Luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học: Thiết lập chủng Bacillus Subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm

Do làloại hàng hóa đặc biệt nên quy trình kiểm nghiệm cũng được quy định nghiêm ngặt.Chủng vi sinh vật chuẩn sử dụng phải theo quy định của Dược điển hoặc các chủngcó đặc tính tương đươn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

HOÀNG THỊ KIM THOA

THIET LAP CHUNG BACILLUS SUBTILIS DOI CHIEUSU DUNG TRONG KIEM NGHIEM DUOC PHAM

Chuyên ngành Cong nghệ sinh họcMã số ngành: 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HO CHÍ MINH, tháng 07 năm 2013

Thanh phân Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vi của Hội dong cham bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên

ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nêu có).

CHỦ TỊCH HỘI DONG TRƯỞNG KHOA

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Hoàng Thi Kim Thoa MSHV: 11310627Ngày thang, năm sinh: 08/03/1988 - «<< «<5 Nơi sinh: Quảng Ngãi

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học - - - - -+- Mã số : 604280

I TEN DE TÀI: Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểmnghiệm dược phẩm

Il NHIEM VU VÀ NỘI DUNG: Phân lập Bacillus subtilis từ các mẫu thuốc bị

nhiễm, đất, không khí Định danh bang phương pháp sinh hóa (sử dung kit) vàsinh học phân tử (PCR và giải trình tự 16S rADN) Kiểm tra đặc tính sinh học củachủng phân lập phù hợp với yêu cầu của chủng đối chiếu trong kiểm nghiệm dượcphẩm Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô và theo dõi tính 6n định ditruyền sau bảo quản

HI NGÀY GIAO NHIEM VU : 02/07/2012

IV NGAY HOAN THANH NHIEM VU: 21/06/2013V CAN BO HUONG DAN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Tp HCM, ngày 15 tháng 07 năm 2013

CAN BO HUONG DAN CHU NHIEM BO MON DAO TAO

(Họ tên và chữ ky) (Họ tên và chữ ký)

TRUONG KHOA

(Họ tên và chữ ký)

của rất nhiều người Người dau tiên tôi muốn cám ơn đó là ông xã — người đã luônở bên cạnh chăm sóc, động viên và tạo điều kiện tốt nhất để em được học tập và làm

việc Cám ơn ông xã và gia đình 2 bên đã luôn yêu thương, chăm sóc và giúp đỡ

con.Một người thầy nhưng cũng gan gũi như một người bạn đã hướng dan, động viên vàtạo cho tôi niềm say mê nghiên cứu từ khi tôi còn là một cô sinh viên chưa biết gì,đó chính là Cô Nguyễn Thúy Hương Em rất biết ơn và luôn kính trọng cô Hi vọngem sẽ còn được đồng hành cùng cô, được nghe những lời giáo huấn đây tâm huyết

của cô.

Lời cám ơn nữa tôi muốn gửi tới các đồng nghiệp ở phòng Khoa học và Đào tạo,đặc biệt là Tổ nghiên cứu và Khoa Vi sinh — Viện kiểm nghiệm Thuốc TP Hỗ ChíMinh Cám ơn các anh chị đã đồng hành, giúp đỡ và luôn quan tâm tới em trong

nghiệm dược phẩm, chúng tôi tiến hành phân lập từ nhiễu nguồn khác nhau: đất,không khí, các mẫu dược phẩm bị nhiễm Sau quá trình sàng lọc, kiểm tra các đặctính sinh hóa, định danh băng kit API 50CHB, API 20E va kit Vitek thu được 2chủng Bacillus subtilis PL1, VT1 với mức độ tương đồng là 97% và 99.5% đối vớikit API và 98%, 99% đối với kit Vitek Tiến hành chay PCR, giai trinh tu doan 16S

rADN, so sánh với các trình tự trên ngân hang dữ liệu gen (NCBI), chương trình

BLAST cho thay chủng Bacillus VT1 tương đồng với chủng Bacillus subtilis subsp.subtilis str 168 chromosome, chủng Bacillus PLI tương đồng với ching Bacillussubtilis BSn5 chromosome với tỉ lệ tương đồng đều là 99% Sau đó kiểm tra các đặctính sinh học đáp ứng yêu cau trong kiểm nghiệm dược phẩm băng phương phápkháng sinh đồ và kiểm tra trên các mẫu thuốc thực tế tại Viện kiểm nghiệm Thuốcthành phố Hỗ Chí Minh Kết quả cho thay cả 2 chủng VT1 và PL1 đều nhạy cảm

với các loại kháng sinh Erythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat,

Erythromycin estolat và Spiramycin Các chủng sau khi đã kiểm tra đáp ứng đượcyêu cau sẽ tiễn hành nghiên cứu khảo sát quá trình bảo quan bang phương phápđông khô Đối với cả hai chủng VT1 và PL1, môi trường bảo vệ tối ưu là Skim milk

12% + Trehalose 7% + Na glutamate 5%, thời gian đông lạnh 2 giờ, nhiệt độ đông

lạnh -80°C thì tỉ lệ sống khoảng 10° cfu/ml Sau đó đông khô ở -52°C, 36 giờ thì đạtđược tỉ lệ sống tương ứng với chủng VT1 khoảng 10’ cfu/ml và khoảng 10° cfu/mlđối với chủng PLI

ABSTRACT: To establish reference strain of Bacillus subtilis using in qualitycontrol of drugs, ten of Bacillus subtilis strains were isolated from soil, air andcontaminated pharmaceutical products Identification of the bacteria was performedby biochemical tests and molecular techniques Two isolated strains were identifiedas Bacillus subtilis PL1, VT1 with identification 97%, 99.5% based on the results ofphysiological and biochemical tests using kit API 50CHB, API 20E and 98%, 99%when using Vitek kit PCR amplification and 16S rDNA sequence analysis weretesting and compared with Bacillus subtilis ATCC 6633 Analysis of DNAsequences and homology was completed with the BLAST server of the NationalCenter for Biotechnology Information This molecular analysis showed that: thestrain of Bacillus VT1 is homogolous with Bacillus subtilis subsp subtilis str 168chromosome, the strain of PLI is homogolous with Bacillus subtilis BSn5chromosome with identification 99% Then, test the sensitivity of the isolatedstrains to a variety of antibiotics with drugs at Institute of drug quality control HoChi Minh city The results that two isolated strains so sensitivity withErythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat, Erythromycin estolat vaSpiramycin Then preservation of two strains by freeze drying With 2 strains VT 1and PL1, media preservation optimize is Skim milk 12 % + Trehalose 7% + Na

glutamate 5%, freeze 2 hours at 80°C, survival rate 10° cfu/ml When drying at 52°C, 36 hours, survival rate is 10’ cfu/ml with VTI strain and 10° cfu/ml with PL1

-strain.

bat kì sự sao chép kêt quả nao tôi sẽ hoàn toàn chịu trách nhiệm.

DANH MỤC HINH cccecccccccccescececcescecseccsceccsecsesscsecsevscsacecssecacacsaseesaceaseavaceacensees VDANH MỤC ĐỎ TT HỊ, - G1121 21 5895653 119151111 1v ng ng ng c VPHAN MỞ ĐẦU -c << 212221 5111112111 51110101111 111010101 111101010201 01 01010 10 g0 |CHƯƠNG 1: TONG QUAN SG co 212 91 91950191111 5111121 HH ng ng sở 31.1 Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis c5 55252 5222 2 £+E+ecEccsrseeeree, 31.1.1 Lịch sử phát triỂn ¿- ¿ ¿+ %9 151 1E 115151 111 111111 E111 re 3

1.1.2 Phan loại - E5: 3S 11115111 11111 111111115 1115111111101 11 0101010111 3

1.1.3) Đặc điểm phân bồ ¿- 5c E21 SE E111 1 5 1151112115 11111111 111111 re 31.1.4 Đặc điểm hình thái - G1261 9193193 E1 1E 2kg ng kg ng ri 41.1.5 Đặc điểm sinh hóa G- c1 E251 21 9193151111 91 121kg ng kg ng ri 4

I.2_ Các phương pháp định danh Vi sinh Vat 5555555 - 5+2 rres 5

1.2.1 Phương pháp truyền thống ¿ ¿6 S222 212123 1E E3 1 1 E11 crrrrei 5

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tỬ E3 1111 Y9 Hee 71.2.3 Phương pháp PCR — Giải trình tự Ø€n - 5< keeeske 10

