Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm: Nghiên cứu tinh sạch Protein từ rong nước lợ (Chaetomorpha SP.) Đồng bằng Sông Cửu Long

với kết quả khả quan là dịch trích protein sau khi kết tủa tại điểm đẳng điện thu được protein có hàm lượng 58,51% khi sử dụng kết hợp sóng siêu âm trong quá trình trích ly protein của

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2015

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hồng Ánh

Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS TS Phan Tại Huân

Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS TS Ngô Đại Nghiệp

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 24 tháng 7 năm 2015

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) 1 PGS TS Lê Văn Việt Mẫn

2 PGS TS Phan Tại Huân 3 PGS TS Ngô Đại Nghiệp 4 TS Phan Ngọc Hòa

5 TS Võ Đình Lệ Tâm

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Hoàng Thị Ngọc Nhơn MSHV: 13111020 Ngày, tháng, năm sinh: 10-02-1988 Nơi sinh: Quảng Trị Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 60540101

I TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu tinh sạch protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp đồng

bằng sông Cửu Long

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Nghiên cứu trích ly protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp bằng phương pháp sử

dụng enzyme kết hợp với kiềm - Nghiên cứu tinh sạch protein bằng các phương pháp tủa để thu được chế phẩm

protein có độ tinh khiết >75% - Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein từ rong nước lợ Cheatomorpha

sp

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài): 19/1/2015 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài): 14/6/2015 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): TS Lê Thị Hồng Ánh

Tp HCM, ngày tháng năm 20

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA (Họ tên và chữ ký)

Xin cảm ơn đến các cán bộ Trung tâm Thí nghiệm thực hành – Trường đại học Công nghiệp thực phẩm Tp HCM đã hỗ trợ về dụng cụ và thiết bị trong quá trình làm thí nghiệm

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ thực phẩm, trường đại học Công nghiệp thực phẩm Tp HCM và các anh chị đồng nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi an tâm công tác và hoàn thành khóa học

Tp Hồ Chí Minh, ngày 07 tháng 7 năm 2015

HOÀNG THỊ NGỌC NHƠN

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện trích ly protein từ

rong nước lợ Cheatomorpha sp bằng phương pháp kết hợp enzyme cellulase và kiềm;

tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa và nâng cao độ tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Quá trình trích ly protein: Hiệu suất trích ly protein khi sử dụng enzyme cellulase và NaOH 0,75% lần lượt là 32,40% và 51,17% Hiệu suất trích ly tổng cộng sau 3 lần trích là 85,41%

Quá trình tinh sạch protein: Tối ưu được điều kiện tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa bằng muối amomiun sulfat Hiệu suất đạt 73,01% và độ tinh khiết là 83,21% (sau thẩm tích) Tiến hành sấy đông khô và xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein Từ kết quả thu được cho thấy khả năng tạo bọt của protein từ rong cao hơn so với protein concentrate từ đậu nành, nhưng khả năng tạo nhũ, tạo gel, hấp thụ nước và hòa tan lại thấp hơn

Protein C-Phycocyanin trong rong Cheatomorpha sp thu được bằng phương

pháp kết tủa với muối amonium sulfat có tỉ số độ tinh khiết (A620/A280) là 2,13 Với độ tinh khiết này có thể ứng dụng vào sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng

ABSTRACT

In this thesis, we study about protein extraction condition from Cheatomorpha

sp algae by using combining cellulase enzyme and alkaline Then protein purification by precipitation method and enhance purity quality of output protein by dialysis

Protein extraction process: Yeild of using cellulase enzyme and NaOH 0,75% obtains 32,40% and 51,17%, respectively Total yeild at 85,41%

Protein purification process: Optimal precipitation condition recorded with amonium sulfat (73,01%) in case of 83,21% purity Drying lyophilized and characterizing propeties of the final product, the results show that it is higher foaming than soy protein concentrate while other propeties such as gelling, emulsifying, water absorption and dissolving is not good as partner

C-Phycocyanin contained in Cheatomorpha sp gain by precipitation with

amonium sulfat result in A620/A280 is 2,13 So, this product can use in order to manufacture functional foods

LỜI CAM ĐOAN

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận văn này là trung thực, và không sao chép từ bất cứ một nguồn nào và dưới bất k hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu

Tác giả luận văn

1.1.1 Giới thiệu chung về rong 3

1.1.2 Protein trong rong 3

1.1.3 Ứng dụng của rong 8

1.2 Rong Cheatomorpha sp 9

1.2.1 Giới thiệu về rong Cheatomorpha sp 9

1.2.2 Thành phần sinh hóa của rong Cheatomorpha sp 11

1.3 Thu nhận protein từ rong 14

1.5 Tính chất chức năng của protein 24

1.6 Hướng nghiên cứu của đề tài 25

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị 27

2.1.1 Rong 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Thiết bị 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30

2.2.2 Quy trình công nghệ thu nhận và tinh sạch protein từ rong Cheatomorpha sp. 31

2.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 32

2.3.1 Nghiên cứu quá trình trích ly protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp bằng phương pháp kết hợp enzyme và kiềm 32

2.3.2 Nghiên cứu tinh sạch protein 34

2.3.3 Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein 38

2.3.4 Thử nghiệm thu nhận C-Phycocyanin bằng phương pháp kết tủa với muối amonium sulfat 41

2.4 Phương pháp phân tích 41

2.4.1 Phương pháp hóa lý 41

2.4.2 Phương pháp hóa sinh 41

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Nghiên cứu quá trình trích ly protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp bằng phương pháp kết hợp enzyme và kiềm 43

3.1.1 Nghiên cứu trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp bằng enzyme cellulase 43

3.1.2 Trích ly protein từ rong bằng dung môi kiềm 46

3.1.3 Trích ly thu nhận protein thô từ rong nước lợ Cheatomorpha sp 49

3.2 Nghiên cứu tinh sạch protein 50

3.2.1 Nghiên cứu tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa 50

3.2.2 Nâng cao độ tinh sạch của protein bằng phương pháp thẩm tích 60

3.3 Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein 61

3.3.1 Khả năng tạo bọt 62

3.3.2 Khả năng tạo gel 62

3.3.3 Khả năng hòa tan 63

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cấu trúc của Phycocyanin 5

Hình 1.2 Rong mền Cheatomorpha sp thu nhận tại các ao nuôi tôm quảng canh ở khu vực tỉnh Bạc Liêu (Dự án SenterVovem ITB-Algen 2011-2013) 10

Hình 2.1 Các thiết bị sử dụng 29

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 30

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận và tinh sạch protein từ rong Cheatomorpha sp 31

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 44

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 44

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 45

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cồn đến quá trình kết tủa protein bằng dung môi cồn

51

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ dịch trích và cồn đến quá trình kết tủa protein bằng cồn 52 Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa protein bằng cồn 53

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ muối và dịch trích đến quá trình kết tủa protein 55

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa protein 56

Hình 3.9 Hiệu quả kết tủa protein của cồn, aceton và muối amonium sulfat 57

Hình 3.10 Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của tỉ lệ muối và dịch trích và thời gian kết tủa protein 59

Hình 3.11 Độ tinh khiết của protein trong kết tủa trước và sau thẩm tích 60

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.3 Thành phần acid amin trong protein của rong Cheatomorpha sp 12

Bảng 1.2 Thành phần một số khoáng đa lượng và vi lượng của rong Cheatomorpha sp 13

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng 27

Bảng 2.2 Mô hình tối ưu 2 yếu tố trực giao cấp 2 với 5 thí nghiệm tại tâm 37

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi NaOH đến quá trình trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 46

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi NaOH đến quá trình trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 47

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly protein từ rong Cheatomorpha sp 47

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly protein từ rong Cheatmorpha sp 48

Bảng 3.5 Hiệu quả trích ly protein sau 3 lần trích ly 50

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ aceton đến quá trình kết tủa protein 54

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ aceton và dịch trích đến quá trình kết tủa protein 55

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa protein bằng aceton 56

Bảng 3.9 Hiệu quả kết tủa protein của cồn, aceton, muối amonium sulfat 57

Bảng 3.10 Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình kết tủa protein bằng muối amonium sulfat 58

Bảng 3.11 Độ tinh sạch của protein trước và sau thẩm tích 60

Bảng 3.12 Thành phần sinh hóa của chế phẩm protein 61

Bảng 3.13 So sánh tính chất chức năng của protein từ rong và protein từ đậu nành 61

