Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Khả năng đối kháng của vi khuẩn Lactic ức chế Vibrio Parahaemolyticus trong nuôi trồng thủy sản

Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn lactic Weissella cibaria được phân lập từ hệ tiêu hóa của tôm được kiểm chứng có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus trong cả điều kiện i

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TÔ ĐÌNH PHÚC

KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN LACTIC

ỨC CHẾ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG NUÔI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TÔ ĐÌNH PHÚC

KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN LACTIC

ỨC CHẾ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG NUÔI

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN PHONG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS NGUYỄN HỮU PHÚC

Cán bộ chấm nhận xét 2: TS PHAN NGỌC HÒA

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường: Đại học Bách Khoa, ĐHQG TP HCM ngày 22 tháng 7 năm 2016

Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ bao gồm:

1 Chủ tịch: GS TS LÊ VĂN VIỆT MẪN 2 Phản biện 1: TS NGUYỄN HỮU PHÚC 3 Phản biện 2: TS PHAN NGỌC HÒA 4 Ủy viên: PGS TS LÊ THỊ THỦY TIÊN 5 Thư ký: TS HUỲNH NGỌC OANH

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá luận văn và Trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: TÔ ĐÌNH PHÚC MSHV: 13310309 Ngày, tháng, năm sinh: 10/09/1990 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã số: 60.42.80

I TÊN ĐỀ TÀI: KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA VI KHUẨN LACTIC

ỨC CHẾ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG NUÔI TRỒNG

THỦY SẢN

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có khả

năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus từ ruột tôm Khảo sát các chỉ

tiêu tăng trưởng của tôm khi bổ sung vi khuẩn lactic tuyển chọn vào thức ăn

Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic tuyển chọn đối với V

parahaemolyticus khi thử nghiệm trực tiếp trên tôm Tối ưu mật độ sinh

khối chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 07/2015 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 07/2016 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Nguyễn Thúy Hương Em cảm ơn Cô trong thời gian vừa qua đã tận tâm hướng dẫn, góp ý giúp em hoàn thiện hơn về mặt kiến thức Cảm ơn Cô đã dạy cho em biết những kiến thức mà trước đây em chưa từng biết Cảm ơn Cô đã dẫn dắt em Cảm ơn cô đã hết lòng tận tụy lo lắng cho sinh viên của mình

Em xin chân thành cảm ơn quí Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã cho em những tiết học bổ ich và những kiến thức chuyên sâu

Em xin cảm ơn Cô Lê Phi Nga và Thầy Hoàng Anh Hoàng đã có những góp ý và phản biện đề cương sâu sắc để em có cái nhìn đúng đắn hơn trong định hướng của mình

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Phạm Minh Tuấn – Giám đốc Công ty cổ phần công nghệ sinh học Tiên Phong đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện đề tài này Một lần nữa em cảm ơn Thầy vì tất cả

Con xin gửi lời tri ân đến Cha, Mẹ Người đã quan tâm đến con nhiều nhất và luôn ủng hộ con, che chở cho con dù có thành công hay thất bại Cha, Mẹ là động lực vô hạn đối với con

Xin cảm ơn những người bạn đã hỗ trợ, động viên và chia sẽ cùng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên do một số lý do khách quan và kiến thức còn nhỏ bé nên không thể tránh được những sai xót Rất mong được sự quan tâm, thông cảm và góp ý của quý Thầy, Cô để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 7 năm 2016

TÓM TẮT

Bệnh hoại tử gan tụy cấp hay bệnh chết sớm trên tôm là một trong những dịch bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản với tác nhân

gây bệnh là Vibrio parahaemolyticus Trên thị trường có rất nhiều chế phẩm trong

việc phòng ngừa và điều trị bệnh do vi khuẩn này gây ra nhưng vẫn chưa mang lại hiệu quả, hơn nữa việc sử dụng kháng sinh mang lại nhiều tiêu cực cho vật nuôi lẫn con người Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển một chế phẩm mới mang lại hiệu quả

trong việc chống lại vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là điều cấp thiết Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn lactic Weissella cibaria được phân lập từ hệ tiêu hóa của tôm được kiểm chứng có khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus

trong cả điều kiện in vitro và điều kiện in vivo khi thử nghiệm trực tiếp trên tôm

Kết quả thử nghiệm cho thấy khi bổ sung W cibaria vào thức ăn của tôm, tỷ lệ sống

được cải thiện rõ rệt đạt 95,67 – 100%, trọng lượng trung bình sau 30 ngày nuôi đạt 0,74 – 1,11 g/con, tốc độ tăng trưởng tuyệt đối đạt 0,02 – 0,04 g/ngày và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) khoảng 0,83 – 0,93 sau 30 ngày nuôi Khi thử nghiệm

cảm nhiễm V parahaemolyticus, kết quả cho thấy hệ vi sinh đường ruột của tôm được cải thiện, mật độ vi khuẩn lactic tăng lên trong khi mật độ V

parahaemolyticus giảm xuống, điều này cho thấy có sự đối kháng mạnh mẽ của W cibaria, bằng chứng là tỷ lệ sống của tôm đạt 55 – 75% so với 0% ở bể đối chứng

Sau khi có được kết quả thử nghiệm khả quan, thí nghiệm tối ưu quá trình lên men

thu sinh khối W cibaria nhằm bước đầu tạo chế phẩm được thực hiện Kết quả thu

được môi trường tối ưu cho sinh khối cao hơn môi trường MRSB đến 39,74% và chi phí giảm đến 32,65%; bao gồm các thành phần là Glucose 20 g/L; Pepton 6 g/L; Beef extract 2 g/L; Yeast extract 8,77 g/L, Sodium acetate 7,18 g/L, K2HPO4 1 g/L, Ammonium citrate 3,8 g/L; Tween 80 1 g/L; Manganese sulfate 0,02 g/L; Magnesium sulfate 0,1 g/L; pH ban đầu 6 và thời gian tăng sinh 72 giờ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong công trình nào khác

Học viên

Tô Đình Phúc

1.3.2.Phân loại Bacteriocin 12

1.4.Các sản phẩm phòng ngừa và điều trị bệnh gan tụy cấp trên thị trường 19

1.5.Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài20CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1.Nguyên vật liệu 25

2.2.Thiết bị và hóa chất 25

2.3.Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1.Nội dung nghiên cứu 25

2.3.2.Bố trí thí nghiệm 27

2.3.2.1.Phân lập vi khuẩn Vibrio sp 27

2.3.2.2.Phân lập vi khuẩn lactic 29

2.3.2.3.Phương pháp định danh vi sinh vật bằng phương pháp giải và phân tích trình tự gen 16S – rRNA 30

2.3.2.4.Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic 31

2.3.2.5.Phương pháp xác định bản chất của chất kháng khuẩn 34

2.3.2.6.Khảo sát sự ảnh hưởng của vi khuẩn lactic đối với các chỉ tiêu tăng trưởng của tôm 34

2.3.2.7.Kiểm tra khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic trên tôm 37

3.1.1.Phân lập vi khuẩn Vibrio sp 47

3.1.2.Phân lập vi khuẩn lactic 48

3.2.Sàng lọc chủng vi khuẩn lactic 49

3.2.1.Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic 49

3.2.2.Định danh chủng vi khuẩn lactic mục tiêu 52

3.3.Khảo sát sự ảnh hưởng của W cibaria đối với các chỉ tiêu tăng trưởng của tôm 53

3.4.Khả năng đối kháng của W cibaria đối với V parahaemolyticus trên tôm 57

3.5.Tối ưu quá trình lên men thu sinh khối W cibaria nhằm bước đầu tạo chế phẩm 61

3.5.1.Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa OD và sinh khối W cibaria 613.5.2.Khảo sát sự ảnh hưởng của pH và thành phần môi trường đến mật độ sinh khối của W cibaria 61

