Luận văn thạc sĩ Công nghệ hóa học: Nghiên cứu tinh dầu tràm trà và ứng dụng trong dược phẩm

 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các mẫu tinh dầu tràm trà bao gồm hoạt tính chống oxy hóa in vitro theo phương pháp quét gốc tự do DPPH và hoạt tính kháng vi sinh vật Bacillus anthra

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học : TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

PGS TS PHAN ĐÌNH TUẤN

Cán bộ phản biện 1 : PGS TS NGUYỄN NGỌC HẠNH Cán bộ phản biện 2 : TS TỐNG THANH DANH

4 PGS TS TỐNG THANH DANH 5 TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ LỆ UYÊN MSHV: 10050143 Ngày, tháng, năm sinh: 05-01-1986 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Kỹ Thuật Hóa Học Mã số : 605275

I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TINH DẦU TRÀM TRÀ VÀ ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC PHẨM

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

 Phân tích, so sánh thành phần tinh dầu tràm trà ở Tiền Giang, Long An và tràm trà ở Úc

 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các mẫu tinh dầu tràm trà bao gồm hoạt

tính chống oxy hóa in vitro (theo phương pháp quét gốc tự do DPPH) và hoạt tính kháng vi sinh vật (Bacillus anthracis, Streptococcus spp, Salmonelle, Shigella spp và Candida albicans)

 Phối chế tinh dầu tràm trà vào nước súc miệng diệt khuẩn hằng ngày

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/08/2011 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/06/2012 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

PGS TS PHAN ĐÌNH TUẤN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

TS NGUYỄN THỊ LAN PHI

PGS TS PHAN ĐÌNH TUẤN

Ngày 12 tháng 09 năm 2012

PHÒNG ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC KHOA QUẢN LÝ NGÀNH

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành biết ơn cô TS Nguyễn Thị Lan Phi và thầy PGS.TS Phan Đình Tuấn đã tận tình giúp đỡ, dành nhiều thời gian và công sức để hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này

Em cám ơn các thầy cô bộ môn Hóa Phân Tích và thầy cô bộ môn Vi sinh trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho em làm thí nghiệm Đồng thời, em xin gửi lời cám ơn đến trưởng phòng vi sinh Viện y tế công cộng Tp Hồ Chí Minh và các anh chị ở Viện đã nhiệt tình hướng dẫn em làm thí nghiệm vi sinh

Con cảm ơn ông Nguyễn Văn Bé - Giám đốc công ty Dược liệu Đồng Tháp Mười đã cung cấp nguyên liệu để con làm thí nghiệm

Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 07 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Xin chân thành cám ơn

TÓM TẮT

Tinh dầu tràm trà (TTO) được chưng cất từ lá tràm trà (Melaleuca alternifolia)

là một hỗn hợp gồm hơn 50 hợp chất, chủ yếu là monoterpenes, sesquiterpenes và các dẫn xuất của rượu, trong đó thành phần chính bao gồm terpinen-4-ol, γ-terpinene, α-terpinene, α-terpineol, α-terpinolene, 1,8-cineole,… Đặc biệt, terpinen-4-ol có hàm lượng (30,79% – 43,85%) và có hoạt tính kháng khuẩn rất tốt Trong luận văn này, thực hiện chưng cất thu tinh dầu và phân tích thành phần tinh dầu tràm trà ở Tiền Giang, Long An và tràm trà ở Úc Sau đó, nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, kháng vi sinh vật và phối chế vào sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn Tinh dầu tràm trà thể hiện hoạt tính chống oxy hóa (theo phương pháp quét gốc tự do DPPH), khả năng ức chế được 50,00% gốc tự do của DPPH ứng với các mẫu Tiền Giang, Long An và Úc lần lượt là 10,441µl TTO/ml methanol; 28,933µl TTO/ml methanol và 9,250µl TTO/ml methanol Mặt khác, tinh dầu tràm trà có khả

năng ức chế các vi sinh vật: Bacillus anthracis, Streptococcus spp, Salmonella, Shigella spp và vi nấm Candida albicans ở nồng độ tinh dầu thấp 0,10%

Dựa vào đặc tính kháng vi sinh vật mạnh của tinh dầu tràm trà (đặc biệt là

những chủng có hại trong miệng và vòm họng: Bacillus anthracis, Streptococcus spp và Candida albicans), trong luận văn này triển khai nghiên cứu ứng dụng tinh

dầu tràm trà vào sản phẩm nước súc miệng diệt khuẩn hằng ngày

ABSTRACT

Tea tree oil (TTO) was distilled from tea tree leaves (Melaleuca alternifolia)

It is a mixture of more than 50 compounds, mostly monoterpenes, sesquiterpenes and alcohol derivatives, in which the main components include terpinen-4 -ol, γ-terpinene, α-terpinene, α-terpineol, α-terpinolene, 1,8-cineole, terpinen-4-ol has high content (30,79% - 43,85%) and antibacterial activities very good In this thesis, implementation distillate oil collection and analysis components of tea tree oil are in Tien Giang, Long An and Australia

Then study the activity of antioxidant, antibacterial, antifungal and blending in mouthwash products kill bacteria Tea tree oil shows antioxidant activity (by radicals scan method DPPH), the ability to inhibit 50.00% of DPPH free radicals with the form of Tien Giang, Long An and Australia respectively 10.441µl TTO/ml methanol; 28.933 µlTTO/ml methanol and 9.250 µl TTO/ml methanol On the other

hand, tea tree oil has strong ability to inhibit microorganisms: Bacillus anthracis, Streptococcus spp, Salmonella, Shigella spp and Candida albicans fungi at low oil

concentrations of 0,10% Based on the properties of the strong antimicrobial activity of tea tree oil