Bảng 3.14 Khảo sát khả năng tạo gel của protein 62

Bảng 3.15 Hiệu suất tủa C-PC ở các tỉ lệ muối khác nhau 65

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA analysis of variance – Phân tích phương sai AOAC Association of Official Chemists – Hiệp hội các nhà

hóa phân tích chính thống HPLC High pressure liquid chromatography - Sắc kí lỏng

cao áp hiệu nâng cao

khối lượng/thể tích thể tích/thể tích

MỞ ĐẦU

Theo ước tính ban đầu về trữ lượng rong Cheatomorpha sp (rong mền) đồng

bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) của Dự án SenterNovem ITB-Algen (2010-2013), có khoảng 10% diện tích nuôi tôm quảng canh nước lợ tại Cà Mau có rong mền phát triển, các ao này thường có mực nước trên mặt trảng trong ao thấp (khoảng 10-20cm) và chế độ trao đổi nước kém Trong các ao đầm có điều kiện phù hợp này, rong mền thường có lượng sinh khối tĩnh trung bình là 1,5kg/m2 ĐBSCL hiện có khoảng 347.000ha diện tích nuôi tôm quảng canh, lượng sinh khối rong mọc tự nhiên trong khu vực có thể được thu hoạch khoảng 3 lần trong một năm với tổng sản lượng khoảng 1,5 triệu tấn rong tươi hay 150.000 tấn rong khô/năm Với đặc điểm có tốc độ tăng trưởng nhanh (trung bình 5-7% trọng lượng/ngày), có thể chủ động việc nuôi kết hợp rong mền trên 20% diện tích nuôi tôm quảng canh tại ĐBSCL và thu hoạch 9 vụ/năm (thu 1 lần/tháng trong 9 tháng mùa vụ thuận lợi) ở mật độ 2 kg/m2, sản lượng rong có thể đạt con số rất lớn, lên tới 1,2 triệu tấn khô Hiện nay, nguồn sinh khối nhiều tiềm năng này tại ĐBSCL còn bị bỏ phí và chưa được sử dụng hiệu quả Chỉ một lượng nhỏ sinh khối rong được sử dụng làm phân bón; một lượng lớn sinh khối rong được bà con nông dân vớt ra khỏi ao và để thành đống thối rữa trên bờ, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến khai thác và sử dụng nguồn rong biển nhưng các nghiên cứu về sử dụng rong nước lợ hầu như rất hiếm Ở Việt Nam, chỉ có một nghiên cứu về thu nhận protein từ rong nước lợ

Cheatomorpha sp với kết quả khả quan là dịch trích protein sau khi kết tủa tại điểm

đẳng điện thu được protein có hàm lượng 58,51% khi sử dụng kết hợp sóng siêu âm trong quá trình trích ly protein của tác giả Bạch Ngọc Minh [1] Tuy nhiên, protein thô này chưa đáp ứng được yêu cầu để sản xuất các sản phẩm thực phẩm Do vậy, việc hoàn thiện phương pháp trích ly protein và tinh sạch protein từ rong nước lợ

Chetomorpha sp có ý nghĩa kinh tế và thực tiễn sâu sắc

Mục tiêu của luận văn:

Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp

lên > 75% để phù hợp sử dụng trong thực phẩm

Tính mới của luận văn:

- Đã nghiên cứu phối hợp phương pháp trích ly bằng enzyme và bằng kiềm để

thu nhận protein thô từ rong nước lợ Cheatomorpha sp Có hiệu suất thu hồi protein

cao

- Đã nâng cao độ tinh khiết của protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp lên

83,21%, đạt yêu cầu sử dụng trong thực phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về rong

1.1.1 Giới thiệu chung về rong

Rong (hay còn gọi là tảo) là những sinh vật có nhân thật, trong tế bào luôn có chất diệp lục và chủ yếu sống quang tự dưỡng Về mặt phân loại, rất khó để phân loại tảo một cách chính xác bởi sự phức tạp trong cấu trúc Đa số loài rong gần với thực vật nhưng một số lại được xem như vi sinh vật (vi khuẩn lam hay tảo lam)

Trong số các loại rong có kích thước lớn (macroalgae) trong tự nhiên thì rong Lục, rong Nâu, rong Đỏ có giá trị kinh tế cao Các loài này được sử dụng rộng rãi nhất nhờ đa dạng về chủng loại và năng suất thu hoạch cao Rong được sử dụng trong các ngành thực phẩm làm thức ăn cho con người, trong y học và các hợp chất trích ly từ chúng (agar, alginate, carrageenan ) được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp [2] Rong được coi là một trong những ứng cử viên tốt cho con người trong việc tận dụng tài nguyên mặt nước và là một đối tượng phù hợp để chuyển đổi cơ cấu nông nghiệp - thủy sản trong bối cảnh biến đổi khí hậu ở các vùng ven bờ và các vùng đất ngập mặn Rong có khả năng xử lý ô nhiễm môi trường nước và khả năng hấp thu CO2trong quá trình quang hợp để chuyển hóa sinh khối, góp phần bảo vệ môi trường và giảm thiểu khí gây hiệu ứng nhà kính

Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến nhóm rong sống trong vùng nước lợ Đây là vùng thủy vực ở các cửa sông hoặc các vùng nước mặn nhân tạo bên trong vùng châu thổ để nuôi thủy hải sản Do sự giao thoa giữa hai vùng nước nên rong sống trong khu vực này có những đặc điểm khác biệt với các loại rong sống trong hai vùng nước riêng biệt Các loại rong nước lợ phần lớn di chuyển từ biển vào và thích nghi dần với độ mặn thấp hơn của vùng nước này Tuy nhiên việc nghiên cứu và ứng dụng các loại rong này chưa nhiều

1.1.2 Protein trong rong

1.1.2.1 Nguồn protein trong rong biển

Ngày nay, tảo biển được khai thác chủ yếu như là nguồn thực phẩm ở các nước châu Á và nguồn polysaccharide có tính chất chức năng như (agar, carageenan, alginate) ở phương Tây Tuy nhiên tảo biển đã bắt đầu nổi lên như là nguồn thay thế

protein hằng ngày cũng như là nguồn tiềm năng chứa các hợp chất protein có hoạt tính sinh học [3]

Hàm lượng protein trong tảo biển thay đổi nhiều tùy thuộc vào chủng loại và mùa vụ Nhìn chung, protein cao nhất trong tảo đỏ (47%w/w), cao vừa phải trong tảo lục (9-26%w/w) và trong tảo nâu (3-15%w/w) Protein của tảo chứa hầu hết các acid amin thiết yếu, hàm lượng cao với acid glutamic và aspartic, hàm lượng thấp với threonine, lysine, tryptophan, histidine, systein và methionine [4] Tỉ lệ protein trong tảo thay đổi lớn theo mùa, sự thay đổi này liên quan đến rất nhiều nhân tố như : vị trí địa lý, nguồn cung cấp dinh dưỡng, điều kiện môi trường (ánh sáng, nhiệt độ và độ mặn của nước) [5, 6, 7, 8, 9]

- Giá trị dinh dưỡng: Protein là một trong những chất dinh dưỡng thiết yếu có tác dụng điều chỉnh các chức năng sinh lý và sinh học của cơ thể người Sau khi được hấp thụ vào cơ thể, protein của thức ăn bị thủy phân bởi enzyme protease thành những peptide nhỏ hơn trong dạ dày Để cung cấp acid amin thiết yếu mà cơ thể không tổng hợp được Những acid amin thiết yếu này có chức năng liên kết với acid mật, điều hòa áp suất thẩm thấu, phát triển võng mạc, thần kinh, miễn dịch và duy trì mức calcium [10] Giá trị dinh dưỡng của protein của tảo phụ thuộc nhiều vào cấu tạo, hàm lượng và tỉ lệ và hoạt tính sinh học của amino acid [11, 12]

- Giá trị dược phẩm: Ngày nay, yêu cầu cấp bách đạt ra phải tách peptide có hoạt tính tính học từ tảo biển Thực sự là loại peptide này sẽ mở ra một viễn cảnh mới để phát triển và thương mại hóa thuốc chữa bệnh [13] Mặt khác, công nghiệp dược phẩm dựa vào sự nghiên cứu những hợp chất và những loại thuốc có tính cải tiến Tuy nhiên, chi phí rất cao và ước tính tiêu tốn để tạo ra một loại thuốc mới trên thị trường khoảng hơn 802 triệu đô la [14] Tuy nhiên, phải mất khoảng 10-12 năm để đạt được sự phê chuẩn cho một loại thuốc mới Trong những năm gần đây, những công ty dược đã hướng tới việc sử dụng các loại tảo biển với khía cạnh peptid sinh học của chúng Hơn nữa, nghiên cứu chỉ ra rằng hoạt tính chữa bệnh của peptid có độc tính thấp, không hoặc ít tích tụ trong các mô trong cơ thể để tập hợp thành cấu trúc khác biệt [15] Peptid sinh học thay đổi các thuộc tính chức năng của cơ thể và có ảnh hưởng tích cực thông qua liên kết với các

thụ thể và tương tác với tế bào mục tiêu hoặc hạn chế hoạt động của enzyme [16], [17] Vì vậy, nhu cầu ngày càng tăng trong việc tách các protein chức năng mới hoặc peptid sinh học từ tảo biển [18]

