Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu phản ứng thủy phân bằng Enzyme định hướng tổng hợp Taxol

trung gian Beta — lactam là hữu ích trong điều chế taxol, đó cũng là lý do tôi chọnđề tài “Nghiên cứu phản ứng thuỷ phân bang enzyme định hướng tổng hoptaxol”Từ mục tiêu tông quát nêu tr

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

p

NGO THI MY HUE

NGHIEN CUU PHAN UNG THUY PHAN BANG ENZYME

DINH HUONG TONG HOP TAXOL

Chuyén nganh: Cong nghé hoa hocMã số: 60 52 75

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

p

NGO THI MY HUE

NGHIEN CUU PHAN UNG THUY PHAN BANG ENZYME

DINH HUONG TONG HOP TAXOL

Chuyên ngành: Công nghệ hoa họcMã số: 60 52 75

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hướng dẫn chính: TS TONG THANH DANH

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2014

Công trình được hoàn thành tại: Trường Dai học Bách Khoa - ĐHỌG-HCM

Cán bộ hướng dân khoa học : T.S Tong Thanh Danh, - 5c 55s cess2

Cán bộ cham nhận xét 1: PGS.TS Phạm Thành Qua n ccccccccccccccseeseecececeneeneees

Cán bộ cham nhận xét 2: T.S Phan Ngọc HOQ.icccccccccccssessscssccsscsscccccecesceeseesseeeeeeees

Luận văn thạc sĩ được bao vệ tại Trường Đại hoc Bách Khoa, ĐHỌU Tp HCMngày 14 tháng 0S năm .2014

Thành phan Hội đông đánh giá luận văn thạc sĩ gom:

(Ghi rõ họ, tên, hoc hàm, học vị của Hội đông cham bao vệ luận văn thạc si)

2 PGs.TS Phạm Thành Quân — GV Phản biện Ï.3 T.S Phan Ngoc Hòa — GV Phan biện 2.

4 T.S Tong Thanh Danh - Ủy viên hội dong5 T.S Trương Vũ Thanh — Thư kỷ hội dongXác nhận của Chủ tịch Hội đông đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sua chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI ĐÔNG TRUONG KHOA

ĐẠI HỌC QUOC GIA TPHCM CỘNG HÒA XA HOI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập — Tu do — Hạnh phúc

NHIEM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGÔ THỊ MY HUE MSHV: 12924381Ngày, thang, năm sinh: 26/05/1984 Noi sinh: Phu YénChuyên ngành: công nghệ hóa học Mã số: 605275

I TEN ĐÈ TÀI: - NGHIÊN CUU PHAN UNG THUY PHAN BẰNGENZYME ĐỊNH HUONG TONG HỢP TA XOLL -=============================m==mm

NHIỆM VU VA NỘI DUNG:: -==~======================rm==r=m=rm==rmm==rmme

Il NGAY GIAO NHIỆM VỤU: -~ -~~ =~-~===~====================e====emm==rmmm=eemIll NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤU: -~ =-~============================mIv CÁN BỘ HƯỚNG DAN: - TS TONG THANH DANH -~-==-

LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

Họ và tên: NGO THỊ MY HUENgày, tháng, năm sinh: 26/05/1984 Nơi sinh: Phú YênĐịa chỉ liên lạc: A7/27/1A, tổ 11, Ấp 1A, xã Vĩnh Lộc B, Huyện Bình Chánh,Tp.HCM

QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO:- Tw 2002 đến 2006: ĐẠI HỌC QUY NHƠN - 170 An Dương Vuong, Tp Quy

Nhơn, tỉnh Bình Định- Tir 2012 đến 2014: ĐẠI HOC BACH KHOA TP HCM - 268 Lý Thường Kiệt,

Q.10, Tp.HCM

QUÁ TRÌNH CÔNG TÁC:- Ti 2006 đến nay: CÔNG TY TNHH PHOT PHAT - Lô A4a, KCN Hiệp

Phước, H.Nhà Bè, Tp HCM

Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn tới Tiến sĩ TốngThanh Danh đã khuyến khích, chỉ dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôitrong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc và các đồng nghiệp Công tyTNHH Phốt Phát đã giúp đỡ tôi rất nhiều về thời gian để tôi có thể hoàn thànhnghiên cứu này.

Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến bạn Nguyễn Lê Mỹ Tiên đã động viên, hỗ trợtôi rất nhiều trong suốt quá trình làm việc và hoàn thành luận văn

Trân trọng!

Lipases Amano PS from Pseudomonas cepacia and Lipase Amano AK fromPseudomonas fluorescens have been catalyzed enantioselective hydrolyses andtransesterifications of racemic esters 3 — hydroxy — 4 — phenyl — beta — lactamderivatives of the taxol side chain We have performed synthesized reactions toobtain taxol side chain e.g (+) — cis — Ï — (p — methoxyphenyl) — 3 — acetoxy — 4 —phenylazetidin — 2 — one, (+) — cis — I — (p — methoxyphenyl) — 3 — acetoxy — 4 —phenylazetidin — 2 — one, (-) — cis — 1 — (p — methoxyphenyl) — 3 — hydroxyl — 4 —phenylazetidin — 2 — one, (-) — cis — 3(R) — acetoxy — 4(S) — phenylazetidin — 2 —one, (+) — cis — 3(R) — hydroxyl — 4(S) — phenylazetidin — 2 — one, cis — 3 — (1 —ethoxyethoxy) — 4 — phenyllazetidin — 2 — one, cis—l — benzoyl — 3 — (1 —ethoxyethoxy) — 4 — phenyllazetidin — 2 — one The results show that enzymes lipaseAmano PS from Pseudomonas cepacia are more capable of synthesis inenantiomeric excess than the others lipase Amano AK from Pseudomonasfluorescens due to its associated specificities The resolved enantiomera are

important intermediates in the synthesis of the C — 13 side chain of taxol.

TÓM TAT

Xúc tác sinh học Lipase Amano PS từ Pseudomonas cepacia va LipaseAmano AK từ Pseudomonas fluorescens được chọn lam xúc tac chon lọc đối phântrong sự phân giải hỗn hợp racemic ester của các dẫn xuất đôi phân 3 — hydroxy — 4— phenyl của vòng beta — lactam qua quá trình thủy phân chọn lọc đối phân Quátrình nghiên cứu đã thực hiện các phản ứng tong hợp các hợp chat cần thiết dé thunhận mạch nhánh chuỗi taxol side chain, cụ thể là (+) — cis — 1 — ( p-methoxyphenyl) — 3 — acetoxy — 4 — phenylazetidin — 2 — one, (+) — cis — 1 — (p —methoxyphenyl) — 3 — acetoxy — 4 — phenylazetidin — 2 — one, (-) — cis — I — (p —methoxyphenyl) — 3 — hydroxyl — 4 — phenylazetidin — 2 — one, (-) — cis — 3(R) —acetoxy — 4(S) — phenylazetidin — 2 — one, (+) — cis — 3(R) — hydroxyl — 4(S) —phenylazetidin — 2 — one, cis — 3 — (1 — ethoxyethoxy) — 4 — phenyllazetidin — 2 —one, cis—1 — benzoyl — 3 — (1 — ethoxyethoxy) — 4 — phenyllazetidin — 2 — one Kếtqua cho thay do tinh đặc hiệu liên kết, enzyme Lipase Amano PS tir Pseudomonascepacia có khả năng tong hợp đối với chất cao hon enzyme Lipase Amano AK từPseudomonas fluorescens Sự phân tách chọn lọc đối phân là bước trung gian quantrọng trong tông hợp mạch nhánh chuỗi side chain C — 13 định hướng tổng hợp nênpaclitaxel.