1.3 Một số phương pháp bảo quản vi sinh Vật ¿2 2 2+2 2 £+£+E+Ezezszzesesed 141.3.1 Phuong pháp cấy truyền Vi sinh vật - ¿5 5< S+ SE cv 141.3.2 Giữ giống dưới lớp dầu khoáng - + 2222222 +e2e 2e £e£ccsrseevee 151.3.3 Giữ giống trong Cát - c1 S211 ST 112111111111 01 1111111 151.3.4 Giữ giống trên silicagen ¿+55 2+ Set SE E111 212121111121 re 151.3.5 Giữ giống trên gelatin c.cccccccccccccsescscsescesesssesesescsssescscsesesesesesseseseecseens 15

1.3.6 Phuong pháp đông khô eee ccccccceceeeeeeaneeeeeseeeeeeeeeececeeseeeeeenaeaas 161.3.7 Phuong pháp bao quan lạnh Sau eeeseneneeeeeeeeeeseeccecceeeeeeeeeeeanaas 20

1.4 Các nghiên cứu trong va ngoài nước về hướng của dé tài - 21CHUONG 2: NGUYEN VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP - 55+: 25

2.1 Vật liệu thí nghiệm wo ¿<< E121 E111 1 121 1 E111 5111111111111 0101011 ve 252.2 Nội dung nghiÊn CỨU - -ĂĂ 5S 1010103009999 99 9n ng vn 26

2.3 Phương pháp thực hiện dé tài -. - ¿+5 5S E132 3 5 5111 1E 151111 1E re.27

2.3.1 Phân lap Bacillus sWfIÏIS SH SH He 27

2.3.2 Định danh Bacillus subtilis bang phương pháp sinh hóa 282.3.3 Định danh Bacillus subtilis bang phương pháp sinh học phân tử 302.3.4 Kiếm tra đặc tính sinh hoc đáp ứng yêu cau trong kiểm nghiệm dượcphẩm - - c2 Q 0200102201211 11211 11 11 TK TT kh Thy chà nhe H 332.3.4.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh bằng phương phápF71 5871/1/8;/2BRRRRREREREREREREE 342.3.4.2 Thu nghiệm trên mot số mẫu thuốc kháng sinh .««« 35

2.3.5 Khảo sát phương pháp bao quan đông khô - +5 + +2 35

2.3.5.1 Khảo sát môi trường chất bảo VỆ cv ca 36

2.3.5.2 Khao sát thời gian đông lạnh .«- 362.3.5.3 Khao sát quá trình đông khÔ ca 37

CHUONG 3: KET QUÁ VA BAN LUẬN G6 + k2 SE E2 vs cvseesxe 38

3.1 Phan lập Bacillus SHfHÏ1S on ng 38

3.2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóa - 393.3 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử 443.4 Kiểm tra đặc tinh sinh hoc đáp ứng yêu cau trong kiếm nghiệm dượcphẩm ree 493.4.1 Kiểm tra khả năng nhạy cảm với kháng sinh - 2+ 2 2 25555552 493.4.2 Thử nghiệm trên một số mẫu thuốc kháng sinh 5-2 2 + 55: 51

3.5 Khảo sát phương pháp bao quản đông khô S5 S S132 <<£<+2 53

3.5.1 Xây dựng đường chuẩn và đường cong sinh trưởng của 2 chủng phân lập

1 “j1 533.9.1.1 Đường cong SIHH [FHỞN nhe 53

3.9.1.2 Đường Chuẩn c 5+ ke SE E11 S11 11111111 111111121 ckr 543.5.2 Khảo sát môi trường chất bảo VỆ - 6 22c 2eS* S2 EtErkekerrrererred 55

3.5.3 Khảo sát thời gian đông lạnh + S11 1x Y9 ren 573.5.4 Khảo sát quá trình đông khô - E111 119 9 1v ve veg 58

3.6 Khảo sát điều kiện bảo quan sản phẩm đông khô - 5555: 593⁄7 Kiếm tra đặc tính chủng sau quá trình đông khô - 2-2-2 eects 60

CHUONG 4: KET LUẬN VÀ KIÊN NGHI ccccccsceccececcecscescesceceesscesceevecsacenees 63AL K@tluan icccccccccccccsceccescscecssecscssceeccssccscecvscsacesceessesscsecssssccacavscvaceacscaevsceaeeess 63A.2 Kiến nghiv.cccccccccccccccscscsscscscscssssescscsesescscscscsesscscscsesssscscsesesssssscscsesssssscsesessss 63TAI LIEU THAM KHẢO) - G- SG S1 13821158 5895353 18 9195191 91 H1 1n ng cọ 64

DANH MỤC BANG

Bang 1 1 Các phản ứng sinh hoá của Bacillus sUfIÏHS - «<< 53s eees 5

Bảng 1 2 Một số phương pháp phân loại Vi sinh vật - 5-5 2 55 5s <<: 7Bảng 1 3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử

¬ Ắ.Ắ.Ắ 9

Bảng 1 4 Thành phan phản ứng PCR - ¿2 252 S2 SE +E2E‡E£E2E£E E2 £zerxererred 12Bảng 1 5 Quy mô một số bộ sưu tập giống trên thế giới - ¿5555555 23Bảng 2 1 Thành phan phản ứng PCR - c2 c2 S2 221cc 32Bảng 2 2 Danh mục các loại kháng sinh và phương pháp thực hiện 34

Bảng 2 3 Môi trường chất bảo vệ của Bacillus subtilis - 22 36Bang 3 1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng VT1 và PLI 41

Bảng 3 2 Kết quả định danh bang kit Api 20E chủng VT1 và PLI 41

Bảng 3 3 Kết quả định danh bang kit Api 50 CHB chủng VT1 và PLI 42

Bảng 3 4 Kết quả định danh bang kit Vitek chủng VT1 và PLI - 43

Bang 3 5 Kết quả giải trình tự gen mã hoá chol6S rARN của 2 chủng VT1 và PLIii 45

Bảng 3 6 Kết quả định danh -¿ ¿52 51222321 2E 2528 1E EEEEEEEEEEEEEEEErkrrreee 48Bảng 3 7 Các đặc tính sinh học của chủng Bacillus subtilis trong kiểm nghiệma0 :iI 49

Bang 3 8 Đường kính vòng vô khuẩn của các chủng vi khuẩn - 50

Bang 3 9 Kết quả kháng sinh đồ của chủng B subtilis VT1 và PLI 51

Bang 3 10 Đường kính vòng vô khuẩn ching Bacillus subtilis với kháng sinhErythrOMycin HT TT ng nh 52Bang 3 11 Đường kính vòng vô khuẩn ching Bacillus subtilis với kháng sinhSDITAIVCIH SG SG Q9 Thìn và 53Bang 3 12 Nông độ vi khuẩn chủng VT1, PLI trước và sau đông lạnh 55

Bang 3 13 Nong độ vi khuẩn trước và sau đông lạnh trong 2 giờ và 16 giờ 57Bảng 3 14 Nông độ vi khuẩn VT1 và PLI sau đông khô - 25s 5+: 58Bảng 3 15 Nong độ vi khuẩn VTI và PLI sau thời gian bao quan 1 tháng ở các

nhiệt độ khác nhau - - - << c0 000006033010 110110 111101111 1111 11111 1111 11v ch 59

Hình | 1 Cac bước trong phan ứng PCTR - -<<-<- II

Hình 1 2 Bản đồ primer cho gen 16S rARN - c2 cà: 12

Hình | 3 Các bước của quá trình đơng khơ -. 18

S000 000.)8ư 0°uiadiiẳắảảä4Ả 32

Hình 2 2 Điện di trên gel aØarOS€ che 33Hình 3 1 Chung vi khuẩn phân lập trên mơi trường lỏng TSB và mơi trường thạchiiiiiiddấấddddddii'Á.Ÿ-.ỐỐỐỐỔỞ - 38

Hình 3 2 Hình thái khuân lạc VT1 và PL1 trên mơi trường MYP 38

Hình 3 3 Chủng VT1 và PLI dưới kính hiễn vi ¿ 2 + + 22x22 +s2ecscscee 38Hình 3 4 Chung VT1 và PLI dưới kính hién vi điện tử quét 39

Hình 3 5 Phản ứng Catalase của chung VT1 và chủng PLI 39

Hình 3 6 Kit Api 50 CHB va Api 20 E trước và sau khi ủ 24 giờ - 39

Hình 3 7 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PLA 44

Hình 3 10 Cây phan loại của chủng VT 1 S1 Y1 ng 46Hình 3 11 Cây phân loại của chủng PUI S11 111555355 3 x2 47Hình 3 12 Vịng vơ khuẩn của các chủng B subtilis ATCC 6633, PLI, VTI1 50

Hình 3 13 Vịng vơ khuẩn của chủng Bacillus subtilis VT1 với kháng sinhSpiramycin và chung Bacillus subtilis PL1 voi Erythromycin 52

Hình 3 14 Kết quả điện di chủng Bacillus subtilis VT1 và PL1 sau đơng khơ 61DANH MUC DO THI