- Giá trị mỹ phẩm: Việc sử dụng các chế phẩm rong biển trong công nghiệp mỹ phẩm đang giành được nhiều sự quan tâm [19] Khả năng chống lão hóa, sáng da và tăng khả năng bảo vệ da người được đặc biệt chú ý [20] Việc sử dụng protein từ tảo có khả năng cải thiện sự nuôi dưỡng tóc và làn da trong quá trình giữ ẩm

Những nghiên cứu gần đây đã khẳng định quan điểm cho rằng protein từ nguồn tảo đóng vai trò quan trong trong sự cải thiện sức khỏe và dinh dưỡng cho con người Theo hướng tiếp cận protein từ biển để nghiên cứu peptid có hoạt tính sinh học như là một hướng đi mới trong công nghiệp dược phẩm Sự phân tích toàn diện sẽ mang đến sự thừa nhận rộng rãi trong việc sử dụng chúng như là thực phẩm chức năng với vai trò chữa bệnh Cũng như protein lấy từ tảo biển, peptid cũng có tiềm năng như là những nguyên liệu có hoạt tính là nguồn được ứng dụng dinh dưỡng, dược phẩm và mỹ phẩm trong tương lai Tuy nhiên để thương mại hóa chúng cần có thời gian, kinh phí và chiến lược hợp lý để phân loại, tinh sạch và tiếp thị

1.1.2.2 Protein phycocyanin trong rong

Phycocyanin là chất màu protein thuộc họ phycobiliprotein, cùng với

allophycocyanin và phycoerythin Nó tiến hóa trước Chlorophyll (sắc tố diệp lục) hàng

tỉ năm Có lẽ nó là tiền thân của Chlorophyll và Hemoglobin, bởi vì nó có cả nguyên tố sắt và magie ở nhân Phycocyanin có lẽ là nguồn gốc sự sống ngày nay của động thực vật [21]

Màu xanh đậm của tảo Spirulina là do phycocyanin, nó làm cho cả hồ nước

trồng tảo có màu xanh đậm rất đặc trưng Hợp chất protein này chiếm khoảng 14%

trong Spirulina Ở Việt Nam, Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ (Bộ khoa học & Công nghệ Môi trường) đã thành công trong việc chiết xuất phycocyanin từ Spirulina để điều trị ung thư vùng hàm, vòm họng [22]

Nghiên cứu cho thấy phycocyanin kích thích hệ miễn dịch, sản sinh hồng cầu và bạch cầu và hỗ trợ tiêu độc trong cơ thể Các nhà khoa học Trung Quốc cho rằng Phycocyanin giới hạn sự sản sinh của các bạch huyết cầu khi các tế bào xương bị hóa

chất độc hoặc nhiễm xạ phá hủy Phycocyanin còn có khả năng kích thích tạo máu,

tăng cường tác động của hormon erythropoetin (EPO) EPO do thận sản xuất, kích thích tế bào gốc tuỷ xương sinh huyết cầu Phycocyanin cũng kích thích sản sinh dòng tế bào bạch huyết, ngay cả khi tế bào gốc tuỷ xương bị phá huỷ bởi độc chất hay tia phóng xạ Thành phần phycocyanin có tác dụng oxy hóa nên làm ức chế độc tố gan hepatotoxin Phycobiliprotein (phycocyanin và allophycocyanin) có tác dụng tăng cường miễn dịch ở người và động vật; tham gia các phản ứng phát hiện kháng nguyên đặc hiệu, đánh dấu kháng thể đơn dòng để chẩn đoán, phát hiện bệnh; hỗ trợ điều trị ung thư Phycocyanin có khả năng ứng dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm (các loại kem làm trắng da, chất chống oxy hoá) và trong y học (khả năng kháng bệnh ung thư) [23]

Phycocyanin có khả năng chống ung thư và ngăn ngừa các phần tử ung thư đã được khoa học chứng minh Phycocyanin có tính chất: tan trong nước, không độc và có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và chống ung thư Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu cũng như đã công bố về khả năng mạnh của phycocyanin về bảo vệ tế bào, bảo vệ gan và thần kinh của các tác giả Cheng và Wong; Romay và cộng sự; Vadiraja và cộng sự [24]

Tế bào ung thư là những tế bào mà DNA đã bị thay đổi dẫn đến chúng không có khả năng tự phân (hầu hết là do ảnh hưởng của quá nhiều gốc oxy hóa) Tế bào ung thư có thể sản sinh ra các loại gốc oxy hóa nội sinh một cách đáng kể về số lượng, điều đó giải thích cho mối quan hệ nguy hiểm của những chất gây ung thư và các loại gốc oxy hóa [25]

Phycocyanin được biết đến là chất chống oxy hóa tự nhiên tiêu diệt các tế bào ung thư và loại trừ các gốc oxy hóa Phycocyanin có tác dụng làm giảm số lượng cyclooxygenase-2 (chất điều hòa tăng tế bào ung thư) Phycocyanin được thừa nhận

chống được tế bào ung thư bởi vì có thể tăng tỉ lệ mức độ chống tế bào ung thư 2/Bax và loại Cyt-c khỏi dịch bào theo nghiên cứu của Lu và cộng sự năm 2011 [26]

Bcl-Phycobiliprotein là chất màu protein thực vật tiến hóa từ hàng triệu năm trước được gọi là phycobilisomes (PBSs) Màu của phycobiliprotein được cấu tạo bằng liên kết cộng hóa trị gồm 4 nhóm màu là các chuổi A, B, C, D gọi là phycobilins Đây là 4 nhóm phycobiliproteins – allophycocyanin (AOC- màu xanh tan trong nước), phycocyanin (PC: màu xanh đậm), phycoerythrin (PE: màu đỏ đậm) và phycocyanobilin (PCB: màu cam)

Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chúng hỗ trợ sức khỏe và ứng dụng trong dược phẩm Nhiều phycobiliprotein là phycocyanin quan trọng nhất bởi vì các đặc tính sinh học và dược lý Những nghiên cứu gần đây cho thấy chúng có tính chống oxy hóa [27] chống đột biến [28], kháng virus [29], chống ung thư [30, 31], chống dị ứng [32], tăng miễn dịch [33], bảo vệ gan [34], bảo vệ thần kinh [35], tiêu diệt gốc tự do [36], tính năng kháng viêm [35] Bệnh Alzheimer’s và Parkinson’s có thể chữa bằng phycocyanin [37] Tác dụng làm thấp hàm lượng mỡ trong máu của phycocyanin cũng là một chú ý đặc biệt [38] Hiện nay, thị trường tiêu thụ phycocyanin hằng năm khoảng 5-10 triệu đô la Mỹ [39]

Việc chiết xuất phycocyanin từ tảo Spilulina để điều trị ung thư đã được tiến

hành bởi các tác giả ở Viện Công nghệ sinh học và tai mũi họng (Hà Nội) công bố năm 1996 Phycocyanin được chiết bằng quy trình thích hợp và thử các độc tính trên súc vật theo quy định thấy tính an toàn cao Hoạt chất này đã bào chế thành thuốc viên nén 0,2g/viên Thuốc được chỉ định cho bệnh nhân ung thư vòm họng và u hạt ác kết hợp với xạ trị Co60

và một số thuốc hỗ trợ khác Kết quả là hoạt chất này giảm tác hại của bức xạ xuyên, giúp tăng thể trọng bệnh nhân, tăng lượng huyết cầu tố và hàm lượng protein trong máu mà không có tác dụng phụ Các nhà khoa học nhận thấy, sau 15 ngày điều trị với 8mg phycocyanin/ kg thể trọng, chức năng gan, thận của bệnh nhân không bị ảnh hưởng Phương pháp này có tác dụng hạn chế 70-80% sự phát triển của tế bào ung thư

Tuy nhiên, giá thành của những chế phẩm phycocyanin có giá thành khá cao, chất phycocyanin tinh chế dùng trong chẩn đoán bệnh, dược phẩm có giá 50

USD/1mg, chất phycocyanin thô dùng nhuộm màu dược phẩm và mỹ phẩm có giá 150 USD/kg [40] Phycocyanin dùng trong thực phẩm chức năng có giá 50$/50g [41]