3.5.3.Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ sinh khối W cibaria 673.5.4.Xác định khoảng giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng 70

3.5.5.Xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng 72

3.5.6.Kiểm chứng lựa chọn giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng77CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 89

iii

DANH MỤC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Mô hình cơ chế hoạt động của nisin xuyên qua màng mục tiêu Nisin liên kết với phân tử tiếp nhận lipid II trên mặt phân cách giữa thành tế bào (CW) và màng sinh chất (CM) Phức hợp Nisin – Lipid II được thành lập và tạo lỗ xuyên

màng [1]

Hình 1.2 : Cơ chế hoạt động của Bacteriocin IIa (a) Những vùng cấu trúc dự đoán của bacteriocin (b) Tương tác giữa các vùng cấu trúc với bề mặt màng (c) Quá

trình chèn vào màng của bacteriocin và hình thành lỗ hỗng [2]

Hình 1.3: Bể nuôi chuẩn bị tôm và nước cho các nghiệm thức Hình 1.4: Mô hình nghiệm thức các bể thử nghiệm nuôi tôm Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn V parahaemolyticus trên hai môi trường TCBS và CHROMagar VIBRIO

Hình 3.2: Kết quả đối kháng của chủng 31.0 và 40.2 với V parahaemolyticus Hình 3.3: Kết quả xác định bản chất chất kháng khuẩn của chủng 31.0 và 40.2 Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ sống của tôm sau 30 ngày nuôi

Biểu đồ 3.2: Mật độ vi khuẩn đường ruột tôm sau 30 ngày nuôi Biểu đồ 3.3: Chỉ tiêu trọng lượng thu hoạch

Biểu đồ 3.4: Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối Biểu đồ 3.5: Hệ số chuyển đổi thức ăn Biểu đồ 3.6: Tổng trọng lượng thu hoạc Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ sống của tôm sau 7 ngày cảm nhiễm V parahaemolyticus Biểu đồ 3.8: Mật độ vi khuẩn đường ruột tôm sau khi thử nghiệm với V parahaemolyticus

Đồ thị 3.1: Đường cong thể hiện khoảng giá trị của các yếu tố cho mật độ sinh khối cao nhất

Đồ thị 3.2 : Đồ thị mặt đáp ứng của mật độ sinh khối (log CFU/m) với cao nấm men và ammonium citrate

Đồ thị 3.3 : Đồ thị mặt đáp ứng của mật độ sinh khối (log CFU/m) với cao nấm men và Sodium acetate

Bảng 3.2: Kết quả đường kính kháng (mm) của vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus qua 3 phương pháp khác nhau

Bảng 3.3: Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA của chủng vi khuẩn lactic 40.2 phân lập được

Bảng 3.4: Phân tích thống kê các chỉ tiêu tăng trưởng của tôm Bảng 3.5: Mật độ vi sinh và tỉ lệ sống của tôm sau khi thử nghiệm V parahaemolyticus

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH và thành phần môi trường đến mật độ sinh khối W cibaria

Bảng 3.7: Giá trị các yếu tố trong ma trận Plackett - Burman Bảng 3.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm Plackett - Burman

Bảng 3.9: Kết quả phân tích dữ liệu ma trận Plackett - Burman Bảng 3.10: Kết quả mật độ của W cibaria theo từng nghiệm thức trong ma trận Plackett - Burman

Bảng 3.11 : Kết quả tính bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng Bảng 3.12 : Kết quả của các thí nghiệm leo dốc

v

Bảng 3.13 : Các mức độ giá trị của các yếu tố ảnh hưởng Bảng 3.14 : Kết quả của các thí nghiệm trong ma trận của phương án cấu trúc có tâm

Bảng 3.15 : Kết quả phân tích ước lượng hệ số hồi quy Bảng 3.16: Kết quả thực nghiệm kiểm chứng các giá trị dự đoán Bảng 3.17: Kết quả thực nghiệm so sánh giữa môi trường tối ưu và MRSB

1

MỞ ĐẦU

Tính cấp thiết của đề tài

Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành mang lại giá trị rất lớn cho nền kinh tế Việt Nam Diện tích nuôi trồng hàng năm luôn được mở rộng và sản lượng thu hoạch ngày càng tăng Đặc biệt, nuôi trồng tôm với giá trị xuất khẩu rất lớn đã đóng góp quan trọng vào mức tăng kim ngạch xuất khẩu thủy sản nói chung Tuy nhiên, ngoài những kết quả đạt được vẫn còn canh cánh nỗi lo về dịch bệnh và biến động thị trường Đặc biệt, tình hình dịch bệnh thủy sản vẫn còn xảy ra ở nhiều nơi, trong đó, dịch bệnh nguy hiểm gây thiệt hại hàng nghìn tỷ đồng của người nuôi và ngân sách nhà nước, ảnh hưởng nghiêm trọng đến xuất khẩu thủy sản của nước ta là hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi

Hội chứng chết sớm (EMS – Early Mortality Syndrome) còn được gọi là Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND – Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease) là một bệnh cấp tính trên tôm, tấn công vào các trại nuôi tôm ở khu vực Đông Nam Á

[3] và đặc biệt là tại Việt Nam [4] Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh lại ảnh hưởng xấu đến môi trường, gây hại cho sức khỏe vật nuôi và con người [5] [6], thậm chí dẫn đến việc tạo ra các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh gây hại [7] Vì

vậy để giải quyết vấn đề này, phương án thay thế kháng sinh bằng yếu tố thân thiện

môi trường, an toàn cho sức khỏe như các hợp chất thay thế kháng sinh [8] hoặc probiotic [9] Trong đó, những giống vi khuẩn sinh bacteriocin là những ứng cử

viên tốt nhất cho phương án thay thế này vì chúng được sử dụng như một yếu tố

thay thế kháng sinh [10] và những vi khuẩn này sẽ là probiotic tiềm năng [11] Hầu

hết các probiotic được cân nhắc sử dụng cho thủy sản đều thuộc các giống vi khuẩn

lactic như Lactobacillus sp., Carnobacterium sp [12] [13] Vi khuẩn lactic được sử

dụng làm probiotic một cách rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản vì những tính năng tốt của chúng như không có độc lực, hoặc độc lực thấp, cạnh tranh và đối kháng với

các vi khuẩn gây hại cũng như khả năng sống sót trong đường tiêu hóa [14] và đặc

biệt kháng được các bệnh do Vibrio sp gây ra [15]

2 Việc chống lại dịch bệnh gan tụy cấp trên tôm bằng các giải pháp thay thế

kháng sinh có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus như bacteriocin

thông qua hình thức sử dụng probiotic của vi khuẩn lactic là điều cần thiết Vì vậy,

đề tài nghiên cứu “Khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic ức chế Vibrio parahaemolyticus trong nuôi trồng thủy sản” được thực hiện nhằm mục tiêu với

nội dung sau:

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát

Tạo chế phẩm probiotic ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh

trong nuôi trồng thủy sản

Mục tiêu cụ thể

Phân lập được chủng giống vi khuẩn lactic đối kháng vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus và tối ưu quá trình lên men thu sinh khối

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và định danh vi khuẩn V parahaemolyticus từ tôm bệnh gan tụy

cấp

- Phân lập và sàng lọc vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng với Vibrio

parahaemolyticus từ ruột tôm

- Khảo sát các chỉ tiêu tăng trưởng của tôm khi bổ sung vi khuẩn lactic tuyển chọn vào thức ăn

- Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic tuyển chọn đối với V

parahaemolyticus khi thử nghiệm trực tiếp trên tôm

- Tối ưu quá trình lên men thu sinh khối vi khuẩn lactic tuyển chọn

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Hội chứng chết sớm – Bệnh hoại tử gan tụy cấp trong nuôi trồng

thủy sản

Hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome – EMS) là tên gọi chung được đặt ra để mô tả tỉ lệ tử vong cao bất thường có thể xảy ra trong vòng 30 ngày đầu tiên của quá trình nuôi tôm thương phẩm do một loạt các nguyên nhân liên quan đến khâu quản lý ao nuôi và các yếu tố gây bệnh Ngoài các vấn đề về quản lý ao nuôi, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy sự liên quan giữa các tác nhân gây bệnh như virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV), virus gây bệnh

đầu vàng (Yellow Head Virus – YHV) và các bệnh do vi khuẩn Vibrio sp đối với

hội chứng chết sớm

Kể từ năm 2009, những trường hợp chết trong giai đoạn nuôi ban đầu đã xuất hiện một cách rõ ràng ở tôm sú và tôm thẻ chân trắng Hội chứng này làm tôm chết với số lượng lớn và tỉ lệ chết lên đến 100% trong vòng 20 – 30 ngày sau thả nuôi Các cá thể tôm nhiễm bệnh có biểu hiện bất thường ở gan tụy, thường là bị teo và có màu trắng kèm theo triệu chứng bong vỏ, đổi màu nhạt, chậm lớn và khi đến giai đoạn gần chết sẽ bơi chìm xuống đáy ao Kiểm tra mô học gan tụy của các cá thể tôm bệnh này cho thấy có sự xuất hiện hoại tử mạnh ở gan tụy Thuật ngữ Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS) được đặt dựa trên thương tổn đặc biệt của bệnh xuất hiện trên gan tụy của tôm, và những dấu hiệu cũng như hậu quả của bệnh đã làm cho hội chứng này trở thành tiêu chuẩn trong chẩn đoán Hội chứng chết sớm so với các nguyên nhân gây bệnh tiềm

năng khác [16]

Như vậy, Hội chứng chết sớm là một thuật ngữ bao hàm các nguyên nhân gây nên từ các yếu tố môi trường như virus gây bệnh đốm trắng, virus gây bệnh đầu

4 vàng Tuy nhiên, ở Việt Nam, thuật ngữ này cũng được gọi với một các tên khác là

bệnh hoại tử gan tụy cấp [17]

Các triệu chứng của bệnh hoại tử gan tụy cấp được nhận thấy thông qua sự tổn thương nghiêm trọng gan tụy ở tôm vào giai đoạn cấp tính của bệnh Trong đó, vi

khuẩn Vibrio parahaemolyticus được xác định là nguyên nhân gây ra bệnh hoại tử

gan tụy cấp ở Việt Nam [17]

1.2 Probiotic

Nuôi trồng thủy sản đã trở thành một hoạt động kinh tế quan trọng ở nhiều quốc gia trên thế giới Trong những cơ sở sản xuất qui mô lớn, thủy sản phải chịu những điều kiện khắc nghiệt, đây là vấn đề có liên quan đến dịch bệnh và sự ô

nhiễm môi trường thường xảy ra dẫn đến sự hao hụt kinh tế nghiêm trọng [7] [12]

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc các vi khuẩn có lợi có thể kiểm soát được các tác nhân gây bệnh thông qua nhiều cơ chế khác nhau ngày càng được xem như là một lựa chọn thay thế cho kháng sinh Sự bổ sung các probiotic vào chế độ dinh dưỡng trong thủy sản đã được thực hiện và ứng dụng vào nhiều năm trước đây

[18 – 22]

1.2.1 Probiotic trong thủy sản

Moriarty (1999) đã đề nghị một định nghĩa mở rộng hơn đề cập đến nuôi trồng thủy sản rằng cũng có thể bổ sung những vi sinh vật sống trong môi trường tự nhiên vào những bể hoặc ao, hồ bởi vì những vi sinh vật này có thể làm thay đổi hệ vi sinh vật trong nước và bùn lắng Sức khỏe của động vật được cải thiện thông qua việc loại bỏ hoặc làm giảm mật độ tác nhân gây bệnh và cải thiện môi trường nước thông qua sự phân hủy nhanh hơn các bã thải hữu cơ Không giống như động vật trên cạn, những động vật trong các ngư trường bị bao phủ bởi hàng triệu tác nhân gây bệnh vô cùng phong phú và đa dạng về chủng loại sống độc lập với vật chủ

[23]

5 Có rất nhiều định nghĩa về probiotic, tuy nhiên, không có định nghĩa nào trong số đó phù hợp với nuôi trồng thủy sản bởi vì những vật nuôi trong thủy sản có một mối quan hệ rất chặt chẽ với môi trường của chúng hơn là những vật nuôi trên cạn Thực ra, trong thủy sản, những tác nhân gây bệnh tăng sinh độc lập với vật chủ, vì vậy những sinh vật cơ hội có thể đạt đến mật độ cao quanh những vật nuôi trong

thủy sản [24] Sự tương tác chặt chẽ giữa môi trường và vật nuôi thủy sản đã dẫn

đến một định nghĩa probiotic được điều chỉnh phù hợp với nuôi trồng thủy sản Dựa vào những căn cứ trên, một định nghĩa mới cho probiotic được đưa ra như sau: “Một chế phẩm bổ sung vi sinh vật sống có một tác dụng có lợi lên vật chủ bằng cách điều chỉnh quần thể vi sinh vật có tương tác với vật chủ hoặc môi trường xung quanh, bằng cách đảm bảo việc sử dụng thức ăn đã được cải thiện hoặc gia tăng giá trị dinh dưỡng của chúng, bằng cách gia tăng đáp ứng của vật chủ đối với bệnh,

hoặc bằng cách cải thiện chất lượng của môi trường xung quanh” [20]

Định nghĩa trên đã trao cho các chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản một khả năng lớn trong việc tác động tích cực đến sức khỏe của vật nuôi bằng khả

năng đối kháng cạnh tranh [12], bằng việc cung cấp enzyme để tiêu hóa và bằng sự tăng cường đáp ứng miễn dịch hoặc bằng việc tạo ra những hợp chất ức chế [9]

1.2.2 Vi khuẩn lactic 1.2.2.1 Khái niệm

Vi khuẩn lactic (LAB – Lactic Acid Bacteria) là nhóm Gram dương, cầu khuẩn không sinh bào tử và trực khuẩn, kị khí tùy nghi Chúng sản sinh ra acid lactic như một sản phẩm chính trong suốt quá trình lên men carbonhydrate Theo

Orla-Jensen (1919), những chi LAB đại diện là Lactobacillus, Leuconostoc,

Pediococcus và Streptococcus Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm xét về

hình thái và xét về kiểu lên men Trong đó, hình thái gồm có cầu khuẩn và trực khuẩn Kiểu lên men gồm vi khuẩn lactic lên men đồng hình với sản phẩm chính là acid lactic qua quá trình lên men đường và vi khuẩn lactic lên men dị hình với sản

phẩm sinh ra là acid lactic và một lượng đáng kể acid acetic và alcohol [25]

