông độ của EGb.

Phản ứng tong hop tạo phức được thực hiện trong môi trường pH từ 5,50 — 10,50 Kếtquả cho thấy, pH tăng từ 5,50 — 9,50 thành phần phức flavonoid tạo thành tăng, tỷ lệphức tạo thành cao nhất đạt được là 79,9 % tại pH 9,50 Tai pH thap hon 9,50; ionhydroxyl từ natri hydroxid làm tăng khả năng khử proton cua flavonoid và lam cho cácligand dé dang tao thành phức Khi giá tri pH tăng lên 10,50, quá trình tao phức giảm, dotại pH cao các ion kim loại có khuynh hướng tạo thành dạng kim loại hydroxide, ngoài ranó cũng gây ra hiện tượng tách proton từ phức.

Nhóm nghiên cứu cũng tiễn hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ZnSO, : EGb đến sự hìnhthành của phức với các ty lệ: 0,10 : 10; 0,15 : 1,0; 0,2 : 1,0; 0,25:1,0 và 0,3 : 1,0 tươngứng với kẽm ZnSO, và EGb, tại pH 9,50 Khi gia tăng tỷ lệ của hai tác chất, hàm lượng

flavonoid tỉnh khiết tăng và đạt được giá tri cao nhất ứng với ty lệ ZnSO, : EGb là 0,2 :

1,0 Và khi tiếp tục tăng tỷ lệ của hai tác chất, nhóm tác giả thay hàm lượng flavonoidtỉnh khiết giảm; điều này được giải thích là do có sự tạo phức của ion kẽm với các tạpchất khác có trong dịch chiết như: các acid hữu cơ, D-glucaric va các acid ginkgolic Do đó, hàm lượng flavonid sẽ giảm khi tiễn hành giải hấp thu

Nông độ EGb cũng là yếu tô ảnh hưởng đến quá trình tinh chế flavonoid Nghiên cứu tiếnđược tiến hành tại pH 9,50; với ty lệ ZnSO, : EGb là 0,2 : 1,0; nồng độ EGb dao động từ0,5 — 2,0% (kl⁄tt methanol) Kết quả cho thay, với nồng độ EGb cao hơn 1,0% (kl/tt) hamlượng flavonoid tinh khiét sé giam dan, do su canh tranh tao phức cua các hop chất kháccó trong dịch chiết với flavonoid

Qua kết quả nghiên cứu, nhóm tác giả nhận xét phương pháp tỉnh chế flavonoid từ dịchchiết lá bạch quả (EGb) bằng phương pháp tạo phức với ion kẽm là phương pháp đơngiản làm gia tăng hàm lượng các flavonoid tinh khiết (kết quả được trình bay trongbang 1), ngoai ra hoạt tính sinh học của các flavonoid không bị mất đi sau quá trình tinhchê.

Bảng 1.1 Kết quả ngiên cứu của nhóm tác giả Jing Zhang

Quercctin Keampferol Isorhamnetin > ham lượng

(%) (%) (%) flavonoid (%)EGb 19,73 + 1,36 1,95 + 0,21 1,66 + 0,14 23,34 + 1,28Sp tinh chế 49,03 + 2,37 3,28 + 0,13 1,75 + 0,27 54,07 + 2,71Nam 2011! Amitabh Chandra và các cong su da tién hanh kiém tra chat luong nhiéudạng chế phẩm thương mai trên thi trường Nhóm nghiên cứu tiễn hành đánh giá va phântích các chế phẩm bằng 2 phương pháp:

- _ So sánh pho vân tay của các flavone glycoside đối với dịch chiết chưa thủy phân.- _ Xác định tong ham lượng các flavone glycoside đối với dịch chiết đã thủy phân.Phương pháp HPLC — DAD được tác giả dùng để tiễn hành khảo sát phô vân tay từ dịchchiết bạch qua, với điều kiện tiến hành sắc ký như sau:

o Cột CI§ Zorbax 150 mm x 4,6 mm x 5um.o Tốc độ dòng: 1,0 mL/ phút

o Nhiệt độ buồng cột: 25°C.© Bước sóng phát hiện: 340 nm.o Thể tích tiêm: 10 wL

o Pha động gồm H;PO¿ 0,2 % - MeOH - ACN, theo chương trình rửa giải đượctrình bày trong Bảng 1.2.