Đồ thi 3 1 Đường cong sinh trưởng của chủng VT 1 và PLI - -5¿ 54Đồ thị 3 2 Đường chuẩn của chủng PL cecccesesesescessescsesescscssssesesesescsescsesesesees 54Đồ thị 3 3 Đường chuẩn của chủng VT l - - ¿5c tt 2e 3E 2 EErrrkrrerrrererred 55Đồ thị 3 4 Nong độ vi khuẩn sau đơng lạnh ee eeeecccccccecneeeseeeeeceeeeeeeeeeeeeeeeeas 56Đồ thị 3 5 Nong độ vi khuẩn sau đơng lạnh theo thời gian - 5: 58

Thuốc là một loại hàng hóa đặc biệt có quan hệ, ảnh hưởng trực tiếp đến sứckhỏe, thậm chí đến cả tính mạng của người bệnh hoặc người sử dụng thuốc Bêncạnh nhiệm vụ hàng dau của ngành y tế là tìm ra những phương thức mới dé phòngvà chữa bệnh thì một trong những mục tiêu hiện nay là tạo ra được những sản phẩmthuốc có chất lượng cao, ôn định, giá cả hợp ly cho người sử dung Do đó, đảm bảochất lượng thuốc là công việc rất quan trọng Chất chuẩn, chất đối chiếu là mộttrong những yếu tố không thé thiếu trong công tác kiểm nghiệm dược phẩm Do làloại hàng hóa đặc biệt nên quy trình kiểm nghiệm cũng được quy định nghiêm ngặt.Chủng vi sinh vật chuẩn sử dụng phải theo quy định của Dược điển hoặc các chủngcó đặc tính tương đương với chủng chuẩn trong Dược điển Việc mua bán khó khănvì thủ tục nhập khẩu (do là một mặt hang đặc biệt nhạy cảm), lại rất dat tiền Mặtkhác, theo quy định thì việc cấy truyền chủng vi sinh vật nhiều lần là không đượcphép Chính vì vậy mà các cơ sở y tế trên thế giới cũng phải tự xây dựng bộ sưu tậpvi sinh vật đối chiếu dé đáp ứng nhu cau của chính mình Hiện nay, trong nước chưacó cơ quan nào chuyên cung cấp nguồn chủng chuẩn vi sinh vật cho ngành dược.Đa số chủng vi sinh vật chuẩn đang sử dụng trong ngành dược được lẫy từ cácnguồn xin - cho thiếu rõ ràng hoặc được mua về từ các ngân hàng chủng quốc tế cóuy tín Do đó, chúng ta chưa thể chủ động nguồn chủng chuẩn này Nắm được nhu

cầu này, xuất phát từ công việc thực tế tại Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hỗ

Chí Minh, chúng tôi tiến hành nghiên cứu để phân lập, định danh và xây dựngnguồn chủng chuẩn vi sinh vật tương đương với ATCC để phục vụ cho công táckiếm nghiệm dược phẩm Có nhiều chủng chuẩn vi sinh vật khác nhau can thiết chocông tác kiếm nghiệm dược phẩm, Bacillus subtilis được sử dụng trong phép thửgiới hạn nhiễm khuan, phép thử xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thửvi sinh vật, kiểm nghiệm sản phẩm probiotic, kiểm tra chất lượng môi trường nuôicay

- Trong phép thử giới hạn nhiễm khuẩn: chủng chuẩn được dùng làm đối

chứng dương trong các phan ứng sinh hóa phát hiện vi sinh vật gây bệnh,

vi sinh vật và xác định hiệu quả kháng khuẩn của chất bảo quản: được đánhgiá dựa trên khả năng ức chế hoặc tiêu diệt chủng vi sinh vật ở điều kiện

thích hợp.

- Trong kiếm nghiệm sản phẩm probiotic, chủng chuẩn được làm chứng

dương trong định danh loài.

- Ngoài ra, chủng chuẩn còn được sử dụng để kiểm tra chất lượng của cácloại môi trường nuôi cấy

Với những ứng dụng trên thì chủng Bacillus subtilis chuan là một trong nhữngđiều kiện bắt buộc của phép thử vi sinh

Với tình hình kinh tế chung của nước ta, việc mua chủng vi sinh vật từ nướcngoài đồng thời tuân thủ đúng quy định quốc tế khi sử dụng là thiếu khả thi Vì thế,

tự nghiên cứu và xây dựng một bộ sưu tập chung vi sinh vat có đặc tính tương

đương với các chủng chuẩn quốc tế dé phục vụ cho ngành là một nhu cầu thực tiễnvà cấp thiết Việc xây dựng này không chỉ phục vụ cho công tác kiểm nghiệm màcòn cho cả công tác nghiên cứu sâu về chuyên môn Do đó, Bộ Y tế đã giao choViện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hỗ Chí Minh thực hiện dự án khoa học côngnghệ mang tên “Xây dựng một số chủng vi sinh vật đối chiếu sử dụng trong kiếmnghiệm dược phẩm”

Với cơ sở vật chất hiện tại và yều cầu cấp thiết của Viện kiểm nghiệm Thuốcthành phố Hồ Chí Minh và thời gian thực hiện luận văn, tôi đặt ra mục tiêu nghiêncứu bước đầu chủng Bacillus subtilis dé có kinh nghiệm thực tiễn về cách thức xâydựng bộ sưu tập chủng vi sinh đối chiếu với dé tài “Thiết lập chủng Bacillus subtilis

đôi chiêu sử dụng trong kiêm nghiệm dược phâm”.

1.1 Dai cương về vi khuẩn Bacillus subtilis1.1.1 Lich sử phát triển

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổchức y học Nazi của Duc Luc dau, chu yếu được sử dụng để phòng bệnh Ii cho cácbinh sĩ Đức chiến dau ở Bắc Phi Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến nhữngnăm 1949 — 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiếtcủa Bacillus subtilis Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc Subtilin ra đời trịcác chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá Ngàynay, VI khuẩn Bacillus subtilis trở nên phố biến và được sử dụng rộng rãi trong chăn

nuồi, y học, thực phẩm "

1.1.2 Phân loại

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:

Bộ: EubacterialesHọ: Bacillaceae

Giống: Bacillus

Loài: Bacillus subtilis.

1.1.3 Dac điểm phân bốVi khuẩn Bacillus subtilis có thé phân lập được ở khắp noi trong không khí, cảtrong đất lẫn trong môi trường nước Chúng thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ởđường ruột, thường có trong những môi trường thiếu hụt dinh dưỡng, được phân bốhầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, đất, nước Phần lớn chúng ton tại 6 trongđất, thông thường dat trồng trọt chứa khoảng 10 — 100 triệu cfu/g Đất nghèo dinhdưỡng ở sa mac, đất hoang thi Bacillus subtilis rat hiễm Nước và bùn ở cửa sôngcũng như nước biển có sự tôn tai của bào tử và tế bào sinh dưỡng Bacillus subtilis

[1].

5) x 0.6wm, đứng thành chuỗi ngăn hoặc đơn lẻ, có khả năng di động, gồm 8 — 12lông, có bào tử hình elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kích thước 0.8 — 1.8 pm Vi trícủa bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào,có thé lệch tâm hoặc gan tâm nhưng không chính tâm Bacillus subtilis là loài sinhvật tự dưỡng, hiểu khí hoặc kị khí tùy tiện [2].

Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bàotử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng sinh ra 1 bào tử Bacillussubtilis có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vikhuẩn sặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ,pH ) Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hoá học cơbản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thànhphan và có thêm một số thành phan mới B subtilis phát triển bằng cách nảy mamdo sự nứt bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu âm, tia tử ngoại,

tia phóng xạ [Š |.

1.1.5 Đặc điểm sinh hóaBacillus subtilis là vi khuẩn hiéu khí nhưng có khả năng phát triển trong môitrường thiếu oxy, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37°C, pH = 7.0 — 7.4, tôi ưu ở pH 7.2.Vi khuẩn lên men không sinh khí các loại đường: glucose, maltose, manitol,saccharose, xylose, arabinosse và một số hoạt tính khác được liệt kê trong bảng.Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác độngcủa hemolysine Hệ enzyme của Bacillus subtilis rat phong phú và đa dạng gồm

protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase.

Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp, đặc biệtlà công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cau trúc kháng nguyên dạng D và Lcủa acid glutamic Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vikhuẩn Gram dương và Gram âm Tuy nhiên, đa số các chủng Bacillus subtilis

không gây bệnh.