Vì vậy nếu thu nhận và tinh sạch được phycocyanin trong rong biển có giá trị kinh tế, thực phẩm, dược phẩm cũng như mỹ phẩm cao

pinnatifida) hoặc Hiziki (Hizika fusiforme), rong nho Caulerpa lentifera… Ngoài ra

tảo đỏ Palmaria cũng được sử dụng từ lâu đời tại Châu Âu và Bắc Mỹ, hay rong lục

Ulva được dùng trong thực phẩm ở đảo Hawai [42]

Ở góc độ dinh dưỡng, rong là loại thực phẩm năng lượng thấp, ít lipid, giàu khoáng chất và protein Rong tảo là nguồn cung cấp các loại vitamin như A, C, D, E, các vitamin nhóm B (riboflavin, niacin, pantothenic acid, folic acid) và các loại khoáng như calcium (Ca), phosphorus (P), sodium (Na), potassium (K) Rong cũng chứa một lượng lớn polysaccharide, thường là polysaccharide cấu trúc của thành tế bào Các thành phần polysaccharide của rong như agar, carrageenan, ulvans, fucoidan không được thủy phân bởi enzyme amylase trong hệ tiêu hóa của người và động vật, vì thế đây là một nguồn chất xơ và prebiotic có triển vọng để sử dụng trong thực phẩm chức năng Sự lên men có chọn lọc các chất xơ prebiotic bởi hệ vi khuẩn có ích trong đường ruột sẽ giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn có hại, cải thiện sức khỏe của hệ tiêu hóa và tăng cường khả năng miễn dịch của người sử dụng Việc sử dụng rong thường xuyên trong khẩu phần ăn đã được chứng minh là mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe của con người Thí nghiệm trên 362 phụ nữ tuổi từ 30-65 cho thấy khẩu phần

ăn hàng ngày chứa Porphyra sp (một loại tảo được dùng thường xuyên tại Hàn Quốc)

giúp giảm đáng kể nguy cơ ung thư vú Những nghiên cứu khác cũng chứng minh tảo giúp giảm nguy cơ tiểu đường ở đàn ông Hàn Quốc [43]

Rong tảo rất giàu protein và khoáng chất, có thể tận dụng để sử dụng trong thức ăn gia súc [45] Trong ngành thủy sản, rong được sử dụng để thay thế một phần nguồn

thức ăn hoặc thay thế hoàn toàn Bổ sung Porphyra sp vào khẩu phần ăn của cá vền (Seabream) hoặc thay thế 5-10% bột cá trong thức ăn của cá vược châu Âu bằng

Gracilaria busra-pastonis sẽ làm tăng tốc độ tăng trưởng Tác động của rong trong

thức ăn chăn nuôi thay đổi tùy theo loài rong và loài thủy sản sử dụng Một số nghiên cứu gần đây cũng đã trích ly protein của rong để làm nguồn protein thay thế cho thức ăn gia súc [46] hoặc cho con người [47]

Trong công nghiệp, rong được xem như nguồn thu nhận các hợp chất có giá trị cao như agar, carageenan, alginate… Các hợp chất trên đều có chung đặc tính tạo cấu trúc cho nhiều sản phẩm công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Hầu hết agar

được trích ly từ các loài rong thuộc giống Gracilaria và Gelidium, 90% agar khai thác

được sử dụng trong ngành thực phẩm và phần còn lại được sử dụng trong vi sinh vật học và công nghệ sinh học Các sản phẩm alginate có cấu trúc khác nhau có thể được thu nhận từ các loài rong nâu Ngoài sử dụng trong thực phẩm, alginate còn được sử

dụng trong ngành in trên vải Hai loài rong Kappaphycus alvarezii và Euchema

denticulatum chủ yếu được dùng để trích ly carageenan, hầu hết carageenan được sử

dụng trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là công nghiệp sữa vì tính chất liên kết tốt với protein [2]

1.2 Rong Cheatomorpha sp

1.2.1 Giới thiệu về rong Cheatomorpha sp

Cheatomorpha sp là thuộc tảo lớn (macroalgae) là loài rong có hình thái dạng

sợi (filamentous algae) thuộc ngành rong lục (Chlorophyta) với đặc trưng là mọc thành

từng đám dài, nổi trên mặt nước ở những vùng bờ biển, hấp thụ ánh sáng và chất dinh

dưỡng trong nước Rong Cheatomorpha sp có thể tập hợp thành từng đám hay cư ngụ

ở trong những dòng nước chảy vừa phải và có nhiều ánh sáng, để chúng có thể hấp thụ

phosphat và nitrat trong nước Trong quá trình phát triển của rong Cheatomorpha sp

sẽ sử dụng nguồn dinh dưỡng dư thừa có trong môi trường nước, và tích lũy nhiều

thành phần dinh dưỡng có giá trị, là nguồn thức ăn của san hô và nhiều động vật khác [48]

Bên ngoài khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng, rong Cheatomorpha sp còn

là nơi trú ngụ cho rất nhiều loài sinh vật như giáp xác chân chèo (copepods), giáp xác chân hai loại (amphipods), kí sinh trùng và sao biển nhỏ [49] Để tăng hàm lượng các chất dinh dưỡng trong rong, người ra trồng chúng trong điều kiện ánh sáng điều hòa và nước chảy mạnh [50] Chúng cũng rất dễ thu nhận bởi vì không bám lên đá hay chất nền khác và có giá thành thấp, dễ dàng thích nghi với nhiều vùng biển khác nhau [49]

Ở Việt Nam, rong Chaetomorpha sp (còn gọi là rong mền) gặp phổ biến trong

các ao nuôi tôm nước lợ quảng canh và các kênh mương tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long Sự xuất hiện với mật độ vừa phải của loài rong này sẽ giúp cải thiện môi trường nước, làm thức ăn cho tôm và tăng năng suất cũng như chất lượng tôm nuôi

Đây là các loài có thể phát triển trong điều kiện độ mặn rộng (euryhaline), có tốc độ tăng trưởng nhanh (5-12%/ngày) và phân bố tự nhiên rộng khắp vùng nuôi tôm nước lợ ven biển Đồng bằng sông Cửu Long Người dân địa phương thường gọi tên chung là “Rong mền” để chỉ các loài rong lục dạng sợi mọc thành từng đám (dề), cài

quấn vào nhau như những thảm mền trên mặt nước Loài Chaetomorpha sp có mặt

phổ biến trong các ao nuôi tôm nước lợ quảng canh, có hàm lượng carbohydrate cao (44-45% w/w chất khô) và protein dao động từ (11-23% w/w chất khô) tùy vào thời điểm thu hoạch

Hình 1.2 Rong mền Chaetomorpha sp thu nhận tại các ao nuôi tôm quảng canh ở

khu vực tỉnh Bạc Liêu (Dự án SenterNovem ITB-Algen 2011-2013)

1.2.2 Thành phần sinh hóa của rong Cheatomorpha sp

1.2.2.1 Thành phần carbohydrate của rong Chaetomorpha sp

Hàm lượng carbohydrate dao động trong khoảng từ 33,48-42,67%, và chúng có sự khác biệt giữa các lớp rong Tuy nhiên trong quá trình làm khô rong, hàm lượng carbohydrate không bị ảnh hưởng bởi điều kiện nhiệt độ và môi trường phơi khô Lớp rong ở giữa ao đã qua giai đoạn sinh trưởng nên việc tích lũy carbohydrate cũng cao nhất trong khi lớp trên đang trong giai đoạn sinh trưởng còn lớp dưới cùng già hơn và bị khoáng hóa vì thế mà hàm lượng carbohydrate không cao bằng lớp giữa [1]

Thành phần đường đơn trong carbohydrate của rong là một thông số hết sức quan trọng giúp đánh giá triển vọng sử dụng sinh khối rong Kết quả phân tích HPLC cho thấy, thành phần đường đơn trong cấu trúc carbohydrate của rong mền

Chaetomorpha sp bao gồm glucose 70-72%, xylose/rhamnose 13-15%, arabinose

10-11% và acid galacturonic/galactose 2-3% Kết quả phân tích các liên kết glycoside

trong carbohydrate của rong cũng cho thấy carbohydrate của rong Chaetomorpha sp

chứa 74,4% liên kết 1,4-glucoside, liên kết tạo nên các chuỗi polymer mạch thẳng của đường 4-glucose là tinh bột và cellulose [50]

Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả Lewis & Dawczynski [42, 51] rong biển thường chứa một lượng lớn các polysaccharide không được thủy phân bởi enzyme amylase trong hệ tiêu hóa của người và động vật, vì thế đây là một nguồn chất xơ và prebiotic có triển vọng để sử dụng trong thực phẩm chức năng Trong thành

phần carbohydrate của rong Chaetomorpha sp., ngoài glucose còn có khoảng hơn 30%

các thành phần đường khác như xylose, rhamnose, arabinose, mannose và galactose/acid galacturonic Đây là những đường thành phần của các loại polysaccharide như hemicellulose hay agar, pectin Những loại carbohydrate này cũng là một trong những thành phần đáng chú ý khi nghiên cứu sử dụng rong