6 Nhiều chủng của các loài vi khuẩn lactic có ảnh hưởng tích cực đến nuôi trồng

thủy sản như Lactobacillus acidophilus, L sporogenes, L rhamnosus, L

plantarum, Lactococcus lactis và Pediococcus acidilactici Tuy nhiên, chỉ có một

vài báo cáo khoa học đề cập đến việc sử dụng chúng trên tôm Mathieu Castex và cộng sự (2008) đã từng nghiên cứu về những hiệu quả của vi khuẩn lactic, đối

tượng nghiên cứu là Pediococcus acidilactici làm probiotic, khảo sát về mức độ

tăng trưởng, dinh dưỡng và về khía cạnh vi sinh của tôm Kết quả thu được là tôm có khả năng chịu được dịch bệnh và tăng khả năng sống sót của tôm khi bổ sung

probiotic Pediococcus acidilactici vào thức ăn Nghiên cứu này càng khẳng định sự

hiệu quả của vi khuẩn lactic đối với sức khỏe của vật chủ trong nuôi trồng thủy sản Trong những năm gần đây, việc kiểm soát sinh học các dịch bệnh bằng các phương pháp thân thiện với môi trường như probiotic đã trở thành một đối tượng nghiên cứu quan trọng trong nuôi trồng thủy sản Một số báo cáo đã mô tả chi tiết những tiến bộ khác nhau trong việc sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản mà đối

tượng đề cập ở đây là tôm [26] Trong đó vi khuẩn lactic được ứng dụng phổ biến

nhất vào chế độ dinh dưỡng của tôm, chúng cạnh tranh chống lại các vi sinh vật gây hại, củng cố các cơ chế bảo vệ tự nhiên của vật nuôi

1.2.2.2 Phân loại

Vi khuẩn lactic được phân loại về mặt hình thái gồm trực khuẩn

(Lactobacillus sp và Carnobacterium sp ) và cầu khuẩn (các chi còn lại) Tính chất

quan trọng tiếp theo được sử dụng trong việc phân loại vi khuẩn lactic là kiểu lên men glucose dưới điều kiện tiêu chuẩn (không giới hạn việc cung cấp glucose, các yếu tố tăng trưởng như amino acid, vitamin và các chất tiền acid nucleic và giới hạn oxy sẵn có), ngoài ra, sự phân loại còn dựa vào các tiêu chuẩn của sinh học phân tử như giải mã trình tự rRNA và tạo ra các cây phát sinh loài nhằm xác định chính xác hơn về chủng loài, phân loại dưới loài và từ đó hiểu rõ hơn về sinh lý, khả năng trao

đổi chất, các đặc tính quan trọng khác [27] Vi khuẩn lactic có thể được chia thành hai nhóm là vi khuẩn lên men đồng hình và lên men dị hình [25] [28] Trong đó, vi

khuẩn lactic được phân ra gồm nhiều chi khác nhau như chi Lactobacillus, chi

7

Pediococcus, chi Leuconostoc, chi Lactococcus, chi Streptococcus, chi Bifidobacterium,…

a Chi Lactobacillus Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que không sinh bào tử, thường không

di động và đôi khi có khả năng làm giảm nitrate, không sinh catalase và phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, như carbohydrate, acid amin, peptide, acid béo,

muối, dẫn xuất của acid nucleic và vitamin Lactobacillus thường sử dụng glucose

dể lên men thông qua con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) và đường phân, hoặc lên men đồng hình, sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose, hoặc lên men dị hình, tạo ra acid lactic, CO2, ethanol và acid acetic

Các tế bào Lactobacillus có hình thái dài và mảnh, đôi khi que cong, ngắn,

hoặc cầu khuẩn; thông thường các tế bào hình que xếp thành chuỗi và có độ dài và

chiều rộng của chuỗi trong khoảng 0,5 – 1,2 x 1,0 – 10,0 µm Lactobacillus tăng

trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 2 đến 53oC, và phạm vi pH trong một khoảng rộng từ 3 đến 8 Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 30 – 40oC và pH tối ưu trong khoảng từ

5,5 đến 6,2 [29]

b Chi Pediococcus

Pediococci là một nhóm vi khuẩn lactic đa dạng Các chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp ra một số chất chống lại vi sinh vật bao gồm các acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, phenyllactic acid và acid caproic), carbon dioxide, hydrogen peroxide, diacetyl, ethanol và bacteriocin Những chất này có khả năng ức

chế hay khử vi khuẩn không mong muốn như Clostridium botulinum,

Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes [29]

Pediococci là cầu khuẩn Gram-dương, phân chia theo hai mặt phẳng, thường xuất hiện dạng song cầu, tứ cầu và những dạng khác, không di động và không bào tử Pediococci không khử nitrate, chúng cũng cần hầu hết các loại amino acid,

8 biotin, folinic acid, pantothenic acid, pyridoxine và riboflavin cho sự tăng trưởng Pediococci lên men đồng hình trong điều kiện kỵ khí, chúng vận chuyển glucose bằng việc sử dụng phosphoenolpyruvate (PEP) thông qua hệ thống phosphotransferase (PTS), và chuyển hóa nó thông qua con đường Embden – Meyerhof – Parnas (EMP) Sự lên men lactose còn phụ thuộc vào chủng

Pediococci có khả năng lên men pentose thành lactate và acetate [29]

c Chi Leuconostoc

Các thành viên thuộc chi Leuconostoc bắt màu Gram dương, không di động,

không sinh bào tử, kỵ khí tuỳ ý, các tế bào hình elip hoặc hình cầu, thường kéo dài,

và sắp xếp theo cặp hoặc chuỗi Leuconostoc sp là những sinh vật thường được tìm

thấy trong các môi trường có các nguyên liệu thực vật, sữa, sản phẩm từ sữa, thịt và

các sản phẩm thực phẩm khác Leuconostoc tương tự như các chủng Lactobacillus lên men dị hình, đặc biệt là các loài Lb confusus và Lb viridescens có sinh khí

Leuconostoc và Lactobacillus thường được báo cáo phải được phân lập từ cùng một

môi trường và có nhiều đặc tính giống nhau Leuconostoc sp là hình thức trung gian giữa liên cầu khuẩn và Lactobacilli

Loài Leuconostoc đôi khi phát triển tốt hơn trong điều kiện hiếu khí so với

điều kiện yếm khí Điều này là do lượng ATP được tạo ra thông qua việc chuyển

hóa acid acetic từ acetylphosphat Các loài Leuconostoc sử dụng con đường biến

dưỡng này để lên men glucose với sự hiện diện của các chất nhận electron bên ngoài như oxy Diacetyl là một hợp chất thơm quan trọng trong các sản phẩm sữa và có hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm và

nấm men Việc tạo ra bacteriocin đã được ghi nhận ở các chủng Leuc

mesenteroides, Leuc carnosum, Leuc citreum, Leuc gelidum và Leuc

pseudomesenteroides [29]

d Chi Weissella

9

Chi Weissella là một chi gần giống với chi Leuconostoc, và cả 2 chi này đều thuộc họ Leuconostocaceae Chi Weissella được đề xuất bởi Collins và cộng sự vào

năm 1993 và bao gồm các loài được gọi tên theo khóa phân loại trước đây như

Leuconostoc paramesenteroides, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus confusus, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus minor và Lactobacillus halotolerans Các loài

này được phân loại lại với tên loài được giữ nguyên và thay đổi tên chi thành

Weissella như Weissella paramesenteroides, Weissella viridescens, Weissella confusa, Weissella kandleri, Weissella minor và Weissella halotolerans Các loài

thuộc chi Weissella bắt màu Gram dương, catalase âm tính, hình que ngắn không

sinh bào tử Khi quan sát vi thể các tế bào xuất hiện theo cặp hoặc chuỗi ngắn và

một số loài có xu hướng đa hình Weissella sp là các loài kị khí tùy nghi, không di

động và có khả năng tổng hợp các hợp chất kháng khuẩn Việc tổng hợp ra các

bacteriocin được tìm thấy trên các loài W cibaria và W paramesenteroides [30],

đặc biệt những hợp chất kháng khuẩn này có khả năng chống lại các loài vi khuẩn

Virbio sp gây bệnh trên cá [31]

e Chi Lactococcus

Lactococci là vi khuẩn Gram dương, catalase âm tính, không di chuyển và kỵ khí tuỳ nghi, dạng cầu khuẩn, sản phẩm cuối cùng chủ yếu của chúng trong quá trình lên men glucose là L - (+) - acid lactic Lactococci có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và hay biến đổi, và thường hiện diện ở trong cơ thể động vật và thực vật Vào năm 1873, Joseph Lister lần đầu tiên thu được canh trường nuôi cấy vi khuẩn