(especially harmful strains in the mouth and throat: Bacillus anthracis, Streptococcus spp and Candida albicans), in this thesis to study the application of

TTO product tea antibacterial mouthwash daily

1.2 Giới thiệu tinh dầu tràm trà 4

1.2.1 Khái niệm tinh dầu 4

1.4 Ứng dụng tinh dầu tràm trà 17

1.4.1 Trong mỹ phẩm 18

1.4.2 Trong dược phẩm 18

1.5 Đối tượng răng và miệng 22

1.5.1 Cấu tạo răng 23

1.5.2 Nước bọt 23

1.5.3 Bệnh gây ra do vi sinh vật có hại trong miệng 23

1.5.4 Các sản phẩm chăm sóc răng miệng 24

1.6 Vi sinh vật gây bệnh 25

1.6.1 Vi khuẩn Gram dương 25

1.6.2 Vi khuẩn Gram âm 26

2.1.3 Hóa chất – Dụng cụ - Máy và thiết bị 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 30

2.2.2 Phương pháp chưng cất 30

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học 34

2.2.4 Phương pháp đánh giá cảm quan tinh dầu 38

2.2.5 Phối chế sản phẩm nước súc miệng 38

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 39

3.1 Mục tiêu nghiên cứu 39

3.2 Tiến trình thí nghiệm 39

3.3 Tách chiết tinh dầu 40

3.3.1 Chưng cất lôi cuốn hơi nước 40

3.3.2 Chưng tách tinh dầu có sự hỗ trợ của vi sóng 42

3.4 Xác định độ ẩm và hàm lượng tinh dầu trong lá tràm trà 43

3.4.1 Xác định độ ẩm 43

3.4.2 Xác định hàm lượng tinh dầu trong lá tràm trà 43

3.4.3 Đánh giá cảm quan tinh dầu sau khi chưng cất 43

3.5 Phân tích thành phần hóa học của tinh dầu tràm trà bằng phương pháp sắc ký khí 44

3.6 Khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu tràm trà 44

3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro – phương pháp DPPH 45

3.6.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật 45

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 57

4.1 Tách chiết tinh dầu tràm trà Long An 57

4.2 Thành phần hóa học của tinh dầu tràm trà 59

4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu tràm trà 62

4.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro – phương pháp DPPH 62

4.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật 77

4.3 Sản phẩm nước súc miệng 86

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 92

TÀI LIỆU THAM KHẢO 94

DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG

BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Cây tràm trà ở Mộc Hóa - Long An (Melaleuca alternifolia) 1

Hình 1.2: Lá tràm trà ở Mộc Hóa - Long An (Melaleuca alternifolia ) 2

Hình 1.3: Tuyến dầu trên lá tràm trà 2

Hình 1.4: Quá trình thu hoạch tràm trà 3

Hình 1.5: Cấu tạo răng 22

Hình 1.6: Vi khuẩn trong răng miệng của mỗi người 24

Hình 2.1: Phương pháp pha loãng nồng độ dịch vi sinh 37

Hình 3.1: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước trực tiếp 41

Hình 3.2: Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước gián tiếp 41

Hình 3.3: Hệ thống chưng cất có sự hỗ trợ của vi sóng 42

Hình 3.4: Quy trình hoạt động của thiết bị GC 44

Hình 3.5: Nước súc miệng Listerine 56

Hình 4.1: Sắc ký đồ phân tích TTO Tiền Giang 61

Hình 4.2: Sắc ký đồ phân tích TTO Long An 61

Hình 4.3: Sắc ký đồ phân tích TTO ở Úc 62

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Các thông số vật lý và hóa học của TTO 5

Bảng 1.2: Thành phần hóa học tinh dầu tràm trà theo tiêu chuẩn ISO 4730 6

Bảng 1.3: MIC & MBC của các loại vi khuẩn với TTO 11

Bảng 1.4: MIC & MFC của các loại nấm với TTO 13

Bảng 1.5: Một số sản phẩm hóa dược chứa TTO trên thị trường hiện nay 19

Bảng 4.12: Khả năng ức chế của TTO – Úc (0,1-1µl TTO/ml methanol) bằng

phương pháp DPPH 73

Bảng 4.13: Khả năng ức chế của TTO – Úc (1-10µl TTO/ml methanol) bằng phương pháp DPPH 74

Bảng 4.14: Khả năng ức chế của Vitamin C (0,3125 – 5 ppm) 75

Bảng 4.15: Khả năng ức chế của Vitamin C (5 – 80 ppm) 76

Bảng 4.16: Đường kính vòng vô khuẩn của TTO – Tiền Giang 77

Bảng 4.17: Đường kính vòng vô khuẩn của TTO – Long An 79

Bảng 4.18: Đường kính vòng vô khuẩn của TTO – Úc 80

Bảng 4.19: Kết quả khả năng diệt khuẩn và nấm của TTO – Tiền Giang 82

Bảng 4.20: Kết quả khả năng diệt khuẩn và nấm của TTO – Long An 84

Bảng 4.21: Kết quả khả năng diệt khuẩn và nấm của TTO – Úc 85

Bảng 4.22: Kết quả khảo sát hàm lượng ethanol 87

Bảng 4.23: Kết quả khảo sát chất hoạt động bề mặt 89

Bảng 4.24: Kết quả khả năng diệt khuẩn và nấm của NaCl 0,9% 89

Bảng 4.25: Kết quả đánh giá sản phẩm nước súc miệng TTO 90

DANH MỤC ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Khả năng ức chế của TTO – Tiền Giang (1-10µl TTO/ml methanol)

