Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus SP. có khả năng ức chế vi khuẩn Helicobacter Pylori

x Kiểm tra khả năng ức chế của các chủng Lactobacillus phân lập được với H.pylori,chọn ra chủng có khả năng kháng H.pylori cao nhất xKhảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của chủng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐĐẶNG ĐÌNH HIỆP

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

LACTOBACILLUS SP CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN

HELICOBACTER PYLORI

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2018

CCÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG-TPHCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thúy Hương Cán bộ phản biện 1

PGS.TS Bùi Văn Lệ Cán bộ phản biện 2 TS Võ Đình Lệ Tâm

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại trường Đại Học Bách Khoa-ĐHQG

Tp.HCM, ngày 21 tháng 7 năm 2018 Thành phần hội đồng đánh giá luận văn gồm:

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng PGS.TS Bùi Văn Lệ

PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên TS Võ Đình Lệ Tâm TS Hoàng Anh Hoàng Xác nhận của chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và trưởng khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sữa chữa

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng

TRƯỞNG KHOA

GS.TS Phan Thanh Sơn Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngày, tháng, năm sinh: 1/4/1983Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Nơi sinh: Hồ Chí MinhMã số: 60 42 02 01

I.TÊN ĐỀ TÀI: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế vikhuẩn Helicobacter pylori

II.NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

x Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn lên men ở Việt nam.

x Kiểm tra khả năng ức chế của các chủng Lactobacillus phân lập được với H.pylori,chọn ra chủng có khả năng kháng H.pylori cao nhất

xKhảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn.xĐịnh danh chủng tuyển chọn bằng phương pháp 16S rDNA.xThử nghiệm tạo chế phẩm probiotic của chủng tuyển chọn và bước đầu đánh giá độ

ổn định của chế phẩm.

III.NGÀY GIAO NHIỆM VỤ 27/2/2017IV.NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ 30/5/2018V.CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

Tp HCM, ngày 31 tháng 5 năm 2018

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

(Họ tên và chữ ký)

75ƯỞ1*.+2$

(Họ tên và chữ ký)

LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến tất cả thầy giáo, cô giáo, những người đã cho tôi kiến thức và khuyến khích tôi trong suốt hai năm học cao học ở trường đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thúy Hương, Người đã hỗ trợ, động viên, sửa bài và cho tôi những lời khuyên quý giá trong suốt quá trình làm đề tài cao học

Hơn thế nữa, tôi cũng cám ơn đến tất cả thầy cô, nhân viên ở phòng thí nghiệm, đã giúp đỡ và cho phép tôi sử dụng những trang thiết bị ở phòng thí nghiệm để làm đề tài nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình cũng như cơ quan đã khuyến khích, động viên và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này

TÓM TẮT

Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những vấn đề tiêu hóa thường gặp nhất, nguyên nhân là do lớp nhày bị suy yếu, acid bắt đầu tấn công niêm mạc dạ dày và dẫn đến các viêm loét gây đau đớn, nóng rát ở vùng thượng vị Ngày nay khoa học đã chứng minh thủ phạm chính

gây ra tình trạng này là do vi khuẩn H.pylori Phương pháp tiêu diệt H.pylori chủ yếu sử dụng kháng sinh, tuy nhiên hiện nay đã trở nên thất bại vì H.pylori đã trở nên kháng kháng sinh Vì

vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm probiotic để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị vi khuẩn

H.pylori đang được các nhà khoa học quan tâm Nghiên cứu này được thực hiện nhằm phân

lập vi khuẩn lactic từ các nguồn nguyên liệu lên men Sau khi phân lập và tiến hành khảo sát

hoạt tính kháng H.pylori của các chủng vi khuẩn lactic được phân lập, chọn ra chủng vi khuẩn lactic có tỷ lệ phần trăm kháng H.pylori cao nhất, sau đó tiến hành khảo sát một số hoạt tính

probiotic cơ bản điển hình và định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn, cuối cùng là bước đầu tiến hành thử nghiệm tạo chế phẩm

Kết quả thí nghiệm đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn lactic từ một số thực phẩm lên men,

chọn ra được một chủng là Lactobacillus plantarum có khả năng kháng H.pylori mạnh nhất,

có tỷ lệ phần trăm ức chế là 70,48%, chịu được các điều kiện cực đoan pH thấp và muối mật với nồng độ 0,3% Định hướng tạo chế phẩm, đề tài đã xác định được một số thông số trong quá trình sấy phun tạo chế phẩm được xác định: lưu lượng dịch phun là 5 ml/phút, nhiệt độ đầu vào cho quá trình sấy phun là 1000C

Qua những kết quả nghiên cứu trên, ta thấy rằng L.plantarum có đặc điểm sinh học phù hợp

với vai trò là một probiotic, có thể sử dụng để làm chế phẩm probiotic và kết hợpù với kháng

sinh để hỗ trợ ngăn ngừa H.pylori

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

TÓM TẮT LUẬN VĂN

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori 3

1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn Helicobacter pylori 4

1.1.2 Cơ chế gây bệnh của Helicobacter pylori 4

1.1.3 Helicobacter pylori kháng kháng sinh 5

1.1.4 Tổng quan về tình hình đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori 6

1.2.Vi khuẩn lactic và probiotic 7

1.2.1 Đặc điểm chung của khuẩn lactic 7

1.2.2 Quá trình lên men lactic 8

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic 9

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic 11

1.2.5 Tổng quan về probiotic và Lactobacillus trong chế phẩm probiotic 13

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 17

Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian và địa điểm 19

2.2 Vật liệu và thiết bị sử dụng 19

2.3 Thiết kế thí nghiệm 20

2.4 Phương pháp 21

2.4.1 Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn Lactobacillus 22

2.4.2 Khảo sát các đặc điểm sinh học 23

2.4.3 Phương pháp nhân giống Helicobacter pylori, Lactobacillus và dựng đường cong sinh

trưởng của Helicobacter pylori 23

2.4.4 Phương pháp khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori 23

2.4.5 Khảo sát các tỷ lệ % của chủng vi khuẩn tuyển chọn với Helicobacter pylori 25

2.4.6 Phương pháp khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản và định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn 25

