NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRÍCH LY L MĂNG CỤT SỬ DỤNG LƯU CHẤT SIÊU TỚI HẠN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 60.52.75 LUẬN VĂN THẠC SĨ... NHIỆM VỤ VÀ
TỔNG QUAN
CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TRÍCH LY α- MANGOSTIN TỪ VỎ MĂNG CỤT
Vấn đề nghiên cứu còn rất hạn chế về phương pháp trích ly lẫn việc so sánh và tối ưu hoá các phương pháp Đa số sử dụng chủ yếu ba phương pháp ngâm, chưng ninh và soxhlet, như:
Năm 2010, Đào Hùng Cường, Đỗ Thị Thuý Vân thuộc trường đại học Sư Phạm và đại học Đà Nẵng đã tiến hành nghiên cứu quá trình trích xanthon bằng hai phương pháp chưng ninh và soxhlet, rồi so sánh điều kiện trích và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đã đưa ra kết luận chưng ninh là phương pháp trích tối ưu[9]
Năm 2011, Đỗ Văn Đặng thuộc trường Khoa Học Tự Nhiên đã tiến hành ngâm dầm vỏ măng cụt đã phơi khô để phân lập và nghiên cứu thành phần của vỏ quả măng cụt xanh[10]
2.1.2 Tình hình thế giới: Đã thực hiện nhiều phương pháp trích ly khác nhau và tiến hành tìm điều kiện tối ưu
Cũng giống như tình hình trong nước đa số các nghiên cứu về trích ly α- mangostin từ vỏ măng cụt với các mục đích khác nhau đều sử dụng phương pháp ngâm dầm và soxhlet
Bên cạnh đó, năm 2011 nhóm nghiên cứu của Lei Fang đã sử dụng phương pháp vi sóng để trích ly xanthon, α-mangostin và -mangostin từ măng cụt và khảo sát các điều kiện để tối ưu hoá: Nhiệt độ, thời gian trích ly, tỷ lệ lỏng/rắn, và nồng độ dung môi ethanol bằng phương pháp tiêu chuẩn trực giao Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng với nồng độ ethanol 95 %, nhiệt độ 343 K, trong khoảng thời gian là 10 phút, tỷ lệ lỏng/ rắn 10 ml/g là điều kiện tối ưu để chiết xuất α- và - mangostin[11]
Việc nghiên cứu và tối ưu hoá phương pháp trích ly siêu tới hạn đồng dung môi đã được thực hiện vào năm 2012 bởi A.S Zarena Trong nghiên cứu này ông đã chứng minh rằng phương pháp trích ly siêu tới hạn đồng dung môi sẽ cho hiệu suất cao hơn là không có đồng dung môi Ngoài ra, ông còn khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly trong khoảng áp suất (180-380 bar), nhiệt độ (313-333 K) và thời gian (2-8 h), sau đó tiến hành tối ưu hoá[12].
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.2.1.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái:
Măng cụt tên khoa học Garcinia mangostana L (họ Bứa Clusiaceae)
Cây Măng cụt còn có tên khác: Mangosteen (Anh-Mỹ), Mangoustan (Pháp), Sơn Trúc Tử (Trung Hoa), Mangkhut (Thái lan)…
Cây măng cụt là một loại cây ăn quả nhiệt đới, thân gỗ vừa, tăng trưởng rất chậm, phân nhiều nhánh đối chéo nhau và nằm ngang Cây non màu xanh lục, mặt ngoài có nhiều khía dọc tiết diện hình chữ nhật Thân cây trưởng thành có màu xám đen, sần sùi, có nhiều rãnh nứt dọc tiết diện tròn, phần vỏ trong màu vàng chứa chất nhựa keo gomme, chầt mủ trắng đắng
Lá: Mọc đối không có lá kèm, cuống lá ngắn, hình bầu dục hay ellip, dày, dai, và màu lục sậm, hơi bóng ở mặt trên, màu lục vàng và sám xịt ở mặt dưới, khoảng 9-25 cm dài, 4,5-10 cm rộng, với gân lá rõ ràng màu xanh nhạt Lá mới màu hồng
Hoa của cây có kích thước từ 4-5 cm, dày thịt và có thể là hoa đực hoặc lưỡng tính trên cùng một cây Chúng có lá bắc và cuống hoa có đốt Những bông hoa đầu tiên mọc thành chùm từ 3-9 bông ở đỉnh cành Mỗi bông hoa gồm 4 lá đài hình trứng bầu dục, cánh hoa màu xanh với các đốm đỏ ở ngoài và màu vàng đỏ ở trong Hoa có nhiều tiểu nhụy, trong đó có tiểu nhụy thụ là tiểu nhụy có phấn hoa và có khả năng thụ phấn, còn tiểu nhụy không thụ là tiểu nhụy vì lý do nào đó không có khả năng thụ phấn như nhụy lép không có phấn hoa Hoa lưỡng tính thường là hoa thụ.