Đồ thị 4.5: Đường kính vòng vô khuẩn TTO – Tiền Giang 78

Đồ thị 4.6: Đường kính vòng vô khuẩn TTO – Long An 79

Đồ thị 4.7: Đường kính vòng vô khuẩn TTO – Úc 80

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tách chiết tinh dầu 40

Sơ đồ 3.2: Thí nghiệm chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH 45

Sơ đồ 3.3: Hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán 46

Sơ đồ 3.4: Hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 49

Sơ đồ 3.5: Phối chế nước súc miệng dùng trực tiếp 53

Sơ đồ 3.6: Phối chế sản phẩm dạng xịt làm mát khoang miệng 54

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

TTO : tinh dầu tràm trà

M alternifolia : Melaleuca alternifolia

ISO 4730 : International Organization standard no 4730 DPPH : 2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl

IC50 : phần trăm ức chế 50% BHT : butylated hydroxytoluene MIC : nồng độ ức chế tối thiểu MFC : nồng độ diệt nấm tối thiểu MBC : nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

C.albicans : Candida albicans

NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân SDA : Sabouraud's Dextrose Agar TSA : Tryptic Soy Agar

TSB : Tryptic Soy Broth MHA : Mueller-Hinton Agar WHO : Tổ chức Y tế thế giới

SP 1 : nước súc miệng dùng trực tiếp SP 4 : sản phẩm dạng xịt làm mát khoang miệng

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây, thế giới rất ưa chuộng các sản phẩm hóa dược cũng như mỹ phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên vì chúng ít độc hại và an toàn khi sử dụng Ở nước ta, với nguồn nguyên liệu thảo dược phong phú và đa dạng lại có sẵn nền y học cổ truyền lâu đời thì việc nghiên cứu sử dụng các dược liệu kết hợp với nền y học hiện đại rất thuận lợi

Nước ta là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, gió mùa nên có nhiều điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, ánh sáng, đất đai, ) cho sự phát triển của nhiều loài thực vật

Trong đó, nhiều loài thực vật có chứa tinh dầu Tràm trà – một loại cây di thực từ

Úc (1986) – là một trong những dược liệu quý Tuy mới được trồng ở nước ta khoảng 25 năm nhưng nó đóng vai trò rất quan trọng trong mỹ phẩm và dược phẩm Vì tinh dầu tràm trà có hoạt tính sinh học khá rộng người ta dùng nó để chữa trị các chứng ngoài da như ngứa ngáy, mề đay, gàu, lở loét, mụn trứng cá, rận rệp, đau nhức, nức nẻ, viêm lợi… Bên cạnh đó, mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật như là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn như các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E… đã và đang được quan tâm nghiên cứu Đó chính là những lý do mà có rất nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về tràm trà

Tràm trà khi mới du nhập được trồng ở Hà Nội, Hà Tây, Quảng Bình, Phú Yên… để phủ xanh đồi trọc, chống xói món, xâm thực, nhưng sau đó được trồng rộng rãi tại các vùng ngập nước như Đồng Tháp Mười, vùng khô hạn như Đông Nam Bộ, vùng khô hạn nhưng có nước tưới như Tây Ninh, vì giá trị kinh tế của tinh dầu tràm trà cho lợi nhuận cao

Ở nước ta, nghiên cứu về tinh dầu tràm trà bắt đầu từ những năm 90 và hiện nay có nguồn nguyên liệu dồi dào ở một số tỉnh trong cả nước Hơn nữa, đề tài này

cũng được sự hỗ trợ của JICA ( Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật bản) trong việc trồng và xây dựng xưởng thực nghiệm sản xuất tinh dầu tràm trà ở Tiền Giang Để tiếp tục chuỗi nghiên cứu này, đồng thời nghiên cứu sâu hơn những ưu điểm của tinh dầu tràm trà – góp phần nâng cao giá trị sử dụng và giá trị kinh tế của sản phẩm Nên trong luận văn này tập trung “Nghiên cứu tinh dầu tràm trà và ứng dụng trong dược phẩm” hướng vào các phần chính sau:

1 Phân tích, so sánh thành phần tinh dầu tràm trà ở Tiền Giang, Long An và tràm trà ở Úc

2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loại tinh dầu tràm trà bao gồm hoạt tính chống oxy hóa (theo phương pháp quét gốc tự do DPPH) và hoạt tính

kháng vi sinh vật (Bacillus anthracis, Streptococcus spp, Salmonelle, Shigella spp và Candida albicans)

3 Phối chế tinh dầu tràm trà vào nước súc miệng diệt khuẩn hằng ngày

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu cây tràm trà

1.1.1 Tên gọi

– Tên khoa học: Melaleuca alternifolia (M alternifolia)

– Tên thông thường: tràm trà, tràm Úc, tràm lá kim – Họ: Sim (Myrtaceae)

1.1.2 Đặc điểm

Là cây thân gỗ đường kính 10 - 15cm, khá to và cao khoảng 4-5m (với cây trồng đựơc 5 tuổi) và to Gốc phân nhánh, tán lá rộng hình tháp, mọc so le, phiến lá hình mác nhỏ hẹp dài 1 - 2,5cm, rộng 0,1 - 0,2cm Gân lá song song nhưng không nổi rõ Mùi thơm đặc biệt Cây cho hoa và quả khi hơn 5 tuổi [ 8, 9, 10]

Hình 1.1: Cây tràm trà ở Mộc Hóa – Long An (Melaleuca alternifolia)

Hình 1.2: Lá tràm trà ở Mộc Hóa - Long An (Melaleuca alternifolia )

Hình 1.3: Tuyến dầu trên lá tràm trà (ảnh của A Curtis) [18]