LƠI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và

chưa từng được ai công bồ trong bất kỳ công trình nào khác

Ngô Thị Mỹ Huệ

MỤC LỤC0099.005057 i

lam ii

KO) Ot v0 iiiLOT CAM DOAN 07 ).).) iv

\/180/960000 _ơƠ V

DANH MỤC BANG BI 2 5° < se xe xe øese eexemesersesore viiiDANH MỤC HINH ANH MINH HỌA 2 < 5-2 5 se sex eeseeseesesesee ixDANH MỤC SƠ ĐỎ PHAN UNG sscssscssssssssssssscsssssscsessssssssesscssssssssssssessssssssessssssssesessees XDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TU VIET 'TẮTT 5-2 so 2s ces se se se xi9)0)89211)003a ,)H)ằH,., ẬHẬHẢ Ơ |Chương 1 TONG QUAIN o° << << E2 0v eeeevxeeeneeersee 31.1 ˆ KHÁI QUÁT VE HỢP CHAT PACLITAXEL -5° 5 5< se s5 se =<eses<e 31.2 MỘT SĨ PHƯƠNG PHAP TONG HỢP TAXOL TỪ 10 — DAB 51.2.1 Tổng hợp tồn phan 2 s- << s° sms sex eexveseeseeeseeese 51.2.2 Ban nã nổ 0 81.2.2.1 Bán tổng hợp Taxol từ 10 — DAB cee ceccecsceseeesccsesescessessecerecseeceeesseneas 81.2.2.2 Một số phương pháp bán tổng hợp mạch nhánh taxol side chạn 111.2.3 Phan ứng thuỷ phân băng enzyme trong bán tong hợp taxol 14

1.2.3.1 Giới thiệu chung về LIPASE: -. - 25 22s + se srerecrreerrree 14

1.2.3.2 Giới thiệu lipase PCL, PFL ¿2 ++k+EE+E£EE+EE+E£EEEEEEEEEEEErkrrerkrrxee 15

1.2.3.3 Cấu trúc và cơ chế phản ứng của lipase: -. - +-5s<<+s<+<s=<2 15

1.2.3.4 Phân giải động học với PCL, PFL ¿+5 52 11 +22 £esseeezreeezs 19

1.2.3.5 Một số phan ứng tổng hợp mạch nhánh cĩ sử dung enzyme lipase 201.2.4 Sinh tổng hop taxol: << << sex eexveseeeveeseseeeesesosee 24Chương 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - 5° << se ss se escsessessee 272.1 DOT TƯỢNG NGHIÊN CUUS 5-2 se se se sex øsseseeecsersee 272.2_ NGUYEN LIEU VA THIET BI: - 2° se se sex seeseesee 282.2.1 Nguyên liệu hố chất và dung mơi -2 5< 2 se se seessesssseses 282.2.2 Dụng cu và thiét bị 2 -° << me mg ven eveeeeeesessozee 30

,y/2/2wN9( 0o 30

2221018107177 aa ` 31

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CUUS 2-< s2 se <seEseessetseseesersesere 312.3.1 Phương pháp sắc ký bản mồng (TLC): - 2 se se se=ssesseees 32.3.2 Phố hồng ngoại IR o- << << se eeEx ve ưeveeeeeesessozee 32

2.3.3 Phố cộng hướng từ hạt nhân 'H NMR 2 s2 so < se scessssssesscse 32

'N N04 000 15 322.3.5 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): 5 ° 5s 32

2.3.6 Xác định góc quay CUC TIEN? o0 s5 2< 9 9.9 95 5.0 9 005 9 00 000995950086 066 33

2.3.7 Xác định đồng phân đối quang và định danh cấu hình R, S: 332.3.8 Xác định độ tỉnh khiết quang học (©€): 2 s-e° << ses se seescsesesseees 34Chương 3 THUC NGHIỆM 5-55 5S s2 SƠ S3 S23 S3 90 2095.055 55 5.55555085095506 363.1 PHAN UNG TONG HỢP N - BENZYLIDENE - P- METHOXY ANILINE

01000115 Ô 36

3.2 PHÁN UNG TONG HỢP (+) CIS- 1— P— METHOXYPHENYL - 3—

ACETOXY - 4—- PHENYLAZETIDIN - 2 - ONE (BETA — LACTAMI 36

3.3 PHÁN UNG THUY PHAN (+) CIS- 1 - P- METHOXYPHENYL - 3—

ACETOXY - 4—- PHENYLAZEDITIN - 2 - ONE (BETA - LACTAM! 37

3.4 PHÁN UNG TONG HỢP (-)- CIS- 3(R) - ACETOXY - 4(S) —

PHENYLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 2A) 5 5-s-cs<s 39

3.5 PHÁN UNG TONG HỢP CIS- 3 —- HYDROXYL — 4—- PHENYLAZETIDIN - 2

- ONE (BETA — LACTAM 2B) <5 <5 se sec tEseEseseseeseserseseseesesre 41

3.6 PHÁN UNG TONG HỢP (+)CIS 3(R) HYDROXYL 4(S)

-PHENYLAZETIDIN - 2 - ONE (BETA — LACTAM 3A) -. -5-5 s5 42

3.7 PHAN UNG TONG HOP CIS - 3 - (1- ETHOXYETHOXY) - 4—

PHENYLLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 4A) - 5-5-5 44

3.8 PHÁN UNG TONG HOP CIS1 BENZOYL 3 (1 ETHOXYETHOXY)

-4 —PHENYLLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 5A) -45

Chương 4 KET QUA VA BAN LUẬN - 5 s- << se sex eesseeseeecsesesesee 464.1 PHAN UNG TONG HỢP N - BENZYLIDENE — P- METHOXY ANILINE

01000115 Ô 46

4.2 PHÁN UNG TONG HOP (+) CIS - 1—- P-METHOXYPHENYL -3 —

ACETOXY - 4— PHENYLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM) 48

4.3 PHAN UNG THUY PHAN (+) CIS — 1- P-METHOXYPHENYL -3 —

ACETOXY - 4—- PHENYLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA - LACTAM) 50

4.3.1 Sản phẩm tạo thành beta — lactam 1A: (+) — cis — 1 — (p — methoxyhenyl) —

3 — acetoxy — 4 — phenylazefidin — 2 — Oone co csss SsS99S55556656 5m 50

4.3.2 San phẩm tạo thành beta — lactam 1B:(-) — cis— 1 — (p — methoxylphenyl) —

3 — hydroxy — 4 — phenylazefidin — 2 — OIn o0 G55 S0 S95S55556555 558 53

4.4 PHAN UNG TONG HOP (-) - CIS — 3(R) - ACETOXY - 4(S) —

PHENYLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 2A) 5 5-<c<¿ 58

4.5 PHÁN UNG TONG HỢP CIS- 3 —- HYDROXYL — 4—- PHENYLAZETIDIN - 2

- ONE (BETA — LACTAM 2B) <5 <5 se sec tEseEseseseeseserseseseesesre 60

4.6 PHAN UNG TONG HOP (+) CIS 3(R) HYDROXYL 4(S)

-PHENYLAZETIDIN - 2 - ONE (BETA — LACTAM 3A) -5-55-<¿ 61

4.7 PHAN UNG TONG HOP CIS - 3- (1 - ETHOX YETHOXY) -4-—

PHENYLLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 4A) -<¿ 64

4.8 PHAN UNG TONG HOP CIS — 1BENZOYL 3 (1 ETHOXYETHOXY)

-4 —PHENYLAZETIDIN - 2 — ONE (BETA — LACTAM 5A) 66

Chương 5 KET LUẬN VÀ MOT SO HUONG MO RONG DE TÀI 68TÀI LIEU THAM KHAO cscssssssssssssssssssssssscsssscsssssssssssessssessssssscsssssssesssssesssssessssessssess 70