Hoa lan dendrobium thường mọc đơn lẻ hoặc thành cặp trên ngọn cành non Cánh hoa thường có viền màu vàng xanh với màu đỏ hoặc chủ yếu là màu đỏ Hoa nở rất nhanh, tạo nên vẻ đẹp rực rỡ cho khu vườn.
Trái: Trái nạt gần như hình cầu, to bằng trái cam nhỏ, được bao quanh bởi những đài hoa lớn và nổi bậc ở phần cuống, với 4 đài cánh hình tam giác, phẳng hợp thành như một hoa hồng ở đỉnh Trái màu tím đậm đến màu tím đỏ và láng ở bên ngoài, kích thước khoảng 3,4 cm đến 7,5 cm đường kính Lớp vỏ dày 6-10 mm, mặt cắt ngang màu đỏ, màu tím trắng bên trong, vị đắng chứa nhiều chất mủ vàng và một dung dịch nước ép nhuộm màu tím Thịt quả có 4 đến 8 phần như múi hình tam giác màu trắng như tuyết, thịt ngọt mềm (đây là lớp vỏ ngoài của hạt) Trái có thể không hạt hoặc có 1-5 hạt được phát triển đầy đủ
Hạt: Hình trứng thuôn dài, hơi dẹt, dài khoảng 2,5 cm và 1,6 cm rộng, được bao bởi nạt thịt trắng như nói trên Phần thịt hơi chua, hương vị chua rõ ràng, nổi tiếng thơm ngon tuyệt vời
Cây măng cụt nguồn gốc Mã Lai, Nam Dương, từ Malacca qua Moluku, ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, ở Ấn Độ, Myanma cũng như ở Sri Lanka, Philippin được các nhà truyến giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam Việt Nam, măng cụt chủ yếu được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long với tổng diện tích lên tới 4900 ha, cho sản lượng khoảng 4500 tấn Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn
Cây măng cụt ưa thích điều kiện thổ nhưỡng đặc biệt, khí hậu ấm áp và ẩm ướt Do những yêu cầu khắt khe này, măng cụt chỉ phân bố tại các tỉnh Bến Tre, Vĩnh Long, Trà Vinh và Bình Dương Khí hậu lạnh phương Bắc không phù hợp với loài cây này, vì vậy măng cụt chỉ phát triển đến vùng Huế.
Tại miền Nam, măng cụt trổ hoa vào tháng 1-2 dương lịch, bắt đầu thu trái từ tháng 5-8 dương lịch, có khuynh hướng cho quả cách năm
Măng cụt là loài thực vật giàu các dẫn xuất xanthon nhất được phát hiện cho đến nay Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthon được tìm thấy ở thực vật thì có đến 50 dẫn xuất ở măng cụt, chủ yếu tập trung ở phần vỏ quả, trong số các dẫn xuất xanthon đó thì α-mangostin có hàm lượng cao nhất (sự xuất hiện của α-mangostin tại các phần khác của cây măng cụt hay quả như áo hạt chỉ được vài tác giả nhắc đến), chiếm khoảng 0,02-0,2% trọng lượng khô Tiếp đến là γ-mangostin và β- mangostin, chiếm khoảng 0,016-0,07% Hàm lượng của các chất gacinone, đặc biệt là garcinone E chiếm khoảng 0,01-0,035%
Bảng 2.1: Các xanthon được trích từ vỏ măng cụt[8]
6 1-Isomangostin 31 Garcimangoson A , C, D 7 1-Isomangostin hydrat 32 Garcimangoson B
8 3-Isomangostin 33 Tovophyllin A 9 3-Isomangostin hydrat 34 Tovophyllin B
10 1,6-Dihydroxy-7-methoxy-8- isoprenyl-60,60-dimethylpyrano (20,30:3,2) xanthon
36 Mangostingon7-methoxy-2-(3- isoprenyl)-8-(3-methyl-2-oxo-3- buthenyl)-1,3,6-trihydroxyxanthon
12 Calabaxanthon 37 5,9-Dihydroxy-2,2-dimethyl-8- methoxy-7-isoprenyl-2H,6H-pyrano (3,2-b) xanthon-6-one
15 Macluraxanthon 40 1,3,7-Trihydroxy-2,8-di-(3- methylbut-2-enyl) xanthon
20 Esmeatxanthon A 45 1,3,6,7-Tetrahydroxy-8-(3 methyl-2-buthenyl)-9H-xanthon-9-one 21 BR-xanthon A , B 46 8-Deoxygartanin
2.2.1.3 Các thuộc tính dược và sinh học của măng cụt: [8]
2.2.1.3.1 Khả năng chống oxy hoá:
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết và xanthone trích từ măng cụt đã được chứng minh bằng các phương pháp: quét gốc 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), đo độ bền màu của hợp chất phức sắt thiocyanat và phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua thử nghiệm ABTS (2,20-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)).