1.1.3 Cây tràm trà

Ở Úc, tràm trà phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển phía Bắc New South Wales (NSW) và ở phía Nam Queensland [18] Chúng có khả năng thích nghi rất rộng như những vùng đất có độ pH = 4,5 - 5,5 (đo trong nước) hay loại đất trong các kênh rạch và các khu vực nằm thấp ở phía Bắc NSW thường là những vùng

đầm lầy thì M alternifolia thích nghi tốt (Colton và Murtagh, 1990) cũng như

những vùng đất mùn cát, đất sét nặng đến đất sét mùn (Small, 1981)

Hình 1.4: Thu hoạch tràm trà (ảnh của R.Colton)

Ở Việt Nam, M alternifolia được du nhập vào nước ta vào năm 1986 còn

được gọi là tràm trà, tràm lá kim, tràm dầu…

1.1.3.1 Sự phân bố

Tràm trà lúc mới du nhập được trồng tại một số tỉnh như: Hà Nội, Hà Tây, Quảng Bình, Phú Yên… nhưng trồng với số lượng ít Đến năm 1995, bác sĩ Nguyễn Hoàng Tâm kết hợp với Úc đã trồng với quy mô lớn hơn tại xã Lộc Thành – Huyện Lộc Ninh – Tỉnh Bình Phước, bước đầu khai thác tinh dầu với lượng lớn và xuất khẩu [10, 15, 17]

Hiện nay, tràm trà được trồng tại các vùng ngập nước như Đồng Tháp Mười, vùng khô hạn như Đông Nam Bộ, vùng khô hạn nhưng có nước tưới như Tây Ninh Điều này chứng tỏ, tràm trà có khả năng thích nghi rất rộng Và đặc biệt, hàm lượng tinh dầu trong lá cao từ 1,72 – 2,00%, chất lượng tinh dầu chứa terpinen-4-ol cao 40,00% – 46,60 % và chứa ít cineol (5,05%) [10, 15, 17]

1.1.3.2 Sự tăng trưởng

Sau khi trồng được một năm tuổi, tốc độ tăng trưởng chiều cao của cây được trồng từ cành chiết nhanh hơn cây được trồng từ hạt Từ năm thứ hai trở đi thì cả hai

loại có sự tăng trưởng tương đương nhau cả về chiều cao và đường kính tán Sau 3 năm, cả hai loại cây trồng giảm tốc độ tăng trưởng về chiều cao.[15]

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng

Các tháng trong năm sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây như theo nghiên cứu về sự sinh trưởng của cây được trồng từ phương pháp chiết năm 1996 thì vào những tháng trong mùa xuân và hè (tháng 1 - 6) thì cây sinh trưởng mạnh hơn vào những tháng mùa thu và đông [10, 15]

Ảnh hưởng thu hái trong năm tới năng suất cành mang lá: hàng năm nên thu hái hai lần vào tháng 1 - 2 và tháng 7 - 8 là hợp lý nhất [15]

1.2 Giới thiệu tinh dầu tràm trà

1.2.1 Khái niệm tinh dầu

Là một hỗn hợp nhiều hợp chất dễ bay hơi, có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu.[1]

1.2.2 Tính chất vật lý tinh dầu tràm trà

Tinh dầu tràm trà là chất lỏng trong suốt không màu hoặc vàng nhạt, linh động, mùi đặc biệt, vị đắng chát, ít kích ứng da, ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong dung môi không phân cực [1, 2, 17]

Bảng 1.1: Các thông số vật lý và hóa học của TTO

Các hằng số vật lý Các chỉ số hóa học

- Tỷ trọng ở 20oC: 0,9074 - Khối lượng riêng ở 20oC: 0,9059 g/ml - Chỉ số khúc xạ ở 20oC: 1,4810

- Góc quay cực riêng ở 25oC: 8,93

- Chỉ số acid: 2,35 - Chỉ số xà phòng hóa: 24,27 - Chỉ số ester: 21,92

- Chỉ số acetyl: 24,06

1.2.3 Thành phần hóa học

TTO chủ yếu được chiết xuất bằng chưng cất hơi nước từ lá M alternifolia

bao gồm hơn 50 hợp chất, chủ yếu là monoterpenes, sesquiterpenes, và các dẫn xuất của rượu, trong đó thành phần chính bao gồm terpinen-4-ol; 1,8-cineole; γ-terpinene; α-terpinene; α-terpineol; α-terpinolene,… [1, 2, 17, 20, 21, 22, 27]

Tiêu chuẩn quốc tế ISO 4730 yêu cầu TTO thương mại có hàm lượng terpinen-4-ol tối thiểu là 30,00% và 1,8-cineole tối đa 15,00%

Bảng 1.2: Thành phần hóa học tinh dầu tràm trà theo tiêu chuẩn ISO 4730

– Tỉ trọng: 0,858 g/ml ở 20o

C – Nhiệt độ đông đặc: -64oC – Nhiệt độ sôi: T760 = 155oC

– Chỉ số khúc xạ: n20

D = 1,4664 – Tan rất ít trong nước

[β-myrcene]

– IUPAC: 7-Methyl-3-methylene-1 ,6-octadiene – Công thức phân tử: C10H16 (M = 136,23 g/mol) – Chất lỏng không màu, có mùi dễ chịu

– Tỉ trọng: d20

4 = 0,768 g/ml – Nhiệt độ sôi: 166 - 168oC – Chỉ số khúc xạ: n20

D = 1,466 – 1,471

[α-terpinene]

– IUPAC: α: 4-methyl-1-(1-methylethyl)-1,3-cyclohexadiene – Công thức phân tử: C10H16 (M =136,23)