2.4.7 Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc 27

2.4.8 Thử nghiệm tạo chế phẩm Lactobacillus plantarum bằng phương pháp sấy phun 28

2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Lactobacillus 34

3.2 Xác định đường cong sinh trưởng của Helicobacter pylori và khảo sát khả năng ức chế của vi khuẩn Lactobacillus với Helicobacter pylori 35

3.3 Khảo sát hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn và định danh 38

3.4.Thử nghiệm tạo chế phẩm L.plantarum và bước đầu đánh giá độ ổn định của chế phẩm 42 3.4.1 Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun 42

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đầu vào 43

3.4.3 Tạo chế phẩm sấy phun và theo dõi chế phẩm 44

3.4.4 Tái khảo sát khả năng kháng Helicobacter pylori của L.plantarum sau khi tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

H.pylori Helicobacter pylori

LAB (lactic acid bacteria) Vi khuẩn lactic GRAS (Generally Recognized As safe) Được công nhận chung là an toàn MRS de Man, Rogosa, Sharpe

sp (species) Loài OAC Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin OAM Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn H pylori

Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế viêm loét dạ dày do H.pylori 5

Hình 1.3: Lactobacillus casei và Lactobacillus bulgaricus 8

Hình 1.4: Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin 12

Hình 3.1: Đường cong sinh trưởng của H.pylori 34

Hình 3.2: Tỷ lệ % ức chế của các chủng vi khuẩn lactic đối với H.pylori 35

Hình 3.3: Khả năng kháng của vi khuẩn lactic (L3) đối với H.pylori 37

Hình 3.4: Khảo sát tỷ lệ % của chủng vi khuẩn tuyển chọn với H.pylori 37

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của chủng tuyển chọn 39

Hình 3.6: Kết quả định danh chủng L3 41

Hình 3.7: Kích thước hạt chế phẩm L.plantarum sau khi sấy phun 45

Hình 3.8: Hình ảnh chế phẩm L.plantarum sau khi sấy phun 46

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của H.pylori ở những khu vực khác nhau trên thế giới 7

Bảng 1.2: Vi khuẩn probiotic và tính an toàn về khả năng lây nhiễm 10

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái của một số dòng vi khuẩn lactic phân lập 33

Bảng 3.2: Tóm tắt thông tin chủng giống 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của lưu lượng dịch phun 43

Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đầu vào 44

Bảng 3.5: Theo dõi chế phẩm 47

MỞ ĐẦU

Viêm loét dạ dày tá tràng là một trong những vấn đề tiêu hóa thường gặp nhất Thông thường, lớp niêm mạc bên trong của dạ dày và ruột non được bao phủ bởi một lớp chất nhày, do đó bảo vệ niêm mạc tránh được sự tác động của acid dịch vị Khi lớp nhày bị suy yếu, acid bắt đầu tấn công niêm mạc dạ dày và dẫn đến các viêm loét gây đau đớn, nóng rát ở vùng thượng vị Ngày nay khoa học đã chứng minh thủ phạm chính gây ra tình trạng này là do vi

khuẩn Helicobacter pylori Vi khuẩn này tiết ra những độc tố làm phá hủy lớp nhày bảo vệ

niêm mạc và gây viêm loét [1, 2]

Phương pháp tiêu diệt vi khuẩn H pylori chủ yếu là sử dụng kháng sinh, tuy nhiên hiện nay đã gặp nhiều thất bại bởi vì H.pylori trở nên kháng với nhiều loại kháng sinh Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học probiotic và bacteriocin để ức chế vi khuẩn H.pylori

đang được các nhà khoa học quan tâm [20]

Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ Bacteriocin khác với hầu hết các kháng sinh dùng trong y học do chúng là các phân tử protein nên dễ bị phân hủy bởi enzyme protease trong hệ tiêu

hóa Bacteriocin được tạo ra bởi các loài Lactobacillus có khả năng ức chế được nhiều loại vi

khuẩn gây bệnh [13] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nhiềú nghiên cứu sử dụng

Lactobacillus sp hay bacteriocin từ Lactobacillus sp để ức chế lại H pylori Đề tài “Phân lập,

tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng ức chế vi khuẩn Helicobacter pylori”

nhằm mục tiêu phân lập, tuyển chọn dòng Lactobacillus sp có khả năng ức chế lại vi khuẩn

H.pylori để thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học ức chế H.pylori gây ra bệnh dạ dày

Nội dung nghiên cứu gồm:

- Phân lập vi khuẩn Lactobacillus từ các nguồn lên men ở Việt nam

- Kiểm tra khả năng ức chế của các chủng Lactobacillus phân lập được với H.pylori, chọn ra chủng có khả năng kháng H.pylori cao nhất

- Khảo sát một số hoạt tính probiotic cơ bản của chủng tuyển chọn

- Định danh chủng tuyển chọn bằng phương pháp 16S rDNA

- Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic của chủng tuyển chọn và bước đầu đánh giá độ ổn định của chế phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn H.pylori