Chaetomorpha sp trong sản xuất công nghiệp [50] 1.2.2.2 Thành phần protein của rong Chaetomorpha sp

Hàm lượng protein dao động từ 9,06-14,02% [1], thành phần này có sự khác biệt giữa các lớp rong, và không bị ảnh hưởng bởi nhiệt trong quá trình phơi khô rong Hàm lượng protein thay đổi theo các lớp rong có thể được giải thích do sự hình thành và tích tụ protein theo chu kì sống Trong các lớp rong, thì lớp trên là lớp mới mọc

đang trong giai đoạn sinh trưởng và phát triển, còn lớp rong phân bố ở gần đáy ao là lớp rong già hơn nên tích lũy hàm lượng protein cao hơn

Thành phần acid amin trong protein của rong được xác định bằng phương pháp GC/MS, kết quả được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1.1 Thành phần acid amin trong protein của rong Cheatomorpha sp.[1]

STT Acid amin Tỷ lệ của các acid amin có trong

Trong tổng số các acid amin của rong thì acid aspartic và acid glutamic là hai acid amin chiếm tỉ trọng cao nhất lần lượt là 12,12% và 12,59% Đây là hai acid amin có tính acid, thuộc nhóm acid amin thay thế được, nhưng lại có vai trò quan trọng với cơ thể sống Aspartic và glutamic có chức năng trong hệ thống thần kinh trung ương như là các chất dẫn truyền có kích thích thần kinh [52] Bên cạnh đó, chúng còn có vai trò hỗ trợ việc tổng hợp các acid amin khác và giúp vận chuyển glucose qua hàng rào máu não để cung cấp năng lượng cho các hoạt động của bộ não theo Kuramitsu và cộng sự [1]

Các acid amin không thay thế trong rong gồm: lysine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan và valine Hàm lượng các acid amin thiết yếu chiếm tỉ lệ cao, hàm lượng của 8 acid amin chiếm 42,11% so với tổng lượng protein có trong rong Hàm lượng cao các acid amin thiết yếu này, đặc biệt là lysine và methionine là thích hợp với nhu cầu dinh dưỡng của nhiều loài tôm, cá [53] Điều này cho thấy tiềm năng của chế phẩm protein thu được trong việc sử dụng làm thức ăn thủy sản [1]

1.2.2.3 Thành phần khoáng trong rong Chaetomorpha sp

Theo nhiều tác giả, rong tảo là nguồn cung cấp các loại khoáng như calcium (Ca), phosphorus (P), sodium (Na), potassium (K) [54] Kết quả phân tích ở bảng 1.2

cũng cho thấy, trong thành phần khoáng của rong Chaetomorpha sp., có đầy đủ các

loại khoáng đa lượng và vi lượng cần thiết cho con người, động vật cũng như cây

trồng Sinh khối rong Chaetomorpha sp phát triển trong các ao đầm nuôi tôm nên

cũng không chứa các kim loại nặng, một vấn đề có thể gặp phải nếu rong mọc trong các kênh rạch bị ô nhiễm [50]

Bảng 1.2 Thành phần một số loại khoáng đa lượng và vi lượng của rong

1.2.2.4 Thành phần khác của rong Cheatomorpha sp

Rong Cheatomorpha sp nguyên liệu chứa khoảng 1,92 - 2,11% lipid, tương đối thấp so với một số loài rong lục khác Theo Vincent JT van Ginneken và cộng sự,

nhiều nghiên cứu, thành phần lipid trong rong có chứa nhiều thành phần acid béo không bão hòa với tỉ lệ lý tưởng mà theo khuyến cáo của tổ chức Y tế thế giới có tác dụng phòng chống bệnh tim mạch Ngoài ra, thành phần sinh hóa của rong còn có manitol, chlorophyl, omega-3, các loại đường đơn

1.3 Trích ly protein từ rong

Các phương pháp trích ly và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan của protein cần thu nhận Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc trích ly các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau Các tác nhân thường sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein đó là sự thay đổi nhiệt độ, nồng độ proton (pH) và sử dụng các dung môi hóa học [1] Ngoài ra, người ta còn sử dụng rất nhiều phương pháp khác như sử dụng enzyme, sóng siêu âm hay trích ly siêu tới hạn…

1.3.1 Phương pháp trích ly bằng kiềm

Đây là tác nhân được sử dụng khá phổ biến để trích ly protein trong rong, Barbarino và Loourenço đã nghiên cứu trích ly protein từ 15 loại rong và đưa ra được quy trình thu nhận protein từ rong với điều kiện tối ưu là sử dụng dung dịch NaOH 0,1N với sự hỗ trợ của đồng hóa trên rong được lạnh đông [55] Tuy nhiên thành tế bào của rong tảo có kích thước lớn (macroalgae) được cấu tạo bởi thành phần polysaccharide như alginate, carageenan, cellulose làm giảm hiệu quả quá trình trích ly protein từ rong bằng kiềm [56] Đây là những tác nhân chính ảnh hưởng đến quá trình

trích ly protein từ rong biển [57] Fleurence đã nghiên cứu trên hai loại rong Ulva

rigida và Ulva rotundata và đưa ra kết luận về quá trình trích ly protein trãi qua hai

giai đoạn, trước hết là trích bằng nước khử ion sau đó là bằng NaOH 0,1M và mercaptoethanol đạt hiệu quả tối ưu [58]

2-Ở Việt Nam, Bạch Ngọc Minh đã nghiên cứu quá trình thu nhận protein trên

đối tượng rong Cheatomorpha sp sử dụng kiềm với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thu

được hiệu suất khả quan 82,46% protein trong rong được trích ly vào trong chế phẩm protein thô khi sử dụng dung dịch NaOH 1% kết hợp với siêu âm 31,65W/g [1]

1.3.2 Phương pháp trích ly bằng enzyme

Amano và Noda đã đề xuất việc sử dụng enzyme để phá thành tế bào Porphyra

yezoensis tạo điều kiện nghiên cứu trích ly protein từ rong [59] Các tác giả đã thực

hiện trên đối tượng rong là Porphyra yezoensis và sử dụng hỗn hợp enzyme gồm các

enzyme tiêu hóa lấy từ ruột bào ngư, kết quả nhận được khả quan với hiệu suất thu hồi tăng 5%, đặc biệt là protein tan trong nước tăng 29% Như vậy, việc sử dụng enzyme thích hợp cho việc trích ly các protein tan trong nước

Ngoài ra, các enzyme carageenanase và cellulase giúp hiệu quả thu nhận protein

tăng lên 10 lần với đối tượng rong đỏ Chondrus Crispus, Gracilaria verucosa và

Palmaria palmate [58] Kyle Sander Ganti S Murthy đã nghiên cứu sử dụng enzyme

hỗ trợ phá vỡ thành tế bào vi tảo nước ngọt, tế bào vi tảo chứa nhiều hợp chất khác ngoài cellulose và phospholipid Phospholipid cũng hiện diện màng tế bào đặc biệt là những giọt lipid ở một số tảo Với mục đích chuyển cellulose trong thành tế bào thành glucose và phospholipid thành acid béo và glycerol, tác giả đã sử dụng hai loại enzyme cellulase và lipase xử lý với sinh khối tế bào sau khi tiền xử lý với H2SO4 1,5% ở 1210C trong 1 giờ Kết quả cho thấy, glycerol hình thành khi ủ với cellulase và phospholipase, glucose được hình thành khi xử lý với cellulase Kết quả này được ứng dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp nuôi trồng và sản xuất từ sinh khối tảo [60]

1.3.3 Các phương pháp khác

Trong số các phương pháp trích ly mới hiện nay đang được áp dụng, có thể kể đến phương pháp SFE (supercritical fluid extraction) sử dụng CO2 siêu tới hạn để trích

ly polysaccharide có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng ung thư từ rong Sargassum

pallidum Phương pháp PLE (pressurized liquid extraction - sử dụng dung môi lỏng để

trích ly ở điều kiện áp suất cao) được coi là “xanh – green” và thân thiện với môi trường vì giảm lượng dung môi sử dụng, nhanh và giúp giữ được tính chất của các chất có hoạt tính sinh học do quá trình trích ly được thực hiện trong điều kiện không có oxy và ánh sáng PLE cũng được đã ứng dụng để tách các chất có khả năng kháng

khuẩn và kháng oxy hóa từ tảo nâu Himanthalia elongate [44]