3;108090 9" ÔỎ 76

vil

DANH MỤC BANG BIEU

Bang 2.1: Hóa chat dùng trong quá trình nghiên cứu tông hợp - -«- 28Bang 2.2: Dung môi cần dùng trong quá trình tinh chế và sắc ký - 30

Bảng 2.3: Chương trình gradient cho test mẫu -. 5-5-5s< s2 << =s=s=sesssssseseses 33

vill

DANH MỤC HINH ANH MINH HỌA

Hình 1.1: Khung pentadecene (1A) [8] œœ so 5-5 5s 5 99999 5 99993 9090.000 000996000009 0650 4

Hình 1.2: Cau trúc 2 chiều và 3 chiều của paclifaxel -s s5 ss sscssseesesesee 5Hình 1.3: Cau trúc của hop chat 10 — DAB III [8] -° 2 s52 se sssesess«e 7Hình 1.4: Cấu trúc Taxol side chain [Ñ] - << s-s- << se << se se se se se seeeees se 7Hình 1.5: Cấu trúc 7 — triethylsilyl baccantin III [ 8 ] -s s- «- œ e< < <5 s s5 5s sesseesss 7Hình 1.6: Cau trúc của (2R, 3S)-N- benZ0yl-O- 5-2 <5 se se cseseeeesesessesesessvee 8Hình 1.7: Mô hình gap khúc ba chiều với bộ ba xúc tác Ser — Asp — His [27] 16Hình 1.8: Cơ chế bi — bi ping — pOnng s-5-< se sex øeseesseseseesesee 16Hình 1.9: Cơ chế xúc tác của lipase Xúc tác Axit / bazơ thông qua cơ chế Bi — bi Ping

— Pong trong đó E là enzyme, ES * va EP * là các phức chất enzyme — chất nền vàENZYME — SAN phẩm [4] 2 << se 9 se em eeseseseeeesesee 18Hình 1.10: Phan ứng thuỷ phan với xúc tac lipase theo cơ chế bi — bi ping — pong 18Hình 1.11: Đối phân R của ester được ưu tiên cho phản ứng thuỷ phân và transester

với xúc tác lipse (nhóm thé ILÍM]) 5 5 Sơ sư He Hee eeee 20Hình 2.1: Các đối trợng nghiên cứu - 2 s-< se se <seessessesesesseseseesecee 28Hình 2.2: Quy trình xác định đối phân sau phan ứng 2 5-5 < «se ses 34

Hình 4.1: TLC phan ứng tao mine 47 so 5 s 55s 5 999 959993 9 999095 6085099680899 96 46

Hình 4.2: Phố IR của hợp chất Beta — lactam 48 -5 < 55c <csce<csesseseseesesee 48

Hình 4.3: TLC phan ứng tao beta — lactam 4Š o5 55s 599 5959999555 95 50550996 49

Hình 4.4: Phố IR của hợp chất Beta — lactam 1A 49A, C s 5s -scsec<csec«e 5Hình 4.5: Phố IR của hợp chat Beta — lactam 1B 49B, D 5-5-5 se c<csec«e 53

Hình 4.6: TLC phản ứng theo tỷ lệ 2:0,5 với enzyme Amano AK ««-<<s« 56Hình 4.7: TLC phan ứng thuỷ phân theo tỷ lê 2:1 và 2:2 với enzyme Amano AK 56Hình 4.8: TLC phan ứng thuỷ phân theo tỷ lệ 2:0,5 với enzyme Amano PS 57

Hình 4.9: Phố IR hợp chất beta — lactam 2 A 5 - 5< 5 se <csecscsesseseseesesersesesee 58

Hình 4.10: TLC phản ứng {ao S(AÁ do << 9 95.990.905 5.0004 9.00 000009 990006089996.06 59Hình 4.11: TLC phản ting ta0 S( Ö, << G9 5 999.95 904 9.10 00009990000 089996.06 61

Hình 4.12: Phố IR hợp chat beta — lactam 3A 51 A -5-5- <sce<cscsecseseesesee 62

Hình 4.13: TLC phản ứng tạo beta — lactam 3A 5Í A oo5- o5 G S525 5555955555595 55 62Hình 4.14: TLC phản ứng tạo beta — lactam 4A 5Š2A o0 G55 5055505599555 895 55 64Hình 4.15: TLC phan ứng tao beta — lactam 5A 53 AÁ co S99 9556055 88996656 66

DANH MỤC SO DO PHAN UNG

Sơ đồ 1.1: Phan ứng tổng hợp taxol từ 10 — DAB theo phương pháp Greene [8] 8

Sơ đồ 1.2: Phương pháp tông hop taxol tir beta — lactam [29] 5-5 s 5s cse«- 9Sơ đồ 1.3: Sự hình thành beta — lactam bởi phan ứng Staudinger [30] 9

Sơ đồ 1.4: Phan ứng tổng hợp 7 — TES — Baccatin III [9] - 5-5-5 5s ss«e 10Sơ đồ 1.5: Phương pháp tông hợp taxol của Shinada và Ohfune [31] 11

Sơ đồ 1.6: Quy trình tổng hợp mạch nhánh taxol side chain từ eis-einnamyl [32] 12

Sơ đồ 1.7: Quy trình tổng hop mạch nhánh từ methyl cinnamat [32] 13

Sơ đồ 1.8: Quy trình tổng hop mạch nhánh taxol side chain từ B - lactam [35] 13

So đồ 1.9: Quy trình tổng hợp chuỗi side chain từ trans — phenylglycidic esters [56] 21Sơ đồ 1.10: Phan ứng thuỷ phân và transester hợp chất beta — lactam băng lipase của0+) 00:3y0ïà28L7107 22

Sơ đồ 1.11: Tổng hợp chuỗi side chain bằng phản ứng thủy phân lipase của Patel [58]Sơ đồ 1.12: Tông hợp chuỗi side chain C — 13 theo phan ứng ngưng tụ Darzens [58] 24Sơ đồ 1.13: Xúc tac lipase cho quá trình chuyển hoá của syn - và anti — 3 [58] 24

Sơ đồ 1.14: Quy trình sinh tổng hop taxol bang phương pháp PCF [63] 26

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TU VIET TAT

I0 — DABAc

CTPTDCMDMSO

Et

hHPLC

KLPTMeMH+

PhPhố 'H NMR

s

ddd

t

q

m

Pho IRTLCTES

THF

SerHisAspGlu

10 — deacetylbaccatin IIIacetyl

Công thức phan tửDichlomethaneDimethylsufoxideEthyl

Gi0High Performance Liquid Chromatography (Sac kylỏng hiệu năng cao)

Khối lượng phân tửMethyl

Phân tử bi proton hóa (Protonated molecules)Phenyl

Phố cộng hưởng từ proton ('H)Đỉnh đơn

Đỉnh đôiĐỉnh đôi của đỉnh đôiĐỉnh tam

Đỉnh tứDinh đaPhố hồng ngoạiThin layer chromatography (Sac ky lớp mỏng)Triethylsilyl