Hoat tinh catalase +Sinh Indol -

MR +

VP +Su dung citrate +Khử nitrate +Tan chay Gelatin +Di dong +Phan giai tinh bot +Arabinose +Xylose +Saccharose +Mannitol +Glucose +Lactose -Maltose +

[2]Chu thich: (+) duong tinh, (-) 4m tinh1.2 Cac phương pháp định danh vi sinh vật

1.2.1 Phương pháp truyền thongTrước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tínhhình thái, sinh lý và sinh hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khảnăng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng nhưsac t6 tạo thành Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc

tính được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không cóý nghĩa đôi với nhóm khác (vi khuan Gram âm).

cơ ban của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thé có mức độ tươngđồng cao vé các đặc điểm hình thái Các phương pháp định danh truyền thống:

- Kit sinh hóa: dựa vào các phan ứng sinh hóa khác nhau của vi sinh vật.

Phương pháp này đơn giản, nhanh và dễ thực hiện Tuy nhiên có nhược điểm làphản ứng còn nhiều sai số trong các trường hợp gen quyết định phan ứng sinh hóanăm trong plasmid lại bi mat do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào,lượng giống cấy hay thay đối trong quá trình nuôi cay dẫn đến sai khác và làm saikết quả Hiện nay, trên thị trường có 2 bộ kit thương mại thường dùng dé định danh

nhanh vi sinh vật, đó là bộ kit của Api va Vitek.

- Phân biệt bằng thực khuẩn thé: Các vi khuẩn có độ man cảm với thựckhuẩn thé khác nhau Có thực khuẩn thé xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức désau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với mộtsố vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩnvà chúng cùng tỒn tại với tế bào vật chủ Dựa vào sự khác biệt nay mà người tadùng các thực khuan thé khác nhau dé phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu

Tuy nhiên, phương pháp nảy cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết làcác đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đối do điều kiệnngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thựckhuẩn thể khác nhau Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đối các đặc tính, dođó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ

- Phân biệt theo tuýp huyết thanh: Đây là phương pháp được dùng khá lâunhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng Nguyên tắc là dựa vào nhómquyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặcprotein vỏ) Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng đểbiệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chungđây là phương pháp khá ôn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp nay ở chỗyêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng khánghuyết thanh không đồng nhất và tính 6n định giữa các lần lặp lại

Như vậy, loại vi khuẩn tạo ra loại bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chínhbacteriocin đó Bởi vậy có nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa vào kiểu

bacteriocin.1.2.2 Phương pháp sinh hoc phân tw

Ngày nay những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụnghữu hiệu trong phân loại học và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu như cácphương pháp truyền thống chỉ tập trung trên một số đối tượng vi sinh vật thìphương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng trên mọi đối tượng vi sinh vật

Bảng 1 2 Một số phương pháp phân loại vi sinh vậtThành phân tế bào Phương pháp phân tích Pham vi phân loại

Thành phân bazơ (%G + C) ChiBién tinh ADN: ADN Loai

~ , , | Cac phan ADN được cat băngADN nhiém sac thé

enzyme giới han

Loài và dưới loàiĐa hình chiêu dài các đoạn giới hạn

của ARN riboxomTrình tự nucleotideARN riboxom Loài, chi và trên chi

Lai ADN: rARNTrình tự axit amin Chi và trên chi

So sánh băng phản ứng huyết thanh

Protein : Loài và chi

Các kiêu điện diĐiện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài

Cau trúc peptidoglycanThanh té bao Polysacherid Loai va chi

Axit teichoic

[4]

- Phân tích acid nucleic: Kỹ thuật phân tích acid nucleic liên quan chủ yếuđến phân tích kích thước, cấu trúc acid nucleic, mối tương quan về trình tự acid

nucleic thong qua giải trình tự ADN và lai ADN Kỹ thuật phân tích acid nucleic

bao gồm: kỹ thuật phân tích ADN plasmid và kỹ thuật phân tích ADN nhiễm sắcthể

Phương pháp phân tích plasmid là phương pháp được dùng phổ biến trong cácphòng thí nghiệm chuẩn đoán vi sinh vật Việc kết hợp giữa phân tích plasmid vớisử dụng enzym cat hạn chế sẽ tạo được sự phân tích chính xác với các thông tinđáng tin cậy đối với các mẫu phân tích Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu dựa trênplasmid thì cần lưu ý là các plasmid có thé bị mat qua các thế hệ phân chia, dẫn đếnsai lệch các kết quả nghiên cứu Khi thực hiện phép phân tích điện di trong trườngxung điện (PFGE) với các plasmid lớn sẽ khắc phục được hạn chế của các phép

phân tích hiện tại với plasmid nhỏ như trên Phương pháp PFGE hiện đang được

dùng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vi sinh vật, áp dụng trên các đối tượng dễnuôi cấy có thể cho các kết quả tốt hơn nhưng hạn chế về giá thành thiết bị cũngnhư yêu cầu cao về kỹ thuật và kinh nghiệm Mặt khác khi sử dụng các enzym catsẽ khó phát hiện được mức độ sai khác Như vậy sự kết hợp giữa các phép phân tíchplasmid, PFGE và lai ADN sẽ cho kết quả tin cậy hơn

- Phân tích protein: bao gém các kỹ thuật sau đây:+ Chuẩn bị dịch chiết tế bao dé tinh sạch protein: việc phan lập và tinh sạchprotein có ý nghĩa quyết định đối với việc tìm hiểu được chức năng của chúng Do

đó, các bước tinh sạch từng loại protein thường dựa trên các đặc tính đặc thù cua nó

về kích thước, hình dạng, điện tích và nhiều khi là chức năng của chúng.+ Sử dụng sắc ký cột trong tinh chế protein: phương pháp chiết suất và tinhsạch protein phố biến nhất là sắc ký cột Ngoai ra còn có phương pháp sắc ký traođổi ion, sắc lý lọc gel

+ Sắc ky ái lực hỗ trợ trong quá trình tinh chế protein: các đặc tính đặc trưngcủa từng loại protein có thé được tận dụng dé giúp tinh sạch loại protein tương ứng

+ Phân tích protein trên gel polyacrylamid: Các phân tử protein được điện ditrên gel polyacrylamid.

+ Định tính protein dựa trên phương pháp thâm tách miễn dịch: thấm táchmiễn dịch gần giống với phương pháp thấm tách (lai) đối với ADN và ARN nhưngdựa trên nguyên tắc miễn dịch đặc thù của protein nên được gọi là thầm tách miễn

dịch.

+ Giải trình tự trực tiếp protein: Mặc dù có cầu trúc phức tạp hơn ADN vàARN nhưng các phân tử protein cũng có thể giải trình tự trực tiếp, tức là việc xácđịnh thành phan và thứ tự các acid amin trong chuỗi polypeptide Có 2 phương phápđược sử dụng pho biến là phương pháp biến tính Dman và phương pháp khối pho kếtiếp [5]

Bảng 1.3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp truyén thông Phương pháp sinh học phân tử- Thời gian lâu - _ Kết quả nhanh

- _ Thiếu chính xác - Chính xác cao- Han chế với các vi sinh vật - D6 phân loại lớn

gần nhau - Thiết bị, máy móc phức- Pon giản, dễ tiễn hành tạp, hóa chất đắt tiền

- Giảm rủi ro khi tiễn hành

trên các vi sinh vật độc hại

Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựachủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (ADN, ARN) Các phươngpháp nay phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinhvật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựatrên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả

phân loại được chính xác.

1.2.3 Phương pháp PCR - Giải trình tự gen

Đề tài định danh chủng Bacillus subtilis bằng kỹ thuật phân tích acid nucleic,cụ thể là phản ứng PCR và giải trình tự gen Phương pháp PCR (Polymerase ChainReaction) được Kary Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kế từ đó đãtạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới PCRlà phương pháp dùng enzym khuếch đại chọn lọc một đoạn ADN theo luật số mũ

Nguyên tắcĐây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mỗi dé tông hợp số lượng lớn

các bản sao từ một trình tự ADN đặc biệt dựa trên hoạt động của enzymepolymerase Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá

trình tổng hợp ADN mới từ mạch khuôn Tat cả các ADN polymerase đều cầnnhững mỗi, là những đoạn ADN ngăn có khả năng bat cặp bố sung với một đầu củamạch khuôn Đoạn môi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADNpolymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh PCR là một chuỗi nhiều chuki nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 bước (hình 1.1):

- Bước 1 là giai đoạn biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợikhuôn xoắn kép, thường ở nhiệt độ 94 — 95°C trong 30 giây — 1 phút

- Bước 2 là giai đoạn lai, hai môi bat cặp vào hai sợi đơn của khuôn, thường

xảy ra ở nhiệt độ 40 — 70°C trong 30 giây — 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng

chảy của mdi.- Bước 3 là giai đoạn kéo dài chuỗi theo mỗi, nhiệt độ được tăng lên dến72°C, chiều 5’ — 3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn dé tạothành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung Tính đặc hiệu của phản ứng đượcquy định bởi mỗi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai môi Như

vậy, kêt quả tao ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài gid.