Một phương pháp mới khác cũng được sử dụng để trích ly các thành phần

protein, carbohydrate… từ rong là sử dụng sóng siêu âm Sóng siêu âm có vùng tần số 20-40kHz ngày càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dựa trên các tác động hóa học và cơ học của sự sủi bong bóng Hiện tượng xâm thực khí (sự hình thành và phá vỡ các bọt khí) sẽ tạo ra một sóng năng lượng có lực cắt lớn và tạo ra sự hỗn loạn trong vùng sủi bong bóng Kết quả là sự đảo trộn và tốc độ truyền khối trong quá trình trích ly sẽ được tăng cường, thành tế bào bị phá vỡ, nguyên liệu rắn bị giảm kích thước và diện tích tiếp xúc giữa bề mặt nguyên liệu và dung môi sẽ tăng lên đáng kể [61] Siêu âm đã được sử dụng trong các quá trình trích ly để thu nhận các chất có hoạt

tính sinh học từ tảo nâu Sargassum pallidum và thu nhận protein từ tảo đỏ Palmaria

palmate [44]

1.4 Tinh sạch protein

Sau khi nhận được dịch chiết protein thô, ta thường sử dụng các phương pháp khác nhau để tách chiết và đồng thời tinh sạch protein Trong nhóm các phương pháp truyền thống có phương pháp tủa bằng các tác nhân khác nhau như dung môi hữu cơ, muối trung tính, polymer, chất đa điện phân, tủa tại điểm đẳng điện, tủa bằng ion kim loại Nhóm phương pháp này có đặc điểm dễ thực hiện, tác nhân tủa dễ kiếm, phổ biến Tuy nhiên hiệu suất không đạt cao so với nhóm các phương pháp hiện đại

Nhóm các phương pháp hiện đại hơn được sử dụng khá phổ biến là thẩm tích, sắc kí lọc gel, sắc kí ái lực, sắc kí trao đổi ion, lọc màng Ưu điểm của nhóm này cho phép thu nhận protein mục tiêu với hiệu quả cao hơn

1.4.1 Phương pháp kết tủa

Kết tủa protein là sự tập hợp thành những phân tử protein đủ lớn, có thể nhìn thấy và thu nhận được bằng ly tâm Sự phân bố các phần kị nước và ưa nước trên bề mặt protein quyết định đến tính tan của protein Tính tan của protein là kết quả của sự tương tác các cực với dung môi Tương tác ion với muối và tương tác lực đẩy tĩnh điện với những phân tử tích điện cùng dấu Tính chất của dung dịch có thể thay đổi nồng độ ion hay pH Việc thêm hỗn hợp dung môi hay các chất tan trơ và polymer cùng với điều chỉnh nhiệt độ có thể điều khiển được sự thu nhận các protein mục tiêu [63]

Khi protein tập hợp lại thành cấu trúc lớn hơn, lượng nước xung quanh protein giảm, làm tăng sự khác nhau về mật độ của protein và dung dịch Khi sự tập hợp này đủ lớn, chúng sẽ nhanh chóng hình thành kết tủa trong quá trình ly tâm [64]

Tủa là một trong những phương pháp tách và phân đoạn protein cổ điển nhất những vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay Có nhiều phương pháp tủa protein khác nhau nhưng về cơ bản là thông qua quá trình biến đổi tính chất có hệ thống như nhiệt độ, lực ion, độ pH, các đặc tính điện môi để tủa protein Phương pháp tủa protein cũng được sử dụng trong công nghiệp mặc dù có một số hạn chế liên quan đến thiết bị và quy trình công nghệ Tuy nhiên, ngay cả trong điều kiện tốt nhất vẫn không tránh khỏi sự tủa của hỗn hợp protein kèm theo các tạp chất khác Do vậy, để thu được protein tinh sạch thì sau khi tủa, việc chiết tách và tinh sạch protein vẫn phải tiếp tục nhờ các kỹ thuật đặc hiệu hơn

Phương pháp này được ứng dụng khá phổ biến trong phòng thí nghiệm và công nghiệp để bước đầu thu nhận các hợp chất có giá trị trong tảo biển như thu nhận enzyme protease [65], thu nhận lectin từ tảo biển [66, 67], thu nhận protein R-

phycoerythrin từ tảo đỏ [68] thu nhận C-phycocyanin từ tảo Spirulina [69, 70]

1.4.1.1 Kết tủa protein bằng muối trung tính

Bản chất của quá trình là tạo tủa protein nhờ bổ sung vào dịch protein muối trung hòa ở nồng độ cao Vì protein tồn tại trong dịch nhờ sự cân bằng giữa các tương tác tĩnh điện và kị nước nên khi bổ sung muối vào sẽ làm thay đổi cân bằng trên dẫn đến sự tạo thành tập hợp các phân tử protein và lắng xuống Bình thường các phân tử protein trong dung dịch đều ngậm nước, khối lượng ngậm nước có thể lớn hơn khối lượng của bản thân nó nhiều lần, do vậy sẽ che chắn một cách hữu hiệu các phần tử kỵ nước trên bề mặt protein và cản trở các phân tử protein tương tác với nhau Khi xuất hiện nồng độ ion muối cao, lượng nước ngậm bị giảm đi dẫn đến sự tủa protein

Kết tủa protein bằng muối amonium sulfat được phát hiện cách đây hơn 120 năm bởi Franz Hofmeister khi ông để ý rằng nếu thêm các muối khác nhau vào lòng trắng trứng thì thấy có sự hình thành kết tủa Có thể thêm muối amonium sulfat vào dung dịch bằng cách thêm muối trực tiếp vào dung dịch protein hoặc là dung dịch muối bão hòa [64]

Để tủa protein người ta sử dụng một số muối khác nhau, khả năng kết tủa của các anion theo chuỗi Hofmeister với những anion phổ biến theo thứ tự là SCN‾, ClO4‾, NO3‾, Br‾, Cl‾, CH3COO‾, SO42‾, PO43‾ Nhưng thông dụng hơn cả là muối sulfate, citrate, phosphate và chloride Theo thứ tự muối phosphate tủa tốt hơn muối sulfate

nhưng trong thực tế ở giá trị pH trung tính, khi muối phosphate phần lớn ở dạng hỗn hợp HPO42- và H2PO4-, thì khả năng tạo tủa của chúng lại yếu hơn Tác dụng tủa protein của ion hóa trị I được sắp xếp theo thứ tự NH4+, K+, Na+ [71]

Ahyar Ahmad và cộng sự sử dụng muối amonium sulfat để nghiên cứu thu nhận và xác định tính chất chức năng của các protein có hoạt tính sinh học từ tảo lục

Halimeda macrobola Tiến hành kết tủa protein ở các phân đoạn 0-20%, 20-40%,

40-60% và 60-80%, sau đó tiến hành thẩm tích loại muối còn lẫn với protein Hoạt tính kháng oxy hóa của protein trong phân đoạn 0-20% với giá trị IC50 là 0,110mg/ml yếu hơn so với phân đoạn 20-40%, 40-60% và 60-80% với kết quả 0,360mg/ml, 0,323mg/ml, 0,387mg/ml Như vậy phân đoạn muối 60-80% độ bão hòa kết tủa được

hiệu quả nhất protein có hoạt tính sinh học trên đối tượng đang nghiên cứu [72]

Khi lựa chọn muối để tủa protein phải tính đến giá trị pH để tủa phân đoạn protein Thí dụ, natri citrate thường được sử dụng ở pH cao hơn 8 trong khi muối amonium lại được sử dụng ở pH thấp hơn Trong thực tiễn phòng thí nghiệm, muối (NH4)2SO4 được sử dụng nhiều nhất vì nó hòa tan tốt và không đắt tiền Tuy vậy, việc sử dụng muối này ở quy mô sản xuất lớn lại bị hạn chế vì phế thải và protein lẫn tạp nhiều muối Trong phòng thí nghiệm thường phải tiến hành lọc gel hay thẩm tích để tách muối ra khỏi protein Nồng độ (NH4)2SO4 thường sử dụng nằm trong khoảng 40-80% độ bão hòa

Thu nhận enzyme Phosphoenolpyruvate Carboxylase từ rong lục Selenastrum

minutum, enzyme Tryptophan synthase từ sinh khối tảo Euglena gracilis [73] trãi qua

công đoạn kết tủa bằng muối amonium sulfat trước khi lọc gel [74, 75] Shilpak Dilip Bele và cộng sự sử dụng tủa muối trước khi lọc gel thu nhận lipase và protease từ rong biển [76] Stélio R.M Oliveria và cộng sự cũng sử dụng muối (NH4)2SO4 80% độ bão hòa để kết tủa lectin trước khi tinh sạch bằng sắc kí ái lực [77]