TetrahydrofuranSerin

HistidinAcid asparticGlutamate

DPCDMAP

Et3N

NMODQCBOsO¿

Enatiomeric excess (độ tinh khiết quang học)đi — 2 — pyridyl cacbonat

4 -dimetylamino — pyridinTriethylamin

N — methylmorpholine — N — Oxiddihydroquinidin 5 — ClorobenzoatOsimum teroxid

Xii

GIỚI THIEU

Paclitaxel (có tên thương mại là taxol) là một sản phẩm thuốc chong ung thuchiết xuất chủ yếu từ vỏ cây Thông đỏ Thái Bình Duong Taxus ssp, Taxusbrevifolia Nutt trong đó hai dược phẩm nỗi tiếng sử dụng nhiễu và hiệu quả nhấttrong điều trị ung thư buông trứng, ung thư vú, ung thư phối chiết xuất từ các loàiThông đỏ la paclitaxel (Taxol®, Mỹ) va docetaxel (Taxotere®, Pháp) Do có giá trikinh tế cao, các loài thông đỏ này bị lạm dụng khai thác làm cho nguồn dược liệuthiên nhiên này ngày càng trở nên khan hiếm, đe dọa nguy cơ tuyệt chủng [1].Trong những thập niên qua, các nhà nghiên cứu đã không ngừng nghiên cứu tổnghợp nên paclitaxel bằng nhiều con đường khác nhau nhằm tìm ra con đường bántong hợp mới hơn, ngăn hơn cũng như tao ra những hoạt chất mới dựa trênpaclitaxel có hoạt tính sinh học cao hơn, dễ tong hop hon va higu qua kinh té caohon [2].

Paclitaxel và docetaxel thuộc họ taxanes được điều chế thông qua các tuyếnđường như tổng hợp toàn phân, bán tổng hợp ưu việt nhất là sử dụng hợp chấttrung gian beta — lactam cùng với một số dẫn xuất của 10 — deacetylbaccatin III (10— DAB) dé tạo thành một chuỗi “taxol side chain” ở vị trí C — 13 Thông qua việc sửdụng xúc tác, hầu hết các sản pham tong hợp được déu là hỗn hợp các đồng phânđối quang (racemic) và lập thể của các taxanes này có ảnh hưởng đến hoạt tính sinhhọc Phương pháp điều chế lập thể của các hợp chất trung gian Beta — lactam cũngnhư các sản phẩm taxanes cuối cùng đã trở thành chủ đề nghiên cứu trong cả lĩnhvực sinh học lẫn hoá học [3] Van đề thường gặp khi sử dụng xúc tác hoá học trongchọn lọc đối phan là độc hại với môi trường, dat tiền, độ chọn lọc không cao; trongkhi đó các xúc tác sinh học chang han như enzyme có thé hoat dong 0 diéu kiénbình thường, không đòi hỏi nhiệt độ hay áp suất lớn tránh những tác động có hạicho môi trường Uu điểm lớn của enzyme so VỚI chất xúc tác hoá học là độ chọn lọccao kế cả độ chọn lọc lập thể (stereoselectivety), chon lọc hoá học(chemoselectivity) va chọn lọc vùng (regioselectivity) Do đó, việc lựa chonenzyme cho quá trình phân tách các hỗn hợp đồng phân đối quang của hợp chất

trung gian Beta — lactam là hữu ích trong điều chế taxol, đó cũng là lý do tôi chọnđề tài “Nghiên cứu phản ứng thuỷ phân bang enzyme định hướng tổng hoptaxol”

Từ mục tiêu tông quát nêu trên, chung tôi dé ra các mục tiêu nghiên cứu cụ thênhư sau:

— Nghiên cứu quá trình tong hợp Imine làm nguyên liệu dé tổng hợp hợp chatbeta — lactam.

— Nghiên cứu quá trình tong hợp hợp chat Beta — lactam — tiền chất tong hopnên taxol.

— Nghiên cứu quá trình thuỷ phân Beta — lactam băng enzyme để tách hỗn hợpraxemic thành hai đồng phân đối quang Tối ưu hoá các điều kiện phản ứngthuỷ phân để đạt hiệu suất cao nhất

— Nghiên cứu một số các phản ứng tổng hợp mạch nhánh của phân tửpaclitaxel.

— Kiếm tra cau trúc và độ tinh khiết của các hợp chất tông hop được bang cácphương pháp phân tích hoá lý hiện đại như phố hồng ngoại IR, phố khối MS,pho cộng hưởng từ hạt nhân từ 'H NMR, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC),góc quay cực, nhiệt độ nóng chảy

Chương 1 TONG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT VE HOP CHAT PACLITAXEL

Paclitaxel (Taxol) nổi tiéng được biết đến với những hữu ích về mặt lâm sàng làmột chất chong ung thu tự nhiên, một trong những alkoloid diterpenoid tự nhiênđầu tiên được chiết xuất từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình Duong Taxus brevifolia [4|-[6] và cầu trúc hoá học của taxol được công bố đầu tiên vào năm 1971 trong cáccông trình nghiên cứu [5], [7]19] Trong quá trình nghiên cứu và sang lọc,paclitaxel không thé hiện hoạt tính sinh hoc nào nổi bật nhưng lại mang một cơ chếtác động độc đáo lên quá trình hình thành vi ống (microtubule) của tế bào (Molè —Bajer, 1983) [10] nên có hoạt tính kháng khối u mạnh Kết hợp với đặc tính khônggây độc, taxol trở thành chất hàng đầu trong điều trị ung thư vú di căn và ung thưbuông trứng từ những thập niên 90 Hàm lượng taxol thu được từ vỏ cây thông đỏrất thấp, khoảng 0,01% (1000mg/kg vỏ cây khô [5], [11], [12] trong khi nhau cầutaxol trong điều trị ung thư ngày càng lớn Năm 1989, Holton đã phát triển mộttuyến đường bán tổng hợp paclitaxel bắt dau từ tiền chất sinh tong hợp 10 — DABvới hàm lượng taxol thu được lớn hon so với hàm lượng paclitaxel trong Taxusbaccata [12] Điều này là lý tưởng cho quá trình tổng hop Taxol với quy mô lớn vàhiệu quả kinh tế hơn

Vé mặt hoá học, taxol được phân loại như một diterpenoid taxane hay taxoid vớibộ khung gồm 20 cacbon xuất phát từ geranylgeraniol pyrophosphate có hệ thôngkhung co bản pentadecene (1.A) như sau:

Hình 1.1: Khung pentadecene (1A) [8]

Đặc trưng cấu trúc trong phân tử Paclitaxel bao gồm một lõi (core) tetracyclicbaccatin III và một phần đuôi amide Các core nay được đánh số từ trái qua phảigôm có một vòng A (cyclohexene) cố định trong cấu tạo dạng thuyền, một vòng B(cyclooctane) ở cầu tạo dạng thuyền, một vòng C (cyclohexane) giả định trong lớpvỏ bị biến đối bởi vòng D (oxetan) hợp nhất với nó [8], [9],[12], [13] Taxol làmditerpenoid taxane bởi sự ester hóa tại vi trí C — 13 của bộ khung pentadecene vớimột nhóm ester N — benzoylphenylisoserine gọi là “Taxol side chain” Sự hiện diệncủa chuỗi taxol side chain là một yếu tố quan trọng can thiết trong hoạt động cautrúc của Taxol Hóa lập thé ở vị trí 2’R, 3°S của các nhóm thé hydroxyl và nhómphenyl ở các vi trí C — 2’ va C - 3' đều rất cần thiết cho hoạt động cau trúc Việcloại bỏ nhóm thé benzoate tại C — 2 hoặc nhóm thé acetate tại C — 4 hay chỉ cần mộtthay đối nhỏ trong chuỗi “Taxol side chain” đều có ảnh hưởng đến hoạt động cấutrúc của Taxol [14].