H.pylori là một trực khuẩn Gram âm, hình cong hoặc hình chữ S, đường kính từ 0.3- 1 µm, dài

1.5-5 µm với 4-6 lông mảnh ở mỗi đầu, chính nhờ các lông này cùng với hình thể của mình

mà H.pylori có thể chuyển động trong môi trường nhớt Điều kiện lí tưởng cho vi khuẩn phát

triển là môi trường có 5 % O2, 10% CO2, 85% N2, nhiệt độ từ 35-370C [3, 4]

ra một lượng lớn urease, lớn hơn nhiều so với bất kỳ một loại vi khuẩn nào khác, vì thế ở dạ

dày sự hiện diện của urease gần như đồng nghĩa với sự có mặt của H.pylori Nhiễm H.pylori thường gặp nhất ở người, tần suất nhiễm H.pylori thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh tế và chủng tộc Có khoảng hơn nửa dân số trên thế giới bị nhiễm H.pylori, chủ

yếu ở các nước đang phát triển với tần suất rất cao từ 50-90% ở lứa tuổi lớn hơn 20 và hầu

hết trẻ em bị nhiễm từ 2-8 tuổi [5, 21] Việt nam cũng thuộc vùng có tỷ lệ nhiễm H.pylori cao

vào khoảng hơn 70% ở người lớn, ở các nước phát triển tuổi bị nhiễm thường lớn hơn 50 tuổi, chiếm 50% dân số [21]

H.pylori được lây truyền qua nhiều đường như miệng-miệng, phân-miệng Ơ những nơi có

điều kiện vệ sinh kém, nước và thức ăn bị nhiễm là nguồn lây lan quan trọng ban đầu [5, 6, 21]

1.1.2 Cơ chế gây bệnh của H pylori

Vi khuẩn H.pylori dễ dàng di chuyển qua lớp niêm dịch vào lớp dưới niêm mạc dạ dày để

tồn tại trong môi trường acid của dịch vị nhờ hoạt động của các tiêm mao và cấu trúc hình

xoắn Sau khi vào trong lớp nhày dạ dày H.pylori bám dính vào biểu mô tiết ra nhiều men

urease, phân hủy urea thành ammoniac trong dạ dày, gây kiềm môi trường xung quanh, giúp

H.pylori tránh được sự tấn công của acid xpepsin trong dịch vị Mặt khác, sau khi bám vào màng tế bào thông qua các thụ thể, H.pylori sẽ tiết ra các nội độc tố, gây tổn thương trực

tiếp các tế bào biểu mô dạ dày, gây thoái hóa, hoại tử, long tróc tế bào tạo điều kiện để acid-pepsin thấm vào tiêu hủy rồi gây loét [5, 7]

H.pylori gây tổn thương niêm mạc dạ dày sẽ làm giảm tiết somatostatin, lượng somatostatin

giảm sẽ gây tăng gastrin máu từ tế bào G sản xuất ra, mà chủ yếu tăng gastrin-17, còn gastrin-34 tăng không đáng kể Hậu quả trên làm tăng tế bào thành ở thân vị, tăng tiết HCL và kèm theo là tăng hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Đây là hai yếu tố tấn công chính trong cơ chế bệnh sinh của loét dạ dày tá tràng

H.pylori sản xuất ra nhiều yếu tố có tác dụng hoạt hóa bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu

đơn nhân, đại thực bào, giải phóng các yếu tố trung gian hóa học trong viêm, giải phóng ra yếu tố hoạt hóa tiểu cầu một chất trung gian quan trọng trong viêm, làm cho biểu mô phù nề

hoại tử , bị acid xpepsin ăn mòn dẫn đến loét Cơ thể bị nhiễm H.pylori, sản xuất ra kháng thể chống lại H.pylori Các kháng thể này lại gây phản ứng chéo với các thành phần tương

tự trên các tế bào biểu mô dạ dày của cơ thể, gây tổn thương niêm mạc dạ dày [5, 7]

H.pylori gây viêm loét dạ dày qua ba cơ chế: sự thay đổi sinh lí dạ dày, nhiễm độc trực tiếp

từ các sản phẩm của vi khuẩn, các phản ứng viêm với sự giải phóng nhiều sản phẩm phản

dạ dày, làm tăng pH lên 6-8 Các tuyến bị mất, viêm teo niêm mạc dạ dày và di sản ruột, điều này có thể khởi đầu cho giai đoạn ác tính [2]

Hình 1.2- Sơ đồ cơ chế viêm, loét dạ dày do H.pylori [2] 1.1.3 H pylori kháng kháng sinh

- Kháng kháng sinh tiên phát của H.pylori Kháng kháng sinh tiên phát là tình trạng trẻ em chưa diệt được H.pylori trước đó, tình trạng

kháng kháng sinh là hậu quả của việc chỉ định điều trị kháng sinh chữa các bệnh lý khác cho bệnh nhân ví dụ như dùng clarithromycin trong điều trị nhiễm khuẩn hô hấp, levofloxacin trong điều trị nhiễm trùng đường tiểu và metronidazole trong điều trị nhiễm trùng tiết niệu và sinh dục Trong những trường hợp này, kháng sinh điều trị đơn liệu không thể diệt được

H.pylori và gây tình trạng đề kháng của H.pylori với kháng sinh Một số ít trường hợp được truyền chủng H.pylori kháng thuốc từ người khác sang, ví dụ H.pylori được truyền từ bố mẹ

sang [8]

