Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Phân tích, ứng dụng Miraculin từ quả và khảo sát sự nảy mầm của hột cây thần kỳ (Synsepalum dulcificum Daniell)

Miraculin làmột glycoprotein được tìm thấy trong quả Thần Kỳ Synsepalum dulcificum nỗitiếng với những cảm giác ngọt ngào độc đáo mà miraculin đem lại mỗi khi nễm mộtvị chua và hoạt động

TRAN TRUC THANH

PHAN TICH, UNG DUNG MIRACULIN TU QUAVA KHAO SAT SU NAY MAM CUA HOTCAY THAN KY (Synsepalum dulcificum Daniell)

Chuyén nganh: Cong nghé sinh hocMã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỎ CHÍ MINH - 2012

Xin gửi lời cam ơn trân trọng nhất tới TS Huynh Ngoc Oanh và TS Lê ThịThủy Tiên đã giảng day và tận tình hướng dan, giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quýbáu trong quá trình tôi thực hiện luận văn.

Lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Đức Lượng và PGS.TS NguyễnThúy Hương đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt thời gianhọc.

Gửi lời cảm ơn chân thành đến em Phạm Thư Trang đã đồng hành, hỗ trợcùng tôi trong một khoảng thời gian làm luận văn.

Một lời cảm ơn riêng tới chị Nguyễn Kim Minh Tâm, Hoàng Mỹ Dung đã sẽ

chia với tôi mọi suy nghĩ, những khó khăn, vướng mắc trong lúc viết báo cũng nhưlàm luận văn và cả trong cuộc sống

Cảm ơn các thây, cô, chi, em trong bộ môn Công nghệ Sinh học trường Dai

học Bách Khoa TP.HCM đã tạo điều kiện về thời gian, phòng thí nghiệm, thiết bịmáy móc, hóa chất cho tôi thực hiện các nội dung nghiên cứu trong luận văn

Cảm ơn gia đình và bạn bè Họ luôn khích lệ, ủng hộ tôi bang cách này haycách khác trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, xin kính chúc ba mẹ, quý thay cô, anh chị và các ban dôổi dao sứckhỏe, gặt hái thật nhiêu thành công trong công việc và cuộc sống

Tp HCM, tháng 05 năm 2012

Trần Trúc Thanh

TOM TAT

Miraculin có đặc tính thay đổi vi giác từ chua thành ngọt Kết quả phân tíchthành phan hóa học trong thịt quả bao gồm: glucosamine, chất khoáng, đường,protein, vitamin Các hợp chất tự nhiên trong thịt quả cũng đa dang: flavonoid,polyphenol, saponin, Miraculin được tách chiết bằng dung dịch NaCl 0,5M sau đótủa phân đoạn với (NH4)2SO,4 50% bão hòa, tinh sạch băng sắc ký trao đổi ion vasắc ký lọc gel Biogel P-30, kiểm tra băng điện di SDS-PAGE có trọng lượng phântử khoảng 28 kDa Miraculin thu được làm biến đổi vị chua của acid citric 002Mthành vị ngọt tương đương với sucrose 0,5M Ung dụng miraculin tạo các sản phẩmThân Kỳ: bột nguyên chất, bột Than Kỳ phối trộn và viên ngậm Than Kỳ Các sanphẩm từ miraculin giữ được hoạt tính trong vòng hơn một tháng

Hot cây Than Kỳ có thành phan dự trữ gồm: lipid 41,05%, protein 11,85%va glucid 18,15% Nhiệt độ và ánh sáng ảnh hưởng lên sự nảy mam của hột Tỷ lệnảy mam cao nhất 93% ở nhiệt độ 25 + 2°C trong điều kiện sáng 5000+ 200 lux vớithời gian chiếu sáng 8 giờ trong ngày Các tác động lên vỏ đều kích thích nay mầmở hột cây Thần Ky: gây ton thương vỏ (90%), ngâm acid HCl 5% ( 80.4%), sốcnhiệt (90%) Xử lý hột với GA; ở nồng độ 20mg/1 rút ngắn thời gian nảy mam giúptăng tỷ lệ này mam của hột (98%) Hột được bảo quản ở nhiệt độ phòng 28 + 2°C cókhả năng nảy mam trên 50% trong 4 tuần và hột mat khả năng nảy mam hoàn toàn ởtháng thứ 3.

The taste-modifying protein, mirraculin, has unusual property of modifying a sourtaste into a sweet taste The results showed that miracle fruit contains: glucosamine,sugar reducing agent, macro-mineral Miraculin was extracted from miracle fruitwith 0,5M NaCl solution, was purified from the extracted solution by ammoniumsulfate fractionation about 50% saturation, resin ion-exchange chromatography, andgel filtration chromatography using Biogel P-30 column The high purity of themiraculin obtained by SDS-Page showed a single band about 28 kDa Miraculinfrom Miracle fruit can be applied to produce Miracle powder by mixing the juicewith dry starch at suitable rate The minimum rate 1⁄2 change of taste, also has higheconomic value Miracle lozenges supplement xylitol melting in the mouth and tastewas record in one hour Related products from miraculin remains taste-modifyingactivity in more than one month.

Seed components include: lipid: 41,05%, protein: 11,85% and glucid: 18,15%.Temperature and light effects on germination of seeds The highest germination rateof 93% at a temperature of 25 + 2°C in bright conditions to 5000 + 200 luxillumination time 8 hours a day The impact on the shell beads improved seedgermination as damaging shell (90%), soaked in 5% hydrochloric acid ( 80,4%),heat shock (90%) Handling of seeds with GA; at 20 mg / Ï to shorten the time andincrease the percentage germination of the seeds (98%) Seeds were stored at roomtemperature 28 + 2°C to germinate above 50% in 4 weeks and nability to germinateseeds in months 3rd

MỤC LỤC

TOM TAT weeccccscsscsssscsscsesscsesssscssssessssesssscsssessssessssessssessssecsssecsssecsssessssecsssssessesecseeeceeees iiABTRACT viccccccccccscscsscssscscsscscscscsssscscscscssscsescssssescscscsvsssscscsssvsssscsesssssesscscacssssseseeseass iiiMỤC LUC iececcccccscscssssessssesesscsesessesesesscsssusscscsesscsesusscsesesscsesusscsesscsssesecssseeesessaeeecseaeees ivDANH MỤC CÁC CHU VIET TAT wicceccccececescesecscececsscecscscecsesevevscececsesevacsceeeavacees viiM.9/0:80/9:7.9 2 viiiDANH MUC HINH 2 XMO ĐẦU 1n 1111 111211111111 0121111 1111111110111 110 1111111110 1101111111 11 1111k |CHUONG 1: TONG QUAN 1 31.1 Cây Thần Ky ceccecccccccccccscsscscssssssesscsssesscscscsscsesesscsesessssesesscsesesscsesesscsesesssseseseeseaes 31.1.1 NQUON QOC 217777 -. :1 31.1.2 Phân loại khoa HOC - «<< c3 3311111111111 111 111111531 1 xe 31.1.3 Đặc điểm sinh hỌC SG G11 31191 1E 1111211 H1 126g neo 31.2 MiiraCulÏInn - << - <2 C21331 11303011 11083 11805 11805 1110 1v HH ng ng kg vn 81.2.1 Câu tao MiraCUlin cece cesccececseeecscecesecsevscsceceesevscscececevaceceesevaraceceees 81.2.2 Trinh tu CDNA mf hóa miracuÏIn - << -<<<sss<<sseessssssssss 912.33 Mô hình không gian của miraCuUÏIT << «s5 eeess 101.2.4 Tính chất và cơ chế tác dụng của miraculin - 2 25s: 121.2.5 Một số ứng dụng của miraCulin ¿5 + 25+ s+s+x+£e+x+xerscxee 161.3 Các yếu tổ anh hưởng đến sự hình thành và phát triển hột của cây có dau 181.3.1 Sự hình thành va phát trién hột ¿2-52 55+ ss+e+eerezrerered 181.3.2 Thời ky miên trạng của Ot - Ăn nh 181.3.3 Sự nảy mam của hột cây chứa dau - 2 255 s+c+£scecsceresree 191.4 Tình hình nghiên cứu trên cây Than Ky o.cccccccccsessssesessesssessesesesseseseseseseesesen 2414.1 TTOD THƯỚC G0 ke 24I.⁄4.2 — Ngoài nƯỚC -GG Q nn rre 241.4.3 Tình hình trồng trọt và phát triển cây Than Ky ở Việt Nam 28CHUONG II: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP - 252 + se se £+E+ese£eesesez 20