Bảng 2.2: Các kết quả nghiên cứu về khả năng chống oxy hoá của xanthon hay dịch trích từ măng cụt 1 Dịch trích methanol từ vỏ quả măng cụt thể hiện hoạt tính quét DPPH
2 α-mangostin ức chế khả năng gây nên sự oxy hoá các lipoprotein tỷ trọng thấp bởi đồng trong ống nghiệm
3 α,- mangostin thể hiện tính chống oxy hoá khi sử dụng phương pháp sắt thiocyanat
4 Sự oxy hoá các lipoprotein tỷ trọng thấp bởi đồng trong ống nghiệm được ức chế bởi α-mangostin và các dẫn xuất của nó
5 Dịch trích methanol từ vỏ áo quả măng cụt thể hiện tính chống oxy hoá khi thử nghiệm bởi DPPH và ABTS
6 Dịch trích methanol thô từ vỏ măng cụt cải thiện sản phẩm của phản ứng nội bào giữa các phân tử chứa oxy trong các tế bào SKBR3
7 Dịch trích từ vỏ măng cụt có thể quét nhóm OH - và có hiệu quả trong việc ức chế sự peoroxy hoá lipip
8 Nhiều xanthon thể hiện khả năng quét ONO - trong ống nghiệm
9 Dịch trích ethanol và nước từ vỏ măng cụt thể hiện hoạt tính quét DPPH và bảo vệ tế bào u nguyên bào thần kinh khởi chất độc hại H 2 O 2
10 Dịch trích ethanol từ măng cụt thể hiện hoạt tính chống oxy hoá chống lại nhóm DPPH và làm giảm sản phẩm polymorphonuclear leucocytes (PML) của phản ứng giữa các phân tử chứa oxy
11 Quả măng cụt thể hiện hoạt tính chống oxy hoá chống nhóm DPPH và ABTS và ngăn chặn khả năng chống oxy hoá giảm do thức ăn cung cấp cholesterol ở chuột
12 α-mangostin thể hiện khả năng chống lại isoproterenol – tạo ra sự oxy hoá nguy hiểm và tổn thương cơ tim ở chuột
13 -mangostin thể hiện hoạt tính quét nhóm OH –
2.2.1.3.2 Khả năng chống ung thư:
Một vài nghiên cứu được thiết lập nhằm khảo sát hoạt tính chống ung thư của các loại xanthon được phân lập từ vỏ quả măng cụt (bảng 2.3) Các dòng tế bào ung thư biểu bì gan, SKBR3 ung thư vú, bệnh bạch cầu ở người đã được dùng cho việc thử nghiệm trong việc nghiên cứu khả năng chống ung thư của xanthon
Bảng 2.3: Các kết quả nghiên cứu về khả năng chống ung thư của xanthon phân lập từ măng cụt
1 Garcinone E có tác dụng đầu độc trên các tế bào ung thư gan cũng giống như trên các tế bào ung thư dạ dày và phổi
2 6 loại xanthon trong vỏ măng cụt thể hiện hoạt tính kháng sinh chống lại tế bào ung thư bạch cầu ở người HL60
3 Trị liệu bằng - mangostin thực phẩm trong chế độ ăn uống giúp hạn chế các tế bào tăng sinh trong ruột kết bị tổn thương ở chuột bị tiêm 1,2- dimethylhydrazine(DMH)
4 Dịch trích bằng nước của vỏ măng cụt thể hiện hoạt tính kháng bệnh bạch cầu trên 4 dòng tế bào
5 - mangostin gây ra sự tự hoại của các tế bào ung thư bạch cầu ở người
6 - mangostin làm ức chế 7,12-dimethylbenz(a)anthracene(DMBA)- nguyên nhân gây ra các tổn thương tiền ung thư trên vú chuột
7 - mangostin thể hiện hoạt tính kháng ung bướu đối với tế bào DLD-1
2.2.1.3.3 Khả năng kháng viêm và chống dị ứng: Được khảo sát với các mô hình khác nhau trong ống nghiệm, trình bày ở bảng 2.4
Bảng 2.4: Khả năng kháng viêm và chống dị ứng của các xanthon phân lập từ măng cụt
1 -mangostin, 1-iso mangostin, và mangostin triacetate thể hiện hoạt tính kháng viêm ở chuột trong một vài mô hình thực nghiệm
2 -mangostin có hiệu quả kháng viêm trên một vài mô hình thử nghiệm tình trạng viêm ở chuột
3 -mangostin cải thiện chất histamine- gây ra sự co động mạch chủ và khí quản ở chuột đực
CƠ SƠ LÝ THUYẾT PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp ngâm và soxhlet:
Trích ly chất rắn là quá trình thu hồi một hay một vài cấu tử của chất tan từ vật liệu rắn bằng cách hòa tan có chọn lọc vào dung môi trích Sản phẩm thu được của quá trình là dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi (tác nhân)
Khi trích ly, chất tan được giữ trong cấu trúc xốp của vật rắn và khuếch tán vào pha lỏng Nồng độ của các cấu tử trong lỗ xốp giảm liên tục Cơ chế của quá trình là phức tạp, bao gồm 3 giai đoạn chính: Dung môi xâm nhập vào các lỗ xốp