Hình 1.2: Cau trúc 2 chiều và 3 chiều của paclitaxel

1.2 MỘT SÓ PHƯƠNG PHAP TONG HỢP TAXOL TỪ 10 — DAB12.1 Tong hợp toàn phần

Dựa vào đặc tính cau trúc phức tap của paclitaxel, các nhóm nghiên cứu khôngngừng nghiên cứu tổng hợp taxol bằng các con đường độc lập khác nhau, cho đếnnay tong cộng có hơn bảy phương pháp tông hợp toàn phần nên taxol [15] liên quanđến hai quá trình, đó là quá trình tong hợp nên chuỗi “Taxol side chain” và quá trìnhtong hợp bộ khung đa vòng polycyclic Phương pháp dé tổng hợp bộ khung đa vòngcủa taxol được chia thành hai phần: một phan tạo ra bộ khung AB bang phan ứngphân cắt hợp chat đa chức epoxy — alcohol từ tecpen tự nhiên bắt nguồn từ nhữngnguyên liệu ban đầu là (-) — camphor (long não) và œ - pinien (Holton và Wender)[16]-[18], phan kia là thực hiện phản ứng đóng vòng nội phân tử giữa vòng B nốivới vòng AC [16] Theo Nicolaou thì xây dựng bộ khung vòng A và vòng C sau đóhình thành vòng B bởi phản ứng đóng vòng [16], [19] Năm 1995, Danishefsky sửdụng phan ứng tạo vòng Heck để tổng hợp toàn phan taxol [16], [20] Năm 1997,Mukaiyama đã công bố phương pháp tổng hợp toàn phần Taxol theo hướng xâydựng vòng B trước, kế đến là vòng A và vòng C, sau đó gan vòng A, vòng C vàovòng B dựa trên nguồn nguyên liệu ban dau là glycol neopentyl hoặc L — serine

[2I]-123I.

Tiền chất sinh tong hợp 10 — DAB (Hình 1.3) là một chat trung gian thứ nămđược sử dụng trong quá trình tổng hợp paclitaxel của loài Taxus [24] Hiện nay,Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn sử dụngpaclitaxel như một giải pháp điều trị các bệnh có liên quan đến ung thư vú, ung thưphối, ung thư buông trứng và hội chung AIDS [25], [26] Tuy nhiên, để tong hoptaxol từ 10 — DAB thì yêu cau dau tiên phải thoả mãn các điều kiện sau đây [8], [9],

[15], [25]-{28]:

Thứ nhất, tổng hop được chuỗi N — benzoyl — beta — phenylisoserine “ taxol

side chain” (Hình 1.4) va bao vệ nhóm hydroxyl OH tại vi tri C — 2’ cua chudi “

taxol side chain” Sau đó, bao vệ nhóm hydroxyl OH tai vi tri C — 7 va acetyl hoanhóm hydroxyl OH tai vị trí C — 10 Nghiên cứu thay rang nhóm acetate tại C — 7 vanhóm diacetate tại C — 7, 10 được hình thành với số lượng tương đương nhau trongđiều kiện nhẹ (24h, 20°C) Trong điều kiện ràng buộc hơn (48h, 60°C), nhómdiacetate tại C — 7, 10 và triacetate tại C — 7, 10, 13 cũng được hình thành với sỐlượng tương đương Tuy nhiên, dưới điều kiện mạnh mẽ hơn (24h, 80°C) thì chỉ cótriacetate được hình thành Nghiên cứu này chỉ ra rằng thứ tự phản ứng acetyl hoácủa các nhóm thé hydroxyl ở các vị trí 7> 10>> 13 Ngoài ra, trong điều kiện acetylhóa bình thường, không xảy ra sự thay thế nhóm hydroxyl OH bậc ba tại vị trí C— 1do bị cản trở về mặt không gian nên Ké cả các nhóm thé hydroxyl tại vi tri C — 7,10, 13 là nhóm thế bậc hai nhưng liên kết hydro giữa nhóm thế hydroxyl OH tại C—13 và nhóm Acetate tại C — 4 của phân tử 10 — DAB cùng với nhóm thé OH ở C —13 của bộ khung tetracyclic làm cho phản ứng của nhóm OH tại C — 13 yếu nhất

Cuối cùng phương pháp hiệu quả cho các khớp nối là bảo vệ chuỗi “side chain”với bảo vệ dẫn xuất của 10 — DAB chang hạn như 7 — (triethlsiyl) — baccatin III(Hình 1.5) Mac du quá trình este hóa của rượu bậc hai xảy ra khó khan do liên kếthydro giữa nhóm OH tại C — 13 của baccatin III với nhóm acetate tại C — 4 làmgiảm khả năng phản ứng của nó Dé khắc phục van đề này, Potier, Greene và cộng

sự đã sử dụng một chuỗi bảo vệ side chain 7 — (triethylsilyl) — baccatin III (Hình

1.6) duoc phan ứng với lượng dư (2R, 3S — N — benzoyl — O — (1 — Etoxyetyl) — 3

— phenylisoserine (Sơ đồ 1.1) trong sự có mặt của di — 2 — pyridyl cacbonat (DPC)và 4 — (dimetylamino) — pyridin (DMAP) ở 73°C trong toluene cho 100 h, loại bỏcác nhóm bảo vệ với dung dich HCL loãng, sau đó thu được Taxol với hiệu suất cao

Hình 1.4: Cấu trúc Taxol side chain [8]

Hình 1.5: Cấu trúc 7 — triethylsilyl baccantin III [8]

VU >

> =>

TL+OoOuY NZOHO

Hình 1.6: Cau trúc của (2R, 3S)-N-

benzoyl-O-phox

o_ 9 <

6 Ty

1 DPC, DMAP, Toluen2 HCL loãng

Phương pháp bán tổng hợp Taxol từ 10 — DAB do Potier, Green công bố dautiên có liên quan đến độ hoạt động tương đối của bốn nhóm hydroxyl trong phân tử10 — DAB bởi sự tan công của nhóm acetyl ở vị trí C — 10 và chuỗi ester B-amido ởvi trí C — 13 qua quá trình ester hoá của rượu bậc | tại vi trí C — 13 với một beta —amido carboxylic acid Sự hiện diện của chuỗi Beta — amido ở vị trí C — 13 là cầnthiết cho hoạt tinh kháng khối u [25] khi cho beta — lactam phan ứng với alcohol vớisự có mặt của một lượng tác nhân trong điều kiện hiệu quả để tạo thành một esterBeta — amido có thé sử dụng như một chat trung gian trong quá trình tổng hợp taxol

Ac0 L0

7 2

5

Sơ đồ 1.2: Phương pháp tổng hợp taxol tir beta — lactam [29]