213 Thiết bị SG SH T 11g TT ng TH ng ng 302.2 Các phương pháp phân tÍCh - - << + 119910011111 9 09 re 302.2.1 Xác định đường tong số hịa fan - +55 2c Se2tvErrkerrrrrereree 302.2.2 — Xác định đường khử theo phương pháp Bertrand - 302.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 312.2.4 _ Xác định dam tong số theo phương pháp Kjeldahl 312.2.5 Phương pháp định lượng khống tổng sỐ ¿2-5 5255255252 322.2.6 Phuong pháp định lượng gÏucoSamine << «s2 322.2.7 Phuong pháp định lượng vitamin C, << se 332.2.8 Phuong pháp xác định độ 4m của thịt quả -555s+c5c<c: 332.2.9 Dinh lượng lipid bang máy Soxhlet ¿5552 s+s+secs+esrsceẻ 332.2.10 Định lượng tinh bột băng phương pháp so mau 580nm 342.2.11 Phương pháp phân tích hĩa thực vật của thịt quả - 342.2.12 Phương pháp sắc ký lọc øel ¿2556222 £E+E£EsEeEEErkrkrrrrerees 362.2.13 Phương pháp điện dÍ << << 9900101 ng kg 372.2.14 Phuong pháp xác định độ hoạt động — độ ngọt của miraculin 372.2.15 Phương pháp đánh gid cảm QUAN 255555111 ssseeeeeeee 382.3 Nội dung nghiÊn CỨU - - - << 5 19001001 gọn và 382.3.1 Xác định các thành phan cĩ trong thịt quả tươi -<- 392.3.2 _ Trích ly va tinh sạch mIraCuÏ1T - << «55s x11 E3 eree 392.3.3 Ứng dụng miraculin -¿- + + 5+ +E+E£EE+E£EEEEEEEEeEkrkrkererxrrerered 402.3.4 Khảo sát sự nảy mầm của hột cây Than Kỳ - 5555: 422.4Xử lý $6 liỆU - CC SE 22121 111515151111 1115 1111111111111 11 0111501010111 11 0111 gre 44CHUONG III: KET QUA VA BAN LUẬN 5-5 SE £EEeEseseseseree 453.1 Hàm lượng các thành phan trong thịt quả Than Kỳ: -. 5 25555: 453.2 Trích ly và tinh sạch miraCỤ1TA «5 6 1 111 999305111 99 v1 ngờ 473.2.1 Khảo sát các phương pháp ly trích miraculin ««««<<<<+2 46

3.2.2 Tinh sạch và thu nhận miraculin - << -<<<ssss<<+ecssssss 503.3 Ứng dụng miraculin từ quả Than IKỲ - ¿5 +52 2s+c+Ecxcxerrrrrererreree 553.3.1 Bột Thần Kỳ nguyên chất - ¿6 +55 t+ESe‡EvEEvkerrkrrerereree 563.3.2 Bột Thần Kỳ phối trộn ¿ - 5-52 2 SESEESEEEEEEEEEEEErrkrkrree 563.3.3 Viên ngậm Than lKỳ +: EE+E2EEESE 1115211121111 5111k 633.4 Khao sát sự nảy mam của hot cây Than Ky ween 653.4.1 _ Hình thái của hột cây Than Ky eccccscsceecscsssscsessscssssesesssesseseseens 653.42 — Sự nảy mam của hột cây Than Ky - + 552 Scccccsesrrsrereee 663.4.3 Trọng lượng và thành phan hột cây Than Kỳ -. - -: G73.44 Thời gian bão hòa nước của hỘ[ - «c1 1 ree 693.4.5 Các yếu tô ảnh hưởng đến sự nảy mam của hột - - -: 703.4.6 Khao sát các biện pháp xử lý kích thích hột nảy mầm 73KẾT LUẬN (E111 1E 511191 1 1 51111151 11v 1110101111 H110 nen: 80DE NGH I ccceccccecccececessesecscecceesscscscecsecevavscecesscvavacacececsevavacecessevavacaceceeavavaceceasevavaeees 82TAI LIEU THAM KHẢO G1 E 12t E5 919191 1 E111 91 51 1 E111 neo 83

DANH MUC CAC CHU VIET TAT

DGsGPCRsGA3TAGABA

BR

NAABAPSDS-PAGEelectrophoresis

CS

DNP

Electron-dense granulesG-protein coupled receptorsAcid gibberellic

triacylglycerolabscisic acidbrassinosteroidI-naphthalene acetic acid6-benzylaminopurineSodium dodecyl sulphate-

cộng sự

2,4-Dinitrophenol CøH¿N2Os

polyacrylamidegel

DANH MUC BANG

Bang 1.1 Thanh phan các amino acid của miraculin -. - 25s: 9Bảng 2.1 Danh mục hóa Chat c.cccccsccccccscsescscscscsscsescssscssescscscsssssscsessssssssesessseeees 29Bang 2.2 Danh mục thiết bi máy móc sử dụng - - +2 2 s+s+s+ss+x+xecscxez 30Bảng 2 3 Kết tủa phân đoạn với (NHa)sSÕa ng ve, 38Bang 2.4 Tỷ lệ khảo sát miraculin : tinh Độ[ - 555111111 eeeeeese 4]Bang 3.1 Kết qua tóm tat ham lượng các thành phan sinh hóa cơ ban trong thịt quả46Bang 3.2 Thành phan hóa thực vật trong quả Than Kỳ - 55-52: 47Bảng 3.3 Kết quả các phương pháp trích ly miraculin - 2 5 2555: 46Bang 3.4 Nong độ protein và nông độ đường qua các phân đoạn 49Bang 3.5 Hàm lượng các chat sau khi tách chiết miraculin - +: 51Bang 3.6 Ham lượng các chất qua sắc ký trao đi ion - 555cc cs+ssse2 51Bang 3.7 Bảng kết qua đường tong số hòa tan, đường khử và protein của 4 mẫu

Bảng 3.8 Thành phan một ống bột Than Kỳ (0.48) -.- ¿5-52 5c+c+csczcszeceee 60Bang 3 9 Kết quả hàm lượng protein, đường tổng số hòa tan và đường khử của các

mẫu bột trước và sau bảo QUAN c.ceccscsssessscscscscsesesesesesescsescscssscscscscseseseecseseseesesesesens 61

Bang 3.10 Thanh phan một viên ngậm Than Kỳ (0.58) -. - 2-2 25555: 64Bảng 3.11 Trọng lượng của 100 hột cây Than Kỳ - + 255252 5scs+cccscce2 68Bang 3.12 Thanh phan sinh hóa trong hột Than Ky - 2-55 25255252: 69Bang 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự nảy mam của hột sau 21 ngày gieo trêngiá thể âm - E1 St 1 S1 31111 21111112111 1111111111 1111 0111111111111 T1 0101111011 70Bang 3.14 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến tỷ lệ nảy mam sau 21 ngày gieotrên giá thể ấm ¿6-5-5 2E23SE21915E12111112111111 211111 111111111111 1110111111101 1 11T 71Bang 3.15 Tỷ lệ nảy mam của hột được xử lý với HCI sau 21 ngày gieo trên giá thé74Bang 3.16 Các biện pháp xử lý ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mam của hột 75Bang 3.17 Ảnh hưởng của GA; lên tỷ lệ nảy mam của hột cây Than Kỳ 76Bảng 3.18 Tỷ lệ phần trăm hột nảy mầm ở các tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng (28

Bảng 3.19 Tỷ lệ nảy mầm của hột qua 3 tháng bảo quản

Hình 1.2 Cây và lá Thần Ky ccccccccsccccscssssesesssscsesscsesessesesessesesesscsesessesesessesesesseseseeees 6Hình 1.3 Hoa và quả của cây Than Kỳ -¿-¿- + 2222 E2EE2Ekerrkrrrrkrrreee 7Hình 1.4 Quả và hột Thần KKỳ ¿<< E33 3 1151515131311 1151515111111 ckckrkg 7Hình 1.5 Trình tự 191 amino acid của phan tử miraculln -«««««««<++s<<s 8Hình 1.6 Trinh tự mã hóa CDNA của MIraculin -<<ss<<<<<<<ssssss 10Hình 1.7 Mô hình phân tử 3D của miracuÌin - - << « «s21 ssesse 12Hình 1.8 Mô tả hoạt động của vỏ não khi ăn quả Than Kỳ . - 5+: 13Hình 1.9 Mô hình mô phỏng hoạt động liên kết của miraculin với hT 1R2 -hT1R3

15

Hình 1.10 Mô hình các hoạt động làm thay đôi vị giác của miraculin 16

Hình 1.11 Dược phẩm từ quả cây Than Ky -. ¿-5- 52 Scccccccevrcrerxrrrrereee 17Hình 1.12 Cơ chế hình thành miên trạng của NOE Y1 re 19Hình 1.13 Sự nảy mam của hột - - 2 + 525226 + SE EEEEEEEEEEE E111 111 ecee, 19Hình 1.13 Các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự nảy mam của hột 22

Hình 2.1 Quả Than Kỳ sử dụng trong các thí nghiệm - - + 5552: 29Hình 2.2 Sắc ký trao đối ion - - +52 1 1 11121 1211151511 21111115 11111111111 35Hình 2.3 Sắc ký lọc gel -¿- 55c 122121911 2121211 21211121111 1111111 111111 37Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn đường chuẩn protein .- 2-5 + + 2s+s+ss+s+sz: 45Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn đường tổng số hòa tan - 255 55+ccs se 45Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn glucosamine +5 + s52 +*+x+£++s+xezezxzxeei 46Hình 3 4 Dịch sau trích ly bang NaCl 0.5M 5-5525 St tererrrerereed 50Hình 3.5 Giá trị OD2g9 của các phân đoạn sau khi qua sắc ký trao đổi ion 51

Hình 3.6 Kết quả điện di SDS-PAGE của mẫu miraculin sau khi trao đối ion 52

Hình 3.7 Giá trị ODzso của các phân đoạn sau khi qua sắc ký lọc gel 34

Hình 3.8 Kết quả điện di SDS-PAGE của mẫu miraculin sau khi loc gel 55Hình 3.9 Sản phẩm bột Than Ky nguyên chất c.ccccccsescssssessssesesesssesssseessssseeeeees 56Hình 3.10 Các mẫu bột Than Ky sau khi đông khô - 5 +52 2£s+s+S+2 57