- Kháng kháng sinh thứ phát của H.pylori Kháng kháng sinh thứ phát của H.pylori là tình trạng kháng kháng sinh của những chủng H.pylori ở những bệnh nhân đã được điều trị diệt H.pylori trước đó [8] Việc kháng kháng sinh ngày càng gia tăng của H.pylori dẫn đến sự thất bại trong điều trị và điều này dẫn đến

gánh nặng về kinh tế cho gia đình bệnh nhân và xã hội

1.1.4 Tổng quan về tình hình đề kháng kháng sinh của H pylori

Sự đề kháng kháng sinh của H.pylori là yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của các phác đồ điều

trị hiện dùng Tỉ lệ lưu hành của vi khuẩn kháng thuốc thay đổi tùy theo từng vùng địa lý khác nhau và tương quan với sự sử dụng kháng sinh trong dân số chung Ví du,ï sự tiêu thụ clarithromycin và tỉ lệ đề kháng kháng sinh này tăng tương tự nhau (gấp 4 lần) ở Nhật Bản trong khoảng thời gian từ 1993 đến 2000 [22] Trái lại, sự sử dụng macrolide thận trọng ở

các nước Bắc Aâu trong những thập niên qua kết hợp với một tỉ lệ H.pylori kháng

clarithromycin thấp hơn so với các nước Nam Aâu, nơi mà clarithromycin được sử dụng rộng

rãi [22] Tài liệu hướng dẫn Châu Aâu hiện nay về điều trị H.pylori gợi ý rằng trị liệu đầu tay

phải được điều chỉnh cho thích hợp với sự đề kháng clarithromycin và metronidazole Thật vậy, một liệu pháp ba thuốc kéo dài 14 ngày được khuyên dùng ở những nơi mà tỉ lệ kháng clarithromycin lớn hơn 15-20%, ưu tiên kết hợp với amocillin nếu tỉ lệ kháng metronidazole tiên phát lớn hơn 40% [22] Trên cơ sở này, việc theo dõi tỉ lệ đề kháng kháng sinh tỏ ra có

ý nghĩa đối với việc điều trị nhiễm H.pylori trong thực hành lâm sàng Dưới đây là một số tổng hợp dữ liệu về tình hình đề kháng của H.pylori với nhiều kháng sinh khác nhau ở những

nước khác nhau trên thế giới

Bảng 1.1.Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của H.pylori ở những khu vực khác nhau trên

thế giới Khu vực Amoxycillin Clarithromycin Metronidazole Tetracyclin Levofloxacin Đa kháng

1.2 Vi khuẩn lactic và probiotic

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khí tùy ý và hầu hết không di động Chúng thuộc loại đa khuyết dưỡng, được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm lên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua LAB tồn tại khá hạn chế trong một số môi trường do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó [9, 10, 24]

Về mặt hình thái, các nhóm LAB tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hình que hoặc hình cầu, về mặt sinh lí, chúng tương đối đồng nhất: thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrate và tiết ra acid lactic [10] Khác với các vi khuẩn đường ruột sinh acid lactic, LAB là nhóm kị khí không bắt buộc, chúng không có cytochrome và enzyme catalase Tuy nhiên, chúng vẫn có thể sinh trưởng được khi có mặt oxy do có enzyme peroxidase [9, 10, 24]

Các loại vi khuẩn lactic bao gồm 4 giống sau: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacilus

a b

Hình 1.3.Lactobacillus casei (a) và Lactobacillus bulgaricus (b) [10]

1.2.2 Quá trình lên men lactic

Quá trình lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường với sự tích lũy acid lactic trong môi trường có thể tóm tắt theo phương trình sau:

Các loài LAB khác nhau về cơ chế lên men glucose, căn cứ vào sản phẩm lên men LAB được chia thành hai nhóm

x Nhóm vi khuẩn lên men đồng hình: sản phẩm tạo ra chủ yếu là acid lactic

x Nhóm vi khuẩn lên men dị hình: sản phẩm tạo ra ngoài acid lactic còn có ethanol, CO2

Lên men lactic đồng hình Các LAB lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMP và cho sản phẩm chủ yếu là acid lactic (90-98%) Chỉ một phần nhỏ pyruvate được decacboxyl hóa và chuyển thành acid acetic, ethanol, aceton và CO2 Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

Một số LAB lên men đồng hình thường gặp là L acidophilus, L casei

Lên men lactic dị hình Vi khuẩn lactic lên men dị hình do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase và triozophosphat- merisoase nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải glucose xảy ra theo con đường pentose-phosphat Quá trình chuyển hóa trizophosphat thành acid lactic giống như lên men đồng hình

Sản phẩm của quá trình lên men lactic dị hình ngoài acid lactic còn có các sản phẩm khác như acid succinic, ethanol, acid acetic và các chất khí còn lại [10, 24]

Một số LAB lên men dị hình thường gặp là L brevis, L.fementumg [9, 10]

1.2.3 Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic

Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế phẩm probiotic Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm probiotic Những chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau: tiêu chuẩn về an toàn, tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng [11, 12]

Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:

x Có định danh chính xác

x Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người

x Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh

x Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh

x Không liên quan tới bệnh tật

x Không gây khử liên hợp muối mật

x Đặc điểm di truyền ổn định

x Đề kháng được kháng sinh Lẽ tất nhiên, tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu Có một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như nghiên cứu trên các đặc tính của chúng probiotic, nghiên cứu về dược động học của chủng probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As Safe)