Một số nhóm nghiên cứu đã đưa ra phương pháp tổng hợp có chọn lọc hợp chấtbeta — lactam sử dụng hợp chat polyaromatic imines theo phản ứng Staudinger.Nghiên cứu hoạt tính cau trúc đã cho thấy răng | — N - chrysenyl và 1 — N —phenanthrenyl 3 axetoxy — 4 — aryl — 2 — azetidinones có hoạt tính chống ung thumạnh Sự hiện diện của nhóm axetoxy cua beta — lactam nhóm tại vi trí C — 3 đãđược chứng minh là có hoạt tính chồng ung thư của hợp chất đó [9], [29], [30]

Phan ứng chuyển đổi 10 -DAB 3 thành 7 — triethylsilyl — 10 - DAB 4a ở 23°Cvới sự có mặt của tác nhân (C›Hz)S¡C]T trong pyridine Sau khi tinh chế, lượng sảnphẩm thu được khoảng 84 — 86%, còn phan ứng để tạo ra 7 — O — triethylsilylbaccatin III 4b xảy ra ở điều kiện 0C với sự có mặt của tác nhân CH;COCI trongpyridine, lượng sản phẩm thu được chiếm khoảng 86% Hợp chất 4b có thể phảnứng với hợp chất beta — lactam tạo ra hợp chất taxol trung gian trong đó tại vị trí C— 7 va C — 2’, các nhóm hydroxyl OH được bảo vệ với nhóm triethylsilyl TES vàethoxyethyl tương ứng Các nhóm thé nay sau đó được thuỷ phân trong điều kiệnnhẹ không làm ảnh hưởng đến các liên kết ester hay các nhóm thé taxol.

1 (CaH;)zS¡iCI, CzHzN2 CHạCOCI, C;HzN

Sơ đồ 1.4: Phan ứng tổng hợp 7 — TES — Baccatin III [9]

Shinada và Ohfune đã thực hiện thành công phương pháp bán tổng hợp mớitaxol từ dẫn xuất 10 — DAB 3 thông qua sự chuyển hoá ester ethyl benzoylacetatevà bảo vệ nhóm 10 — DAB 3 khi gan phan đuôi ester Beta — keto vào vị trí C — 13có mặt chất xúc tác qua quá trình chuyển hoá ester Beta — keto và hình thành chấtmới ở vị trí 2” - OH — 3’ — NH; và chất đồng phân không đối quang mà không canbat kỳ một trợ chất bat đối xứng nào [12], [31]

Sơ đồ 1.5: Phương pháp tông hop taxol của Shinada va Ohfune [3 1]

1.2.2.2 Một số phương pháp bán tong hợp mach nhánh taxol side chain“Taxol side chain” được nghiên cứu cũng là một trong những công đoạn quantrọng trong quá trình tong hợp nên paclitaxel vì nó góp phan quyết định đến hoạttính sinh hoc của phân tử paclitaxel nhưng cũng là phan linh động, dễ bị biến đổinên phải có phương pháp phù hợp để bảo vệ nhóm hydroxy tại vị trí C — 2° [32]-[34] Sau khi ghép mạch nhánh “taxol side chain” vào khung baccatin, các nhómbảo vệ sẽ được loại bỏ dưới những điều kiện nhất định để hình thành một phân tửpaclitaxel hoàn chỉnh.

Green và các cộng sự lần dau tiên đưa ra phương pháp tong hợp thành côngchuỗi taxol side chain bằng phản ứng epoxy hoá Sharpless để chuyển alcohol cis-cinnamyl 16 thành nhóm alcohol epoxy 17 với hiệu suất 61 — 65% trong đó 76 —80% là đồng phân quang học [35] Dẫn chất trung gian này sẽ thực hiện phản ứngmở vòng bằng xúc tác azidotrimethylsilane với lượng nhỏ ZnCl, tạo thành dẫn chat18 Sau phản ứng khử và chuyển hóa nhóm benzoyl, mạch nhánh methyl ester 4được hình thành qua sự chuyển hoá giữa O N với hiệu suất 23% sẵn sàng chophan ứng ghép cặp vào khung baccatin.

Sơ đồ 1.6: Quy trình tổng hop mạch nhánh taxol side chain từ cis-cinnamyl [32]

Greene đã cải tiến phương pháp epoxy hóa của Sharpless trong tổng hợp chuỗiside chain C — 13 bang phan ứng dé hydro hoá methyl cinnamat trong dung dichacetone với osimum teroxid, N — methylmorpholine — N — Oxid (NMO),dihydroquinidin 5 — Clorobenzoat (DQCB) và oxy hoá đồng thời chuyển thành hopchat cis — diol 20 đạt hiệu suất khoảng 82% và trong đó khoảng 82% là đồng phânquang học [36], [37].

1 DỌCB, NMO, OsO¿ (cat.)

W > COOMe Phe j3 ,coowe

2 TsCI, Et;N, CH,Ch, aceton - H;O pp K;CO; V\A

Sơ đồ 1.7: Quy trình tổng hợp mạch nhánh tir methyl cinnamat [32]

Holton đã đưa ra phương pháp tong hợp chuỗi side chain methyl ester bat nguồntừ bộ khung B-lactam gồm cả a — và — amino axit bang NaBH, để chuyển 23thành đơn đồng phân dạng cis 24, dùng dẫn xuất chloacetyl để bảo vệ nhómhydroxyl mới tạo thành 25 Mở vòng dẫn suất B - lactam bang TMSCI trong MeOHđồng thời bảo vệ nhóm hydroxyl của a-hydroxy f - aminoester 26 dé chuyền thànhhợp chat taxol side chain methyl ester 4

H

o Ph Ho Ï ph xua Ph

VY 1 NaBH, MeOH - T SY 4 OCICH,CO, Pyrindin, CH;CI

N i 2 CAN, MeCN - H;O, 0 - 5°C NH

26 OH

Sơ đồ 1.8: Quy trình tổng hợp mạch nhánh taxol side chain từ B - lactam [35]

1.2.3 Phản ứng thuỷ phân bằng enzyme trong bán tổng hop taxol1.2.3.1 Giới thiệu chung về lipase:

Lipase (tricyglycerol acyhydrolase, EC 3.1.1.3) thuộc ho serine hydrolazes,đóng vai trò trong qua trình di hoá cua triacyglycerides thành di — vàmonoacyglycerides, các axit béo tự do va glycerol Lipase là một trong những xúctác được sử dụng nhiều nhất và phố biến nhất cho nhiều loại phản ứng như thuỷphân, ester hoá, alcoholysis vì nó có tính chọn lọc lập thể rất cao trên nhiều loạichất nền đặc biệt là chất nền không tan trong nước nên rat được ứng dụng trongtong hợp hữu cơ chăng hạn như điều chế các hợp chất đối quang tinh khiết Cáclipase tác dụng lên các nối carboxyl ester của các triaciglycerol và các chất nền kháctương tác trong các dung môi hữu cơ với lượng nước thấp [38]-[40] và hoạt độngxúc tác diễn ra trên bé mặt phân cách giữa pha nước và pha dung môi hữu cơ [41].Lipase có tính 6n định cao và hoạt động tốt trong các dung môi hữu cơ va thườngkhông cần bat kỳ một yếu tố đồng thời nào cho xúc tác phản ứng Mỗi lipase có 1giá trị pH tối ưu, sở hữu một nhiệt độ tối ưu do trạng thái bên nhiệt của mỗi lipasekhác nhau Dựa vào các điều kiện phản ứng thủy phân đạt được đến cân băng và cácthành phan trung gian ở chuỗi thủy phân được tách ra nhờ sự kết tinh, chưng cấthoặc sac ký.