Hình 3.11 Mức độ yêu thích các mẫu qua đánh giá cảm quan - 58

Hình 3.12 Sản phẩm bột Than K} ¿ ¿2E E2 E2 EE+E£E+ESEEEEEEEEEEEEEErkrkrkrree 60Hình 3.13 Kết quả cảm quan của nhóm l + 25+ ++s+E+££+s+xeezxzxerecxee 62Hình 3.14 Kết quả cảm quan của nhóm 2 - ¿2 + s22 +E+E+££+x+Eezezxexrecree 63Hình 3 15 Sản phẩm viên ngậm Than Kỳ ¿5-52 2 52+SS2+z+xz£+cxvxereceee 64Hình 3.16 Cau tạo hột cây Thần Kỳ: cắt dọc (A); cắt ngang (B) 66Hình 3.17 Hot cây Than Ky nảy mam: 5 ngày (A); 9 ngày (B) 66Hình 3.18 Cây Than Ky nay mam: 14 ngày (A); 16 ngày (B); 23 ngày (C) 67Hình 3.19 Cây con trồng từ hột: 28 ngày (A); 30 ngày (B) -cccec 67Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn trọng lượng của hột qua thời gian bao quản 68Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn sự hấp thu nước của hột bảo quan sau | tuần và 4 tuan70Hình 3.22 Đồ thị biểu diễn ty lệ nảy mầm của hột bóc vỏ và không bóc vỏ theo thờiHình 3.23 Hot bóc vỏ sau 10 ngày gieo trên bông ấm .- 25-552 s25: 73

DANH MỤC SƠ ĐỎ

Sơ đồ 2.1 Dinh tính các hợp chat tự nhiên có trong thịt quả - 5: 35Sơ đỗ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu chung + 2 6E SE 3E E2 SE EEEEEEErkrkrkred 38Sơ d6 2.3 Các ứng dụng miraCulin 5-5256 S62E2E+E2EE E23 E E3 SE rErkrkred 4]Sơ đỗ 2.4 Khảo sát su nảy mầm của hột Than Kỳ ssesseeseeeseeeees 42

chăng hạn như: đường, amino acid, peptide và các protein có vị ngọt Miraculin làmột glycoprotein được tìm thấy trong quả Thần Kỳ (Synsepalum dulcificum) nỗitiếng với những cảm giác ngọt ngào độc đáo mà miraculin đem lại mỗi khi nễm mộtvị chua và hoạt động này kéo dài từ 15 phút đến 2 giờ Miraculin là chất tạo ngọt tựnhiên không sinh năng lượng, an toàn cho người sử dụng Chính vì thế, miraculintrong quả Than Ky có thé thay thé cho các loại đường chứa nhiều năng lượng, thíchhợp cho người ăn kiêng, béo phì Hơn nữa, vi ngọt tự nhiên của miraculin giúp bệnhnhân ung thư cải thiện chế độ dinh dưỡng hoặc tạm thời làm mất vị đăng của thuốckhi người bệnh hay trẻ em phải điều trị bằng những thuốc rất đăng Vì vậy, có thểnói miraculin là chất điều vị hứa hẹn nhiều triển vọng trong tương lai Bên cạnh đó,cây Thần Kỳ cũng là một loại cây cảnh tuyệt đẹp với quả sai, chín đỏ rực khắp câyvà được nhiều người ưa thích.

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới rất phù hợp để trồng cây ThầnKỳ Tuy nhiên, cây Thần Kỳ chỉ mới du nhập vào Việt Nam khoảng 6 năm trước.Cho đến nay, cây Thần Kỳ ở Việt Nam chủ yếu để thu hoạch quả và làm cây cảnh,các nghiên cứu khoa học trên giống cây mới này còn rất hạn chế trong khi ở cácnước Mỹ, Nhật, quả của cây Thần Kỳ đã được phát triển thành các loại thực phẩmbố sung hết sức da dạng Mặc khác, hiện nay số lượng cây Than Kỳ trưởng thành taiViệt Nam không nhiều và chủ yếu cây con được trồng từ hột Tuy nhiên, hột câyThan Ky là loại hột có chứa dầu gây khó khăn cho quá trình nảy mam và bảo quanhột Vì thế, nếu hiểu rõ về sự nảy mam của hột cây Than Ky từ đó có thé ứng dụngcho những nghiên cứu phát triển loại cây trồng này ở nước ta

Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên chúng tôi tiến hành thực hiện dé tài:“Phân tích, ứng dụng miraculin từ quả và khảo sát sự nảy mầm của hột câyThân Kỳ (Synsepalum dulcificum Daniell)”

- Tao ra một số sản phẩm chức năng từ quả Thần Ky- Tang tỷ lệ và rút ngăn thời gian nảy mam của hột Than Kỳ.

Nội dung thực hiện đề tài:- _ Xác định thành phan trong quả Than Kỳ- Ly trích và tinh sạch miraculin từ quả Thần Kỳ- ‘Tao dạng bột và viên ngậm Thần Ky

- Khao sát các yếu tổ ảnh hưởng đến sự nảy mam của hột Than Ky- Khao sát điều kiện nhiệt độ bảo quản hột Than Kỳ

1.1.1 Nguồn gốc

Năm 1725, Nhà thám hiểm người Pháp, Reynaud dés Marchais khi ghé lạimột ngôi làng ở Ghana (Tây Phi) đã viết về tập tục ky lạ của tho dân vùng này.Theo quan sát của ông thì các thức ăn của họ đều rất chua và không hề có đường,nhưng sau khi nhai một loại quả cây màu đỏ thì các vị chua này đã trở thành ngọt vàhọ cũng sử dụng loại trái cây này để làm rượu palm chua trở nên ngọt hơn Đếnnăm 1852, Tiến sĩ W.F Daniel đã nghiên cứu về đặc tính cây này và phát hiện rarang thành phan chính của quả là miraculin, cây được định danh là Synsepalumdulcificum, ho hỗng xiém (Sapotaceae) và ông đặt tên là “miracle fruit” (cây kỳdiệu) [23].

1.1.2 Phần loại khoa học- Guidi: Thực vật (Plantae)- Nganh: hột kin (Magnoliophyta)- Lép: Hai lá mam (Magnoliopsida)- Bo: Ericales

- Ho: Hong xiém (Sapotaceae)- Chi: Sideroxylon

- Danh pháp khoa hoc: Synsepalumdulcificum

- _ Tên tiếng Việt: cây Thần Kỳ

Day la loai cay tiéu mộc nhỏ, phat triển rất chậm và có thé cao 1,2 -1,5m nếutrồng trong chậu, cao 3,0 — 4,5m nếu trồng ngoài tự nhiên Khoảng 10 năm cây mớicó thé cao được 1,2 — 1,5 m Tan cây tạo thành hình chóp Có một thân chính, 4 — 5nhánh phụ [7].

1.3.3.3 Lá

Lá nguyên, dày, dài, bóng, mọc so le hay tạo thành chùm ở đầu các ngọnnhánh phụ, lá non màu xanh nhạt và đậm dan khi già Lá xanh hàng niên, quanhnăm không rụng lá và chỉ thường lá già mới rụng [7|

1.3.3.4 Hoa

Hoa Synsepalum dulcificum nhỏ có màu trang, mùi rất thơm, có lông tơ ởmặt ngoài, đường kính khi nở khoảng 0,3 — 0,5 mm Cuống nhỏ dài 0,2 — 0.3mm.Đầu tiên ở nách lá xuất hiện mầm hoa, dần dan lớn lên thành nụ, trên một cànhthường có 15 — 20 nụ ở nách lá, sau này nở thành hoa Hoa moc tập trung hay đơnđộc từ nách lá ở gần ngọn nhánh Hoa có cánh dính liên ở đáy Cánh hoa chia làm 5thùy, dính nhau ở đáy tạo thành hình ống Hoa có tiểu nhị thấp hơn nhiều với nướmnhụy cái, tiểu nhị dính chính diện với cánh hoa, bộ nhụy cái gồm bầu noãn, có mộtchỉ nhụy và một nướm moc dai ra khỏi bao hoa, sau khi thụ tinh chỉ nhụy không bịtiêu biên đi mà tôn tại song song với sự phát triên của quả [7].

Hình 1.3 Hoa và quả của cây Thần Kỳ1.3.3.5 Quả

Quả chín từ cây Thân Kỳ có màu đỏ tươi và chứa một hột Chiều dài trungbình cua quả khoảng từ 2 — 3,5 cm Đường kính quả khoảng từ | — 1,8 cm Trọnglượng quả khoảng 1,5 — 3 g Vỏ qua mỏng, khi quả còn non có màu xanh damnhưng khi chín quả có màu đỏ, mọng nước Thịt quả khi chín có màu trăng, hơinhớt, khi ăn lại có vị thanh chua nhẹ Cây Thần Kỳ cho quả quanh năm và từ lúc rahoa đến khi kết trái khoảng 30 đến 45 ngày [7]

1.3.3.5 Hột

Mỗi quả có một hột, hột có hình elip, kích thước từ 1,0 — 1,5 cm Vỏ hộtcứng và gôm có hai mặt, mặt trên trơn và mặt dưới nhám có đường kẻ sọc Bên

Khi ăn quả Thần Kỳ vào thì vi chua, cay, đăng của các loại quả, thức ăn, thức uốngkế tiếp sẽ trở nên ngọt Năm 1968, miraculin được ly trích đầu tiên bởi Giáo sưKenzo Kurihara và Tiến si Lloyd Beidler, dai hoc Florida [40].

1.2.1 Cau tao miraculin

Miraculin là một loại glycoprotein, có trong lượng phân tử 24.600 dalton,được tạo thành bởi một chuỗi phân tử đường và một chuỗi protein gồm 191 aminoacid [56].

Thành phan các loại đường trong miraculin: glucosamine (31%), mannose(30%), fucose (22%), xylose (10%) và galactose (7%) [56].