STM ts SaHình 1 1 Các bước trong phản ứng PCR [6].

Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phan ứng PCR:- ADN mẫu: mức độ tinh sạch, chiều dài của ADN mẫu.- Enzyme: sử dụng enzyme có khả năng chịu nhiệt tốt, không bị phá hủy ởnhiệt độ biến tính và xúc tác sự tong hợp từ dau đến cuối quá trình phản ứng

- Mỗi va nhiệt độ lai: việc chọn mỗi đặc hiệu là giai đoạn quyết định hiệuquả của phản ứng PCR Trình tự của mỗi được chọn sao cho không thé có sự bắtcặp bố sung giữa mỗi xuôi và mỗi ngược, không có cấu trúc kẹp tóc, nhiệt độ nóngchảy của môi xuôi và môi ngược không cách biệt quá xa và môi phải đặc trưng chotrình tự ADN cần khuếch đại

Giải trình tự: Giải trình tự gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại

nucleotide A (adenine), C (cytocine), G (guanine), T (thymine) trên phân tử ADN.

Trình tự rADN của vi khuẩn 0.3 — 0.4 % bộ gen Các chủng vi khuẩn đều mangđoạn gen 16S có độ bảo thủ cao, không có sự trao đối giữa các loài và nó mang tính

đặc trưng cho loài Ngoài ra, chỉ có gen 16S rARN với kích thước khoảng 1500

nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không

gây khó khăn trong nghiên cứu Theo Stackebrandt và cộng sự (2002) trình tự 16S

rADN chỉ có giá tri trong phân loại và định danh một loài mới khi được giải mã từ 1

300 nucleotide trở lên và không quá 5% nucleotide không thé xác định Sau khi sosánh kết quả phân tích độ tương đồng ADN bộ gen và trình tự 16S rADN,Stackerbrandt cùng Goebel (1994) đã xác định các chủng thuộc về cùng 1 giống cóđộ tương đồng vẻ trình tự 16S rADN lớn hon hay bằng 97% [7] Các chủng thuộcvề cùng một loài có độ tương đồng về trình tự 16S rADN từ 99% trở lên [8] Do đó,

nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuân Gen mã hóa cho câu trúc

16S rARN đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập đượcrất nhiều các cặp môi để nhân đoạn chúng băng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi

lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rARN.

ADN khuôn I0 — 100 ngdNTP (mỗi loại) 200 mM

Môi xuôi 0.1 — 1.0 mMMỗi ngược 0.1 — 1.0 mM

Taq polymerase 1UKCl 50 mMTris HCI (pH 8.4) tai 25°C 10 mM

MegCl, 2.85 mMGelatin 100 mg/lNonidet — 40 0.05%

[10]

Ưu điểm:- Độ nhạy rất cao, phân loại, xác định loài chính xác.- Thời gian thực hiện nhanh (chi cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự ADN

được quan tâm)

- Là cơ sở cho sự phát triển nghiên cứu về sự tiến hóa của giống, loài.- Thao tác đơn giản, ít tốn kém

- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.Nhược điểm:

- Sự ngoại nhiễm là van dé lớn nhất đặt ra đối với PCR, gan liền với khảnăng khuếch dai ban sao của phương pháp nảy

- Su nhân bản không đặc hiệu xảy ra khi môi bắt cặp không đặc hiệu với

những trình tự khác với trình tự đích.- Độ chính xác của Tag polymerase không cao.

- Không phân biệt được ADN của tế bào sống và tế bào chết trong mẫu banđầu

Ứng dụng: Các ứng dụng của phương pháp PCR bao trùm nhiều lĩnh vựcquan trọng của nghiên cứu và đời sống Chủ yếu gồm có: sản xuất mẫu dò dùng

trong phương pháp lai phân tử, nhân ban mot trình tự ARN, định lượng so sánh một

sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau Cụ thể trong từng ngành như sau:- Y khoa: dùng dé chuẩn đoán bệnh với tác nhân là virut, vi khuẩn, chan đoánviêm não, viêm màng não Xét nghiệm trong chuẩn đoán virut gây viêm gan siêu viB và C Sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh nhóm vi khuẩn gây bệnh trong

dịch não tủy Phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh (HIV, HBV, HCV,

M.tuberculosis, leptospira, H.pylory ) có trong các loại bệnh phẩm lâm sàng khácnhau, chân đoán các bệnh ung thư: vú, leukeumia và các loại ung thư khác Pháthiện định danh về huyết thống, dau vân tay, định tuýp mô học, pháp y

- Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định yếu t6 gây bệnh trong câytrong Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống Dùng phát hiệnra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo như việc xác địnhgen thu thé estrogen, gen halothan, gen thụ thé prolactin

- Thực phẩm: xác định tác nhân gây bệnh do vi khuẩn, virut có trong mẫuthực phẩm gây ngộ độc thực phẩm Dùng dé chuẩn đoán thực phẩm có nguồn gốc tựnhiên hay sản phẩm chuyển đổi gen Shigella spp là một loại vi khuẩn gây bệnhnguy hiểm có mặt trong thực phẩm, có thé gây bệnh với một lượng nhỏ từ 10 đến20 tế bào Phương pháp truyền thống hiện nay để phát hiện Shigella từ thực phẩmdựa vào các kỹ thuật nuôi cay, phân lập vi sinh, các thử nghiệm sinh hóa, mat nhiềungày để cho kết quả Do vậy, một quy trình PCR để pháy hiện Shigella có tính đặchiệu cao và cho kết quả nhanh hơn đã được phát triển Quy trình này được tiễn hànhVỚI cap môi SHIG khuếch dai cho một trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặchiệu cho cho Shigella spp Và cặp mỗi 16S rARN hiện diện trong moi vi khuẩn.Phương pháp này cho phép phát hiện Shigella spp ở mức 10 cfu/25g thực phẩm sau12 — 24 giờ tăng sinh, cho kết quả sau 24 giờ, ngắn hơn rất nhiều lần so với việcphát hiện băng phương pháp truyền thống.

Như vậy: Có nhiễu phương pháp được sử dung dé phân loại vi sinh vật nhưngkhông có phương pháp nào là tối ưu thích hợp cho mọi doi tượng vi sinh vật, tínhchính xác chỉ có thé đạt được khi ta phối hợp các phương pháp với nhau

1.3 Một số phương pháp bảo quan vi sinh vậtCó nhiều phương pháp bảo quản giống khác nhau, tùy theo từng loại vi sinhvật, điều kiện trang thiết bị mà ta có cách bảo quản riêng

1.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vậtĐây là phương pháp bao quan đơn giản, các chủng vi sinh vật được cay trênmôi trường thích hợp (dịch thé hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giácvà để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng vi sinhvật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình nay đượclặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chung vi sinh vật luôn được chuyểnđến môi trường mới trước khi già và chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thíchhợp với phương pháp bảo quan này như: Staphylococi, Coliform có thé sông đượcvai năm theo cách này Cho dù phương pháp nay là phương pháp khá phố biến được

dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chung vi sinh vật đặc biệt là các

chủng đang dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiềunhược điểm sau:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mat chủng giống góc.- Mất hay nhằm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản.- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các

Pseudomonas, Streptococus, Vibriio Phuong pháp thực hiện là phủ lên môi trường

agar đã có vi sinh vật phát triển một lớp dầu khoáng Phương pháp này có thể bảoquản giống khoảng 12 tháng, đỡ tốn công cấy truyền như phương pháp thạchnghiêng và ít có nguy cơ bị thoái hoá hoặc nhiễm tạp

1.3.3 Giữ giống trong cátPhương pháp này thường để giữ các vi sinh vật có bào tử Bảo quản trongphòng mát hoặc tủ lạnh 4°C, thời gian bảo quản trên 1 năm Giống trước khi dùngcấy ria lên môi trường agar, chọn các khuẩn lạc điển hình

1.3.4 Giữ giống trên silicagenCách làm: Silicagen nghiền min | mm, xử lý và tiến hành như phương phápgiữ giống trên cát

1.3.5 Giữ giống trên gelatinRất nhiều vi sinh vật được giữ giống trên gelatin, đây là phương pháp dễ làm

và an toàn được công bồ năm 1947 và ngày cảng phô biên rat rộng rãi Có 2 cách:

Các bước tiễn

Chuan bị moitruong gelatin

Môi trường nước thịt + 10%gelatin + 5% inosit

Môi trường nước thịt + 10%gelatin + 0.25 axit ascorbic

Chuan bị giống Tron té bào đã chuan bi

trước vào gelatin

Nuôi vi sinh vật trên môi

trường gelatin đến 1x10'°/ ml

Phân làm cácmiêng nhỏ

Say khô Say trong tủ hút chân không,

dùng P;Os hấp thu nước

Sây trong tủ hút chân không,dùng PzOs hấp thu nước

Bảo quản Trong ông nghiệm ở +5°C Trong ống nghiệm ở +5°C

Đông khô là phương pháp được sử dụng để bảo quản vi sinh vật trong nhiềuthập kỉ và ngày càng được dùng pho biến trong các ngân hàng chủng chuẩn trên thế

giới như American Type Culture Collection (ATCC), National Collection of Type

Cultures (NCTC) San phẩm đông khô dễ dàng bao quản va vận chuyền [8].Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ởtrạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp vàđược làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bi đông khô sẽ hút nước và cudicùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trườngchứa mau là chân không Đây là phương pháp phố biến có hiệu quả cao cho bảo

quản các đôi tượng vi sinh vật khác nhau như nam sợi, nam men, vi khuân và một

số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vậtnguyên sinh và tế bào động vật.