– Chất lỏng không màu, mùi chanh nhẹ – Tỉ trọng: d20

4 = 0,8375 g/ml – Nhiệt độ sôi: 173,5 - 174,8o

C – Chỉ số khúc xạ: n20

D = 1,4765

[p-cymene]

– Công thức phân tử: C10H14 (M=134,21) – IUPAC: 1-methyl-4-(1-methylethyl)benzene – Nhiệt độ đông đặc: -68oC

– Nhiệt độ sôi: T760 = 176 - 178oC – Tỉ trọng: d20

4 = 0,8583 g/ml – Không tan trong nước, tan trong ethanol và ether – Hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng virus

[limonene]

– Công thức phân tử: C10H16 (M = 136,23) – IUPAC: 1-Methyl-4-prop-1-en-2-yl-cyclohexene – Chất lỏng không màu, mùi cam

– Tỉ trọng: d20

4= 0,8411 g/ml – Nhiệt độ đông đặc: -92,5oC – Nhiệt độ sôi: T760 = 176oC

[1,8-cineol]

– Công thức phân tử: C10H18O ( M = 154,24 ) – IUPAC: 1,3,3-trimethyl-2-oxabicyclo[2,2,2]octane – Chất lỏng không màu

– Nhiệt độ sôi: T760= 176 - 177oC – Tỷ trọng: d20

4= 0,8583 g/m3 – Nhiệt độ đông đặc: 1,5oC – Chỉ số khúc xạ: 1,448

[γ-terpinene]

– IUPAC: γ:4-methyl-1-(1-methylethyl)-1,4-cyclohexadiene – Công thức phân tử: C10H16 (M = 136,23 )

– Chất lỏng không màu – Tỉ trọng: d20

4 = 0,853 g/ml – Nhiệt độ đông đặc: 1 - 1,5oC – Nhiệt độ sôi: 183oC

– Chỉ số khúc xạ: n20

D = 1,448 – Hoạt tính sinh học: kháng khuẩn

[terpinolene]

– Công thức phân tử: C10H16 (M = 136,23 )

– IUPAC: 1-methyl-4-isopropyliden-1-cyclohexen – Chất lỏng không màu, mùi gần giống mùi lilac nhẹ – Tỉ trọng: d20

4 = 0,8628 g/ml – Nhiệt độ sôi: 185 - 187oC – Chỉ số khúc xạ: n20

D = 1,4809

[terpinen-4-ol]

– Công Thức phân tử: C10H18O ( M = 154,24 ) – IUPAC: 1-metyl-4-isopropyl-1-cyclohexen-4-ol

– Chất lỏng không màu – Nhiệt độ sôi: T760= 209 - 212oC – Tỷ trọng: d20

4 = 0,9265 g/m3 – Chỉ số khúc xạ: n20

D= 1,4765 – Năng suất quay cực: 0,933 - 0,935 – Tan trong ethanol, không tan trong nước – Hoạt tính sinh học: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virus…

[α-terpineol]

– Công thức phân tử: C10H18O (M = 154,24) – IUPAC: 2-(4-methyl-1-cyclohex-3-enyl)propan-2-ol – Chất lỏng không màu

– Nhiệt độ sôi: T760 = 219oC (ở 4.5 mmHg: 81-82o

C) – Tỷ trọng : 0.9338 g/cm3

– Không tan trong nước, tan trong ethanol

– Hoạt tính sinh học: kháng nấm, kháng khuẩn

1.2.4 Hoạt tính sinh học

Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các loại tinh dầu chiết xuất từ thảo mộc và gia vị khác nhau đã trở nên ngày càng phổ biến bởi vì các loại tinh dầu có nhiều

chức năng như kháng khuẩn, chống oxy hóa, và chống ung thư Kết quả là, tinh dầu đã được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất chống oxy hóa tự nhiên trong hương thơm và cây thuốc liên quan chặt chẽ với đặc tính sinh học của chúng, chẳng hạn như giảm các bệnh mãn tính (ví dụ: đột biến, chất sinh ung thư, ) và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh,

Ngày nay, nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung nghiên cứu về hoạt tính dược lý của các loại tinh dầu Trong số đó, TTO là một trong những đối tượng nghiên cứu quan trọng nhất vì đã chứng minh được hoạt tính sinh học của nó là khá rộng [17, 19]

1.2.4.1 Hoạt tính chống oxy hóa

Các nghiên cứu chỉ ra rằng TTO có khả năng chống oxy hóa t Hoạt tính của các chất chống oxy hóa giảm theo thứ tự sau: α-terpinene > α-terpinolene> γ-terpinene bằng phương pháp DPPH Hơn nữa, hoạt tính của các chất chống oxy hóa của TTO được so sánh với chất chống oxy hóa tiêu chuẩn thương mại - butylated hydroxytoluene (BHT) Mặt khác, nhờ có hoạt tính chống oxy hóa mà TTO ngày càng có giá trị trên thị trường [16, 23]

1.2.4.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật

a Hoạt tính kháng khuẩn Cơ chế: tinh dầu tràm trà có tính diệt khuẩn vì khi nó thấm qua màng tế bào vi khuẩn nó sẽ phá hủy cấu trúc của thành và màng tế bào, phá vỡ tính nguyên vẹn và chức năng sống của màng tế bào, làm mất vật chất, mất khả năng duy trì tính nội cân bằng, sự hô hấp bị ức chế

Tính diệt khuẩn của tinh dầu tràm trà do các thành phần: terpinen-4-ol; terpineol; 1,8-cineol; α-pinene; β-pinene; linalool; trong đó terpinen-4-ol; linalool và α-terpineol có hoạt tính cao nhất