1-50 DSAPNPVLDI DGEKLRTGTN YYIVPVLRDH GGGLTVSATT PNGTFVCPPR51-100 VVQTRKEVDH DRPLAFFPEN PKEDVVRVST DLNINFSAFM PNPGPETISS101-150 WCRWTSSTVW RLDKYDESTG QYFVTIGGVK FKIEEFCGSG FYKLVFCPTV

Hình 1.5 Trình tự 191 amino acid cua phan tử miraculin [68]

] Aspatic acid (D/N) 21 11,02 Threonine (T) 14 73

3 Serine (5S) 12 6,3

4 Glutamic acid (E/Q) 12 6,55 Proline (P) 15 7,96 Glycine (G) 16 8,77 Alanine (A) 6 3,5S Half —cysteine | (C) 7 2,69 Valine (V) 21 10,8

10 Methionine (M) l 0.5

I1 Isoleucine (I) 8 4312 Leucine (L) 10 5,513 Tyrosine (Y) 7 3,7

14 Phenylalanine (F) 14 TA

15 Lysine (K) 12 6,5

16 Histidine (H) 2 1,017 Arginine (R) II 5,5

18 Tryptophan (W) 2 1,0

“Giá trị kết quả của lượng amino acid trên tổng giá trị 100.

> Giá trị kết quả của lượng trên 21200 polypeptide1.2.2 Trình tự cDNA mã hóa miraculinNăm 1995, Yutaka Masuda (Đại học Showa, Tokyo, Nhật Bản) cùng các csđã sử dụng đoạn mỗi mã hóa (GIu”-Thrˆ' miraculin thiết lập trình tự cDNA mahóa protein thay đổi vị giác — miraculin [43]

Trình tự cDNA mã hóa miraculin gồm 220 amino acid, trong đó có chuỗi tínhiệu gồm 29 amino acid Phân tích Western blot chỉ ra răng mRNA mã hóa cho

miraculin được tìm thay trong quả Than Kỳ vào thời điểm 3 tuần sau khi thụ phan[43].

ACAACAATGAAGGAATTAACAATGCTCTCTCTCTCGTTCTTCTTCGTCTCTGGATTGTTG 60

M K E L T M L S Lb S F F F V S A L L 18

GCAGCAGCGGCCAACCCACGTCTTAGTGCAGCGGATTCGGCACCCAATCCGGTTCTTGAC 120A A A A N P LL 5 A 5” SA P N P VL OD 38ATAGACGGAGAGAAACTCCGGACGGGGACCAATTATTACATTGTGCCGGTGCTCCGCGAC 180T D G E K L R F G T N ¥Y Y I V P V L R D 58CATGGCGGCGGCCTTACAGTATCCGCCACCACCCCCAACGGCACCTTCGTTTGTCCACCC 240H G G 6G L T V S A T T PN GC T7 F V C P P 78AGAGTTGTCCAAACACGAAAGGAGGTCGACCACGATCGCCCCCTCGCTTTCTTTCCAGAG 300R V V Q T R K E V D H D R P L A F F P E 98AACCCAAAGGAAGACGTTGTTCGAGTCTCCACCGATCTCAACATCAATTTCTCGGCGTTC 360WP AUWE DV VRE V Š FD & NHN OF Š OA EÈ 118ATGCCCTGTCGTTGGACCAGTTCCACCGTGTGGCGGCTCGACAAATACGATGAATCCACG 420MP C R W T S S T V W R L D K Y D E § T 138GGGCAGTACTTCGTGACCATCGGCGGTGTCAAAGGAAACCCAGGTCCCGAAACCATTAGT 480GQ ¥ F V T I G 6G V K G N P G P E T TI S 158AGCTGGTTTAAGATTGAGGAGTTTTGTGGTAGTGGTTTTTACAAGCTTGTTTTCTGTCCC 540

S W F K =f E E F € G 5S G F ¥ K L V F C P 178

ACCGTTTGTGGTTCCTGCAAAGTAAAATGCGGAGATGTGGGCATTTACATTGATCAGAAG 600

T V €C G 5 € K V K C GDVGdI Y iI DQ kK 198GGAAGAAGGCGTTTGGCTCTCAGCGATAAACCATTCGCATTCGAGTTCAACAAAACCGTA 660

G R R R L AL S$ D K P F À EL: EF N K T V 218

TACTTCTAATTGGGTTTGGGGGTGGTTTTTCCAATCACATCTCATGTATGATCAGCTCCA 720

y¥ +s * 220TTATCGATCTGCATAATTATAATTAATAAGGAAGCTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 780

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 801

Hình 1.6 Trinh tự mã hóa cDNA của miraculin [43]Các trình tự amino acid gach chán được su dụng cho việc thiết kế môi PCR

Dấu mũi tên cho biết vị trí phân tách của quá trình dịch mã miraculin

Dấu (*) đánh dấu codon kết thúc.1.2.3 Mô hình không gian của miraculin

Miraculin là một chuỗi protein liên kết với chuỗi đường có trọng lượng phântử 24,6 kD Miraculin thường ton tại ở dạng tetramer, là sự kết hợp của hai dimergôm 4 monomer Ca tetramer va dimer đêu có kha năng thay đôi vi giác từ chua

thành ngọt [14].

Trong mỗi chuỗi protein, các dimer miraculin liên kết với nhau bằng liên kếtdisulfide Liên kết này có hoạt tính thay đổi vị giác ở pH acid (lớn nhất ở pH 3),không đổi ở pH trung tính và ở pH 6,5 thì hầu như bị mat hoạt tính [14, 17] Cácnghiên cứu Antonella Paladino và cs đã chỉ ra hai dư lượng His29 và His59 củaphân tử miraculin là những nhân tố chính liên quan đến hoạt động thay đổi vị giác.Ở pH acid, độ chặt của phân tử miraculin giảm, khoảng cách giữa hai monomer củadimer tăng Ở pH trung tính, miraculin trở nên nhỏ gon hơn, hai tiểu đơn vị gannhau hơn Việc sắp xếp lại cau trúc của các tiểu đơn vị làm giảm khoảng cách giữacác dư lượng His29 ở pH acid, do đó bề mặt xung quanh của chúng trở nên gannhau hơn và tạo thành vùng tương tác thiết yếu trên bé mặt dimer [14]

Mô hình dimer miraculinDimer miraculin duoc thé hién trong hình 1.7B Các vùng bị tích điện xungquanh dư lượng His đã được phát hiện và phân tích Vùng này liên quan đến sự liênkết giữa các thụ cảm vị giác gây ra hoạt động làm thay đổi vị giác Đặc biệt, cónhiều dư lượng tích điện xung quanh His29 (Arg27, Asp28, Arg54, Glu56, Asp166,Argl7I, Argl72, Asp177, Lys178, Lysl7§ và Glul83) và His59 (Arg54, Lys55,Glu56, Asp58, Asp60, Arg61, và Lys186) Điều này giúp giải thích cho việc xảy rasự tương tác điện tích của các thụ thé T1R2-T1R3 (2 thụ thể nhận biết protein-GPCR) trên lưỡi và vùng tích điện xung quanh [14].

Mô hình tetramer miraculinCác tetramer miraculin được mô phỏng bang chương trình mô phỏng Haiđịnh hướng khác nhau của các dimer được mô phỏng, cả hai đều tương thích với sựhiện diện của chuỗi đường Sự kết hợp các dimer dẫn đến cấu trúc tetramer khônggian với hình cau và thăng (hình 17C) và 1.7D) Cả hai mô hình tetramer hình cầuvà hình thăng có sự khác biệt với các tính năng của các dimer riêng rẽ về vị trí củahistidine, các histidine này có khả năng tiếp xúc và và tích điện bề mặt Trong môhình hình cau, bốn liên kết hydro được hình thành giữa hai dimer và 46 dư lượngAsn cho mỗi tiểu đơn vị ở bề mặt, trong khi ở dạng thắng chỉ có một liên kết hydrogiữa hai dimer và gan một nửa sô dư lượng Asn năm tại các bê mặt Các câu trúc

hình câu và thăng đại diện cho hình thức “đóng” và “mở” cua tetramer miraculintương ứng [14].

Dư lượng Cys va His được nhận dang theo loại nguyên tu và màu xanh tương ứng.(A) Cấu trúc monomer: màu vàng biểu hiện cho sợi Ö.(B) Dimer miraculin Monomer đầu tiên và thứ hai có màu xanh lá cây và màuxanh nước biển, tương ứng với chuỗi H và 1

Hình bau dục biểu hiện liên kết disulfide liên chuỗi (C137-C137).(C) và (D) Mô hình tetramer dang cầu và dang thang của miraculin Màu sac giốngnhau thé hiện các monomer tương ứng cua hai dimer (H và I; L và M) trongtetramer [14].

1.2.4 Tinh chat va co chế tac dụng của miraculin

Miraculin không bên ở nhiệt độ cao và bị phân hủy khi đun nóng Miraculinlà một base lưỡng tính, tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ, không

bên trong môi trường acid - base mạnh [68].

Quả Than Kỳ được người dân châu Phi đã sử dung hang trăm năm, bên cạnhđó, người phương Tây đã biết đến cây này hơn 275 năm [17] Cho đến nay, chưa cóbat kỳ tài liệu khoa học chính thức nào cho thay tác dụng bat lợi của quả Than Kỳ.Miraculin được gọi là protein ngọt làm thay đổi vị giác (sweet-tasting proteins) vàđánh giá là an toàn với người sử dụng được chứng minh qua những nghiên cứu trênkhỉ nau Macaca mulatta và người [21, 35, 64].