Lactococcus lactis tinh khiết và được gọi là vi khuẩn lactis Tính đến tháng 12 năm

2013, các chi Lactococcus gồm 11 loài và phân loài được công nhận gồm Lac

chungangensis, Lac fujiensis, Lac garvieae, Lac lactis subsp cremoris, Lac lactis

subsp hordniae, Lac lactis subsp lactis, Lac lactis subsp tructae, Lac piscium,

Lac plantarum, Lac raffinolactis và Lac taiwanensis

Các hình thái chung của lactococci gồm từ 0,5 đến 1 µm đường kính hình cầu hoặc hình trứng, tế bào tồn tại ở dạng đôi hoặc chuỗi Các tế bào lactococci

10 thường mọc dài ra theo hướng của chuỗi, điều này làm cho việc phân biệt với

lactobacilli trở nên khó khăn hơn Lactococcus thường phát triển trong khoảng 10 –

40oC Chúng thường phát triển trong môi trường nuôi cấy có chứa 4,0 % (w/v)

NaCl, ngoại trừ Lac lactis subsp cremoris chỉ có thể chịu được 2,0 % NaCl

Lactococci phát triển tốt nhất tại các giá trị pH gần như trung tính và không còn khả năng tăng trưởng khoảng pH 4,5 Lactococci là vi khuẩn vi hiếu khí lên men đồng

hình Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, Lac lactis sẽ tạo ra các hợp chất oxy độc

hại như superoxide, hydrogen peroxide và các chất có gốc hydroxyl [29]

f Chi Streptococcus Streptococcus bắt màu Gram dương, không di chuyển, tế bào hình cầu hoặc

hình trứng thường được sắp xếp theo cặp hoặc chuỗi khi nuôi cấy trong môi trường lỏng Tất cả các loài đều kỵ khí tùy nghi, một số cần CO2 trong quá trình tăng

trưởng Streptococcus không sinh bào tử, catalase âm tính, lên men đồng hình và có

nhu cầu dinh dưỡng phức tạp Chúng chuyển hóa carbohydrate thông qua quá trình lên men và tạo ra acid lactic nhưng không sinh khí Nhiệt độ tối ưu khoảng 37oC, tuy nhiên, giữa các loài khác nhau thì khoảng nhiệt độ cũng khác nhau Nhiều loài gây bệnh cho người và động vật và một vài trong số chúng có độc lực cao Năm

1884, từ Streptococcus được sử dụng lần đầu tiên với ý nghĩa chung để mô tả loài

Streptococcus pyogenes Streptococcus pyogenes ban đầu đã được phân lập từ các

vết thương mưng mủ ở người; chúng được quan sát thấy dưới dạng liên cầu khuẩn và thuật ngữ 'Streptococcus' được sử dụng từ đây dựa vào hình thái vi thể Một vài

năm sau đó, một số loài Streptococcus khác được phân lập từ nhiều nguồn khác

nhau như bò với bệnh viêm vú, từ ngựa và người bị viêm phổi [29]

g Chi Bifidobacterium Bifidobacterium được phân lập lần đầu tiên từ phân của trẻ bú sữa mẹ vào

năm 1899, bởi Henri Tissier, và vào thời điểm đó, chúng được đặt tên là Bacillus

bifidus Tính đến thời điểm tháng 12/2013, chi Bifidobacterium có 41 loài và 9

11 chủng dưới loài được đề xuất Những loài này điều được phân lập từ đường tiêu hóa của con người, động vật và côn trùng, và đặc biệt là từ răng bị sâu của con người và các sản phẩm từ sữa

Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, không tạo khí, bắt màu

Gram dương, âm tính với catalase Hình thái vi thể của chúng thường là hai nhánh, dạng V hoặc Y Lý do bất thường của hình thái vi khuẩn này đến nay vẫn chưa có lời giải đáp Tuy nhiên, một vài nghiên cứu cho thấy việc không có hoặc có ít hàm lượng N-acetylamino, Ca2+ hoặc amino acid trong môi trường nuôi cấy có thể gây

ra những hình dạng phân nhánh như vậy Đa số các loài Bifidobacterium kỵ khí bắt buộc, nhưng một số loài như B psychraerophilum, B scardovii và B tsurumiense,

có thể chịu oxy và phát triển trong điều kiện hiếu khí Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu là 37 – 41oC cho hầu hết các loài với nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu và tối đa là 25 và 45oC Đặc biệt, B psychraerophilum có thể tăng trưởng ở 8oC và B

thermacidophilum có thể tăng trưởng ở 49,5oC pH tối ưu cho sự phát triển ban đầu

12 tiêu diệt các vi khuẩn mục tiêu Bacteriocin được sản xuất bởi cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm Bacteriocin được tạo ra bởi vi khuẩn Gram dương có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn hơn Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương có khả năng kháng lại các loài gần gũi với loài tạo ra chúng và thậm chí có thể kháng được các

loài vi khuẩn Gram âm khác [32]

Hầu hết bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn Gram âm là các phân tử peptide lớn và không có khả năng chịu nhiệt, ngoại trừ microcin, trong khi phần lớn các bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương thì nhỏ hơn, chỉ bao gồm 30 – 70 acid amin

1.3.2 Phân loại Bacteriocin

Các peptide kháng khuẩn được tạo ra bởi vi khuẩn đã được nhóm lại thành các lớp khác nhau dựa trên các tiêu chí khác nhau như sinh vật sản xuất, kích thước phân tử, tính chất vật lý, cấu trúc hóa học, phương thức hoạt động Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương đã thu hút được nhiều sự quan tâm vì nhiều lý do: chúng thường xuyên được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn lactic có lợi (ví dụ như lactococci, lactobacilli, pediococci) và chúng thường được coi là an toàn cho con người Hơn nữa, chúng đều không độc hại đối với các tế bào nhân chuẩn, và có phổ ức chế rộng lớn hơn nhiều so với bacteriocin từ các vi khuẩn Gram âm Ngoài ra, một số bacteriocin cũng phát huy hoạt động trực tiếp đối với vi khuẩn gây bệnh trên cả thực phẩm, và do đó đại diện cho một tiềm năng lớn trong điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và an toàn thực phẩm Bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương hiện nay được chia thành bốn nhóm chính:

1.3.2.1 Lantibiotic

Các lantibiotic trải qua nhiều bước thay đổi trong quá trình sinh tổng hợp Các gen đằng sau quá trình này đặc hiệu không chỉ đối với lantibiotic loại A mạch thẳng mà còn cho loại B hình cầu Các gen chịu trách nhiệm cho sự sinh tổng hợp lantibiotic thường nằm trên plasmid hoặc các yếu tố di truyền khác và được tổ chức trong các cấu trúc tương tự như operon

13 Lantibiotic loại A thấm xuyên màng tế bào và gây rò rỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài làm cạn kiệt các vật chất bên trong tế bào và gây mất điện thế màng Các loại lantibiotic A tích điện dương (nisin, epidermin, và galidermin) sử dụng lớp lipid II như một phân tử tiếp nhận và kết hợp hai cơ chế hoạt động gồm xuyên màng tế bào và ức chế sinh tổng hợp vách tế bào Tóm lại, chúng tấn công vào lớp màng đôi lipid II và tiền chất peptidoglycan, nhằm ngăn chặn tổng hợp thành tế bào Đối với những lantibiotic liên kết với lipid II sẽ tạo ra hai hệ quả như sau: một là ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan; và hai là lớp màng lipid II sẽ trở thành thụ thể để

Lantibiotic tạo các lỗ hỗng trên màng tế bào [33]