23 nguyên liệu rắn, hòa tan cấu tử cần trích ly vào tác nhân, khuếch tán các cấu tử đã hòa tan vào pha lỏng
Tốc độ chung của quá trình được quyết định bởi giai đoạn chậm nhất, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó: Khuếch tán phân tử của chất bị trích ly trong chất lỏng đứng yên chứa trong các lỗ xốp đến bề mặt nguyên liệu là chậm hơn quá trình hòa tan; Khi hòa tan các chất tiếp xúc trực tiếp với chất lỏng đứng yên có trở lực khuếch tán không lớn Phương pháp đơn giản để cường hóa quá trình là làm giảm kích thước vật liệu nhưng sẽ gặp khó khăn khi tách bã sau trích ly
2.3.1.2 Nguyên tắc của phương pháp:
Trích ly bằng cách ngâm được thực hiện ở nhiệt độ phòng khi cho một lượng dư dung môi vào bình chứa nguyên liệu Sau một thời gian nhất định, dung dịch trích được rút ra và thay một lượng mới dung môi vào cho đến khi chất trích được trích ra hoàn toàn Động lực của quá trình là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử cần trích trong nguyên liệu với môi trường dung môi Đối với phương pháp soxhlet, đây là quá trình liên tục được thực hiện nhờ một bộ dụng cụ riêng Khi nguyên liệu mẫu là pha rắn, quá trình là sự khuếch tán của các chất trích trong hỗn hợp mẫu trích vào pha lỏng ngưng tụ hoàn lưu từ tác nhân được gia nhiệt đến điểm sôi Dịch trích thu được sẽ tiếp tục hoàn lưu cho đến khi hoàn tất quá trình Để biết được quá trình kết thúc, dùng pipet lấy vài giọt dịch trích trong bộ phận chứa mẫu nhỏ lên mặt kính và làm bay hơi dung môi Nếu trên mặt kính không có vết gì thì quá trình trích ly được xem là hoàn thành
Phương pháp được tiến hành trong điều kiện thường nên ngoài yếu tố nhiệt độ có ảnh hưởng đến thành phần chất trích thì các yếu tố ảnh hưởng như bản chất của chất tan, bản chất của dung môi, bản chất của mẫu nguyên liệu, kích thước mẫu,… sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình
2.3.1.3 Ưu – nhược điểm: Ưu điểm: Nguyên liệu theo phương pháp ngâm tiếp xúc trực tiếp với dung môi, cách thực hiện đơn giản thích hợp cho các thử nghiệm sơ bộ; Ngoài ra,
24 lượng dung môi sử dụng trong thí nghiệm soxhlet tuy ít nhưng vẫn có thể trích kiệt hợp chất mong muốn, hệ thống cũng đơn giản, dễ sử dụng
Nhược điểm: Thời gian trích ly dài nếu muốn trích kiệt hoàn toàn, so với các phương pháp khác thì lượng dung môi hữu cơ sử dụng là nhiều hơn, riêng với soxhlet, nhiệt độ của hợp chất trích luôn bằng với nhiệt độ sôi của dung môi nên dễ bị phân hủy nếu kém bền với nhiệt
2.3.2 Phương pháp trích ly bằng vi sóng:[19, 20]
Vào năm 1975 để nghiên cứu phân tích dấu vết kim loại các mẫu sinh học Từ đây kỹ thuật vi sóng đã phát triển Đến năm 1986 các tài liệu về ứng dụng của vi sóng trong trích ly các hợp chất hữu cơ đã xuất hiện lần đầu tiên Cũng trong năm này Ganzler et al.và Lane và Jenkins trích các hợp chất bằng chiếu xạ vi sóng Ngày nay, có rất nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu phân tích khả năng của kỹ thuật trích ly mới này
2.3.2.1 Cơ sở lý thuyết của vi sóng:
Vi sóng là những trường điện từ trong phạm vi 300 MHz đến 300 GHz hoặc giữa các bước sóng của 1 cm và 1 m Sóng điện từ có hai dao động vuông góc gồm 2 phần: Điện và từ
Vi sóng ứng dụng để truyền thông hoặc dẫn năng lượng bằng cách tác động trực tiếp đến vật liệu có khả năng hấp thụ điện từ, chuyển hóa thành nhiệt Ở tần số 2,450 MHz phổ biến trong lò vi sóng, vi sóng gây ra chuyển động hỗn độn của các phân tử, tạo ra sự gia tăng nhiệt độ đáng kể (lên tới 100K/giây ở tần số 4,9 GHz) Do các thành phần điện của sóng dao động nhanh (4,9 x 109 lần/giây), chúng khiến các phân tử tự quay, dẫn đến nhiệt sinh ra.