Quy trình đông khô gồm có 3 giai đoạn:- Tiền đông lạnh: đông lạnh mẫu hoàn toàn.- Làm khô sơ cấp: khoảng 90% tổng lượng nước trong mẫu được loại bỏbăng thăng hoa (tất cả những nước tự do và một số nước ở vùng ngoại biên)

- Lam khô thứ cấp: nước ngoại biên và bước bên trong sản phẩm tiếp tụcđược giải phóng ra ngoài, kết quả là sản phẩm chỉ có độ âm dưới 1 — 3 % Bước nàyđòi hỏi 1/3 — 1/2 thời gian của quá trình làm khô sơ cấp

Tùy thuộc vào cau hình của máy mà giai đoạn tiên đông lạnh và làm khô cóthé thực hiện chung trong cùng một máy hoặc ở hai máy riêng biệt, máy đông lạnh

và máy đông khô (hình 1.3).Các phương pháp đồng khô: có 3 phương pháp:

- Phương pháp manifold: các bánh làm khô được nối kết với các lỗ riêng biệt

trên một manifold trung tâm Mẫu được đựng trong những lọ nhỏ và thường được

làm đông lạnh bằng phương pháp shell và đặt vào các bình làm khô để nối kếtnhanh tới manifold và đặt dưới chân không dé tránh hiện tượng bị tan chảy lại.Phương pháp này thường hiệu quả cho những thể tích tương đối nhỏ

- Phương pháp batch được su dung với SỐ lượng lớn các vật chứa có kích cỡtương tự được làm đông khô đồng thời, ví dụ các ống huyết thanh Một hệ thốngkhay được sử dụng thay thế cho manifold Yếu tố nhiệt trong các khay sẽ cung cấpnhiệt Hầu hết các hệ thống lô có một cơ chế dé hàn kín các ống trước khi chúngđược đưa ra phơi nhiễm ngoài không khí

- Phương pháp bulk được sử dụng cho những thể tích lớn của một mẫu đơnlẻ Mẫu thường được đồ vào trong một cái khay đặc biệt, được làm đông lạnh và sauđó làm khô trong máy đông khô Các mẫu làm khô bulk không thé hàn kín trongthiết bị Việc phơi nhiễm ngoài không khí có thé ảnh hưởng tới tuôi thọ sản phẩm

Thông thường theo phương pháp đông khô vi sinh vật được bao quan từ 10 —

20 năm Nói chung phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp

trước như thời gian bao quan lâu, tiệt kiệm được công sức, sai sót nhấn mác và tạp

nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp nảy là giá thành thiết bị.Độ 6n định của các chung vi sinh vật bao quan theo các đợt đông khô là khác nhau.Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môitrường thích hợp một số lần dé phục hồi các đặc tính sinh học.

Đông lạnh các vial Chuyên các vial

y vào máy đông lạnh

Chuyên các vial vào máy đông khô

FREEZER

Hình | 3 Các bước của quá trình đông khô [8].

Vai trò của các chất bảo vệ:

- Duong: đường đôi (lactose, maltose, trehalose, sucrose), đường don

(glucose, galactose), đường ba (raffinose) Co ché bao vé do: thay thé lién két hydrotrong phân tử nước giữa lớp mang kép, hạ thấp sự chuyén pha mang và bao vệ trạngthái protein của tế bào vi khuẩn, tạo tinh thé hỗ trợ cau trúc khối của sản phẩm khiđông đá, ôn định màng tế bào Với những vi khuẩn không chịu được lạnh có thé sẽbị sụt giảm số lượng ngay ở giai đoạn đông đá, các đường giúp tăng điểm nhiệt độ

T, hay Ty, han chế sự chết của vi khuẩn Các đường thường sử dụng với nông độ từ5 - 15% phụ thuộc các thành phần kết hợp khác (thông thường sử dụng ở nồng độ

7.5% và 12.5%) [8.10,13].Trong đó, trehalose va sucrose đã được sử dụng rộng rãi với các loại vi sinh

vật trên 20 năm qua nhờ các tác dụng bảo vệ như: giúp ôn định màng và protein củavi sinh vật bang cách thay thế nước xung quanh các phan phân cực của cau trúc đạiphân tử, bảo vệ cấu trúc và chức năng của protein bang cách hình thành liên kếthydro bảo vệ cau trúc bậc 3 của protein khi mat phân tử nước Trehalose còn đượcdùng rộng rãi hơn vì những ưu điểm: có Ty cao nên giúp khối nước đá của sản phẩmbên ở nhiệt độ cao hơn mà có thé là do dạng cau trúc vô định hình của trehalose duytrì tính 6n định tương đối khi tăng nhiệt độ, có khả năng hình thành tính thé ngamhai nước vi vậy giúp hap phụ một lượng nước nhỏ thiết yếu để giúp khối matrix kếttinh bền vững và không gây giảm Ty [12,1314]

- Protein: như sữa gay, huyết thanh, pepton, cao nam men, albumin huyếttương bò, trypton, trypsin, cao thịt có tác dụng là nguồn cung cap đạm, acid amin,

vifamin và khả năng đệm.

Các protein có thé cải thiện đáng ké đặc tính kết tinh so với các đường nhờ sựbên vững hơn khi nhiệt độ trên điểm Tg của chúng Điều này gợi ý rằng các proteincó thể đóng vai trò quan trọng hơn trong việc hình thành tinh thể Đó là lí do màskimmed milk và huyết thanh được sử dụng trong đông khô Vì thế, kết hợp proteinvà đường có thé tạo tác nhân bảo vệ hiệu quả nhất [12,15]

Tuy nhiên huyết thanh ngựa không được dùng cho đông khô vi khuẩn thuộcnhóm Enterobacteria do làm thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn [16]

- Amino acid: như sodium glutamat, proline, glutamat có tác dụng nhờ phản

ứng với nhóm carboxyl của vi sinh vật và ôn định protein, là chất bảo vệ tham thấu,chất ôn định sản phẩm

- Các chất chong oxi hóa: như sodium thisulfat, than hoạt, acid ascorbic, tácdụng là chống oxy hóa, làm mat các gốc tự do, ôn định san phẩm

Than hoạt còn có tác dụng hấp phụ oxi và các chất độc hại sinh ra trong môitrường Một số trường hợp nhạy cảm, do nồng độ các chat bảo vệ trong quá trình

đông khô quá cao khiến ức chế kha năng phục hồi vi khuẩn đã đông khô trong môi

trường dinh dưỡng, thì than hoạt còn giúp cải thiện ty lệ này.- Các polymer: như gôm xanthum, gelatin, maltodextran, tinh bột,

polyethylen glycol có tác dụng giảm khả năng bám nước vào mẫu, giảm độ âmtrong mẫu, giúp nhanh cân bằng nước, ngăn hình thành đá nội bào

- Các polyol va alcohol: như butanol, mannitol, glycerol, sorbitol, inositol có

tác dụng thay thé phân tử nước khi bị loại khỏi lớp lipid màng, giảm khả năng bámnước trên bề mặt protein, tăng thoát hơi nước ngay trong quá trình đông lạnh

- Các chất khác như mật ong là nguồn hỗn hợp các đường, thay thé liên kết

hydro của phân tử nước khi nước bị loại bỏ, sodium acetat, myo - inositol bảo vệhoạt tính enzym màng, whey có khả năng đệm

Các yếu tố anh hưởng tới chất lượng của sản phẩm đông khô:- Đặc tính của mẫu: đặc tính lý hóa của các thành phần hóa học và nhữngtương tác có thé có của dung dịch hoặc hỗn hợp được đông khô Điểm nhiệt độeutectic, nông độ dung dịch

- Kích cỡ mẫu, bề mặt tiếp xúc của mẫu, bề dày của mẫu.- Điều kiện thực hiện quy trình đông khô: cách thực hiện tiên đông lạnh, ápsuất, nhiệt độ kiểm soát trong quá trình làm khô, thời gian làm khô

- Đặc tinh lý hóa của các vật chứa trong quá trình đông khô và bảo quản vềsau.