α-Bảng 1.3: MIC & MBC của các loại vi khuẩn với TTO Loại vi khuẩn

Terpinen-4-ol, α-terpineol, β-pinene, α-pinene, 1,8-cineol… có khả năng kháng nấm tốt với nhiều loại nấm (như các loại nấm thuộc họ Candida (22 loại), họ Malassezia furfur (26 loại), trong đó MIC thường từ 0,03 - 0,50%, MFC thường từ 0,12 – 2,00% [17, 28]

Bảng 1.4: MIC & MFC của các loại nấm với TTO Loại nấm

Ngoài ra, tinh dầu tràm trà còn có khả năng kháng virus gây bệnh herpes (bệnh mụn rộp) là HSV, hoạt tính kháng virus chủ yếu do các cấu tử terpinen-4-ol, α-terpineol, 1-8-cineole Trong đó, terpinen-4-ol > 1, 8-cineole > ρ-cymene > γ-terpinene > α-terpinene [18]

d Hoạt tính chống viêm Vi sinh vật đơn bào cũng bị TTO ức chế Nó có thể ức chế 50% sự phát triển

của sinh vật đơn bào Leishmania majorv và Trypanosomabrucei ở nồng độ 403

mg/ml và 0,5 mg/ml, trong đó terpinen-4-ol đóng vai trò quan trọng còn nồng độ

300 mg/ml tiêu diệt hoàn toàn tế bào Trichomonas vaginalis [17]

Bên cạnh đó, TTO còn có hoạt tính kháng viêm (F.Caldefie-chezet, M.Guerry và đồng nghiệp, 2004)

1.2.5 Độc tính của tinh dầu tràm trà

TTO không gây khó chịu ngay cả khi đƣợc sử dụng lên đến 10,00% (Altman, 1991) hoặc 25,00% (Southwell et al, 1997.) Nhƣng một số nghiên cứu khác cho

rằng TTO có thể gây ngộ độc khi dùng dạng thuốc uống với liều lượng lớn, không nuốt trực tiếp TTO vì dễ gây ngộ độc

Nồng độ TTO dưới 10,00 % không gây kích ứng da, không dùng TTO nguyên chất, nguyên nhân gây kích ứng da có thể là do 1,8- cineole nên hàm lượng 1,8- cineole có trong TTO Khi sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm và dược phẩm

được giới hạn: dược phẩm: 1,8- cineol ≤ 3,00%, terpinen-4-ol ≥ 37,00%; mỹ phẩm: 1,8- cineol ≤ 5,00%, terpinen-4-ol ≥ 35,00%; kỹ thuật: 1,8- cineol ≤ 10,00%,

Năm 2008, tại Viện Pasteur TPHCM nhóm nghiên cứu OPODIS pharma cho rằng thuốc sử dụng α-terpineol được chiết từ TTO có tác dụng ức chế virut cúm H5N1 và họ đang nghiên cứu khả năng ức chế trên virut H1N1 Ngoài ra, Bộ Y tế đã đưa TTO vào danh mục thuốc thiết yếu để kiểm tra và kiểm soát bệnh trong cộng đồng [9]

Nguyễn văn Nghi với nghiên cứu về cách trồng thử nghiệm tràm trà trên vùng gò đồi Đồng Hới Ông chứng tỏ rằng tràm trà có khả năng sinh trưởng tốt ở vùng đất này và hàm lượng terpinen-4-ol là 40,00% [10]

Năm 2002, Nguyễn Thới Nhâm cùng cộng sự chứng minh TTO có hoạt tính kháng khuẩn và hàm lượng terpinen-4-ol trong TTO là: 46,60%; 1,8-cineole (5,05%) [17]

2007 và 2008, nhóm nghiên cứu của trường ĐH Bách Khoa Tp HCM gồm Phan Đình Tuấn, Lê Nhất Thống và cộng sự đã tinh chế thành phần

terpinen-4-ol (98%) vả khào sát khả năng kháng vi sinh vật của TTO [12, 13]

1.3.2 Trên thế giới

Năm 1770, thuyền trưởng Cook - nhà thám hiểm người Anh trong chuyến thám hiểm của mình đã quan sát thấy người Úc pha trà từ một loại lá Sau đó, ông lấy lá này về nghiên cứu và đặt tên cho nó là “tea tree” [18]

TTO là một trong số tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn, đã và đang được sử

dụng rộng rãi nhờ thuộc tính sát trùng Môi trường sống của Melaleuca alternifolia

là khu vực Bungawalbyn của phía Đông Bắc New South Wales, nước Úc và các thổ dân Bundjalung sống ở khu vực này đã điều trị nấm da, bôi lên vết thương nhiễm trùng da bằng cách nghiền lá của cây tràm trà (Drury, 1991)

Nghiên cứu khoa học về TTO bắt đầu vào những năm 1920 tại Bảo tàng Công nghệ và Khoa Học Ứng Dụng tại Sydney Penfold và Grant (1925) báo cáo rằng TTO là loại tinh dầu không độc hại và có tính sát khuẩn, không gây khó chịu mà hiệu quả hơn là phenol Sau này qua quá trình thí nghiệm họ đã đưa ra bằng chứng của việc sử dụng TTO trong điều trị, từ đó giá trị của TTO trên thị trường càng được nâng cao

Humphrey (1930) đã thử nghiệm và báo cáo giá trị nồng độ của TTO ở 2,5 – 10,00% thì có thể điều trị một loạt các bệnh chẳng hạn như rửa vết thương, nhiễm trùng của móng, sổ mũi và viêm họng, và cho rằng TTO sẽ có những ứng dụng tiềm năng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng âm đạo và bỏng Ngoài ra hiệu quả của TTO như là một chất khử trùng và một số tính năng khác của TTO đã được công bố bao gồm các khả năng như hòa tan mủ trong nhiễm vết thương, làm sạch vết thương bẩn và giải quyết nhiễm trùng mãn tính, đặc biệt là các móng tay, móng chân mà không có tác động bất lợi cho các mô khỏe mạnh