2.3.2.2 Nguyên lí hoạt động của các bức xạ vi sóng:
Dựa trên hiện tượng nhiệt, do sự tương tác của điện trường với các phân tử của nguyên liệu Việc chuyển đổi điện năng thành nhiệt năng xảy ra theo hai cơ chế:
Dòng ion là sự di chuyển của các ion từ cực dương sang cực âm, đồng thời sinh ra nhiệt do sự cản trở trong quá trình dịch chuyển này Sự va chạm giữa các phần tử cũng xảy ra do sự thay đổi liên tục hướng di chuyển của các ion, dẫn tới nhiệt năng sinh ra.
2 cực có liên quan đến sự chọn lựa đường di chuyển của các phân tử phân cực với điện trường Nhiều sự va chạm như thế này sẽ kích thích các phân tử tạo ra năng lượng và do đó sinh ra nhiệt
Hình 2.3: Nguyên lí hoạt động của các bức xạ vi sóng
Sự phát nhiệt xảy ra khi nguyên liệu là chất điện môi hoặc chất dẫn nhiệt Sự hấp thụ năng lượng phụ thuộc vào sự phân ly δ với tan δ =ε"/ε', phần thực tế và phức tạp của hằng số điện môi (ε = ε' – j.ε"), ε' gọi là hằng số điện môi, thể hiện khả năng của một phân tử có thể phân cực dưới điện trường, ε" là yếu tố làm mất hằng số điện môi, do tác động của quá trình chuyển năng lượng điện thành nhiệt năng
Các hợp chất có điện môi cao chủ yếu là hợp chất phân cực Hằng số điện môi của các dung môi phổ biến được tóm tắt trong bảng 2.7 Một trong những đặc trưng của vi sóng bức xạ nhiệt là tính chọn lọc Đặc trưng thứ 2 đó là gradient nhiệt độ thì đảo ngược so với bức xạ nhiệt thông thường và bức xạ nhiệt thì nhiều
26 Bảng 2.7: Hằng số điện môi của các dung môi phổ biến
NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT
NGUYÊN LIỆU
Măng cụt trồng tại các tỉnh phía nam, sau khi thu hoạch được phân phối cho các chợ đầu mối của các vùng lân cận Măng cụt dùng làm nguyên liệu trong thí nghiệm được mua tại chợ đầu mối Tân Bình, thành phố Hồ Chí Minh, vào tháng 9
Vỏ măng cụt được sấy khô trong 3 ngày ở nhiệt độ 323 K và được nghiền bằng máy nghiền búa nhằm tăng khả năng truyền khối giữa nguyên liệu và dung môi trong quá trình trích ly Kích thước hạt có đường kính trong khoảng 506,06 ±29,15àm
Bột măng cụt được giữ trong hộp kín và bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh phục vụ cho các thí nghiệm sau này Độ ẩm của nguyên liệu trích ly được xác định bằng thiết bị đo độ ẩm hồng ngoại Tiến hành đo mẫu 3 lần, độ ẩm trung bình của bột măng cụt là 3,6 %.
HOÁ CHẤT
Chuẩn bị mẫu: ethanol, n – hexan có nguồn gốc Trung Quốc dùng trong các thí nghiệm sơ bộ
Trích ly: CO2 có nguồn gốc Singapore dùng làm dung môi trong trích ly siêu tới hạn, ethanol có xuất xứ Probalo dùng làm đồng dung môi trong quá trình trích ly bằng CO 2 siêu tới hạn, ethanol(Probalo) làm dung môi chính trong trích ly bằng vi sóng
Xử lý mẫu: ethyl acetate, n – hexan, nguồn gốc Trung Quốc, dùng để xử lý mẫu sau khi trích ly và trước khi đem phân tích HPLC
Phân tích HPLC: methanol (xuất xứ: Merck), nước siêu sạch
THIẾT BỊ SỬ DỤNG
3.3.1 Thiết bị tr ch ly siêu tới hạn:
Thiết bị trích ly Thar SFC, xuất xứ Hoa Kỳ, được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm các thiết bị chính:
Hình 3.1: Thiết bị trích ly siêu tới hạn Thar SFC
Bình chứa dung môi CO2
Bình chứa dung môi hỗ trợ
Bơm dung môi hỗ trợ
Thiết bị trao đổi nhiệt
Bộ điều khiển áp suất tự động
Bộ phận thu hồi sản phẩm
Một số thông số của Thar SFC – S.N 11419:
- Áp suất làm việc: 100 – 340 bar - Nhiệt độ làm việc tối đa là 353 K - Giới hạn cho phép của đồng dung môi: 0 – 20%