¬ ¬ ; Nước

® Acid citric sau khi ăn qua

Hình 1.8 Mô tả hoạt động của vỏ não khi ăn quả Thần Kỳ [21]

50 {Tem

Mau vàng, đỏ và hình tròn màu xanh lá cây cho thấy vị trí dòng điện lưỡngcực tương đương trong nắp đỉnh vỏ não tương ứng với acid citric, sucrose và acidcitric sau khi ăn qua Thân Kỳ Hình phía bên phải tương ứng với bên phải vỏ não.Đường dọc xanh nước biển là khi bắt dau kích thích; dọc màu vàng, đỏ và xanh lácây chỉ những xuất hiện đâu tiên của các hoạt động do được tương ứng với acidcitric, sucrose và acid citric sau khi ăn qua Than Kỳ [21]

Gan day nhat (năm 2006), Chizuko Yamamoto cùng cộng sự nghiên cứu sự

tác động của miraculin trên não người cho thấy độ an toàn của miraculin được đảmbảo Các chất dùng được để kích thích là acid citric 0,05M và sucrose 0,5M (hình1.8) Ở nồng độ này, tất cả các đối tượng bị tác động bởi acid citric đều có vị chuavà khó chịu còn với sucrose cho vi ngọt va dé chịu Thử nghiệm được tiễn hành với4 loại: acid citric 0,05M, sucrose 0,5M, acid citric 0,05M sau khi ăn qua Than Kyvà nước am Kêt qua cho thay hoạt động cua vỏ não đáp ứng với sucrose rat chậm

và thời gian lâu hơn đối với acid citric Đáp ứng gây ra với acid citric sau khi ăn quảThan Ky là tương tự với sucrose Nước không gây ra bat ky đáp ứng đáng chú ý nao

[21].Bên cạnh đó, miraculin đã được FDA (Cục Quan lý Dược và Thực phẩm HoaKỳ) cho phép sản xuất là thực phẩm chức năng

Từ năm 1852 cho đến nay, cơ chế tác dụng của miraculin làm thay đổi vị giácđược các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu.

Năm 1969, Ernest Dzendoleti cùng cs đưa ra giả thuyết răng miraculin làmkhóa vị trí nhận biết vị chua trên lưỡi, làm cho các proton khác không thé gan vào,do đó vị giác “bỏ qua” vị chua Giả thuyết này chỉ ra rằng vị ngọt sẽ được cảm nhậnmạnh mẽ trong môi trường muối vô cơ có nồng độ thấp như LiCl, NaCl, Vi ngọt

này giống như vị của các chất làm ngọt nhân tạo như saccharin hoặc chất ngọt hữu

co sucrose Miraculin có khả năng khóa phan lớn các vị chua, không phải tat cả, do

đó vẫn có những vi trí nhận proton không bị vô hiệu Độ ngọt nhận được còn phụ

thuộc vào anion gan với proton Chang hạn như với acid citric, vị ngọt có thé đượccảm nhận rõ ràng do muối citrate là chất nhận proton mạnh, có thé lay proton khỏivị trí thụ thé ngọt, làm mat vị chua [26]

Năm 2002, Hajime Nagai cùng các cộng sự đưa ra cơ chế của sự tác động thayđối vị giác của miraculin là do các liên kết của miraculin có tính chất trái ngược vớichất nhận vị ngọt và sau khi tiếp xúc với vi chua, miraculin thay đổi cau trúc và liênkết với chất nhận vị ngọt [30]

Năm 2007, Paladino cùng các cs nghiên cứu cho rang hai dư lượng histidine(His29 và His59) chủ yếu chịu trách nhiệm về hiện tượng làm thay đổi vị giác [ L4].Bình thường, những khẩu vị làm kích hoạt những tế bào tiếp nhận đặc thù chứa bêntrong các gai lưỡi và nối dính với các receptor ngọt, mặn , sau đó gửi đến nãonhững tín hiệu cho chúng ta biết là khau vị ngọt, mặn, đăng, chua hay những vikhác Miraculin có thé làm thay đổi cau trúc của tế bào vị giác trên lưỡi Ở pH acid,trong đó vị chua nói chung, các thụ thể ngọt T1R2-T1R3 cua protein thu thé duockích hoạt, hình dang của cdc receptor thay đối làm miraculin nỗi chặt vào chúng,như chìa khóa găn vào ô khóa Mặc khác, trong phân tử của miraculin còn có chuôi

phân tử đường nên tao ra vi ngọt trong thời gian miraculin lưu lại trên lưỡi Hiệuứng này vẫn còn cho đến khi vị giác trở lại bình thường Vì miraculin quá chặt vàocác thụ thể cảm nhận trên gai lưỡi cho nên ảnh hưởng của miraculin có thé kéo daiđến vai giờ Sự tác động của các phân tử miraculin đã làm sai lệch định hướng củacác thụ thể cảm nhận trên gai lưỡi, lam cho lưỡi trở nên thích ứng và nhận định duynhất với vị ngọt trong một khoảng thời gian nhất định Thời gian và cường độ củahiện tượng thay đối vị giác, phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như nồng độmiraculin, thời gian liên lạc của miraculin với lưỡi và nồng độ acid VỊ ngọt tối đagây ra đã được chứng minh là tương đương với vi ngọt cua sucrose 17% [14] Tácdụng này có thé kéo dài 1 đến 2 giờ và sẽ biến mat nhanh chóng, nếu dùng trà nónghay nước nóng đề súc miệng.

Hình 1.9 Mô hình mô phỏng hoạt động liên kết của miraculin với hT1R2 -hT1R3

[16]

Mau xanh: miraculin; màu xám: TIR2; màu vàng : TIRI; mau do: các hiên kết

giữa miraculin và TIR2Tháng 9 năm 2011, Ayako Koizumi cùng cộng sự nghiên cứu rõ về cơ chếhoạt động làm thay đổi vị giác của miraculin Trong nghiên cứu này, AyakoKoizumi đã đánh giá vị ngọt do acid gây ra khi sử dụng miraculin, kết quả cho thayrang miraculin kích hoạt các thụ thé hT1R2 và hT1R3 và giảm hoạt tính khi pHgiảm từ 6,5- 4,8 (hình 1.9, hình 1.10) Thí nghiệm sử dụng người và chuột làmkham thụ thé và mô hình phân tử cho thay miraculin liên kết với hT1R2 và hT1R3

như một chat đối kháng ở pH trung tinh và thay đối chức năng khi ở pH acid Sựtương tác của miraculin xảy ra tại vị trí amino acid từ 448 đến 494 trên thụ thểhT1R2 [16].

(trái) và miraculin hoạt động khi chuyển sang pH acid (phải)

(B) Một loạt các chất ngọt gan với hT1R2-hT1R3 làm miraculin hoạt động thay đổi

vị giác (trái), nhưng miraculin bị ức chế khi ở pH trung tính (phải)1.2.5 Một số ứng dụng của miraculin

Chất miraculin của cây Thần Kỳ là hợp chất tạo vị ngọt tự nhiên và không tạo

ra năng lượng nên các nhà khoa học và nhà sản xuất kỳ vọng miraculin sẽ được ứng

dụng rộng rãi trong tương lai để điều trị bệnh nhân cần sử dụng các chất tạo ngọtnhưng hạn chế dùng sucrose như bệnh tiểu đường, bệnh béo phì Hơn nữa, vị ngọttự nhiên của miraculin giúp bệnh nhân ung thư cải thiện chế độ dinh dưỡng hoặctạm thời làm mat vi dang của thuốc khi người bệnh hay trẻ em phải điều trị bang

những thuốc rất đăng Bên cạnh đó, cây Thần Kỳ cũng là một loại cây cảnh tuyệtđẹp với quả sai, chín đỏ rực khắp cây và được nhiều người ưa thích.

Mỹ là nước có ý tưởng đầu tiên trong việc sử dụng miraculin cho thực phẩmcông nghiệp, tuy nhiên Nhật là nước sử dụng thực phẩm từ miraculin pho biến hon.Tại Tokyo, Nhật Bản, có quán cà phê phục vụ món "cà phê miraculin" Khách uốngkhông cần dùng đường hoặc chất tạo ngọt tổng hợp khác mà dùng quả cây kỳ diệudo hãng "Namco" cung cấp Tại Nhật, quả Thần Kỳ được dùng hỗ trợ những ngườitiêu đường và ăn kiêng [68]

Từ năm 2008, Bệnh viện Mount Sinai Medical Center tai Miami ở bangFlorida (Mỹ) bắt đầu nghiên cứu hiệu quả của quả Thần Kỳ trong việc khôi phụccảm giác ăn ngon cho bệnh nhân ung thư Các gai vị giác trên lưỡi của bệnh nhânung thu bị ton thương nặng khi điều trị hóa chất khiến họ chán ăn, chán ăn khiếnbệnh nhân có thể sụt cân, suy dinh dưỡng, làm giảm khả năng của hệ miễn dịch vàchức năng cân bằng điện giải của cơ thể [69] Cơ quan Dược phẩm và Thực phẩmHoa Kỳ (FDA) cũng quyết định xem xét lợi ích của cây Thần Kỳ trong phòngchống bệnh tiểu đường và béo phì ở nước này FDA đang chờ các nghiên cứu kỹlưỡng và trên diện rộng hơn tiến hành từ năm 2009 đến nay Hiện nay, theo FDAnhững chế phẩm có liên quan đến quả Thần Kỳ đều được dán nhãn là nhóm “thựcphẩm bồ sung” (dietary supplement) thay vì “chất làm ngọt” (sweetener)

Tại Việt Nam, cây Thần Kỳ chưa có tên trong danh mục cây thuốc và chưa cócông trình nghiên cứu công dụng của quả Cây Than Kỳ chủ yếu được trông làm

cây cảnh và thu hoạch quả chín Cây con được trồng từ hột, tuy nhiên hột cây ThầnKỳ là loại hột có chứa dau nên gây khó khăn trong quá trình nảy mam và bảo quảnhột.