Năm 1936, công ty sản xuất tinh dầu - Australian Essential Oils Ltd - công bố về các ứng dụng y tế và nha khoa của Ti-trol - tên được sử dụng cho TTO (Lassak và McCarthy, 1983) Các ứng dụng của TTO tiếp tục được công bố trong và ngoài

nước Úc, và tất cả các báo cáo đều nhấn mạnh tính không độc hại và không gây khó chịu của tinh dầu tràm trà Khả năng của tinh dầu không gây dị ứng trên da cũng đã được Drury báo cáo (1991)

Ngoài ra, TTO còn là một chất khử trùng hiệu quả, an toàn đã được xác minh trong thời gian bùng nổ của cuộc chiến tranh thế giới thứ hai Hơn nữa, đây là tinh dầu đầu tiên được sử dụng chính thức trong quân đội và hải quân ở các vùng nhiệt đới (Drury, 1991) để làm giảm nhiễm trùng vết thương và sát trùng dụng cụ y tế (Lassak và McCarthy, 1983)

Sau chiến tranh thế giới II, một số công ty đã tổng hợp được terpinen-4-ol (cấu tử quý trong TTO) bán với giá thấp Mặt khác, thành phần TTO bị biến chất do quá trình bảo quản không hợp lý, giống tràm trà không thuần chủng, thổ nhưỡng, đã làm giảm cả về chất lượng lẫn số lượng TTO trong ngành công nghiệp cũng như sự cạnh tranh trên thị trường nội địa và quốc tế

Trong những năm 1970, mối quan tâm đến sản phẩm "tự nhiên" đã được đổi mới, và việc sản xuất tinh dầu tiếp tục tăng lên và do đó có nhiều ứng dụng TTO được kết hợp như là một chất kháng khuẩn và là chất bảo quản tự nhiên trong phạm vi rộng của dược phẩm, mỹ phẩm và các sản phẩm bao gồm các loại kem khử trùng, sữa mặt rửa, gel mụn, kem bôi âm đạo, sản phẩm chăm sóc da, thú y, thuốc trị bệnh nấm da, dầu gội và các loại kem trị bỏng

1.4 Ứng dụng của tinh dầu tràm trà

Trong những năm gần đây TTO đã được nghiên cứu rất nhiều và đặc biệt là hoạt tính sinh học của TTO Mối quan tâm của các nhà khoa học đã giúp tăng giá trị của TTO trên thị trường

TTO có tác dụng như một chất khử trùng tự nhiên đã được chứng minh có phạm vi hoạt động rộng, hiệu quả chống lại một loạt các vi khuẩn Gram dương và Gram âm, nấm men và nấm mốc Ở nồng độ 5,00% và nhiều hơn nữa, nó được sử dụng trong điều trị làm chất khử trùng, kháng nấm và điều trị mụn trứng cá trên toàn thế giới [18]

1.4.1 Ứng dụng TTO trong mỹ phẩm

Trên thế giới mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân có chứa TTO đang được phát triển ngày càng tăng Kể từ khi ra mắt tiên phong của các sản phẩm chăm sóc cá nhân trong năm 1980 bởi các công ty như Thurssday Plantations, Melaleuca Inc và Dessert Essence Người ta có thể thấy một sự bùng nổ của các sản phẩm có chứa TTO trong mỹ phẩm [18] Dẫn đầu là Body Shop, phạm vi sản phẩm chứa TTO thành công nổi bật trên toàn thế giới Tiếp nối là L'Oreal tại Pháp với Ushuata thành công dầu gội đầu và sữa tắm Nhiều công ty khác, bao gồm cả Clarins, Yves Rocher, Ella Bache, Boots, Aveda, Unilever, Carter Wallace, Colgate, Benckiser, Reckitt và Colman, Rhone Poulenc, Úc Bodycare và Blackmores đã nghiên cứu và sản xuất các sản phẩm có chứa TTO tại thị trường mỹ phẩm

Ở nồng độ thấp hơn, TTO tăng thêm hiệu quả cho một loạt các mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc cá nhân và từ sản phẩm em bé đến các sản phẩm cho người cao niên và người mắc bệnh về da

Tiềm năng của nó là ứng dụng và bổ sung vào các chất tẩy rửa, giặt ủi như một tác nhân ngăn ngừa ghẻ (McDonald và Tovey, 1993)

1.4.2 Ứng dụng TTO trong dược phẩm

TTO sẽ có lợi thế hơn so với hóa chất tổng hợp, chẳng hạn như những người hiện đang được sử dụng để kiểm soát các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch ngũ cốc, được chấp nhận hơn cả vì môi trường và người tiêu dùng Ứng dụng tiềm năng bao gồm kiểm tra tác nhân gây bệnh của các loại côn trùng và ứng dụng phối chế vào thuốc trừ sâu Bên cạnh đó, terpinen-4-ol - thành phần chính của TTO, đã được chứng minh như là một loại thuốc chống bệnh sốt do muỗi vàng da, muỗi Aedes aegyptii (Hwang et al, 1985)

Vào năm 1989, Price đã chứng minh rằng: sử dụng TTO để chữa bệnh nhanh chóng, phòng chống nhiễm trùng và giảm đau (Price, 1989) Ngoài tính chất diệt khuẩn đã có nhiều báo cáo cho rằng TTO còn có khả năng chống viêm, giảm ngứa và sưng do côn trùng cắn, ban đỏ, nổi mụn và bị cháy nắng