'8 A, Chandra, et.al (2011), Journal of Functional Foods, 3(2), pp 107 — 114.

XI

Bang 1.2 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dịch chiết cao bạch

quả trong nghiên cứu của tác gia A Chandra

Thời gian (phút) % HạPO,(02%) %MeOH %CAN

0 69 19 1212 51 34 1518 20 40 4025 69 19 1235 69 19 12

Ngoài ra nhóm tác giả cũng tiễn hành định lượng tong ham lượng flavonoid bang cáchxác định hàm lượng flavonid quercetin, kaempferol, isorhamnetin, theo diéu kién sac ky:

o Cot C18 Zorbax 150 mm x 4,6 mm x 5um.o Tốc độ dòng: 0,6 mL/ phút

o Nhiệt độ buồng cột: 25°C.© Bước sóng phát hiện: 370 nm.o Pha động gồm H3PO, 0,2 % - ACN, theo chương trình rửa giải được trình bay

trong Bảng 1.3.

XII

Bang 1.3 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dịch chiết cao bạch

quả trong nghiên cứu của tac gia Amitabh

Thời gian (phút % H;PO, (0,2 %) % ACN

0 70 3027 65 3528 70 30

30 70 30

o Thể tích tiêm: 10 uLDựa trên các kết quả phân tích được, tác giả đã xác định được pho van tay cua cao chuanbạch quả, dùng dé phân biệt với các được liệu khác dùng dé làm giả bach quả; như dichchiết từ cây hoa hòe Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng tiến hành xác định hàm lượng baaglycone (quercetin, kaempferol, isorhamnetin) nhằm tăng cường tính đối chiếu cho dượcliệu bạch qua, va tính tong hàm lượng các flavone glycosides trong bạch quả chuẩn Từđó, tác giả đã xây dựng phương pháp đánh giá dịch chiết lá bạch quả

Năm 2013!”°Ì: Các flavonoid và trilactone terpen là các thành phan có hoạt tính được lýtrong dịch chiết của lá bạch quả Mặc dù flavonoid có thể được tìm thấy trong nhiều loạicây khác nhau, nhưng các ginkgolide và bilobalid là các thành phần đặc trưng của bạchquả, ngoài ra tam diterpenoid cũng được tìm thấy trong bạch qua Trước đây, các nghiêncứu thiết lập phố vân tay cho cao bạch quả được thực hiện bằng phương pháp sắc ky lỏnghiệu năng cao với đầu dò tử ngoại (HPLC/UV) Tuy nhiên, phương pháp này không phùhợp để xác định các trilactone terpen, do khả năng hấp thụ UV kém Vì vậy, nhóm nghiêncứu Jiun-Lung Luo đã tiễn hành thiết lập sắc ký đồ vân tay của dịch chiết lá và cao bạchquả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối phố TOF Điều kiệntiễn hành sắc ký được tác giả ghi nhận:

'J.L Luo, et.al (2013), Journal of Food and Drug Analysis, 21(1), pp 27-39.

XIII

© Cột C18, 150 mm x 43,0 mm x 2,5um.o Thể tích tiêm: 0,1 pL

o Nhiệt độ buồng cột: 30°C.o Pha động gồm A(HCOOH/H;O 0,1 %) - B (HCOOH/MeOH 0,1%), theo theo

chương trình rửa giải được trình bày trong Bảng 1.4.Bang 1.4 Chương trình pha động rửa giải xác định pho vân tay dịch chiết cao bạch

quả trong nghiên cứu của tác giả Jiun-Lung Luo

Thời gian (phút) % A %oB

0 20 805 30 7010 40 60

15 40 6020 45 5522 45 5530 50 5035 60 4040 75 25

o Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút.o Dau dò MS: m/z từ 50 -3000 amu.Phuong pháp phân tích khối phô có thé dùng để xác định cau trúc của các hop chất màkhông cần dùng chuẩn đối chiếu, do đó đây là một phương pháp định tính khá hiệu quả.Bang phương pháp HPLC — Q — TOF/MS, tác giả đã phát hiện 7 flavonoid glycoside 1-7chưa được biết đến trước đây trong dịch chiết cao bạch quả (trước khi được acid hóa),bằng sự phỏng đoán dựa trên sự phân mảnh của các hợp chat; do phố khối mang tinh chấtđặc trưng cho mỗi flavonoid Ngoài ra, phương pháp cũng được sử dung dé phân tích và

XIV