Bảng 1.2.Vi khuẩn probiotic và tính an toàn về khả năng lây nhiễm

Giống vi sinh vật Khả năng lây nhiễm

nhân suy giảm miễn dịch (AIDS)

sản phẩm sữa

Đối với những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic (bảng 1.2) cho người đều bắt buộc phải đạt những yêu cầu trên, song đối với vật nuôi chúng ta có thể giảm bớt đi một số yêu cầu, chủ yếu là tùy thuộc vào từng loài vật nuôi và tính an toàn khi sử dụng nó [11, 12]ù

Để một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức khỏe con người chúng phải có những đặc điểm sau:

x Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ để có thể đưa vào sản xuất, dễ nuôi cấy

x Có khả năng sống và không bị biến đổi chức năng khi đưa vào sản phẩm, không gây các mùi vị khó chịu cho sản phẩm

x Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng, để tồn tại được chúng phải có hai đặc tính là có khả năng dung nạp với acid (chịu pH thấp ở dạ dày) và dịch vị của người, đồng thời chúng phải có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non) Bên cạnh đó, vi khuẩn phải có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ, khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa người được xem là điều kiện tiên quyết quyết định chức năng của probiotic Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dịch hơn là những chủng không có khả năng bám dính

x Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng, có khả năng kích thích miễn dịch nhưng không có tác động gây viêm

x Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là vi sinh vật gây bệnh đường ruột

x Sản xuất các chất kháng vi sinh vật như bacteriocins, acid hữu cơ

x Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư

1.2.4 Cơ chế kháng khuẩn của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn các mầm bệnh bằng cách tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm Đó là các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và đặc biệt là bacteriocin nhóm peptide hay protein được tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính kháng vi sinh vật

Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầm bệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate và butyrate, nhất là acid lactic

Hình 1.4 Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [26]

Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin Gram dương [26] Dựa trên bản chất cation và tính kị nước, hầu hết các peptide hoạt đông như màng tế bào thấm Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào [26] Trong giả thiết rộng của kiểu hoạt động của bacteriocin, có giả thiết rằng sự tương tác của bacteriocin với tế bào nhạy cảm bao gồm 2 giai đoạn Giai đoạn thứ nhất tương ứng với sự hút bám vật lý của phân tử bacteriocin để tiếp cận thụ quan bên ngoài tế

được tạo ra và loại bỏ của bacteriocin trong giai đoạn này Trong một thời gian vừa phải sau đó, giai đoạn 2 phát triển mà thay đổi bệnh lý không thuận nghịch bị ảnh hưởng qua tổn thương sinh hóa đặc trưng Những nghiên cứu về colicins thấy rằng colicinsù hút thụ quan đặc trưng trên vỏ bên ngoài của sinh vật

Giai đoạn 1: sự hút bám vật lý để tiếp cận với thụ quan của tế bào Quá trình thuận nghịch không thường xuyên gây nguy hiểm sinh lý tế bào

Giai đoạn 2: xuất hiện những thay đổi không thuận nghịch dẫn đến chết tế bào

Lactobacillus là một ví dụ điển hình, được ứng dụng làm chế phẩm probiotic để ức chế sinh trưởng của vi khuẩn H.pylori và làm giảm hoạt tính của urease cần thiết cho H.pylori để sống

trong môi trường acid của dạ dày [26]

1.2.5 Tổng quan về probiotic và đặc điểm vi sinh Lactobacillus trong chế phẩm probiotic

1.2.5.1 Tổng quan về probiotic Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh học người 1JD (OL 0HWFKQLNRII ĨD× ĨØD UD WKXDỈW QJØ× uSURELRWLFv FRÛ QJXRÂQ JRÃF WØÚ +\ /DĐS WKHRQJKÕDĨHQODÚuYỴFXRỈFVRÃQJvĨHÇFKÈQKØ×QJYLVLQKYDỈWĨD×ĨØƯĐFFKØÛQJPLQKFRÛDÝQKKØƯÝQJWRÃWđến sức khỏe của người và động vật [28]

Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có chứa

uLactobacillus acidophilusv>]

.KDÛLQLHỈPQDÚ\VDXĨRÛĨØƯĐFODÚPUR×KƯQEƯÝL)XOOHU 3URELRWLFODÚuPRỈWFKDÃWERÇWUƯĐWKØÛFăn chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện sự cân bằng hệ YLVLQKYDỈWĨØƯÚQJUXRỈWFXÝDQRÛv

0RỈWĨƠQKQJKÕDNKDÛFYHÂSURELRWLFODÚuFDÛFYLVLQKYDỈWVRÃQJFRÛÏFKFKRVØÛFNKRÝHFXÝDYDỈWFKXÝNKLđược bổ sung một lượng ỲÚDĨXÝv>] Đây là những nhóm vi khuẩn sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ vi sinh vật, cản trợ sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến

hệ miễn dịch Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loài thực phẩm, thuốc phòng và chữa bệnh [13]

- Các vi sinh vật probiotic thường gặp Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB

Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa, điển hình

là các điều kiện như:

x Chịu pH thấp

x Chịu acid mật

x Chịu kháng sinh

x Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

- Cơ chế hoạt động của probiotic Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ [13] Ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra acid lactic, acid béo, peroxide và các kháng sinh

Tăng cường tiêu hóa thức ăn: vi khuẩn lactic sản xuất vitamin nhóm B và các enzyme phân giải protein, lipid và chuyển hóa đường lactose trong sữa thành acid lactic, ngăn ngừa chứng tiêu chảy do không dung nạp đường lactose trong sữa

Giảm cholesterol: nhiều kết quả cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu Gilliland và cộng sự (2007) thấy rằng vi khuẩn lactic phân lập từ lợn có khả năng phân hủy cholesterol trong môi trường nuôi cấy Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol trong máu thấp ở những con lợn được nuôi bằng cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn lactic được phân lập trên