- Các đồng dung môi thường sử dụng: Methanol, ethanol, aceton nitrile
Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của thiết bị SFE
Trong thiết bị trích ly siêu tới hạn, dung môi được dẫn qua nhiều bộ phận khác nhau để đạt đến điều kiện thí nghiệm đã chọn trước nhằm trích ra các thành phần từ nguyên liệu ban đầu
Ban đầu, CO 2 lỏng được làm lạnh bằng hỗn hợp nước: ethylen glycol C 2 H 6 O 2 (50:50) từ bộ phận làm lạnh để duy trì trạng thái lỏng trước khi vào bơm cao áp
Bơm cao áp cũng được làm lạnh để đảm bảo nén CO2 đến áp suất làm việc đã được cài đặt trước Bên cạnh đó, dung môi hỗ trợ cũng được đưa vào dòng dung môi chính thông qua bộ trộn nhờ một bơm cao áp khác Hỗn hợp dung môi sau bộ trộn được gia nhiệt đến nhiệt độ trích ly được cài đặt trước, trước khi đi vào bình trích ly chứa nguyên liệu Bình trích được làm bằng thép không gỉ, chịu được áp suất cao
Nguyên liệu được bố trí giữa hai lớp hạt thủy tinh phía dưới đáy và trên đỉnh bình;
Hai lớp hạt này có độ cao ổn định nhằm đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và độ phân tán của dòng dung môi được tốt hơn Áp suất trong bình trích được điều khiển bằng bộ phận giảm áp tự động, có tác dụng giữ cho áp suất không đổi trong suốt quá trình Sau khi đi qua bộ phận giảm áp suất, CO2 siêu tới hạn chuyển sang trạng thái khí, thoát ra ngoài và mẫu được thu hồi ở bình thu mẫu
3.3.2 Thiết bị cô quay chân không:
Thiết bị cô quay chân không sử dụng trong thí nghiệm hiệu Buchi R210, được sản xuất từ Đức Kích thước dài x rộng x cao là 550 x 415 x 575 mm, khối lượng thiết bị khoảng 16 – 18 kg (chưa tính thiết bị làm lạnh) Thiết bị có thể cô quay mẫu với thể tích từ 50 đến 4000 ml
Hình 3.3: Thiết bị cô quay chân không Buchi R210
Nguyên lý hoạt động dựa theo sự thay đổi của áp suất ảnh hưởng đến nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung dịch; Khi áp suất giảm thì nhiệt độ sôi của hỗn hợp giảm theo, nhờ vậy mà đặc tính sinh học của mẫu ít bị thay đổi do điều kiện nhiệt độ Khi hỗn hợp đạt nhiệt độ sôi, dung môi sẽ bay hơi và được ngưng tụ lại trong bình chứa
46 dung môi nhờ hệ thống nước giải nhiệt Bình cô quay chỉ chứa mẫu sau khi dung môi bay hơi hết
Một số bộ phận chính trên thiết bị cô quay chân không:
Hình 3.4: Cấu tạo thiết bị cô quay chân không
1,2,3,4,5,6: Bộ phận ngưng tụ 7: Rãnh nước ngưng tụ
8: Ống nhập liệu/ xả chân không 9,10: Cổ nối bình chứa mẫu cô quay
11: Đệm chân không 12: Vòng ren
13: Kẹp nối bình ngưng tụ với thiết bị 14: Kẹp nối bình bốc hơi với thiết bị Thiết bị cô quay chân không được dùng để tách dung môi ra khỏi mẫu trong quá trình trích ly hoặc xử lý mẫu sau trích ly trước khi phân tích HPLC
3.3.4 Thiết bị tr ch ly bằng vi sóng:
Hình 3.5: Thiết bị trích ly bằng vi sóng Thiết bị trích ly bằng vi sóng Synthos 3000 của Anton Par có dạng khối hộp chữ nhật Mặt trước của thiết bị có một màn hình cảm ứng cho phép thao tác vận hành tiện lợi và đọc kết quả dễ dàng
Công suất tối đa của thiết bị là 1200 W
Hình 3.5: Mô tả hệ thống trích ly soxhlet
4 Ống hoàn lưu dung môi
5 Ống sinh hàn 6 Bộ phận chứa nguyên liệu
Thông số của quá trình chiết suất, bao gồm công suất, thời gian lưu giữ và tỷ lệ dung môi, được điều chỉnh thông qua màn hình điều khiển Khi quá trình phản ứng hoàn tất, ba cánh quạt sẽ hoạt động để làm mát bình phản ứng về nhiệt độ phòng, đánh dấu sự kết thúc của quá trình.