1.4.1.2 Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ

Tủa bằng dung môi hữu cơ có mặt trong nhiều quy trình sản xuất Muốn tủa có hiệu quả dung môi phải hoàn toàn được trộn đều với nước và phải có tính ưa nước để tránh làm biến tính protein Tác động cơ bản của việc bổ sung dung môi hữu cơ là làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh protein do tác động đẩy ra một khối lượng nước lớn và sự cố định một phần phân tử nước bởi quá trình hydrate hóa các phân tử

dung môi hữu cơ Phân tử nước bình thường sắp xếp một cách trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt protein sẽ được thay thế bằng các phân tử dung môi hữu cơ làm giảm độ hoàn tan của chúng Các protein kỵ nước mạnh có khả năng tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ Ở điều kiện tạo tủa giống nhau, phân tử protein càng lớn thì càng dễ tủa Nên lưu ý là dung môi hữu cơ có khả năng làm biến biến protein ngay cả ở nhiệt độ thường Do vậy, quá trình tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp 0-50C và chọn lựa dung môi thích hợp

Các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu để kết tủa whey protein và sấy khô để thu protein concentrate Ethanol là dung môi an toàn hơn hai dung môi còn lại Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan hơn so với protein concentrate kết tủa từ ethanol trong khi n-butanol cho whey protein concentrate chứa nhiều béo và lactose nên gần như không tan trong nước Ethanol 72% kết tủa được 45-60% whey protein và hàm lượng tăng lên 4 lần [78] Nồng độ ethanol trên 60% được sử dụng để kết tủa lysozyme lòng trắng trứng, khả năng hòa tan của lysozyme giảm với sự tăng của nồng độ ethanol, mặc dù sự tạo gel ở nồng độ từ 60-75% làm hạn chế việc xác định tính tan [79] Bromelin trong dứa được thu nhận khi kết tủa bằng cồn 30-70% đạt độ tinh sạch 2,07 lần nhưng bảo toàn được 98% hoạt tính của enzyme trong khi muối amonium sulfat ở phân đoạn 20-40% độ bão hòa có hiệu suất đạt đến 44% và độ tinh sạch tăng 4,4 lần Tuy nhiên phương pháp cồn lại được sử dụng phổ biến ở Brazil, nơi sản xuất cồn lớn nhất thế giới [80]

Phương pháp kết hợp TCA/aceton được ứng dụng để thu nhận proteomics từ

tảo đỏ Gracilaria changii [81] và tảo Alexandrium sp [82] cho kết quả tốt

1.4.1.3 Kết tủa protein tại điểm đẳng điện

Điểm đẳng điện xuất hiện khi tổng điện tích của protein bằng 0, lực tương tác tĩnh điện thấp nhất là nguyên nhân dẫn đến các phân tử tập hợp lại với nhau [63]

Ở điểm đẳng điện, độ hydrate hóa của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein dẫn đến tạo tủa [71] Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có giá trị pH đẳng điện giới hạn Vì điểm đẳng điện của dịch trích thô bao gồm của rất nhiều protein khác nhau, có thể có cả phức hợp protein và acid nucleic [63] Phương pháp này đạt hiệu quả không cao nhưng thường áp dụng kết hợp với các phương pháp khác

Sử dụng kết tủa tại điểm đẳng điện với pH = 4,3-5,7 sau khi trích ly protein từ

hạt Amaranthus Cruentus ở pH = 7,8-9,2 cho protein có hàm lượng cao (protein

isolate) và những tính chất hóa lý tốt [83] Protein isolate từ hạt cải dầu cũng được thu nhận được bằng phương pháp trích ly ngược và kết tủa tại điểm đẳng điện [84]

Umar Garba và Sawinder Kaur đã kết tủa protein ở điểm đẳng điện để thu nhận protein từ đậu nành và cho thấy pH = 4,2 cho lượng kết tủa lớn nhất [85], sau đó mới tiến hành lọc membrane để nâng cao độ tinh sạch của protein Cách làm tương tự cũng

được tiến hành trên đối tượng là vi tảo Chlorella vulgaris [86] Hay phycobiliprotein từ tảo Porphyra yezoensis kết hợp tủa ở điểm đẳng điện với amonium sulfat [87]

1.4.1.4 Kết tủa bằng các tác nhân khác:

- Tủa bằng polymer: Các loại polymer sử dụng bao gồm: polyacrylic acid, polysaccharide, polyphosphate Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polymer, hiệu suất tạo kết tủa cao Chi phí cho phương pháp này cao

- Tủa bằng chất đa điện phân: Thường dùng polyethylene glycol có phân tử lượng 6.000 và 20.000 để tủa protein Có thể sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao Nhược điểm của phương pháp này là rất đắt tiền và dễ gây biến tính protein

1.4.2 Phương pháp thẩm tích

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dạng dịch các tinh thể Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp…) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa) Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại bỏ muối amonium sulfate ra khỏi dung dịch protein, thường cho dung dịch protein vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túi colodion hoặc cellophane (loại sau hay được dùng hơn) Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M) Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích

thước lỗ chỉ cho các chất có phân tử nhỏ đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán, như vậy muối sẽ khuếch tán vào, nước hoặc dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein, mặc dầu trong quá trình thẩm tích, dung dịch sẽ bị pha loãng hơn Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch

Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy khuấy cơ học hay máy khuấy từ hoặc là quay chậm túi nhờ dao động cơ không lớn Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả ở môi trường lạnh

Thẩm tích thường được dùng kết hợp sau một phương pháp tinh sạch ban đầu, phổ biến nhất là sau phương pháp kết tủa với muối amonium sulfat Sau khi thẩm tích, tùy yêu cầu mức độ tinh sạch của chế phẩm mà người ta sẽ dừng lại hoặc tiếp tục với các phương pháp tinh sạch khác như sắc ký hay lọc màng [88, 89]

Khác với trong kỹ thuật sắc ký trao đổi ion, các hạt được sử dụng để nhồi cột trong kỹ thuật này không mang các nhóm tích điện mà thay vào đó là mang các lỗ có kích thước khác nhau Các phân tử protein càng nhỏ càng có nhiều khả năng thâm nhập vào tất cả các lỗ; Vì vậy, thời gian chạy qua cột dài hơn và thời gian hồi lưu muộn hơn Ngược lại, các phân tử protein kích thước càng lớn càng có thời gian hồi lưu (chạy qua toàn bộ cột) sớm hơn

Để đảm bảo cho việc tách protein được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với các yếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi và phải là chất ưa nước

Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein

Lọc gel là phương pháp phổ biến được dùng để thu nhận protein có giá trị cao trong rong như phycocyanin, lectin Sau khi tinh sạch sơ bộ bằng muối amonium sulfat trong chế phẩm protein vẫn còn sót muối và các tạp chất khác, để nâng cao độ tinh sạch và ứng dụng của chúng, người ta sử dụng lọc gel để đạt được mục đích này [82, 88, 89, 90, 91]

1.4.3.2 Sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit Đây là những chất mang trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol Giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất mang là cellulose, sephadex thông thường được dùng để tách protein, còn chất trao đổi ion có chất mang là polistirol chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn

Thu nhận C-Phycocyanin (C-PC) được thực hiện với ba loại tảo Spirulina sp (nước ngọt), Phormidium sp (nước mặn) và Lyngbya sp (nước mặn) được thực hiện

qua nhiều công đoạn, trước hết dịch trích được kết tủa với muối amonium sulfat, sau đó tiếp tục qua sắc kí trao đổi ion trên cột DEAE–Sepharose CL-6B Độ tinh khiết của C-phycocyanin (A620/A280) thu được lần lượt là 4,42; 4,43; và 4,59 [92] Với độ tinh sạch (>4,0) chế phẩm C-PC có thể ứng dụng được trong công nghiệp dược phẩm Lectin từ tảo đỏ nước mặn được tinh sạch bằng phương pháp tủa với muối amonium sulfat 60% trước khi qua thiết bị lọc trao đổi ion cột lọc DEAE-cellulose, độ tinh sạch

của lectin tăng 16,5 lần [66]

Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì sẽ chảy ra khỏi cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp có thể tách được protein khỏi cột ở trạng thái sạch

Phương pháp sắc kí ái lực sử dụng phổ biến trong thu nhận kháng nguyên, kháng thể [93, 94, 95, 96]

1.4.4 Phương pháp lọc membrane

Membrane là loại màng đặc biệt có thể phân riêng một cách chọn lọc các cấu tử có kích thước khác nhau, từ những hợp chất cao phân tử như tinh bột, protein cho đến các chất có kích thước phân tử thấp như ion hóa trị một