1.3 Các yếu tố anh hướng đến sự hình thành và phát triển hột của cây có dầu1.3.1 Sự hình thành và phát triển hột

Trong chu trình sinh sản của thực vật cấp cao, chéi sinh trưởng được biệt hóathành chôi sinh sản dưới sự ảnh hưởng của các yếu tổ nội sinh và ngoại sinh Khichổi hoa được hình thành và phát triển đầy đủ các thành phan, quá trình thụ phan vàthụ tinh xảy ra, hột được hình thành.

Hột ở trạng thái tiém sinh: hàm lượng nước của hột rất thấp, mọi hoạt động

sống của hột đều ở mức tối thiểu.Hột là kết quả thụ tinh của trứng, được tạo chủ yếu bởi phôi và các chất dự trữ.Phôi và các chất dự trữ được bao bọc bởi lớp vỏ hột Phôi ở trạng thái phát thé (trừhột lan với phôi chưa phân hóa), bao gồm các cơ quan dinh dưỡng của cây con: rễmam, thân mầm và chéi mầm [12]

Cùng với sự phát triển của hột, nguồn dinh dưỡng và hàm lượng hormon cũngđược tích lũy ở trong hột Những hormon chính có trong hột là: auxin, cytokinin,gibberellin và acid abscisic Những hormon này xuất hiện đóng vai trò quan trọngtrong quá trình sinh trưởng và phát triển của cả quả và hột [18]

1.3.2 Thời kỳ miễn trạng của hột

Mién trạng (sự ngủ) là trạng thái sinh học mà trong đó hột có khả năng sốngnhưng không nảy mam trong điều kiện môi trường thích hợp cho sự nảy mam [12]

Có 2 dạng miên trạng chính là miên trạng sơ cấp và miên trạng thứ cấp.Miên trạng sơ cấp là trạng thái miên trạng được thiết lập trong giai đoạntrưởng thành của hột [12].

Miên trạng thứ cấp là trạng thái miên trạng của trụ thượng diệp không đượcgỡ đồng thời với sự ngủ của rễ mam, thậm chí không thé gỡ khi rễ mầm chưa pháttriển đầy đủ Miên trạng thứ cấp có thể được cảm ứng bởi các điều kiện khôngthuận lợi trong sự nảy mam như: nhiệt độ quá cao, ánh sáng hay tối không thíchhợp, thừa CO; [12|.

Sự ngủ do vo hột là ngăn chặn va kiềm hãm sự nảy mam bởi lớp vỏ Sự ngủdo phôi có nguồn gốc trong chính phôi, không thé được gỡ bởi các xử lý trên vỏ

[12].

Hột có miền trạng so cấp Ánh sáng, nhiệt

độ, hóa chấtMôi trường, kiểu gen ảnh Ánh sáng, nhiệt R R CA

hưởng đến sinh lý hột độ sau khi chín Hột không miễn trạng

Ỷ ¬ Hot nảy mam

Hot trưởng thành Hột có miền trạng thứ câp

A

Môi trường, kiểu

gen ảnh hưởng

Hình 1.12 Cơ chế hình thành miên trạng của hột [18]Hột sau khi trưởng thành dưới tác động của các yếu tô môi trường, kiểu genvà sự ảnh hưởng của các điều kiện sinh lý của hột có thé làm cho hột có miên trangsơ cấp hoặc hột không có miên trạng Hột có miên trạng sơ cấp và hột không cómiên trạng có thé dễ dàng chuyển sang dạng miên trạng thứ cấp Ngược lại, dạngmiên trạng thứ cấp dưới tác dung cua ánh sáng, nhiệt độ và hóa chất có thể chuyểnsang hột không có miên trạng và có thé nảy mam trong điều kiện thích hợp(hinh].12) [I8].

Các tác nhân gây hiện tượng miên trạng hột như : ánh sáng, nước, độ cứngcủa vỏ, nhóm chất hóa học, điều kiện sinh lý phôi (phôi chưa trưởng thành) Vì vậy,tùy đặc tính của hiện tượng miên trạng mà có biện pháp phá bỏ trạng thái miêntrạng cho phù hợp, cũng như lợi dụng đặc tính này giúp cho quá trình cất trữ hột cóhiệu quả hơn [27].

1.3.3 Sự nảy mầm của hột cây chứa dầu

Sự nảy mam của hột bat dau khi hột hap thu rất nhiều nước và tăng thể tíchlên một cách đáng kế, có khi đến 200% Kết quả của sự hấp thu nước này làm chophôi giải phóng gibberellin và đây là yếu tố cảm ứng để tong hợp một số các

enzyme thủy giải trong đó có cả amylase Những enzyme này thủy phân nhữngchất dự trữ trong phôi nhũ, cung cấp năng lượng cho sự tăng trưởng của phôi Sựbiến dưỡng của phôi tăng sự gia tăng này làm cho tế bào bắt dau phân cat, tong hợpthêm tế bào chất mới, và tế bào gia tăng kích thước nhờ sự hấp thu nước Phôi tăng

trưởng làm bung vỏ hột ra và nhanh chóng hình thành một cây con, có rễ và thânphân biệt.

es)

tử diệp dan tien

ni diéptrục ha diép trac thương diép

ré con rễ bat định

Vỏ hột trọc ha điệp điệp tiền ị

Hình 1.13 Sự này mầm của hột: (A) nảy mầm thượng địa; (B) nảy mam hạ địaCác đặc tinh quan trọng nhất của sự nảy mam là: hấp thu nước mạnh, hoạttính biến dưỡng mạnh và phát sinh nhiệt mạnh [12] Đặc điểm cau tạo của hột câyThan Ky là loại hột chứa dau, vỏ dày hap thu nước kém cho nên quá trình nảy mầmcó những đặc điểm đặc trưng riêng

Hột của thực vật chứa dầu, bao gồm hột cây thần kỳ (Synsepalum dulcificum)và một số loài cây khác như hột hồng xiêm (Manilkara zapota), hột vú sữa(Chrysophyllum cainito), hột cây Arabidopsis chữa phần lớn chat dự trữ trong hộtlà dầu ở dạng triacylglycerol (TAG) Khi quá trình nảy mam xảy ra, bên trong hộtdiễn ra quá trình biến đối dầu thành đường để cung cấp năng lượng cho quá trìnhphát triển của phôi TAG sẽ cung cấp nguồn carbon và năng lượng cho hột nảymam và sinh trưởng Trong suốt quá trình nảy mam, sinh trưởng và phát triển củahột chất dự trữ TAG trong dau sẽ bị bẻ gãy tạo thành acid béo tự do thông qua sựxúc tác của enzyme lipase Acid béo tự do sau đó được chuyên tới peroxisome tại

đây có chứa enzyme ÿ-oxidase là sản phẩm của acetyl CoA Acid tự do bị phân giảinhằm cung cấp carbon cho quá trình tổng hợp sucrose trong tế bào chất (quá trìnhtân tạo đường) và quá trình sản sinh năng lượng tại ty thé [22, 24, 44, 51].

1.3.3.1 Các yếu tổ nội sinh anh hướng đến sự nảy mam của hộta) Sự trưởng thành và tuổi thọ của hột

Điều kiện đầu tiên để hột nảy mam là sự trưởng thành của mọi thành phâncau tạo của hột: vỏ (vỏ hột, có thé thêm vỏ quả, tùy loài), các mô dự trữ và phôi.Phôi phải hoàn toàn phân hóa về mặt hình thái Tudi thọ của hột là khoảng thời gianmà hột còn sống và giữ khả năng nay mam Thời gian thay đối đáng ké theo loài, từvai ngày cho đến vài năm Độ âm và nhiệt độ cao rút ngăn đáng ké thời gian sốngcủa hột [12].

Hot cây Than Ky có tudi thọ trung bình khoảng 4-6 tuần [48] Tuôi thọ củahột Thần Ky còn tùy thuộc vào các điều kiện lưu trữ

b) Thành phần dự trữ của hộtNgoài những thành phần hóa học như tất cả các mô trong cây Hột còn chứanhiều chất hóa học như các chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng thực vật.Các chất dự trữ được tích lũy là glucid, protein và lipid Ngoài ra, hột còn chứa cácchất hóa học khác có tác dụng điều hòa hoạt động chuyển hóa các hợp chất hữu cơ.Với hột cây Thần Kỳ, lipid được tích lũy nhiều trong hột

c) Chất điều hòa sinh trưởng thực vat

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của hột từ khi thụ phan, các chatđiều hòa sinh trưởng điều hòa sự miên trang và sự nảy mam của hột Sự tương táccua auxin, cytokinin, giberelin (GA), abscisic acid (ABA), ethylene vabrassinosteroid (BR) điều khiến quá trình miên trang và quá trình nảy mam của hội.ABA kích thích quá trình miên trang, ức chế quá trình nảy mam của hột GA giảiphóng miên trạng, kích thích sự nảy mâm của hột và làm mat tác dụng của ABA.Ethylene va BR cũng có tác dụng tương tự GA [41].