3.3.5 Thiết bị phân t ch sắc ký lỏng hiệu năng cao:
Hình 3.7: Hệ thống phân tích HPLC
Hệ thống sắc ký lỏng HPAgilent1200 series bao gồm các module sau:
Bình chứa pha động: Hệ thống HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ thiết lập trước và tổng tỉ lệ là 100%
Bơm cao áp: Bơm pha động vào cột nhằm thực hiện quá trình chia tách sắc ký
Lưu lượng bơm từ 0,1 – 10 ml/phút Trước đó, dung môi pha động được loại bỏ các bọt khí nhỏ còn sót lại để tránh làm thay đổi tỷ lệ của pha động cũng như áp suất của hệ thống
Cột tách: Làm bằng thép không gỉ, cột pha đảo C 18 có đường kính lỗ lọc là 10 àm C18 là cột silica được đớnh bởi lớp carbon C18H37 tạo thành pha tĩnh khụng phõn cực
49 Đầu dò: Phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột, cho phép nhận các tín hiệu chính xác thông qua thời gian dừng
Chương trình sử dụng: Chemstation
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
QUY TRÌNH XỬ LÝ DỊCH TRÍCH VÀ PHÂN TÍCH HPLC
4.1.1 Quy trình xử lý dịch tr ch:
Dịch trích thu được sau trích ly sẽ được xử lý theo sơ đồ trong hình 1.1
Hình 4.1: Sơ đồ xử lý dịch trích
Nước là dung môi phân cực mạnh, n - hexane là dung môi không phân cực Sự phân đoạn giữa hai pha nước và n - hexane nhằm loại bỏ các thành phần không phân cực vào pha n – hexane (chất béo và các tạp chất khác) Thành phần quan tâm là α - mangostin và các thành phần phân cực mạnh (như các hợp chất phenolic) được giữ trong pha nước Ethyl acetate là dung môi có xu hướng mang moment lưỡng cực lớn Sự phân đoạn lỏng - lỏng giữa pha nước vừa thu được và ethyl acetate nhằm làm giàu thành phần α - mangostin trong pha ethyl acetate
Cô quay dịch trích thu được để loại tách ethyl acetate ở nhiệt độ 323K Sau
Để xác định nồng độ α-mangostin trong mẫu, mỗi lần quay HPLC, mẫu đều được cân định lượng để tính toán Sau khi quay, khối lượng mẫu được hòa tan trong methanol và pha loãng phù hợp để nồng độ α-mangostin trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn.
Hỳt khoảng 1 ml dung dịch sau khi pha loóng qua đầu lọc 0,45 àm rồi cho vào vial phân tích sắc ký
4.1.2 Phương pháp phân t ch HPLC:
Pha động là MeOH: H2O (0,1% AcOH) (85:15 v/v) Tốc độ dòng là 1 ml/ phút
Thể tớch tiờm mẫu là 5 àl Bước sóng phân tích là 320 nm Thời gian phân tích là 15 phút Đường chuẩn được xây dựng tuyến tính trong khoảng nồng độ 20 - 200 ppm
Các kết quả ban đầu thu được từ sắc ký đồ được tính theo phương trình hồi quy nằm trong khoảng nồng độ nói trên
Với hệ số tin cậy R 2 = 0,9999 Trong đó: C là nồng độ phân tích, ppm S là diện tích của peak, mAU.s
Chất chuẩn α-mangostin được tinh chế từ nhóm nghiên cứu của TS Tống Thanh Danh
Từ kết quả sắc ký đồ, có thể tính toán được các đại lượng quan tâm khi thực hiện quá trình trích ly Ở đây, cần tính được kết quả của các đại lượng sau:
Hàm lượng α-mangostin (mg) - mα-mangostin: mangostin 1000 m nCV
Trong đó: n là hệ số pha loãng
C là nồng độ chất trích (ppm)
V là thể tích bình định mức (ml)
Độ thu hồi (mg/g) – Y: ê mangostin nguy nlieu
Trong đó: mnguyênlieu là khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
Trong đó: m’α-mangostin là lượng α-mangostin khi trích kiệt (mg)
Hàm lượng α-mangostin trong cao (%) – Y2:
Trong đó: msau cô quay là khối lượng sau cô quay lần 1 (mg)
TRÌNH TỰ THÍ NGHIỆM
Tất cả các thí nghiệm đều lặp lại hai lần
4.2.1 Xác định lƣợng -mangostin khi tr ch kiệt:
Cân 15 g nguyên liệu cho vào một becher 500 ml, sau đó cho 200 ml dung môi C 2 H 5 OH vào Bọc kín becher, đặt lên bếp từ khuấy trong 24 giờ
Tắt bếp để nguyên liệu lắng xuống rồi tiến hành lấy dung dịch ra cho vào một becher khác lưu trữ Tiếp tục cho dung môi vào và khuấy Tiến hành như vậy cho đến khi dịch trích không có màu
Dịch trích thu được lần đầu có màu nâu đỏ và nhạt dần trong những lần thêm dung môi tiếp theo Thời gian thực hiện thí nghiệm là khoảng 5 ngày
Các dịch trích được gộp chung lại, lọc qua giấy lọc Sau đó tiến hành xử lý dịch trích như sơ đồ quy trình 4.1, rồi phân tích HPLC
Cân 15g nguyên liệu, bọc trong giấy lọc và tiến hành chiết xuất bằng bộ dụng cụ Soxhlet Borosilicate Glass với dung môi là C2H5OH Chiết xuất đến khi dung môi trong ngăn chứa nguyên liệu không còn màu Lấy dịch chiết và xử lý mẫu theo sơ đồ quy trình 4.1 Sau đó, tiến hành phân tích HPLC Quá trình chiết xuất và phân tích kéo dài trong 2 ngày.