 Các phương pháp membrane:

 Phương pháp vi lọc – MF: membrane vi lọc với đường kính mao dẫn 0,01–2µm sẽ giữ lại các cấu tử lơ lửng có kích thước rất nhỏ như các tế bào vi sinh vật Có áp suất làm việc dao động trong khoảng 0,3–1 bar Đây là phương pháp khá phổ biến trong chế biến thực phẩm như tách vi sinh vật từ sữa, nước trái cây…

 Phương pháp lọc nano – NF: trong phương pháp nano, mao quản có đường kính trung bình khoảng 2nm Áp suất làm việc trong quá trình lọc nano cần phải cao, thông thường từ 20–40bar Phương pháp này được áp dụng trong quá trình cô đặc đường, các dung dịch có chứa các gốc muối hóa trị hai, chất màu hay các hợp chất có khối lượng phân tử lớn 1000 Dalton

 Phương pháp siêu lọc – UF: phương pháp siêu lọc là quá trình phân riêng chọn

lọc các hợp chất với áp suất làm việc vào khoảng 1–10bar Đường kính mao quản trung bình từ 2–50nm Phương pháp này được áp dụng để tách protein, thuốc nhuộm và các hợp chất có khối lượng phân tử lớn 10000 Dalton

 Phương pháp thẩm thấu ngược – RO: là quá trình phân riêng với đường kính lỗ mao quản nhỏ nhất và cũng là phương pháp phân riêng phức tạp nhất Phương pháp này sử dụng membrane có đường kính lỗ mao quản nhỏ hơn 1nm, nên có khả năng tách các cấu tử có kích thước nhỏ như các ion của muối như Na+, Cl-… ra khỏi dung dịch Vì vậy, áp suất làm việc trong phương pháp này phải đủ lớn (15–70bar) để thắng áp suất thẩm thấu trên bề mặt màng

Trích ly, cô đặc các hợp chất từ thực vật bằng kỹ thuật membrane được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật này đầy triển vọng và có hiệu quả cao hơn so với các phương pháp thông thường Ưu điểm vượt trội của phương pháp membrane bao gồm sự cải thiện về chất lượng sản phẩm, chi phí năng lượng thấp Đối với cô đặc protein từ thực vật sử dụng màng lọc UF hoặc kết hợp với các phương pháp khác cho chất lượng sản phẩm cô đặc cao hơn so với phương pháp truyền thống, nhưng vẫn giữ được các tính chất công nghệ của sản phẩm Còn đối với cô đặc, trích ly các hợp chất chống oxy hóa sử dụng membrane với các hệ thống màng MF, NF, UF, RO liên tiếp cho phép thu được các hợp chất polyphenol với các phân tử lượng khác nhau từ thấp đến cao, hiệu quả trích ly cao hơn so với sử dụng dung môi truyền thống hay dung môi siêu tới hạn Trong ứng dụng phương pháp membrane trích ly lipid, phương pháp màng dùng để loại bỏ các acid béo tự do và gum là những thành phần không mong muốn trong công nghệ chế biến dầu béo

Trên thị trường yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sản phẩm, thì sự ứng dụng các phương pháp membrane, đặc biệt là các mô hình membrane kết hợp mang tính hiện đại vào sản xuất là xu hướng phát triển mạnh trong tương lai

Siêu lọc thu nhận protein trong nói chung là mục tiêu của nhiều nghiên cứu hiện nay để có thể tìm được quy trình tối ưu ứng dụng vào thực tiễn sản xuất [97, 98, 99, 100] Đặc biệt hiện nay người ta sử dụng phương pháp này để thu các loại protein từ rong như Protein isolate từ rong tảo [73, 101, 102, 103, 104]

1.5 Tính chất chức năng của protein

Protein có thể có mặt trong thực phẩm ở trạng thái rắn hoặc lỏng, dạng thuần

nhất hoặc hỗn hợp Nó là hợp phần có sẵn hoặc đưa vào để tạo giá trị dinh dưỡng, tạo hình và tạo kết cấu đặc trưng cho thực phẩm Trong các điều kiện công nghệ nhất định, protein có thể tương tác với nhau, với nước, glucid, lipid để tạo độ đặc, độ dẻo, độ trong, tạo bọt, tạo độ xốp cho sản phẩm

Các tính chất chức năng của protein chính là các tính chất hóa lý tạo nên các đặc tính mong muốn cho sản phẩm chứa protein Các tính chất chức năng của protein được chia làm ba nhóm:

- Hydrate hóa (phụ thuộc vào liên kết protein – nước) như khả năng hút ẩm, giữ nước, trương nở, dẻo dính, phân tán, hòa tan, tạo độ nhớt…

- Các tính chất do liên kết giữa protein – protein như là khả năng đông tụ, tạo gel, kết tủa và tạo các cấu trúc khác (như tạo sợi, tạo màng, tạo bột nhão…)

- Các tính chất bề mặt liên quan đến sức căng bề mặt như khả năng tạo nhũ tương, tạo bọt…

1.6 Hướng nghiên cứu của đề tài

Rong biển là nguồn nguyên liệu tự nhiên xanh, sạch và rất quý giá với rất nhiều các thành phần, dưỡng chất được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, y học

Nguồn protein trong rong có giá trị cao, ngoài hai thành phần protein là lectin và phycobiliprotein vừa đề cập ở trên, các chế phẩm protein concentrate (PC) và protein isolate (PI) từ rong cũng có triển vọng sử dụng trong thực phẩm chức năng do có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch Kết quả một số nghiên cứu khác cũng cho thấy sử dụng các loại protein thực vật làm giảm sự tổng hợp một loại hormone là glucagon dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol và triglyceride trong máu [105]

Hơn nữa, việc thu hoạch và sử dụng rong biển sẽ hỗ trợ phát triển cộng đồng nông thôn ven biển dựa trên các nguồn tài nguyên rong biển bền vững Tuy vậy hiện nay việc nghiên cứu về rong còn khá mới nên chưa có nhiều công trình liên quan đến vấn đề này

Hàm lượng protein trong rong Cheatomorpha sp ở khu vực đồng bằng sông Cửu

Long ở nước ta khá cao (9,06-14,02%w/w) nhưng chưa được khai thác sử dụng thỏa đáng Những nghiên cứu bước đầu trong việc xác định các thành phần sinh hóa và

trích ly protein từ rong nước lợ Cheatomorpha sp của tác giả Bạch Ngọc Minh đã đặt

nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực này Tác giả đã phân tích các

thành phần sinh hóa trong rong và trích ly protein từ rong tươi Chetomorpha sp bằng

phương pháp sử dụng kiềm có hỗ trợ siêu âm trong quá trình trích ly đạt hiệu suất trích ly tổng cộng là 82,46% Phương pháp dùng kỹ thuật siêu âm gặp hạn chế khi triển khai ở quy mô công nghiệp Vì vậy có thể phát triển nghiên cứu theo hướng trích ly protein sử dụng enzyme kết hợp kiềm để thu nhận protein thô Mặt khác, chế phẩm protein thu được sau kết tủa ở điểm đẳng điện có hàm lượng protein 58,51% của tác giả Bạch Ngọc Minh chưa phù hợp sử dụng trong thực phẩm Do đó, cần phải nghiên cứu tinh sạch protein để thuận tiện ứng dụng trong thực phẩm cũng như xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein thu được

Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi tập trung nghiên cứu các nội dung sau:

- Nghiên cứu trích ly protein từ rong nước lợ Chaetomorpha sp bằng phương

pháp sử dụng enzyme cellulase kết hợp với kiềm - Nghiên cứu tinh sạch protein bằng các phương pháp tủa để thu được chế phẩm

protein có độ tinh khiết >75%

- Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein từ rong nước lợ

Cheatomorpha sp

- Thử nghiệm thu nhận protein C-Phycocyanin trong trong Cheatomorpha sp

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Rong

Rong mền Cheatomorpha sp được thu nhận ở các ao nuôi tôm quảng canh tại

xã Long Điền, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu Rong được vận chuyển trong thùng xốp trong ngày lên phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm thực hành (trường Đại học Công nghiệp thực phẩm Tp HCM) Tại phòng thí nghiệm, rong được rửa để loại bỏ các tạp chất, sau đó sấy ở nhiệt độ 500

C tới độ ẩm 9-10%, xay nhỏ với lưới 80 mesh và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50 – 60oC đến độ ẩm 4%

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng

1 Enzyme Clellulase (Crestone Conc) 1.100UI/ml Genecor, Mỹ

10 Natri citrate (Na3C6H5O7) ≥ 99,7% Trung Quốc

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein:

 Tủ bảo quản mẫu: tủ lạnh Toshiba, Nhật