Hình 1.1: Mô hình cơ chế hoạt động của nisin xuyên qua màng mục tiêu Nisin liên

kết với phân tử tiếp nhận lipid II trên mặt phân cách giữa thành tế bào (CW) và màng sinh chất (CM) Phức hợp Nisin – Lipid II được thành lập và tạo lỗ xuyên

màng [1]

1.3.2.2 Bacteriocin lớp II

Bacteriocin lớp II tạo thành một nhóm lớn và đa dạng các peptide kháng khuẩn Loại bacteriocin lớp II có cấu trúc đơn giản hơn lantibiotic vì không có sửa đổi hậu dịch mã Gen liên quan đến khả năng miễn dịch và vận chuyển thường được kết hợp chặt chẽ với các gen cấu trúc bacteriocin Đối với một số hệ thống

14 bacteriocin, quá trình sinh tổng hợp của chúng được điều hòa bởi một hệ thống ba thành phần điều hòa gồm pheromone peptide điều hòa, một cảm biến (histidine protein kinase) và một protein điều hòa (đáp ứng nhân tố điều hòa)

Giống như lantibiotic, các gen cho bacteriocin lớp II thường được tìm thấy trên plasmid hoặc các yếu tố di truyền khác, trong đó có thể giải thích rằng bacteriocin tương tự hoặc giống hệt nhau được tìm thấy trong các loài khác nhau

[33]

a Bacteriocin lớp IIa

Bacteriocin lớp IIa là một nhóm bacteriocin lớn nhất và bao gồm các

bacteriocin tương tự như pediocin có khả năng kháng mạnh với Listeria Chúng

được tạo ra bởi nhiều loài vi khuẩn lactic khác nhau và có nhiều hơn 30 loại bacteriocin lớp IIa như thế Các bacteriocin trong nhóm IIa có chuỗi acid amin tương đồng lên đến hơn 40% và một số vùng bảo tồn bao gồm trình tự (YGNGV)

và cầu nối disulfide cysteine [33]

Bước đầu tiên trong tương tác giữa bacteriocin lớp IIa với bề mặt màng tế bào là tương tác tĩnh điện liên kết trung gian với phân tử tiếp nhận gắn trên màng Mặt khác, các phần tử phân cực tích điện dương của bacteriocin lớp IIa liên kết chủ yếu với các nhóm phospholipid tích điện âm trên màng Bước tiếp theo, những tương tác kị nước sẽ diễn ra giữa các vùng kị nước của một nửa đầu C với các chuỗi lipid Đây là bước quan trọng trong quá trình hình thành các lỗ hổng Những vùng tương tác kỵ nước với màng có lẽ là vùng quyết định tính đặc hiệu tế bào của bacteriocin, ngược lại vùng đầu N tương tác tĩnh điện với bề mặt màng tế bào theo phương thức không đặc hiệu Trong trường hợp này, những tương tác kỵ nước có lẽ đã xảy ra giữa những phần tử thuộc vùng quyết định tính đặc hiệu của bacteriocin với một thành phần của màng tế bào nhạy cảm, do đó làm cho màng tế bào trở nên nhạy cảm hơn đối vởi khả năng thấm của màng Ngoài ra, việc làm mất ổn định màng diễn ra do gia tăng liên kết bacteriocin với bề mặt tế bào dẫn đến một nồng độ

15 bacteriocin cao hơn ở những vùng trên màng, nhưng ít khả năng xảy ra Sau khi tương tác kỵ nước diễn ra, bacteriocin có thể được định hướng lại thành một hướng thuận lợi hơn về mặt năng lượng để có thể chèn vào màng một cách đơn giản, sau

đó là kết hợp [2]

16

Hình 1.2 : Cơ chế hoạt động của Bacteriocin IIa (a) Những vùng cấu trúc

dự đoán của bacteriocin (b) Tương tác giữa các vùng cấu trúc với bề mặt màng

(c) Quá trình chèn vào màng của bacteriocin và hình thành lỗ hỗng [2]

17

b Bacteriocin lớp IIb

Bacteriocin lớp IIb là loại bacteriocin 2 peptide Để xác định một bacteriocin 2 peptide dựa vào 3 tiêu chuẩn sau: (i) cả 2 peptide phải có đầy đủ hoạt tính và mỗi peptide đơn lẻ có thể thể hiện 1 phần hoặc không có hoạt tính kháng khuẩn, (ii) một protein miễn dịch đủ để thể hiện chức năng miễn dịch, (iii) tổ chức di truyền của hệ bacteriocin 2 peptide bao gồm 2 gen cấu trúc bacteriocin liên tiếp mã hóa cho hai peptide đơn lẻ, theo sau bởi một gen miễn dịch duy nhất

Mỗi peptide đơn lẻ của bacteriocin lớp IIb có chung nhiều đặc tính lý hóa với bacteriocin một peptide gồm có tính kỵ nước, ưa nước và tích điện dương, cũng như sở hữu những cơ chế tiêu diệt tế bào đích như nhau, thông qua việc thấm xuyên màng tế bào mục tiêu Hoạt tính của một số bacteriocin IIb có thể giết chết tế bào đích chỉ với nồng độ rất thấp, trong khi các peptide đơn lẻ không có hoạt tính, hoặc chỉ có hoạt tính yếu với nồng độ cao hơn Một phức hợp gồm α – peptide và β – peptide có thể hình thành lỗ hỗng xuyên màng làm cho thất thoát các ion hóa trị một, trong đó có K+ làm cho tế bào bị chết đi [34] [35]

c Bacteriocin lớp IIc

Bacteriocin lớp IIc không thuộc bất kỳ phân loại nào của bacteriocin

Lactococcin A là một trong những bacteriocin đầu tiên của loài Lc lactis

Lactococcin A không có chung bất kỳ trình tự tương đồng ý nghĩa nào với các bacteriocin còn lại Lactococcin A có rất nhiều ở chi Lactococci và có phổ tác dụng

đặc hiệu hẹp, chỉ có thể tiêu diệt các loài Lactococcus khác nhưng độc lực lại rất

mạnh so với các bacteriocin cùng chi Thụ thể mục tiêu của Lactococcin A lại tương tự với các bacteriocin IIa mang tên là mannose PTS Lactococcin A chỉ có thể tiêu diệt các loài thuộc chi Lactococci, trong khi đó các bacteriocin tương tự pediocin

không làm được điều này [32] [36] [37]

18

d Bacteriocin lớp IId

Bacteriocin lớp IId là bacteriocin được tìm thấy ở các chủng vi khuẩn Gram

dương Các peptide này lần đầu tiên được xác định ở Streptococcus và

Staphylococcus Các peptide đơn lẻ này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn nhưng phải

kết hợp với các peptide bổ sung khác để gia tăng hoạt tính kháng khuẩn Các bacteriocin này có phổ kháng khuẩn khá rộng và một vài trong số chúng có khả năng tan huyết Một đặc điểm thú vị là một số trong những peptide này được tạo ra với rất nhiều bản sao gen và điều này có thể ứng dụng trong việc can thiệp vào trình tự dịch mã bacteriocin để tạo ra một lượng lớn hay tạo ra bacteriocin có hoạt tính

mạnh [33]

e Bacteriocin lớp IIe

Bacteriocin lớp IIe là bacteriocin bắt nguồn từ protein lớn Các peptide kháng khuẩn này được tạo ra bằng sự bẻ gãy đặc hiệu các protein lớn Ở các tế bào eukaryote, các peptide điển hình như lactoferrin Hiện nay có rất ít thông tin về các

loại peptide kháng khuẩn này [33]