Các nhà nghiên cứu tại Khoa Nha Khoa của Đại học Tennessee đã tìm thấy được ứng dụng tiềm năng của TTO trong vệ sinh răng miệng

Ngoài ra, có thể phối TTO vào một sản phẩm ở mức 0,50% hoặc cao hơn có thể loại bỏ sự cần thiết phải thêm một chất bảo quản

Các sản phẩm dược có TTO

Gần đây, TTO được sử dụng thương mại trong nhiều sản phẩm bao gồm: sản phẩm chăm sóc em bé, các công thức massage, chăm sóc bàn chân, khử mùi, sữa tắm, kem chống nắng, thuốc chống côn trùng, kem đánh răng, nước súc miệng, xà phòng, các sản phẩm thú y Trong đó, các sản phẩm dược có chứa TTO đóng vai trò nhất định trên thị trường toàn cầu vì có sự hỗ trợ của các công trình nghiên cứu chứng tỏ TTO rất lành tính, là chất linh hoạt nhất, có ý nghĩa rất lớn trong y học

Bảng 1.5: Một số sản phẩm hóa dược chứa TTO

Kem đánh răng

- Không florua, kiểm soát mảng bám tự nhiên Rất lý tưởng cho vệ sinh răng miệng, răng giả, viêm nướu

US $ 8,49

Nước súc miệng

- Không chứa cồn, chữa trị hôi miệng, loét miệng

US $ 14,49

Thuốc mỡ

- Thuốc mỡ với Vit.E, kháng khuẩn nhẹ nhàng, không thấm nước Giúp bảo vệ vết loét, chống lại nhiễm trùng

US $ 15,95

Gel trị nấm, mụn nhọt

- Trị nấm, lang ben, mụn nhọt

US $ 14,75

Thuốc xịt chân

- Giúp ngăn ngừa nhiễm trùng nấm chẳng hạn như bệnh nấm da Kiểm soát vi khuẩn gây mùi ở chân

US $ 11,95

Bột thoa chân

- Điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng nấm như bệnh nấm da Khử mùi và diệt vi khuẩn gây mùi

US $ 15,99

Nước xịt khử mùi đa năng

- Khử trùng và loại bỏ vi khuẩn và mùi hôi từ các phòng tắm, nhà vệ sinh và sàn nhà Làm giảm triệu chứng của vết thương nhỏ và bệnh nấm da Giúp kiểm soát mùi hôi chân bằng cách phun giày dép

US $ 16,32

Dung dịch vệ sinh phụ khoa

- Sát trùng và kháng khuẩn và làm giảm ngứa âm đạo

US $ 13,21

Kem trị ngứa

- Giảm tạm thời kích thích nhỏ, ngứa và đốt cháy các lĩnh vực âm đạo và hậu môn

US $ 11,56

1.5 Đối tượng răng và miệng

Trong đời sống thì răng có nhiệm vụ để cắt và nghiền thức ăn, răng miệng và hệ thống nhai ở người nói chung, là bộ phận để tiếp xúc, giao tiếp với thế giới bên ngoài, giữa cá nhân với cá nhân, giữa cá nhân với cộng đồng (chức năng xã hội) Vì vậy, nó đóng vai trò quan trọng cho con người

Miệng gồm 2 phần: phần cố định (răng, má lưỡi và lợi), và phần di động (nước bọt) Trong đó phần cố định luôn được tẩm bởi một luồng nước bọt liên tục [2]

1.5.1 Cấu tạo răng

Hình 1.5: Cấu tạo răng

a Men răng: không chứa tế bào sống

Thành phần gồm (tính theo khối lượng) : 95% vô cơ (Canxi, Photpho, Magie, CO3, Na, F, Ca-P), 1% hữu cơ (Protein và Lipid), 4% nước

b Ngà răng: thành phần gồm: 70% chất vô cơ, 20% chất hữu cơ và 10% là

nước

c Tủy răng: chứa lipid, protid, … dây thần kinh và gân máu

1.5.2 Nước bọt: trong nước bọt chứa: Protein chứa nhiều hydratcacbon làm nước

bọt nhờn và muối Ca2+, PO43- (duy trì sự toàn vẹn bề mặt men răng), một số enzim, vi khuẩn,…

1.5.3 Bệnh gây ra do vi sinh vật có hại trong miệng

Theo giáo sư Wade (Viện Nha khoa, Trường King’s College London), “miệng của một người khỏe mạnh là nơi trú ngụ của vô vàn các vi trùng khác nhau, trong đó có cả virus, nấm, sinh vật đơn bào và vi khuẩn Vi khuẩn chiếm số lượng đông đảo nhất - có khoảng 100 triệu vi khuẩn/ml nước bọt và hơn 600 loại vi khuẩn khác

nhau trong miệng"

Trong một bản báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), sâu răng là căn bệnh răng miệng phổ biến nhất ở nhiều nước châu Á và châu Mỹ Latin Ở các nước phát triển cũng không thua kém với 60,00 – 90,00% trẻ em tuổi đi học và đa số người lớn mắc bệnh Theo PGS-TS Trần Văn Trường - Chủ tịch Hội Răng Hàm Mặt Việt Nam, trên 90,00% dân số Việt Nam bị các bệnh răng miệng Trong đó, hơn 85,00% trẻ em độ tuổi 6 - 8 bị bệnh răng, nhưng 94,00% số trẻ này không được điều trị

Ngoài ra, bệnh loét miệng ở Việt Nam cũng rất phổ biến Bệnh do nhiễm phải loại virus có tên herpes simplex

Một số vi sinh vật thường có trong răng miệng và họng của con người thường

gặp: Streptococcus spp, Bacillus anthracis, Candida albicans, Lactobacillus spp, Neisseria sp, Vellonella spp, Stomatococcus spp,