- Độ sạch cũng như ngoại nhiễm, trang thiết bị

1.3.7 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trongmôi trường dịch thé và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ởnhiệt độ lạnh sâu (-196 C — -80 C)

Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tanmẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giảitrong mẫu bảo quan và hình thành các tinh thể nước trong tế bảo Dé khắc phụcnhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm

tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide) Việc bảo quản theo phương

pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20°C, -30°C,

-40°C, -70°C, -140°C va -196°C Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30°C cho hiệu

quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải Phương phápbảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nắm sợi, nammen, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut [11]

Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp

vạn năng hơn cả Phương pháp nảy thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khácnhau như vi khuẩn, nắm sợi, nắm men, virut, tảo và cả các dong té bao dong vat.Tuy nhiên, phương pháp nay cũng bộc lộ một số nhược điểm như dau tư kinh phícho thiết bị và điện, nito lỏng hoặc rủi ro như cháy nô Đặc biệt phương pháp naykhông thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung

phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính químà không thích hợp với phương pháp đông khô.

Tóm lại, không có phương pháp nao là vạn năng cho bao quản các nhóm vi

sinh vật khác nhau Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách day du xét theo moiyêu cầu đã được đặt ra ở trên Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phảiđược kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn raphương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau

1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tàiTình hình thế giới

Bộ sưu tập chung vi sinh vật là một tập hợp các loài vi sinh vật đã được định

danh rõ ràng và xác định những đặc điểm sinh lý, sinh hóa, được bảo quản trongđiều kiện thích hợp va đặt mã số riêng, có hồ sơ riêng Trên thế giới, đã có khánhiều các ngân hàng chủng chuẩn có uy tín như: American Type Culture Collection

(ATCC), National Collection of Type Cultures (NCTC), NITE Biological ResourceCenter (NBRC), National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria(NCIMB), German Collection of Microorganisms and Cell cultures (DSMZ )

ATCC được thành lập vào năm 1925 nhăm đáp ứng nhu cau về giống vi sinhvật của các nhà khoa học trên toàn thé giới Ké từ lúc ra đời đến nay, ngân hàngkhông ngừng phát triển cả về số lượng lẫn chất lượng và đóng vai trò ngày cảng

quan trọng trên thế giới Đây là trung tâm lưu trữ nguyên vật liệu sinh học dành chonghiên cứu, bao gồm tế bào, bộ gen, vi sinh vật chuẩn và những sản phẩm probiotic.Ngân hàng gồm hơn 3 400 dòng tế bào của người, động vật, thực vật Bộ sưu tập visinh vật với hơn 18 000 chủng vi khuẩn, 2 000 loại vi rút động vat va 1 000 loại vi

rút thực vật khác nhau Ngoài ra, ATCC cũng lưu trữ hơn 2 000 loại nguyên sinh

động vật và hơn 49 000 loại nắm men, nam mốc Đây là trung tâm lưu trữ giống lớnnhất trên thế giới, các chủng chuẩn tại day được sử dung rộng rãi ở nhiều nước khác

nhau [17].

Hiện nay, DSMZ là một trong những trung tâm chủng sinh học lớn trên thế

giới với bộ sưu tập hơn 40 000 loại khác nhau Trong đó có hơn 20 000 chung vi

khuẩn, 5 000 chủng vi nam, 700 dòng tế bào của người và động vật, 800 dòng tếbào thực vat, | 000 loại vi rút và hơn 4 800 bộ gen ADN vi khuẩn khác nhau Ngoàira, DSMZ là nơi cung cấp các tài liệu va thong tin chân đoán chỉ tiết về các vật liệu

sinh học Các nghiên cứu xuyên ngành của DSMZ tập trung vào: sự đa dạng vi sinh

vật và cơ chế tiễn hóa cơ bản (tiến hóa bộ gen, di truyền học dân số), phương phápcải thiện cho việc tiếp cận và tiền bảo quản đa dạng sinh học, cơ chế phân tử của sựtương tác sinh học (cộng sinh, cơ chế của các loại bệnh, ung thư) Chính sự đa dạngvề chủng loại và cách quản lý chất lượng đã làm cho DSMZ trở thành một nhà cungcấp sản phẩm sinh học nỗi tiếng trong nghiên cứu khoa học, phòng thí nghiệm, làtài liệu tham khảo cho quốc gia cũng như các đối tác công nghiệp [18]

NCTC (National Collection of Type Cultures) được thành lập năm 1920, là

một trong bốn trung tâm thuộc tổ chức HPA Culture Collections Trung tâm lưu trữhơn 5 000 chủng vi khuẩn và hơn 100 mycoplasmas

Mặc dù đã có nhiều ngân hàng chủng lớn nhưng các nhà khoa học trên thế giớivẫn không ngừng nghiên cứu phân lập và ứng dung chủng này trong nhiễu lĩnh vực

khác nhau Một nghiên cứu của Yu — Kyoung Kim và cộng sự năm 2006, nhóm tácgiả đã phan lập được 3 chung Bacillus subtilis SL9 — 9, C5 — 16, và S52 — 2 từ nông

nghiệp có enzyme cellulolytic để chuyển hóa cellulose va hemicellulose Tỉ lệ sốngcủa vi sinh vật rất quan trọng trong quá trình bảo quản Vì vậy, năm 2007, Yikie

Miyamoto — Shinohara và cộng sự đã khảo sát tỉ lệ sông của một sô chung vi khuân

trong quá trình bảo quản và sau bảo quản băng phương pháp đông khô Kết quả chothay tỉ lệ sống của vi khuan Gram dương cao hon vi khuẩn Gram âm Đồng thời khiđông khô một số chủng Bacillus subtilis với chat bảo vệ là 10% skim milk, 1%sodium glutamate thì tỉ lệ sống có thé dat được 100%, thông thường là 62.8 — 92.4%ngay sau đông khô và tỉ lệ sống này sẽ giảm mỗi năm theo hàm số log Nhóm tácgiả cũng đưa ra 3 cách để tăng tỉ lệ sống của vi khuẩn Một là giảm các phân tửnước trong các ống mẫu bằng cách chuẩn bị vi khuẩn ở điều kiện khô và đóng góidưới điều kiện chân không Hai là giảm hoạt động của phân tử nước bằng cách bảoquản các ống mẫu ở nhiệt độ thấp (<-20°C) Ba là cho thêm chất hút âm vào các ốngmẫu Năm 2010, một nhóm tác giả gồm Chun — lei Wang và cộng sự đã phân lập vađược chủng Bacillus subtilis từ dat rừng, chủng này có khả năng ức chế hoạt độngcủa laccase, sau đó nhóm tác giả tiễn hành định danh bằng phương pháp sinh hóa,

sinh học phân tử, giải trình tự 16S rADN

Chung Bacillus subtilis đã được phân lập và định danh, có hồ sơ chủng tạingân hàng lưu trữ giống của Mỹ (ATCC) và một số ngân hàng chủng trên thế giới

Bảng 1 5 Quy mô một số bộ sưu tập giống trên thé giớiTên Bao tàng vi sinh Số lượng ching vi

ở Nước

vật (viet tat) sinh vatATCC My 75 400DSMZ Duc 40 000NBRC Nhat 18 300

[11]

Tinh hình trong nước

Chất đối chiếu, chất chuẩn là một yêu cầu quan trọng không thể thiếu trongngành kiểm nghiệm Chủng vi sinh vật chuẩn có ý nghĩa rất lớn trong lĩnh vực kiếmnghiệm vi sinh của các ngành dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm

Tại Việt Nam, để cung cấp và phục vụ cho công tác kiếm nghiệm Dược phẩm,các chất chuẩn hóa học đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng nhiều Trong khiđó, nguồn chủng chuẩn vi sinh vật lại chưa đáp ứng được nhu cau thực tiễn dang đòihỏi rất lớn Từ năm 1995 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học thuộc Đại hoc

Quốc gia Hà Nội đã xây dựng bộ sưu tập vi khuẩn VTCC (Vietnam Type CultureCollection) Bộ sưu tập VTCC hiện nay có hon 9 000 chủng vi khuẩn dang đượcbảo quan băng phương pháp lạnh sâu nito lỏng và đông khô Tuy nhiên chỉ có hon