Hot ệ Hot nay mam

BGlu |

EREBPHình 1.14 Các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự nay mam của hột [41]

GA : gibberellin ; ABA : abscisic acid ; BR : brassinosteroid1.3.3.2 Các yếu tô ngoại sinh ảnh hưởng đến quá trình nay mam của hột

Sự nảy mâm trải qua rất nhiều những biến đổi rất phức tạp, phụ thuộc vàođặc tính của từng loại hột khác nhau Có hột nảy mam cần trải qua điều kiện nhiệtđộ lạnh (thọ hàn) [52] Tuy nhiên, có những loại hột nảy mầm trong nhiều điều kiện

nhiệt độ khác nhau, có hột nảy mam trong điều kiện ánh sáng tốt, nhưng cũng có

hột nảy mam trong điều kiện thiếu ánh sáng [53] Những yếu tô bên ngoài có tácđộng đến sự nảy mầm của hau hết các loại hột

a) Độ âmNước có vai trò thiết yếu cho sự này mam của hột [12] Hot miên trạng thườngở dạng rất khô, cho nên cần một lượng nước đủ để khởi động chương trình nảymam Nước cung cấp cho quá trình nay mam của hột thông qua quá trình tham thấuqua lớp vỏ hột Nước là nguyên nhân làm cho cau trúc vỏ hột kém bên do quá trìnhthủy giải và giúp cho phôi dễ dàng thoát khỏi lớp bảo vệ để thực hiện quá trình nảymam Sự hút nước của hột xảy ra đồng thời với sự hoạt hóa các chất điều hòa sinhtrưởng giúp cho quá trình nảy mam xảy ra [57]

Hot cây Thần Kỳ có vỏ dày, lớp bên ngoài khó thắm nước nên quá trình hútnước của hột rất lâu, hột hap thu nước chủ yếu là ở vị trí rốn hột nơi hột nhận đượcđịnh dưỡng từ quả khi hột chưa trưởng thành.

b) OxyOxy can thiết cho quá trình trao đối chất khi hột nảy mầm Khi bat đầu nảymam bên trong hột có nhiều hoạt động trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ, một trongnhững quá trình này là quá trình oxy hóa giải phóng năng lượng thông qua hoạtđộng hô hấp Vì vậy, oxy cần được cung cấp từ bên ngoài trong quá trình nảy mầmcủa hột Tuy nhiên, tùy từng loại hột mà oxy can nhiễu hay ít trong quá trình nảymam Có nhiều hột vùi sâu trong đất hay ngập trong nước vẫn nảy mầm được thôngqua lượng oxy được cung cấp rất ít hoặc thông qua quá trình hấp thu nước [57].

Hột cây Thần Kỳ có lớp vỏ cứng ngăn cản quá trình trao đổi khí, vì vậy cần cóbiện pháp kích thích phá bỏ lớp vỏ hột dé phá vỡ sự miên trạng của hot

c) Nhiệt độNhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ trao đối chất va sinh trưởng của tế bào Tùytừng loại hột mà biên độ nhiệt độ khác nhau, phan lớn là nhiệt độ phù hợp với điềukiện sống của cây mẹ Không kế nhiệt độ cần dé gỡ miên trạng của hột, nhiệt độ cầncho sự nảy mam rất thay đồi, từ 3-5°C cho tới 30 — 40°C [12]

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm của hột Thân Kỳ Quá trình nảymam của hột Than Ky trở nên khó khăn hơn do quá trình chuyển hóa dau thành cáchợp chất thứ cấp gây ức chế đến phôi

d) Ánh sáng

Anh sáng cũng có thé được xem như yếu tô khởi động quá trình nảy mam, khihột ngủ Tùy từng loại hột mà thời gian kích thích cũng như cường độ kích thíchhoàn toàn khác nhau Thành phần dự trữ khác nhau của hột trong quá trình nảymam cũng có sự tiếp nhận ánh sáng khác nhau cũng như loại tia sáng kích thích

[45].e) Cac chat héa hoc

Các chất gở miên trạng có tác dụng kích thích sự nay mam: nitrate postasium,calcium, thioure, monoclohidirin, gibberellin, cytokinin va ethylen [ L2, 20]

Các chất cản Sự nay mầm được biết là: KCN, 2,4-Dinitrophenol,hidroxilamin, hidrazid maleic, dẫn xuất của acid cinamic (Cumarin và acid cafeic)và acid abscisic Acid abcisic cản mạnh sự nảy mâm, do kích thích sự ngủ, có trong

vỏ hột hay trái nhiều loài thực vật [12].f) Tác động cơ học

Một số hột (như hột Thần Kỳ) có lớp vỏ bên ngoài khá cứng Vì vậy, các tácnhân tác động bên ngoài như côn trùng ăn mòn lớp vỏ, bi va đập làm bể lớp vỏ hoặcdo những tác động khác làm cho lớp vỏ hột bị thay đối, giúp cho hột dé dàng hapthụ nước, tăng hoạt động hô hap làm cho quá trình nảy mam xảy ra dễ dàng

1.4 Tình hình nghiên cứu cây Than Kỳ1.4.1 Các nghiên cứu trong nước

Đến nay, các nghiên cứu về cây Than Kỳ ở trong nước chi gồm nghiên cứucủa Trần Danh Thế và cộng sự (4/2009) bước đầu điều tra một số đặc điểm sinh họcthích nghi của cây Than Kỳ với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu Việt Nam, hoạt chatmiraculin trong qua Than Ky được chiết trong dung dịch muối loãng và tinh chếbăng phương pháp sắc ký trao đối ion Miraculin qua tinh chế được ghi nhận là cókhả năng biến đối vị chua của acid citric trở nên ngọt tương đương với độ ngọt củađường sucrose 0,4M [7]

1.4.2 Các nghiên cứu ngoài nướcNăm 1968, miraculin được ly trích đầu tiên bởi Giáo sư Kenzo Kurihara vàTiến sĩ Lloyd Beidler (đại học Florida) Thịt quả quả Thần Kỳ đông khô đồng nhấttrong dung dịch đệm pH=10,5 và tinh sạch qua cột Sephadex G-75 Miraculin thuđược có trọng lượng phân tử 44.000 dalton Điều này cho thay miraculin thu đượccòn nhiều tạp chất, làm miraculin kém tinh khiết và giảm vị ngọt [42]

Năm 1983, J.N.Brouwer nghiên cứu tác dụng của miraculin lên thần kinh khinâu (Macaca mulatta) Các hoạt động của day thần kinh được chi nhận với sự kíchthích của lưỡi với nhiều chất ngọt: acid, NaCl, quinine hydrochloride ở khi nâu đãgây mê Lưỡi được xử lý trước với 0,3mg - 5mg miraculin, ghi nhận cho thấy có sựtăng gấp đôi phản ứng than kinh với các acid Miraculin ở hàm lượng 0,lmg tạo raphản ứng thần kinh yếu hơn [35]

Nam 1988, Sarroch Theerasilp and Yoshie Kuriharas đã ly trích và tinh sạchmiraculin Theo nghiên cứu này, thịt quả Than Kỳ đông khô được bố sung nước,thêm dung dịch muối NaCl 0,5M vào dé tách chiết miraculin, sau đó tủa phân đoạn

băng (NH,)2SO, đến bão hòa, tủa này hòa tan trong đệm phosphate Dịch thu đượctinh chế bằng sac ký trao đối ion và sắc ký ái lực, sau đó kiểm tra bằng điện di SDS-Page thu được vạch hiện diện miraculin có kích thước 28.000 dalton, không phải40.000-48.000Da như các báo cáo trước đó Miraculin tinh sạch có chứa 13,9%đường trong đó có glucosamine, manonose, galactose, xylose, frucose với tỷ lệ lầnlượt là 3,03 : 3,00 : 0,69 : 0,96 : 2,12 [55].

Năm 1989, Sarroch Theerasil va cs sử dụng phương pháp sắc ky long cao ápphân tích cấu trúc và trình tự amino acid của miraculin Theo nghiên cứu này,miraculin là mot glycoprotein có trọng lượng phân tử 24.600 dalton, được tạo thànhbởi một chuỗi phân tử đường (3 4kDa, 13,9%) và một chuỗi protein gom 191 aminoacid Các thành phần đường có trong miraculin: glucosamie (31%), mannose (30%),galactose (7%), xylose (10%), fucose (22%) [56].

Cac phuong phap ly trich va tinh sach miraculin cua Theerasilp va Kurriharachính là co sở cho các nghiên cứu sau nay.

Năm 1990, Takahashi N và cs đưa ra cấu trúc monomer N-glycosyl và dimercủa miraculin Cau trúc của mỗi oligosaccharide được cô lập va phân tích bằng sắcký lỏng cao áp (HPLC) với cột amidesilica [61].

Năm 1993, Kamimura và cs nghiên cứu phương pháp ly trích miraculin.Miraculin thu được giữ được hoạt chất và độ 6n định cao Theo phương pháp này,miraculin được ly trích băng cách sử dụng dung dịch đệm NaCl 0,5M có pH từ 3,5-5,5 có thể loại bỏ tạp chất và các chất có tính acid trong thịt quả mà không cần xử lýtrước băng nước Kết quả thu được miraculin có độ tinh sạch cao và ôn định.Phương pháp này khắc phục nhược điểm của Sarroch Theerasilp và YoshieKurihara là thịt quả xử lý trong thời gian dài có thé ảnh hưởng đến độ 6n định củamiraculin [38].

Năm 1995, Masuda và cs xác định trình tự mã hóa cDNA của miraculin.cDNA mã hóa tiền thân của miraculin gồm 220 amino acid Kết quả phân tíchNorthern blot cho thấy mRNA mã hóa cho miraculin được tìm thấy trong quả ThầnKỳ lúc 3 tuần sau khi thụ phan [43]

Năm 2006, Chizuko Yamamoto va cs mô tả hoạt động vùng vỏ não của người

đối với sự thay đổi vị giác từ miraculin Các chat dùng để kích thích vị giác là acidcitric 0.05M va sucrose 0,5M O nong độ nay, acid citric chua va khó chịu, sucrosengọt và dé chịu Kết qua cho thay, khi chưa ăn qua Than Ky, đáp ứng kích thích vớisucrose chậm hơn so với acid citric, con sau khi ăn quả Thần Kỳ đáp ứng kích thíchvới acid citric và sucrose tương tự nhau [21].