4.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tr ch ly bằng vi sóng:
Xác định thời gian trích ly thích hợp:
Cân chính xác 1 g nguyên liệu Chuẩn bị 4 mẫu cân cho một lần thí nghiệm
Tiến hành khảo sát thời gian trích ly thích hợp Khoảng thời gian cho các thí nghiệm là 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút Các thí nghiệm này có chung điều kiện công suất P = 50 W, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: L/R = 25 ml/g Sau thời gian trích ly và thời gian giải nhiệt, các dịch chiết được lấy ra, lọc bằng giấy lọc Dich chiết thu được tiến hành xử lý dịch chiết như sơ đồ quy trình 4.1, rồi phân tích HPLC Đánh giá sơ bộ kết quả thu được xác định thời gian trích ly thích hợp
Tiến hành thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của công suất và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (L/R) đến hiệu suất và hàm lượng α-mangostin trong cao Mỗi yếu tố với ba mức khảo sát
Công suất: 50 W, 75 W, 100 W Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 15 ml/g, 20 ml/g, 25 ml/g Điều kiện tiến hành thí nghiệm được trình bày trong bảng 4.1
Bảng 4.1: Các điều kiện tiến hành trích ly bằng vi sóng TN Công suất P, W Tỉ lệ L/R, ml/g
Dịch trích thu từ các thí nghiệm trên được xử lý như sơ đồ quy trình 1.1, rồi phân tích HPLC, tính toán
4.2.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hoá quá trình tr ch ly siêu tới hạn:
Xác định thời gian trích ly thích hợp: Để các thí nghiệm được tiến hành đồng nhất và giảm bớt yếu tố ảnh hưởng, thời gian trích ly thích hợp là yếu tố được khảo sát đầu tiên nhằm xác định thời gian trích ly chung cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo để không mất nhiều thời gian mà hàm lượng trích ly được vẫn cao
Tiến hành thí nghiệm với 20 g nguyên liệu được trích bằng thiết bị trích ly CO 2 siêu tới hạn Thar SFC ở điều kiện áp suất 300 bar, nhiệt độ 323 K, lưu lượng dòng dung môi là 15 g/phút trong đó có 5% C 2 H 5 OH làm dung môi hỗ trợ Khoảng thời
55 gian khảo sát là 30, 60, 90, 120,150, 180, 210, 240, 270, 300 phút
Dịch trích thu từ các thí nghiệm trên được xử lý như sơ đồ quy trình 4.1, rồi phân tích HPLC, tính toán, xác định được thời gian trích ly thích hợp
Thiết lập theo phương pháp bề mặt đáp ứng để quy hoạch thực nghiệm cấu trúc có tâm đánh giá sự ảnh hưởng của hai biến độc lập: áp suất (X1) và lưu lượng hỗn hợp lưu chất (X2) Lưu lượng hỗn hợp lưu chất được cố định ở tỷ lệ 5% so với tổng lưu lượng hỗn hợp lưu chất.
(X2), nhiệt độ (X3) đến hiệu suất và hàm lượng α-mangostin trong cao với thời gian trích ly thích hợp đã xác định ở trên
Tổng số thí nghiệm được xác định theo công thức:
Trong đó: N là số thí nghiệm k là số yếu tố khảo sát n0 là số thí nghiệm tại tâm, chọn là 3 Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 cho ta các điều kiện tiến hành trích ly
Bảng 4.2: Các biến khảo sát ảnh hưởng của quá trình trích ly bằng siêu tới hạn
Biến mã hoá X 1 : áp suất P
56 Bảng 4.3: Hàm đáp ứng của quá trình trích ly bằng siêu tới hạn
Hàm Tên gọi Đơn vị
Y 1 Hiệu suất trích ly – mangostin % Y 2 Hàm lượng – mangostin trong cao %
Bảng 4.4: Các điều kiện tiến hành thí nghiệm trích ly siêu tới hạn
Tiến hành các thí nghiệm theo điều kiện trên Dịch trích thu từ các thí nghiệm được xử lý như sơ đồ quy trình 4.1, rồi phân tích HPLC, tính toán Sau đó tiếp tục sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố và tối ưu hoá quá trình
Phương trình hồi quy trong thí nghiệm có dạng:
Trong đó: ym là hàm đáp ứng (m = 1, 2) b j là hệ số hồi qui (j = 1, 2, 3) xj là các biến khảo sát (j = 1, 2, 3) k là số nhân tố (k = 3)