2 300 chủng đã nghiên cứu được đặc tính sinh hóa, sinh lý và sinh học phân tử, còn

lại rất nhiều chủng chỉ được xác định đến giống, hoặc có nhiêu vi khuẩn có cùnggiống chăng hạn như giống Lactobacillus có đến 25 chủng vi khuẩn nên số lượngloài vi khuân không được phong phú Năm 2010, Phạm Hùng Vân cùng cộng sự đãxây dựng ngân hàng vi khuân để huấn luyện và đào tạo về vi sinh, kiểm tra chấtlượng của các phòng thí nghiệm và để hỗ trợ nhiều nghiên cứu khác Các chủngđược định danh rõ ràng với các dữ liệu về nguồn gốc chủng, tinh chat vi thé, sinhhóa học, trình tự 16S rADN và tính chất dé kháng kháng sinh Nhóm tác giả đã xâydựng được ngân hàng vi khuẩn với 155 chủng vi khuẩn thuộc 152 loài khác nhau.Một số nơi khác như Bộ môn xét nghiệm, Khoa Dược, trường Đại học Y DượcThành phố H6 Chi Minh cũng có bộ sưu tập dùng trong giảng dạy về xét nghiệm visinh lâm sàng nhưng số lượng rất hạn chế, chỉ khoảng 20 chủng và đa phần cácchủng vi khuẩn này không có nguồn gốc rõ ràng và được định danh dựa trên vàitính chất sinh hóa học nên kết quả không thé chuẩn xác được Nguén chủng chuẩnhạn hẹp, đặc biệt là những chủng chuẩn dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm vẫnchưa đáp ứng được nhu câu Do vậy mà các công ty cũng như cơ quan kiểm nghiệmdược phẩm phải mua chủng chuẩn từ các ngân hàng chủng chuẩn có uy tín trên thếgiới Chính vì vậy, xây dựng một ngân hàng chủng chuẩn dùng trong kiểm nghiệmdược phẩm là một điều hết sức cần thiết và cấp bách Do đó, chúng tôi thực hiện détài “Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiéu sử dung trong kiếm nghiệm dược

phâm” nhăm đáp ứng nhu câu nói trên.

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

2.1 Vật liệu thí nghiệm

2.1.1 Giống vi sinh vật:- Ching Bacillus subtilis phân lập từ đất, không khí, mẫu thuốc

- Chung Bacillus subtilis ATCC 6633.

2.1.2 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường Trypticasein soy agar (TSA) (Merck)

- Môi trường TSA có bố sung 0.001% MnSO,

- Môi trường Trypticasein soy broth (TSB) (Merck)- Môi trường Mannitol Egg yolk Polymyxine Agar (MY P) (Merck)- Môi trường Mueller Hinter agar (MHA) (Oxoid)

- Môi trường Api (Bio Merieux)

2.1.3 Hoá chất- Bộ thuốc nhuộm Gram

- Dung dịch NaOH- Methanol

- Thuốc thử phenolphtalein- Côn 96°

- KH¿zPOx, Na;HPOx, MnSO,- H,O,

- Cac kit dinh danh: Api 20 E, Api 50 CHB, kit Vitek (Bio Merieux).

2.1.4 Thiết bị và dụng cu

Thiet bị nuôi cây vi sinh: tu cay vô trùng Assab, tủ âm, tu say, nôi hap tiệt

trùng, máy lắc, tủ lạnh, lò viba, bếp điện.- Thiết bị phân tích: kính hiển vi, cân kỹ thuật, cân phân tích, micro pipet, pHkế, máy đo quang phố, máy vortex, máy đo đường kính vòng kháng khuẩn, máy

PCR, máy điện di ngang HU10, máy định lượng ADN

- Dung cụ thủy tinh dùng trong phân tích: erlen, becher, đĩa petri, ốngnghiệm, bình định mức, phéu, pipette

- May đông khô Christ2.2 Noi dung nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu được thé hiện băng sơ đồ bồ trí thí nghiệm sau:

Phân lập Bacillus từ

thuốc, đất, không khí

Định danh B subtilis bang

phuong phap sinh hoa

Dinh danh bang phuong

phap sinh hoc phan tu (PCRva giai trinh tu 16S rADN)

Vv

Kiểm tra đặc tinh sinh họcphù hợp yêu cau chủng đốichiếu trong kiểm nghiệm

dược phẩm ¬thế P Khao sát tiền

đông khôVv

Khao sat phuong phap baoquan đông khô

Khảo sát đôngkhô

Theo dõi tính 6n định ditruyền sau bảo quản

a ỜN,

Định danh Kiểm tra một số

đặc tính sinh học

2.3 Phương pháp thực hiện đề tài

2.3.1 Phân lập Bacillus

Nguyên tắcDựa vào nguyên tắc Kock, tiễn hành phân lập các vi sinh vật từ các khuẩn lạcriêng lẻ Tiếp tục cấy ria các khuẩn lạc này trên các đĩa môi trường đến khi thu đượcchủng thuần có độ đồng nhất về hình dang, kích thước, màu sắc trên môi trường

Tiên hànhMục dich của dé tài là xây dựng chủng chuẩn dùng trong công tác kiểmnghiệm dược phẩm Do đó, tôi tiễn hành phân lập Bacillus bị nhiễm từ trong cácmẫu dược phẩm, đất, không khí

Phân lập trong các mẫu thuốc bị nhiễm: Trong quá trình kiểm nghiệm dượcphẩm, phát hiện trong mẫu có nhiễm Bacillus Do đó chúng tôi tiễn hành phân lập.Cân 10g thuốc vào 90ml dung dịch đệm phosphat pH 7, lắc cho kỹ để thuốc tanhoan toàn Sau đó tiến hành pha loãng thành các nồng độ 10”, 10”, 10”, hút 1mlmẫu cho vào đĩa, cho môi trường TSA vào lắc đều, dé đông Đồng thời, hút 10mldung dịch pha loãng ban đầu vào bình chứa sẵn 90ml môi trường TSB đã được hấptiệt trùng, đem tat cả ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau khi ủ, kiểm tra trên môi trường đĩaTSA, nếu có vi khuẩn, tiễn hành quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram vàquan sát dưới kính hiến vi Tiến hành cấy ria từ môi trường TSB sang môi trườngthạch dia TSA rồi tiếp tục ủ ở 37C trong 24 giờ, nhận dạng khuẩn lạc đặc trưngBacillus Lay các khuẩn lạc nghi ngờ đem nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiểnvi Tiếp tục phân lập đến khi thu được các khuẩn lạc thuần, cấy sang ống thạchnghiêng dé giữ giống

Tương tự như trên ta cũng tiến hành phân lập chủng trên một số loại thuốc

khác.Phân lập trong môi trường không khí: Đặt đĩa petri có chứa sẵn môi trường

TSA trong không khí trong 3 giờ Sau đó đem đĩa ủ ở 37°C trong 24 giờ Lay khuẩnlạc nghi ngờ đem nhuộm Gram, tiếp tục cấy ria sang môi trường TSA rồi thực hiện

các phản ứng sinh hóa khác.

Phân lập trong dat trồng: 10g đất vườn + 90ml nước cat, lắc đều, tạo huyềnphù, lay dịch trong cho vào bình tam giác 100ml, gia nhiệt 80 — 85°C trong 20 — 25phút dé diệt các vi sinh vật khác, chỉ giữ lại bào tử Bacillus Day miệng bình để giữâm, nuôi ở 30 — 37°C trong khoảng 48 giờ.

Lay lớp màng nhảy trên bề mặt đem pha loãng và nuôi cấy ở nhiệt độ 30 —37°C, sau 2 — 3 ngày xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ, quan sát hình thái

2.3.2 Định danh Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh hóaSau khi phân lập được các chủng thuần, tiễn hành định danh bằng phương

Tiên hànhQuan sát đặc điểm hình dạng khuẩn lạc: Sử dụng phương pháp cấy ria các

chủng vi sinh vật trên các môi trường thạch đĩa tương ứng Quan sát trên môitrường TSA ủ ở 37°C trong 24 — 48 giờ.

Nhuộm Gram: Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn Gramdương va Gram âm được quy định bởi vách tế bào mà tiến hành nhuộm Gram đểxác định các chủng vi khuẩn phân lập được thuộc loại nào

b Khảo sát nhu cầu oxyCấy vi khuẩn vào môi trường thạch sâu TSA, ủ ở 37°C trong 48 giờ Quan sát

sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy Nếu khuẩn lạc chỉ mọc trên bé mặt

thạch thì đó là vi khuẩn hiếu khí, khuẩn lạc mọc dọc theo đường cấy từ trên xuốngthì đó là chủng vi hiếu khí và nếu khuẩn lạc chỉ moc ở đáy môi trường thì đó là vikhuẩn ky khí bắt buộc