- Ứng dụng probiotic cho viêm loét dạ dày

Phương pháp tiêu diệt vi khuẩn H.pylori chủ yếu là sử dụng thuốc kháng sinh, tuy nhiên hiện

nay đã gặp nhiều thất bại Sau nhiều nghiên cứu và thử nghiệm, các nhà nghiên cứu thấy rằng uống probiotic có thể giúp ngăn chặn các vi khuẩn có hại gây loét Một nghiên cứu thử

nghiệm về hoạt động của lợi khuẩn Bifidobacterium bifidum chống lại H.pylori thực hiện trên

chuột đã được công bố trong ứng dụng và vi sinh môi trường Kết quả thử nghiệm cho thấy, sau vài ngày, những con chuột được sử dụng lợi khuẩn có loét ít hơn so với nhóm đối chứng Người ta giải thích kết quả này là do khi đưa probiotic vào trong hệ thống tiêu hóa, sẽ cạnh

tranh với H.pylori về oxy và thức ăn để tiêu diệt chúng Các xét nghiệm bổ sung cũng cho

thấy phương pháp điều trị này đã giảm thiểu một phần thương tổn mô dạ dày do nhiễm

H.pylori và vi khuẩn Bifidobacterium bifidum không gây bệnh hoặc tử vong cho cả những con

chuột khỏe mạnh cũng như những con bị suy giảm miễn dịch

Sử dụng kháng sinh để tiêu diệt H.pylori sẽ không thể loại bỏ được hoàn toàn vi khuẩn này, tỉ

lệ tiêu diệt cao nhất chỉ đạt 75 đến 90% Hiệu quả điều trị cao hơn nếu phối hợp kháng sinh với probiotic Probiotic sẽ làm giảm các tác dụng phụ khi sử dụng kháng sinh, tăng hiệu quả

của phác đồ sử dụng kháng sinh, hạn chế khả năng bám dính của H.pylori vào tế bào biểu mô

[15, 23]

1.2.5.2.Đặc điểm vi sinh Lactobacillus trong chế phẩm probiotic

- Tính kháng mật của Lactobacillus

Dịch mật là một thách thức lớn với rất nhiều vi sinh vật được đưa vào đường tiêu hóa Mật

phá hủy màng tế bào vi sinh vật và tiêu diệt vi khuẩn Các chủng vi sinh Lactobacillus có lợi

trong nghiên cứu có khả năng thích ứng được trong môi trường mật nồng độ lên tới 2% Chế

phẩm probiotic dùng một số chủng Lactobacillus có khả năng thích nghi với dịch mật tốt nhất

- Khả năng kháng khuẩn của Lactobacillus

Khả năng chống lại các vi khuẩn có hại với hệ tiêu hóa là điểm quan trọng nhất trong các

nghiên cứu Chế phẩm sinh học Lactobacillus có lợi cho đường ruột bởi vì hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus tốt, chống lại những vi khuẩn gây hại nghiêm trọng Lactobacillus có

hoạt tính kháng khuẩn cao, tuy nhiên lại không biểu hiện tính kháng lại những vi khuẩn có lợi hay vi khuẩn cùng chủng

- Tạo ra bacteriocin và nhiều chất kháng khuẩn khác

Lactobacillus tạo ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic làm giảm môi trường pH trong đường ruột, kích thích hoạt hóa kháng khuẩn Bên cạnh đó, Lactobacillus cũng tạo ra

bacteriocin và nhiều chất kháng khuẩn khác như H2O2, CO2

- Khả năng kháng kháng sinh

Lactobacillus qua nghiên cứu có khả năng kháng kháng sinh tốt, kháng sinh không làm ảnh hưởng tới hệ vi sinh Lactobacillus Vi khuẩn Lactobacillus giúp chức năng tiêu hóa được duy

trì, loại bỏ nguy cơ rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy do kháng sinh ở người Khả năng kháng các loại kháng sinh vô hình chung tạo nên một hệ miễn dịch tự nhiên cho đường tiêu hóa, bảo vệ đường ruột khỏi các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy sinh trưởng, nhân rộng do mất cân bằng vi

sinh

Giảm cholesterol: nhiều kết quả cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm cholesterol trong máu Gilliland và cộng sự (2007) thấy rằng vi khuẩn lactic phân lập từ lợn có khả năng phân hủy cholesterol trong môi trường nuôi cấy Các báo cáo cho thấy nồng độ cholesterol trong máu thấp ở những con lợn được nuôi bằng cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn

lactic được phân lập trên [16]

1.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở Việtnam

Ơû Việt nam đã áp dụng việc chẩn đoán và điều trị nhiễm H.pylori từ hơn 20 năm nay Trong

những đầu năm 1990, một số nghiên cứu điều trị loét dạ dày tá tràng với phác đồ OAM (Omeprazol, Amoxicillin, Metronidazol), OAC (Omeprazol, Amoxicillin, Clarithromycin) 7-

14 ngày, tỉ lệ tiệt trừ có thể đạt lớn hơn 90% Song gần đây, tỉ lệ diệt H.pylori giảm đáng kể,

một số nghiên cứu làm kháng sinh đồ cho thấy tình trạng kháng kháng sinh chủ yếu ở Việt Nam gia tăng, đặc biệt là Levofloxacin 18.4%, kháng Clarithromycin có nơi lên đến 30-38.5%, kháng với Metronidazol 59.8-91.8% Amoxicillin, Tetracyclin trước kia không kháng thuốc ngày nay có nơi đã thấy tỉ lệ kháng 5.8-55.9% [14] Vì vậy, tỉ lệ thất bại trong điều trị bằng phác đồ 3 chuẩn (Esomeprazole + Metronidazole+ Amocillin) cũïng gia tăng Ởû miền