Với những giá trị và lợi ích mà miraculin mang lại, trong những năm từ 2006đến nay các nhà khoa học đã nghiên cứu nhăm thu nhận miraculin hàm lượng caobăng phương pháp chuyển gen miraculin lên rau diép, cà chua, khoai tây, vi

khuẩn

Năm 2006, Hyeon-jin Sun và cs thực hiện nghiên cứu chuyển gen miraculinlên cây rau diép Một gen mã hóa tong hợp miraculin được kiểm soát bởi cácpromoter được chuyên lên cây rau diếp Biểu hiện gen này trong rau diép biến doigen dẫn đến sự tích tụ lượng protein miraculin trong lá Miraculin biểu hiện trongrau diếp biến đổi gen có có khả năng gây ra vị ngọt Kết quả này chứng minh việcsản xuất miraculin ở thực vật ăn được có thể là chiến lược thay thế để tăng lượngprotein nay [58].

Nam 2007, Keisuke Ito va cs nghiên cứu chuyển gen miraaculin vàoAspergillus oryzae Gen mã hóa tong hợp miraculin được chuyển vào chủngAspergillus oryzae NS4 Sự bién nap va biểu hiện tiết ra miraculin với ham lượng 2mg/l Kết quả cho thay hàm lượng 0,5 mg/l miraculin tái tổ hợp tương đương với0,lmg/ml miraculin tự nhiên khi khảo sát sự thay đổi vị giác ở pH=3.0 [34]

Năm 2008, Toshiyuki Sugaya và cs thành công trong việc chuyển genmiraculin trên cây dâu tây Hàm lượng miraculin trong qua dâu chuyền gen là 0,5-2 g/ø thập hơn so với trong quả Than Kỳ (145yg/g quả tươi) [63]

Từ năm 2008-2010, các nhà khoa học trên thé giới thực hiện nhiều nghiên cứuchuyển gen miraculin lên E.Coli, Saccharomyces cerevisiae, cây rau diép, cây càchua Trong các đối tượng thực vật được chuyển gen tổng hợp miraculin thì cà chuađược coi như là thành công nhất, mặc dù hàm lượng miraculin cà chua biến đổi genthấp hơn 2 lần so với miraculin tự nhiên có trong quả Than Kỳ [36, 40, 46, 59, 62,65].

Năm 2008, K E Ogunsola và C O Ilori tiến hành nuôi cay in vitro cây ThanKỳ bằng phôi và chổi nách Hột được khử trùng bang ethanol 70% trong 5 phút,javel 10% trong 20 phút, javel 5% trong 10 phút, sau đó tách lay phôi và nuôi cấy.Bang trong môi trường MS có bồ sung auxin và cytokinin Kết quả phôi đã đượctái sinh trong MS có bố sung 0,1 mg/l NAA + 02 mg/l BAP Khảo sát sự nảy mầmtừ phôi với trong môi trường MS có bố sung 0.6 - 3,0 mg/l BAP + 0,1 - 0/2 mg /1NAA, trong đó 3,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA nay mam với số lượng cao nhất [37].

Năm 2008 - 2010, Antonella Paladino và cs nghiên cứu mô hình phân tử củamiraculin và giải thích cho giả thuyết cơ chế vị ngọt của miraculin Mô hìnhmiraculin gồm 6 cysteine được liên kết bởi ba cầu nối disulfide (Cys46-Cys91,Cys147-Cys158 và Cysl5I-Cysl54) Hai histidine là His29 va His59 trong phantử miraculin đóng vai trò quan trong trong các hoạt động làm thay đổi vi giác Kếtquả này đồng ý với giả thuyết cho rằng protein ngọt hoạt động làm sai lệch địnhhướng các thụ thé cảm nhận trên gai lưỡi [14, 15]

Năm 2009, Narendra Duhita cùng cs tiễn hành tinh chế miraculin từ qua ThanKỳ bang cách sử dung sắc ký cột cô định với nickel - IMAC (HiTrap IMAC HP, GEHealthcare) với đệm Tris-HCI và 0,5 M NaCl ở pH 7,2 Phương pháp này thu đượcdịch chiết miraculin có tính 6n định Sau đó, các mẫu chứa miraculin kiểm tra vớisắc ký lỏng cao áp được thực hiện trên cột RPC (0.46x15 cm, GE Healthcare) đểkiểm tra độ tinh khiết Sau khi chạy với đệm acetate pH 5, 1 ml mẫu đã được chovào cột với acid trifluoroacetic 1% Quá trình tach rửa được thực hiện băng cách sửdung gradient tuyén tinh nong độ aceton (20 - 70%) có chứa acid trifluoroacetic 1%với tốc độ dòng chảy của | ml / phút va độ hap thụ được do ở bước sóng 280 nm

Trình tự chuỗi N- amino acidcủa protein thu nhận được xác định là Pro, trình tự này phù hợp với chuỗi amino acid của miraculin [47]

Asp-Ser-Ala-Năm 2010, Tadayoshi và cs nghiên cứu cho thay rang miraculin tồn tại nhiềunhất trong vùng gian bào của quả Hai giai đoạn khác nhau: quả xanh 5-7 tuần saukhi thụ phan và quả chín đỏ hơn 9 tuân sau khi thụ phan được nghiên cứu vùng tồntại của miraculin dưới kinh hiển vi điện tử Kết quả cho thay miraculin tiết ra và dichuyền từ bộ máy golgi qua thành tế bào va tích lũy ở giữa các lớp tế bào trong quả

Than Kỳ [60].Năm 2011, Ayako Koizumi cùng cs nghiên cứu rõ về cơ chế hoạt động làmthay đổi vị giác của miraculin Theo nghiên cứu này, miraculin kích hoạt các thụ théhTTIR2 va hT1R3 và giảm hoạt tính khi pH giảm từ 6,5- 4,8 Sự tương tac cuamiraculin xảy ra tại vị trí amino acid từ 448 đến 494 trên thụ thể hT1R2 [16]

1.4.3 Tình hình trồng trọt và phát triển cây Thần Kỳ ở Việt NamCây thần Cây Than Kỳ có nguồn gốc từ Tây Phi với khí hậu nang nóng ViệtNam là một nước nhiệt đới vì vậy rất phù hợp dé trồng cây Than Kỳ Mặc dù vậy,cây Thần Kỳ chỉ mới có mặt ở Việt Nam vào năm 2006 do một thương gia ngườiĐài Loan mang đến trồng tại huyện Hóc Môn (TP HCM) và từ đó phong trào trồngcây này như một loại cây cảnh tuyệt đẹp với quả sai, chín đỏ rực khắp cây đượcnhiều người ưa thích Hiện nay, cây Thần Kỳ đươc trồng chủ yếu ở quận 12, CủChi, Hóc Môn, xã An Bình (Vĩnh Long) Tuy nhiên, số lượng cây trưởng thành vàcó quả không nhiêu

Cây Thần Kỳ chỉ mới du nhập vào Việt Nam khoảng 6 năm trước Ở ViệtNam, loài cây này chưa có trong danh mục cây thuốc và chưa có công trình nghiêncứu công dụng của qua Vì vậy, có thé nói đây là giống cây mới, có giá trị sinh hoc,y học và chưa được trồng phô biến rộng rãi ở nước ta, cho nên những nghiên cứutrên cây Thần Kỳ, đặc biệt là tính chất “kì điệu” của miraculin trong quả Thần Kyvà việc ứng dụng còn rat hạn chế Việc đánh giá chat lượng của qua Than Ky thôngqua thành phan hóa học và tính chat của miraculin chưa được quan tâm nhiều Xuấtphát từ thực tiễn trên chúng tôi tiễn hành xác định các thành phần hóa học có trongthịt quả Than Kỳ, trích ly và tinh sạch miraculin nhằm làm cơ sở khoa học chứngminh giá trị dinh dưỡng và tinh năng “kỳ diệu” của quả Than Ky Đồng thời khảosát một số yếu tố ảnh hưởng lên sự nảy mâm của hột cây Thần Kỳ để có thể mởrộng qui mô trồng trọt cây Than Ky ở Việt Nam trong tương lai

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu — hóa chất — thiết bị2.1.1 Vật liệu

Quả Than Ky (Synsepalumdulcificum) được thu hai tại vườn câythuộc ấp Chánh, xã Tân Xuân, huyệnHóc Môn, chọn quả chín đỏ, khôngsâu bệnh, không dập nát Quả ThầnKy được tách phan thịt và hột Phanthịt quả được đông khô và bảo quản ở

-4°C cho tới khi sử dụng cho các thí

nghiệm.

2.1.2 Hóa chấtBảng 2.1 Danh mục hóa chất

Hình 2.1 Quả Than Ky sử dung trongcác thí nghiệm

Hóa chatAcid citric AlbuminAcid sunfuric Dowex HCR-S

Trinatricitrate Bio gel-P30

NaCl Thang chuẩn protein -— prestainedPhenol 5% protein marker (BioRad)

Kali permanganateSat (IIT) sunfateThuốc thử FehlingChi acetate 1%Natri sufate bao hoaAcid citric thực phamMagie sterate

AcrylamideBis-acrylamideSDS

2-mercapto ethanolAmonium persulfateGlycerol

TEMED

Folin