Lipase hiện diện trong tat cả các sinh vật từ vi khuẩn (chăng hạn như chủng loạiPseudomonas, Bacillus, ), nam ( như chung loại Candida, Penicillium, ), men,xạ khuẩn (Antinomycetes), thực vật ( từ cây đu đủ, dứa như Veronia, Euphorbia)đến động vật (như cô lập từ tuyến tuy của heo PPL (Porcine pancreatic lipase)) vàtên gọi thường được đặt theo sinh vật đã sản sinh ra nó Đa số các lipase thương mạiđều có nguồn gốc từ vi sinh vật [3], [38] [42]-[45]

Lipase được ứng dụng rộng rãi trong chuyền hoá sinh học và trong tong hợp hữucơ, đặc biệt lipase được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ là sự phân giải các hỗn hợpracemate, nó có thé phân biệt giữa các nhóm đối hình (enatiotopic) và nhóm đối ảnh(enatiomers) Do khả năng chọn lọc phản ứng trên nhiều loại dung môi hữu cơ khácnhau nên lipase có vai trò rất quan trọng trong ngành y dược đặc biệt là trong điều

trị ung thư hay nói cách khác lipase là chất hoạt hoá các yếu tố phá huỷ tế bào ungthư.

1.2.3.2 Giới thiệu lipase PCL, PFLTheo các tác giả [39], [46], PCL (Lipase Amano PS) xuất phát từ vi khuẩnchủng Pseudomonas cepacia (còn gọi là Burkholderia cepacia), do tên vi khuẩn nàythay đổi theo thời gian và có nhiêu nhà sản xuất nên PCL có nhiễu tên gọi cũng nhưtên viết tắt khác nhau như là Burkholderia cepacia lipase, Altus Biologics(ChiroCLEC — PC), Amano P, Amano P — 30, Amano PS, Amano LPL — 80,Amano LPL — 200S Tat cả các tên cho cùng một lipase đó đều được phân lập từ vikhuẩn ATCC 21808 PCL là enzyme hình cau có khối lượng phân tử là 30 — 35kDa,chuỗi polypeptide cau tao từ 320 amino axit PCL có dạng bột màu trang, có mùinhẹ, tan một phần trong nước, hoạt động tốt nhất ở pH từ 7- S8

PFL (lipase Amano AK) xuất phát từ vi khuẩn chủng Pseudomonas fluorescensvà cũng có nhiều tên gọi cũng như tên viết tắt khác nhau như Amano (lipase AK),Amano (lipase YS) PFL có dang bột màu nâu, có mùi nhẹ, tan một phan trongnước, hoạt động tốt nhất ở pH từ 7 — 8 PCL, PFL xúc tác cho phản ứng thuỷ phântriglicerid với số C > 8

1.2.3.3 Cau trúc và cơ chế phản ứng của lipase:4 Cấu trúc lipase:

Theo các nghiên cứu cho đến nay có khoảng 12 lipase được giải thích có đặcđiểm cấu trúc chung [46], [47] Trung tâm hoạt động trong tất cả các lipase đềuhình thành từ ba axit amin đó là Serine ( Ser), Aaspartate (Asp) hoặc Glutamate(Glu) va Histidine (His) gọi là bộ ba xúc tác Cau trúc ba chiều của tất cả các lipasetheo một motif phổ biến là chuỗi nếp gấp khúc a/B — hydrolase gồm một bảng(sheet) B làm trung tâm tạo bởi các dải sợi (strand) tương tự nhau dải sợi thứ haisắp xếp ngược chiều so với các dải sợi còn lại Các chuỗi xoăn œ nằm xen kẻ cácdai sợi từ B3 dén Bg và năm ở hai bên của bảng ; bảng B xoăn về bên trái sao cho

bê mặt của bảng tạo thành nửa hình trụ và góc tạo bởi dải sợi đầu tiên và dải cuôicùng khoảng 90”.

Hình 1.7: Mô hình gap khúc ba chiều với bộ ba xúc tác Ser — Asp — His [27]

% Cơ chế phản ứng lipase: Cơ chế bỉ — bi ping — pong:

Si Pi > ọ

`4

E ES, F* FS» E

ay

Hình 1.8: Cơ chế bi — bi ping — pong

Trong co chế này, phản ứng phát xuất từ trái sang phải được thé hiện bằng mũitên năm ngang Chất nên dau tiên S¡ phản ứng với Enzyme dé tạo thành phức hợpđầu tiên ES, và phóng thích ra sản phẩm P¡ ( một mảnh của chất nền S¡ ban đầu).Enzyme ban đầu biến đổi thành phức hợp thứ hai F* có mang phan còn lại của S,tiếp tục phan ứng với chất nền S, để tạo thành phức hợp thứ ba FS, và phóng thíchsản phẩm P; đồng thời trả lai enzyme ban đầu E Emzyme theo cơ chế này tổn tạitrong hai trạng thái đó là trang thái ban đầu E và trạng thái biến đối về mặt hoá họcE* gọi là trạng thái trung gian phản ứng Trong cơ chế nay, chất nền S, nối kết làmthay đối enzyme ở trạng thái ban đầu E thành E* bang cách giao một nhóm chức

vào trung tâm hoạt động (active site) và sau đó được phóng thích P¡ Sau khi chatnên dau tiên P, được phóng thích, một chất nền S, mới có thé kết nối lại phan ứngvới E* và tái tạo trạng thái ban dau E [48]-[50].

Cơ chế chủ yếu của xúc tác lipase là theo cơ chế bi — bi ping — pong [48]-[53].Nó là một phản ứng hai bước Hai chất nền được chuyển thành hai sản phẩm (bi —bi) và sản phẩm dau tiên phóng thích khỏi trung tâm hoạt động trước khi chất nềnthứ hai vào (ping — pong) Đầu tiên, trung tâm hoạt động serine của lipase có nhiệmvụ như một tác nhân nucleophin, được acyl hóa với nhóm cacboxyl của chất nên |(chất cho acyl) tạo thành một trung tâm tứ diện ES* và các alcol R'OH (hoặc nướcnếu R'= H) được phóng thích dé cung cap cho các enzyme acyl (ES) Chất cho acylcó thể là ester carboxylic, acid carboxylic, anhydric, beta — lactam hoặclacton Thứ hai, phức hop enzyme acyl (ES) được dé acyl hod (deacylation) bởitác nhân nucleophin như nhóm hydroxyl của chất nền 2 ( có thé là nước hoặc alcol)tạo ra một trung gian tứ diện thứ hai (EP*), phân hủy tái tạo trạng thai enzyme banđầu (E) và các sản phẩm acyl (P) Như vậy, hai khu phức hợp trung gian (ES * vàEP *) tham gia vào cơ chế phản ứng Ester trong phản ứng thủy phân đóng vai trònhư chất nên | trong sự hình thành của các enzyme acyl Vì vậy, việc hình thành vàphóng thích của trung gian tứ diện đầu tiên (ES *) quyết định kết quả và độ chọnlọc của xúc tác lipase thủy phân Tuy nhiên, ở độ phân giải động của rượu, sự hìnhthành và phóng thích của trung tâm tứ diện thứ hai (EP *) là quan trọng bởi vì rượuđóng vai trò như chất nên 2 trong sự hình thành của trạng thái chuyển tiếp EP *