Bắc (Việt nam), phác đồ bộ ba tỉ lệ diệt trừ H.pylori là 75.8% Trong khi ở miền Nam (Việt nam), phác đồ bộ ba tỉ lệ tiệt trừ H.pylori giảm thấp dao động từ 66.1-68.5% [14]

Các phác đồ điều trị diệt H.pylori khác nhau tạo hiệu quả điều trị khác nhau Sự thất bại trong điều trị có thể là do nhiễm H.pylori kháng thuốc và sự tuân thủ điều trị không đúng ở bệnh nhân H.pylori kháng thuốc đối với Metronidazole ở Châu Âu và Châu Mỹ 20-40%,

châu Á 30-60%, đối với Clarithromycin ở châu Âu và châu Mỹ 4-22%, châu Á 5-13% Do vậy với tỷ lệ đề kháng cao với Clarithromycin và Metronidazole cho thấy phác đồ bộ ba chuẩn không được chọn lựa như phác đồ điều trị ban đầu tại Việt Nam Vì vậy, việc tìm ra phác đồ điều trị mới để thay thế phác đồ bộ ba là vấn đề cấp bách hiện nay ở Việt Nam

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ngày nay tỉ lệ diệt H.pylori của các phác đồ bộ ba ở mức toàn cầu đã giảm xuống thấp Kết

quả nghiên cứu những năm gần đây trên thế giới đã khẳng định việc kháng thuốc với

Metronidazole và Clarithromycin ảnh hưởng đến hiệu quả tiệt trừ H.pylori các phác đồ bộ ba chuẩn hiệu quả tiệt trừ H.pylori giảm thấp nhỏ hơn 80% [22] Vì vậy, phương pháp tiếp cận

điều trị cần mới hơn nữa nhằm nâng cao hiệu quả điều trị Trong những năm gần đây, một số

tác giả trên thế giới đã báo cáo nhiều lựa chọn điều trị khác, đó là các phác đồ tuần tự và

phác đồ tuần tự cộng thêm probiotic nhằm nâng cao hiệu quả tiệt trừ H.pylori

Trong nhiều nghiên cứu trên thế giới gần đây đã đưa ra phác đồ tuần tự, tức là thay đổi kháng

sinh trong liệu trình điều trị với mục đích tăng hiệu quả tiệt trừ H.pylori và khắc phục tình

trạng đề kháng Clarythromycin Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy rằng hiệu quả

phác đồ tuần tự diệt trừ H.pylori từ 80-93% [22]

Theo báo cáo của nghiên cứu Maastricht III (2007), chế phẩm sinh học probiotic cũng có thể

đóng vai trò liên quan trong việc điều trị H.pylori bằng cách cải thiện khả năng dung nạp điều trị và tăng tỉ lệ tiệt trừ H.pylori [20, 22] Thật vậy, một số nghiên cứu Lactobacillus đã được chứng minh, Lactobacillus có hoạt tính đối kháng chống lại H.pylori [22] Lactobacillus

đã được chứng minh làm giảm tác dụng phụ trong quá trình điều trị kháng sinh và tăng cường

diệt trừ H.pylori Hơn nữa một số nghiên cứu bổ sung thêm rằng, Lactobacillus tác dụng trên niêm mạc dạ dày, ức chế sự kết dính của H.pylori lên dòng tế bào biểu mô dạ dày và ngăn chặn H.pylori hoạt động tiết urea [20] Lactobacillus là loại vi khuẩn có lợi cư trú ở đường tiêu hóa con người và được thêm vào thực phẩm và sữa Lactobacillus đã cho thấy tác dụng đầy hứa hẹn trong điều trị H.pylori [20],

Tóm lại những nghiên cứu trên cho thấy, việc kết hợp probiotic cùng với kháng sinh không chỉ ngăn chặn các tác dụng phụ mà còn gia tăng hiệu quả điều trị đối với H.pylori Những nghiên cứu về probiotic ức chế H.pylori đã có nhiều nhưng chế phẩm probiotic chuyên biệt trong hỗ trợ điều trị H.pylori vẫn chưa có Bên cạnh đó, những lợi ích của probiotic không chỉ dừng lại ở đó, ngoài việc duy trì sức khỏe tiêu hóa, probiotic có thể giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường,

kiểm soát trọng lượng, tăng cường khả năng miễn dịch và ngăn ngừa bệnh ung thư [20, 22] Vì vậy nghiên cứu này được thực hiện nhằm chọn ra được chủng Lactobacillus có khả năng kháng

được H.pylori mạnh nhất, khảo sát một số hoạt tính cơ bản probiotic của chủng tuyển chọn, tiến hành định danh chủng tuyển chọn, bước đầu khảo sát và đánh giá độ ổn định của chế phẩm bằng phương pháp sấy phun

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2016 đến tháng 12/2017 Các thí nghiệm được thực hiện ở phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, thuộc bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu và thiết bị sử dụng

2.2.1 Nguyên liệu

- Các mẫu rau quả lên men gồm cải chua, kim chi, kim bắp được thu thập từ các chợ và siêu thị trong thành phố HCM, mẫu được phân tích trong vòng 24 giờ, lưu mẫu ở nhiệt độ 5-80C sau khi mang về phòng thí nghiệm

- 10 chủng vi khuẩn lactic được lưu trữ tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Bách Khoa Hồ Chí Minh, được ký hiệu từ L11-L20 Đây là những chủng đã được sàng lọc ở hoạt tính kháng khuẩn trước đây

- Chủng vi khuẩn Helicobacter pylori (PH9) được phân lập từ dự án hợp tác giữa Việt

nam và Jica Nhật Bản từ năm 2012-2016, được lưu trữ tại viện Pasteur Chủng PH9 kháng clarithromycin

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng

- Cao nấm men, cao thịt, tween 80 (Đức)

- Glucose, pepton, MnSO4.4H2O, NaCl, NaOH, HCl (Trung Quốc)

- MgSO4.7H2O, KH2PO4, CH3COONa.3H2O

- Agar (Trung Quốc)

Thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ giữ mẫu, máy li tâm thường, kính hiển vi OLYMPUS, máy lắc và thiết bị dùng để sấy phun miniB290, máy đo kích thước hạt HORIBA Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa PHWULEỴQKWDPJLDÛFTXHFDÃ\SLSHWĨDÂXWÏSFDÛFORDĐLg

2.3 Thiết kế thí nghiệm

Sơ đồ 2: Nội dung thí nghiệm

Từ các nguồn đã chọn, tiến hành pha loãng các canh trường, tách loại các chủng vi sinh vật riêng rẽ ra khỏi nhau bằng phương pháp dàn đều và cấy ria Từ các nhóm vi sinh vật

Chọn nguồn phân lập

Phân lập dòng vi khuẩn Lactobacillus sp

Kiểm tra khả năng ức chế của Lactobacillus sp với

chủng chỉ thị Helicobacter pylori

Kiểm tra các hoạt tính probiotic cơ bản và định danh

vi khuẩn tuyển chọn kháng Helicobacter pylori

Thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic bằng phương pháp sấy phun

Khảo sát các đặc điểm sinh học Phương pháp nuôi cấy đồng thời- trải đĩa Khảo sát vòng kháng khuẩn

Khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng sấy phun (4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 ml/pht) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun (90; 100; 110; 120; 1300C)

Kiểm tra khả năng chịu pH và muối mật Định danh bằng phương pháp 16S rDNA

Chế phẩm Khảo sát các tỷ lệ của chủng vi khuẩn tuyển chọn với

thuần khiết, làm các bước phân loại bằng cách khảo sát đặc tính hình thái nhờ vào hình thái khuẩn lạc, hình thái của vi sinh vật khi quan sát dưới kính hiển vi và nhuộm Gram

Tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế H.pylori bằng phương pháp

nuôi cấy đồng thời, trải đĩa đếm khuẩn lạc và khảo sát vòng kháng khuẩn Sau đó, khảo

sát các tỷ lệ (1,2,3,4,5%) của chủng vi khuẩn tuyển chọn với H.pylori bằng phương pháp nuôi cấy đồng thời-trải đĩa Tiến hành thử họat tính probiotic như khả năng chịu pH và muối mật của chủng tuyển chọn có khả năng kháng H.pylori mạnh nhất Tiến hành định

danh chủng tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA Sau định danh, bước đầu tiến hành thử nghiệm tạo chế phẩm bằng phương pháp sấy phun Trong sấy phun, nhiệt độ dòng khí ra là một thông số quan trọng, ảnh hưởng đến sự sống sót của vi khuẩn Số lượng vi khuẩn ngày càng giảm dần khi nhiệt độ dòng khí vào, dòng khí ra tăng lên và phun dưới áp suất cao [15] Do đó việc cải thiện khả năng tồn tại của vi khuẩn rất quan trọng Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng của lưu lượng dòng vào, ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun và độ ẩm của mẫu sấy phun đến tỷ lệ sống của vi khuẩn được thực hiện

2.4 Phương pháp 2.4.1 Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn Lactobacillus

Một số mẫu thực phẩm lên men như kim chi, cải chua, cà pKDÛRgĨØƯĐFWKXWKDỈSWØÚPRỈWVRÃchợ và siêu thị trong thành phố Hồ Chí Minh (xem phụ lục) Mẫu được tiền tăng sinh trong 10 ml môi trường MRS lỏng qua đêm ở 370C trước khi phân lập Quá trình phân lập được thực hiện bằng cách pha loãng thập phân đến 10-7, trải lên môi trường MRS thạch và ủ ở 370C trong thời gian từ 24 đến 48 giờ Sau đó làm thuần nhiều lần và thực hiện một số

thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của Lactobacillus Chọn những chủng có hình que, Gram

dương, catalase âm tính, vi hiếu khí, không di động, giống được giữ lạnh 40C trên ống nghiệm thạch nghiêng

2.4.2 Khảo sát các đặc điểm sinh học

2.4.2.1 Quan sát đại thể

Cấy trải chủng vi khuẩn lactic lên môi trường thạch đĩa, nuôi ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h quan sát hình thái, màu sắc, kích thước khuẩn lạc

2.4.2.2 Quan sát vi thể

Quan sát vi thể bằng cách tiến hành nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào, xác định vi khuẩn là Gram dương hay Gram âm

Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram 1938) phát minh ra từ năm 1884 Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: vi khuẩn Gram dương và Gram âm Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, còn vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng

(1853-Tiến hành:

x Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24h) hòa vào một giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

x Cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

x Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

x Nhỏ bổ sung lugol lên vết bôi trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

x Rửa bằng cồn 30 giây, tiếp theo rửa lại bằng nước

x Nhuộm bổ sung fuchsin kiềm 10-30 giây, rửa lại bằng nước Để khô vàsoi với vật kính dầu x100

x Ghi nhận khả năng bắt màu Gram của vi khuẩn [6]