1.3.2.3 Bacteriocin lớp III

Trong khi những bacteriocin lớp khác được tạo ra từ vi khuẩn Gram dương chỉ là những peptide nhỏ thì bacteriocin lớp III là những bacteriocin có trọng lượng phân tử lớn hơn 10 kDa Một số protein kháng khuẩn lớn đã được mô tả ở cả 2 khía cạnh sinh hóa và di truyền học Những bacteriocin này là những protein không bền nhiệt, ngoại trừ propionicin SM1 là một nhân tố kháng khuẩn có khả năng chịu

được nhiệt độ được tạo ra bởi P jensenii Những protein kháng khuẩn này được

chia thành hai nhóm riêng biệt gồm các enzyme có khả năng làm tan vi khuẩn (bacteriolysins) dễ dàng tiêu diệt vi khuẩn nhạy cảm bằng cách thủy phân tế bào và

những protein kháng khuẩn không làm tan tế bào vi khuẩn [38]

19

1.3.2.4 Bacteriocin lớp IV

Dựa vào đặc tính riêng biệt với cấu trúc xoắn đuôi mà các bacteriocin dạng này được phân thành một lớp riêng biệt Những peptide vòng này có liên kết cộng

hóa trí giữa đầu và đuôi của phân tử, trong đó, bacteriocin AS – 48 từ E faecalis

được nghiên cứu kỹ lưỡng nhất AS – 48 là một trong những bacteriocin được tạo ra từ vi khuẩn Gram dương có hoạt tính tiêu diệt không chỉ tế bào vi khuẩn Gram

dương mà còn có cả vi khuẩn Gram âm [39] [40]

AS – 48 xuyên qua màng sinh chất của tế bào mục tiêu dẫn đến việc giảm mạnh lực di chuyển proton của màng tế bào và làm cho tế bào bị chết Cơ chế này cũng tương tự với nhiều bacteriocin khác được tạo ra từ tế bào Gram dương Cơ chế

cụ thể vẫn chưa được biết rõ [33]

1.4 Các sản phẩm phòng ngừa và điều trị bệnh gan tụy cấp trên thị

trường

Trên thị trường có rất nhiều sản phẩm trong và ngoài nước được sử dụng để phòng ngừa và điều trị bệnh hoại tử gan tụy cấp, điển hình là các sản phẩm của các công ty và tập đoàn lớn như công ty Virbac, công ty Mekovet, tập đoàn Bayer và tập đoàn Sitto

Công ty Virbac (Pháp) có các sản phẩm sau:

- Combax L chứa Bacillus sp kết hợp khoáng Pro Marine và thuốc bổ trợ gan Nutrimix để tránh bùng phát dịch bệnh và ngăn ngừa sự phát triển của Vibrio

khuẩn, thành phần Benzalkonium 80%

Tập đoàn Bayer (Đức) có các sản phẩm sau:

- Probai A chứa các vi khuẩn Bacillus sp có lợi cạnh tranh loại bỏ các vi

Tập đoàn Sitto (Thái Lan) có các sản phẩm sau:

- Sitto SC thành phần có Saccharomyces cerevisiae ngăn ngừa các bệnh do vi

khuẩn gây ra

- Sitto LB-1 thành phần có Lactobacillus lactis tăng cường hệ miễn dịch - Sitto Pro BCS với thành phần là Bacillus subtilis ức chế vi khuẩn Vibrio sp

Tuy nhiên vẫn chưa có chế phẩm nào chuyên trị Vibrio parahaemolyticus một cách hiệu quả, hoặc chỉ sử dụng các kháng sinh để tiêu diệt Vibrio sp., vì vậy diện tích nuôi tôm có bùng phát dịch vẫn còn rất cao (theo Tổng cục thủy sản, 2015) Vì vậy, việc phát triển thêm các chế phẩm mới chống lại vi khuẩn Vibrio sp đặc biệt là V parahaemolyticus là điều cần thiết

1.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

21

Đặng Phương Nga và cộng sự (2006) đã công bố kết quả nghiên cứu “Khả

năng đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm của một số chủng vi khuẩn lựa chọn” Nghiên cứu tiến hành xác định khả năng đối kháng một số loài Vibrio

thường gặp trong nước nuôi tôm tại một số địa bàn ven biển để lựa chọn các chủng

có khả năng kháng Vibrio sp tốt Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi cấy

trên các môi trường và ở các điều kiện khác nhau tương ứng Hoạt tính kháng khuẩn

của các chủng vi khuẩn này được xác định qua khả năng kháng hai loài V

parahaemolyticus và V furnisii Khả năng kháng Vibrio sp được xác định bằng

phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng 30 – 60 µl dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ sinh khối nhỏ vào các lỗ thạch, vòng kháng khuẩn được quan sát sau 24 giờ nuôi cấy ở 30oC Các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều có thể kháng được hai chủng

Vibrio này, trong đó có vi khuẩn lactic Lactobacillus buchneri [41]

Đặng Phương Nga và cộng sự (2007) đã công bố kết quả nghiên cứu “Khả

năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K” Nghiên cứu được tiến hành để xác định khả

năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn được phân lập từ nước nuôi tôm Hoằng

Hóa (Thanh Hóa) và từ nước dưa đối với các chủng vi khuẩn Vibrio như V

parahaemolyticus HH-1, V furnisii VT14-1, V harvey NC5-1 và V vulnificus HH2

được phân lập từ nước nuôi tôm tại Hoằng Hóa, Nông Cống và từ nước biển ven bờ Bà Rịa – Vũng Tàu và đã phân loại dựa vào trình tự gen 16S rRNA Hai loài phân

lập được là Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K Trong đó, L lactis CC4K có khả năng kháng tất cả 4 chủng Vibrio nêu trên Tuy nhiên, khi xác định lại

bản chất chất kháng khuẩn thì yếu tố kháng Vibrio sp có thể là lactic acid [42]

Khuất Hữu Thanh và cộng sự (2009) đã công bố kết quả nghiên cứu “Phân

lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có đặc tính probiotic trong chế tạo chế phẩm nuôi tôm sú” Nghiên cứu được tiến hành để xác định khả năng đối kháng của

các chủng probiotic đối với một số loại vi khuẩn gây bệnh trong đó có V

parahaemolyticus và V alginolyticus gây bệnh trên tôm Các chủng vi khuẩn được

phân lập từ các mẫu đất ở các ao nuôi tôm sú tại Nha Trang và Đồ Sơn, từ phân

22 giun nuôi làm thức ăn nuôi tôm, mẫu tách từ hệ tiêu hóa của tôm sú Kết quả của

quá trình phân lập bao gồm hai nhóm Lactobacillus sp và Bacillus sp Phương

pháp thử hoạt tính kháng khuẩn là phương pháp đục lỗ thạch Kết quả nghiên cứu

cho thấy các chủng vi khuẩn lactic được phân lập có khả năng kháng được V

parahaemolyticus là Lactobacillus acidophilus LH5 và Lactobacillus helveticus

IMAU40107, trong đó L acidophilus LH5 kháng được cả V alginolyticus [43]

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Chae-Woo Ma và cộng sự (2009) đã công bố kết quả nghiên cứu về

Lactobacillus spp JK-8 and JK-11 trong việc loại bỏ các vi khuẩn gây bệnh Mục

đích nghiên cứu nhắm đến là việc ứng dụng các vi khuẩn lactic vào việc cải thiện chất lượng nguồn nước ở các trại nuôi tôm bằng cách loại bỏ các tác nhân gây bệnh trên tôm cũng như các hợp chất nitrogen Các chủng vi khuẩn được phân lập từ mẫu nước được thu nhận từ các ao nuôi tôm ở Viện Thủy Hải Sản, Đại học

Soonchunhyang, Hàn Quốc bao gồm Lactobacillus plantarum JK-8 và

Lactobacillus hilgardii JK-11 Các chủng vi khuẩn gây bệnh gồm Vibrio parahemolyticus, V harveyi, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella sonei, Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, và Edwardsiella tarda có

nguồn gốc từ bộ sưu tập giống chuẩn Hoa Kỳ (American Type Culture Collections – ATCC)

Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng phương pháp đặt đĩa giấy chứa dịch có chất kháng khuẩn Canh trường nuôi cấy được ly tâm và thu dịch nổi không chứa sinh khối, sau đó được lọc qua đầu lọc cellulose acetate 0,2 µm Dịch sau lọc được cô đặc 5 lần bằng máy đông khô Đĩa giấy vô trùng được thấm 50 µl dịch sau lọc đến bão hòa đĩa giấy rồi đặt lên đĩa thạch đã cấy khuẩn gây bệnh mục tiêu Sau đó quan sát vòng kháng khuẩn để xác định chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng các tác nhân gây bệnh

23

Kết quả cho thấy Lactobacillus plantarum JK-8 không có khả năng kháng

khuẩn gây bệnh khi dịch thử nghiệm được điều chỉnh pH về trung tính, ngược lại, khi không điều chỉnh pH thì xuất hiện vòng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn

của JK-8 có khả năng do acid hữu cơ Lactobacillus higardii JK-11 kháng được các vi khuẩn gây bệnh trong đó có V parahaemolyticus ngay cả khi điều chỉnh pH dịch

thử nghiệm về trung tính Như vậy, chủng JK-11 có thể có hợp chất bacteriocin

[44]

A D Talpur và cộng sự (2011) đã công bố kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ ruột ghẹ càng xanh làm probiotic trong thử nghiệm mô hình nuôi ghẹ càng xanh in vitro Nghiên cứu thực hiện nhằm phân lập các chủng vi khuẩn probiotic kháng lại các tác nhân gây bệnh trong thủy sản, mà cụ thể là trên ghẹ xanh Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ hệ tiêu hóa của ghẹ

xanh bao gồm L plantarum, L salivarius, L rhamnomus, W confusa và W cibaria Các vi khuẩn gây bệnh được phân lập từ ghẹ xanh bị bệnh bao gồm V harveyi, V

parahaemolyticus và P piscicida Xác định khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh

bằng phương pháp đặt đĩa giấy lên thạch Canh trường vi khuẩn lactic sẽ được ly tâm 12.000 xg trong 10 phút, thu dịch nổi không chưa sinh khối rồi đem lọc qua đầu lọc 0,2 µm (Whatman, England) Dịch lọc được sử dụng cho việc xác định khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh được điều chỉnh pH về 7.6 bằng NaOH 1M Đĩa giấy chứa 40 µl dịch lọc được đặt vào các đĩa thạch NA đã được cấy các vi khuẩn gây bệnh ở nồng độ 106 CFU/ml, ủ trong 24 giờ ở 37oC, sau đó quan sát sự xuất hiện của vòng vô khuẩn Kết quả cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn lactic phân lập được đều có

khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh nên trên trong đó có V parahaemolyticus

[45]

Natesan Sivakumar và cộng sự (2012) đã công bố kết quả nghiên cứu tác

động của probiotic Lactobacillus acidophilus đối với bệnh do Vibrio sp gây ra trên

tôm sú con Nghiên cứu này được tiến hành để đánh giá mức độ tiềm năng của vi

khuẩn probiotic Lactobacillus acidophilus 04 đối với vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh trên tôm con Penaeus monodon Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp

24 đặt đĩa giấy (6 mm) tẩm 20 µl dịch qua lọc (0,25 µm), được điểu chỉnh pH về 7,0 rồi đặt lên các đĩa thạch MHA (Mueller Hinton Agar) đã cấy vi khuẩn gây bệnh

Kết quả cho thấy rằng L acidophilus có khả năng đối kháng với Vibrio

parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi và Vibrio alginolyticus [46]

Tóm lại, tình hình dịch bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm đang vẫn là một vấn nạn lớn, vẫn chưa có hướng giải quyết hiệu quả, gây thiệt hại lớn trong nuôi tôm Hơn nữa, các nghiên cứu về các vi khuẩn đối kháng với V parahaemolyticus vẫn chưa rõ ràng và chỉ dừng lại ở khảo sát đối kháng quy mô phòng thí nghiệm, ngoài ra, các sản phẩm phòng ngừa và điều trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm vẫn chưa đặc hiệu chuyên biệt Vì vậy, các thí nghiệm đối kháng vi khuẩn gây bệnh này bằng các bản chất kháng khác nhau, cũng như thử nghiệm trực tiếp trong quá trình nuôi tôm là cần thiết nhằm tạo ra chế phẩm hiệu quả cho vấn đề này

25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Máy đo pH - Máy đo OD

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn Vibrio sp từ tôm có triệu chứng bệnh gan tụy

- Phân lập vi khuẩn lacitc từ đường ruột của các cá thể tôm khỏe mạnh

26 - Kiểm tra khả năng đối kháng của vi khuẩn lactic phân lập được từ tôm khỏe

mạnh đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, từ đó xác định bản chất

kháng bằng ba hình thức thử nghiệm: o Đối kháng bằng dịch sinh khối của canh trường vi khuẩn lactic o Đối kháng bằng dịch ly tâm qua lọc của canh trường vi khuẩn lactic o Đối kháng bằng dịch qua lọc có điều chỉnh pH của canh trường vi

khuẩn lactic

- Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng với Vibrio

parahaemolyticus bằng ba hình thức đối kháng và định danh các chủng tuyển

chọn này - Bước đầu thử nghiệm khả năng đối kháng của chủng vi khuẩn lactic tuyển

chọn đối với V parahaemolyticus trực tiếp trên tôm trong điều kiện in –

vivo - Tối ưu môi trường lên men thu sinh khối chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn

o Khảo sát sơ bộ các thành phần môi trường đối với quá trình lên men thu sinh khối vi khuẩn lactic mục tiêu

o Sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng trong thành phần môi trường đối với mật độ sinh khối vi khuẩn lactic

o Khảo sát khoảng giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng o Xác định các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng

27

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tóm lược nội dung nghiên cứu của đề tài

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Phân lập vi khuẩn Vibrio sp

Thu nhận tôm có các biểu hiện lâm sàng của bệnh hoại tử gan tụy cấp như

gan tụy bị đổi sang tái nhạt và bị teo đi [3] [47], giai đoạn cuối của bệnh sẽ xuất

hiện các đốm hoặc vệt đen trên gan tụy của tôm do tích tụ melanin từ hoạt tính tan

huyết của V parahaemolyticus [47]

Tôm khỏe mạnh

Phân lập vi khuẩn lactic

từ ruột

Phân lập vi khuẩn Vibrio sp

Kiểm tra khả năng đối kháng

Bước đầu thử nghiệm in vivo

28 Tôm được rửa sạch bằng nước nhiều lần, sau đó tiến hành tách bộ phận gan tụy ra khỏi cơ thể bằng dao mổ Gan tụy sau khi tách được cho vào nước muối sinh lý đã hấp khử trùng trước đó Sử dụng dao mổ để khuấy đồng thời nghiền gan tụy trong nước muối sinh lý trong 10 phút để giải phóng vi khuẩn

Sau đó dùng 100 µl dung dịch mẫu vừa chuẩn bị để cấy vào môi trường chọn

lọc Vibrio sp gồm TCBS và CHROMagar VIBRIO Kiểm tra hình thái khuẩn lạc,

quan sát vi thể sau 24 giờ nuôi cấy Dựa vào kết quả quan sát rồi tiếp tục cấy thuần

các khuẩn lạc đặc trưng nghi ngờ là Vibrio sp., sau đó tiến hành định danh vi sinh

Đồng nhất mẫu gan tụy

Phân lập trên môi trường

đặc hiệu

Quan sát vi thể và đại thể

Định danh