Hình 1.9: Cơ chế xúc tác của lipase Xúc tac Axit / bazo thông qua co chế Bi — bi Ping— Pong trong đó E là enzyme, ES * và EP * là các phức chất enzyme — chất nền và

enzyme — sản phẩm [49]

1

Nu NwH

Trung gianacyl enzyme

RCONu! + Enz ye RCO-Enz RCONw + = Enz

Hình 1.10: Phan ứng thuỷ phân với xúc tac lipase theo co chế bi — bi ping — pong

1.2.3.4 Phân giải dong học với PCL, PFLTheo các tac gia [39], [47], [54], [55], PCL, PFL có thé dung lam xtic tac chonhiều chất như alcol, acid, amin, ester Trong phan ứng phân giải alcohol nhị cấphoặc ester, Kazlauskas đã dự đoán đồng phân đối quang sẽ cho phản ứng phân giảinhanh là đồng phân có nhóm thế có kích thước lớn L có số C > 3 và có nhóm thế cókích thước trung bình M có C > 2; khi thay đổi nhóm thế L và M thì chất nền sẽkhông phù hợp với trung tâm hoạt động của lipase làm cho phản ứng xảy ra sẽ chậmhơn.

Trong sự chọn lọc đồng phân đối quang phản ứng thuỷ phân hay ester hoá thìđồng phân R cho phản ứng nhanh hon đồng phân S Kazlaukas cho rang sự chọn lọcđối phân của lipase phan lớn phụ thuộc vào cau trúc của chất nên, hau hết các lipaseđều được ưu tiên cho chất đồng phân có cấu hình R mang nhóm thé nhỏ và lớn tạitâm bat đối xứng Sự chọn lọc này càng tăng khi có sự khác biệt về kích thước củahai nhóm thế ngày càng lớn, kích thước của nhóm thế nhỏ sẽ làm giảm khả năngphản ứng của chất nên với lipase, néu nó vượt quá carbon thì chất nên sẽ phản ứngchậm hoặc không phản ứng Điều này đã được kiểm nghiệm trên 130 ester củaalcohol nhi cap đối với các loại lipase như PCL, CRL dựa trên kích thước của cácnhóm thế tai tâm bat đối xứng va được gọi là “quy tac thực nghiệm Kazlaukas”.Quy tắc thực nghiệm này dùng để dự đoán đối phân ưu tiên cho alcohol và ester củaaxit carbocylic nhưng độ tin cậy trong dự đoán đối phân cho ester sẽ thấp hơn sovới alcohol nhị cấp

Hình 1.11: Đối phân R của ester được ưu tiên cho phan ứng thuỷ phân va transester

với xúc tác lipse (nhóm thế L>M)

1.2.3.5 Một số phản ứng tổng hop mạch nhánh có sử dụng enzyme lipaseHoing là người dau tiên đã phác thảo quy trình tổng hợp chuỗi side chain C — 13dựa trên tuyến đường enzyme và được Chen và cộng sự đã tong hop thuc té chudiside chain C — 13 bằng phan ứng enzyme hoá chiral trans — phenylglycidic esters sửdung vi khuẩn Mucor michei (Amano, MAP — 10) (So đồ 1.9) [[56] qua một chuỗicác phản ứng chuyển vị cau hình của (2R, 3S) — epoxide (-)-27 với diethylaminehydrobromide và diethylaluminium clorua tạo thành (2R, 3R) bromide — hydroxy29 Phan ứng benzoyl hoá, dé hydro hoá và thuỷ phân bang K,CO; trong methanolthu được chuỗi “Taxol side chain” đạt hiệu suất 80% từ (-) -27 Mat khác rượuazido (+) -33 tạo ra từ (+) - 28 bang phan ứng mở vòng epoxide qua quá trìnhchuyển đổi benzoyl làm đảo ngược cấu hình ở vị trí C — 2’, thuỷ phân với HCI thuđược chuối side chain 4

tạo thành một hỗn hợp phan ứng trong đó có khoảng 1 gam Beta — lactam với

khoảng từ 5 ml đến 100 ml đồng chất, điều chỉnh và duy trì pH ở khoảng từ 7 đến 8với bộ dung dịch đệm phosphate Dung môi cho pha hữu cơ có thé bat kỳ dung môihữu cơ nào có khả năng trộn lẫn trong nước chang han nhu toluen, benzen, hexan,cyclohexane, xylene, dichloromethane, ether , pha nước có thé là nước cất, dungdịch đệm đặc biệt là dung dịch đệm photphate với tỉ lệ thé tích dung mồi hai pha tốtnhất là khoảng 10 đến 90 phần trăm theo thể tích pha hữu cơ và khoảng 90 đến 10phân trăm theo thể tích của pha nước Lựa chọn thời gian phản ứng dựa trên đồngchất, nhiệt độ và nồng độ enzyme Nhiệt độ làm việc từ khoảng 4°C — 60°C, tối ưunhất là khoảng 30°C — 50°C [3], [43], [44]; thời gian phan ứng thích hợp có thểkhác nhau tùy thuộc vào lượng enzyme sử dụng và mức độ hoạt động của nó, chănghạn như ở 30°C, thời gian phản ứng là 24h sẽ phản ứng cho độ tinh khiết quang

học là 98% trở và có thé dao động lên đến khoảng 72h cho các chuyền đổi lớn hơn,độ tinh khiết quang học thu được có thể sẽ cao hơn [57].

Rosario Brieva đã mô tả và đưa ra các quy trình thử nghiệm quá trình thuỷ phândẫn xuất beta — lactam cần thiết cho tổng hop “taxol side chain” băng xúc tác lipasevà thực hiện chuyên hoá trong dung môi hữu cơ Tính chat lập thé của xúc tác thuỷphân lipase P — 30 trên hợp chất beta — lactam được xác định băng cách thiết lập cầuhình tuyệt đối của beta — lactam là (3R, 4S) thông qua các phản ứng sau đây [42]:

OCH, (+) -35B (-) -35A(4) -35B 3R,4S 35,4R

lactam có độ chọn lọc đối quang cao và giảm lượng vi khuẩn đối quang chọn lọccủa 2 — keto — 3 — N — benzoylamino — 3 — phenyl propionic axit ethyl ester tạo ra(2R, 3S) —(- ) — N — benzoyl — 3 — phenyl isoserine ethyl ester đạt hiệu suất >48%với ee> 99% đối với R — acetate 36A [58], [59].

AcO Kw HO AcO N HO K% 2 %,“4 S NG ` ⁄⁄ `“Ge > % Nà é `% %MeOH, K,C

So đồ 1.11: Téng hợp chuỗi side chain bằng phản ứng thủy phân lipase của Patel [58]

Mặc dù một số tài liệu mô tả quá trình tổng hợp chuỗi side chain C — 13 bằngxúc tác lipase để có thể thu được những hợp chất có độ tinh khiết quang học (ee)cao Tác giả [10], [12] mô tả quá trình điều chế 3 — clo — 2 — hydroxyl — 3 —phenylpropanoate với độ tinh khiết quang học cao qua sự tách động xúc tác lipasebang phan ứng ngưng tụ Darzens giữa dichloroacetate với andehit thơm cho 2 —chloro — 2, 3 — epoxypropanoate Phan ứng ngưng tụ Darzens mô tả sự tong hợpanti — 3 — chloro — 2 — hydroxyl ester dưới sự tách động cua xúc tác lipase của nóđược tóm tat trong sơ đỗ sau: